PRAKTIKUM Č. 3: KULTIVACE BAKTÉRIÍ, BAKTERIOLOGICKÉ PŮDY, PODMÍNKY INKUBACE, VZNIK A MORFOLOGIE BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ, RŮSTOVÉ FÁZE, MNOŽENÍ BAKTERIÍ V TEKUTÝCH MÉDIÍCH. SELEKTIVNÍ POMNOŽENÍ A IZOLACE BAKTERIÍ.

CÍLE:

1. Seznámit se s přípravou a druhy bakteriologických půd.

2. Naučit se základním kultivačním technikám.

3. Seznámit se s různými nároky bakterií na podmínky inkubace.

4. Naučit se hodnotit morfologii kolonií a rozlišovat růstové fáze bakterií.

Kultivace bakterií je umělé mnoţení bakterií, které provádíme na bezbuněčných kultivačních (ţivných) půdách. Účelem kultivace je získání čisté kultury mikroba z vyšetřovaného vzorku. Čistá kultura je předpokladem pro úspěšnou biochemickou, sérologickou, nebo i další identifikaci vypěstovaného izolátu bakteriální kultury.

Fyzikálně-chemické podmínky kultivace

1. Přítomnost vody - je nutnou podmínkou pro vstřebávání ţivin. Tuto podmínku splňují půdy tekuté i půdy pevné.

2. Optimální pH - u většiny půd se pH upravuje na pH 7,2 - 7,4.

3. Isotonie kultivačního prostředí - se zajišťuje přidáním NaCl do většiny půd (0,5%).

4. Optimální plynná atmosféra – pro kultivaci aerobů a fakultativních anaerobů je s atmosférickou koncentrací kyslíku a anaeroby vyţadují bezkyslíkaté prostředí (anaerobní kultivace).

Anaerobní kultivace. Podmínkou pro anaerobní kultivaci mikrobů je nízký oxidoredukční potenciál kultivačního prostředí, neboť u anaerobů neprobíhají při nevhodném redox-potenciálu fosforylační reakce, které jsou nezbytné pro získání energie. U striktních anaerobů je limitující po¬tenciál -200 mV, u méně náročných anaerobů se pohybuje v rozmezí 0 aţ +150 mV, kdeţto půdy pro aerobní kultivaci mají hodnotu redox-potenciálu asi +300 mV. Redukčního prostředí (záporné hodnoty redox - potenciálu) dosahujeme v tekutých a polotuhých půdách pouţitím čerstvě připravené a rychle ochlazené půdy, nebo jejím povařením po dobu 20 minut a rychlým ochlazením těsně před pouţitím, dále přídavkem redukujících chemických substancí (nejčastěji kyseliny thioglykolové nebo její sodné soli, cysteinu, glukózy, redukovaného ţeleza) nebo rozemleté ţivočišné tkáně (svalovina, játra, mozek). Lze vyuţít i přidání malého mnoţství agaru (0,1-0,3%), který podstatně omezuje difúzi vzdušného kyslíku do půdy. Takto redukované tekuté a polotuhé půdy se chrání před oxidací převrstvením povrchu sterilním parafinovým olejem.U

pevných (agarových) půd pouţíváme média čerstvě připravená nebo regenerovaná těsně před pouţitím a inkubujeme v anaerobní nádobě (anaerostatu).

5. Optimální teplota - při hodnocení závislosti růstu na teplotě se udávají tři důleţité teploty, minimální, maximální a optimální. Minimum je nejniţší teplota, při které se zastavuje růst příslušného mikrobního druhu, podobně maximum je nejvyšší teplota, při níţ se růst zastaví, ale po ochlazení na niţší teplotu dále pokračuje. Optimum je pak tepelný bod, při kterém je rychlost růstu bakterií maximální. Medicínsky významné bakterie a většina moţných kontaminant patří do skupiny mezofilů, jejichţ optimální teplota je v rozmezí 30 aţ 40

oC. Proto se většinou

naočkované půdy v laboratořích lékařské mikrobiologie inkubují při teplotě 37 nebo 35oC. Při této

teplotě ponecháváme naočkované půdy v inkubátoru (biologickém termostatu) s automatickou regulací teploty 24-48 hodin aţ několik týdnů, podle růstové intenzity mikrobního druhu. Při izolaci některých mikrobních druhů (salmonely, kampylobaktery, E. coli) je z důvodu zvýšení selektivity postupu izolace vyuţívána i vyšší teplota (40 aţ 44

oC). Naopak vzorky pocházející

z poikilotermních ţivočichů a vzorky potravin a krmiv vyšetřované za účelem průkazu saprofytických plísní a psychrofilních bakterií se inkubují při niţších teplotách.

6. Nároky bakterií na živiny Většina bakterií patří mezi mikroorganismy chemoheterotrofní. Ty jsou závislé na zdrojích chemické energie a vyuţívají organické sloučeniny jako hlavní zdroj uhlíku. Jejich poţadavky na ţiviny splňují kultivační půdy, které obsahují různé soli, kovové ionty, cukry, aminokyseliny, vitamíny a jiné růstové faktory. Kultivační půda má svým sloţením zajistit získání růstově optimální a vzhledově charakteristické kultury bakterií.

MIKROBIOLOGICKÉ ŽIVNÉ PŮDY, JEJICH ROZDĚLENÍ A PŘÍPRAVA

Rozdělení půd:

a)podle původu

přirozené (mléko, brambor, krevní sérum aj.)

umělé (uměle připravované, ale chemicky nepřesně definované - jde o většinu půd

užívaných v bakteriologické diagnostice)

syntetické (půdy s přesně známým chemickým složením, umožňující např. studium

metabolismu)

b) podle konzistence

tekuté (pomnožovací) - které dobře pomnožují, ale nehodí se k získávání čisté kultury

pevné (agarové) - tekuté půdy zahuštěné agarem (1,5-2%) nebo želatinou, případně

koagulací bílkovin teplem (krevního séra, vaječné hmoty apod.). Jsou vhodné k izolaci

čistých kultur (izolační půdy).

polotuhé (semisolidní) s přídavkem 0,1 až 0,5 % agaru

c) podle obsahu živin

základní - slouží ke kultivaci řady běžných bakterií a jsou východiskem pro přípravu

ostatních půd. Z tekutých půd sem patří peptonová voda a masopeptonový bujón (MPB),

z pevných půd je to masopeptonový agar (MPA) s různými peptonovými základy.

obohacené - základní půdy s příměsí růstových faktorů ve formě různých extraktů,

hydrolyzátů, krve, séra apod. (např. masopeptonový krevní agar, sérový bujón).

d) podle účelu použití

univerzální - hodící se k záchytu a izolaci většiny medicínsky významných bakterií

selektivní (výběrové, elektivní) - základní půda (živný základ) do níž přidáme inhibiční

složku, která ve směsi bakterií potlačí bakterie nežá¬doucí a umožní dobrý růst hledané

skupiny nebo druhu bakterií. Sem můžeme zařadit tekuté půdy k pomnožení některých

patogenů z klinického materiálu (např. pomnožovací půdy pro salmonely a další).

diagnostické - k základní půdě se přidává diagnostická přísada, jež se metabolismem

mikroba charakteristicky mění (chemicky a barevně), nebo rozkladné produkty odhalí

vhodný indikátor, přidaný již přímo do půdy, nebo přidaný po určité době inkubace

k narostlé kultuře. Jde zejména o větší počet půd, používaných v tzv.“pestré řadě“ při

určování biochemické aktivity izolovaného kmene.

výběrově-diagnostické - jsou kombinací dvou předchozích. Jde většinou o pevná média

s živným základem, výběrově inhibiční složkou a diagnostickou přísadou, doplněná

vhodným indikátorem. Sem patří řada půd používaných k izolaci některých patogenů.

transportní média – slouží k ochraně vzorku, nejčastěji ve formě vatového tamponu, po

dobu od odběru do okamžiku zpracování v laboratoři.

Příprava mikrobiologických živných půd

Některé chemicky nedefinované suroviny k přípravě kultivačních půd:

Masová infuze - připravuje se z rozemletého masa (hovězí, koňské) extrahovaného přes noc dvojnásobným mnoţstvím destilované vody. Potom se směs povaří a zfiltruje. Místo takto připravené suroviny, lze pouţít komerčně vyráběné koncentráty (např. Beef extract).

Pepton - enzymatický (pouţívá se trypsin, pepsin, papain, pankreatická šťáva) nebo kyselý hydrolyzát různých druhů bílkovin. Enzymatickou cestou získaný pepton je zdrojem peptidů, aminokyselin a růstových faktorů, kdeţto kyselé hydrolyzáty vitamíny a další růstové faktory neobsahují.

Kvasnicový extrakt - uţíváme jako zdroje ţivin, hlavně vitamínů skupiny B a dalších růstových faktorů.

Agar - je to sušená hydrofilní substance získaná z mořské řasy (Agar agar). Přidává se v 1,5 aţ 5 % koncentraci do půd k jejich zpevnění. Ve vodném prostředí připravovaného média znovu váţe vodu (bobtná), získaná rosolovitá hmota se při 100

o> C rozváří a tuhne mezi 25-60

oC.

Opět různé druhy peptonů, agarů a extraktů jsou komerčně dostupné (………..)

Příklady složení základních kultivačních médií

Peptonová voda: 1 - 5 % roztok peptonu v destilované vodě s 0,5 % NaCl. Pouţívá se hlavně k přípravě diagnostických uhlohydrátů.

Masopeptonové bujony (MPKA): je masová infuze s 1% peptonu a 0,5% NaCl, pH je upraveno na 7,2 - 7,4. MPB je pomnoţovací médium, které spl¬ňuje růstové a energetické poţadavky nenáročných mikrobiálních druhů. Lze ho obohatit např. přidáním séra (sérový bujón), ascitu (ascitový bujón), vařených jater (játrový bujón). Pro přípravu bujónů určených ke kultivaci náročných druhů bakterií bývá infuze získána z jiných tkání, jako např. BHI bujón, jehoţ základem je mozko-srdcová infuze (brain-heart infusion). Dále můţe být pro tento účel vyuţito směsi různých peptonů, např. tryptózo-sójový bujón (TSB) obsahuje enzymatický štěpený pepton ţivočišného původu a pepton rostlinného původu. Různé typy bujónů bývají výchozím základem pro přípravu pevných půd. Existují také dehydratované speciality, které se vyrábějí komerčně

(…………..).

Masopeptonový agar (MPA)- označovaný také ţivný agar. Jedná se o MPB s přídavkem agarové řasy (běţně v mnoţství 1,5 - 2%). Po přidání řasy do MPB se nechá nabobtnat a pak se půda rozvaří v proudící páře. Upraví se pH na 7,2 - 7,4 a půda se ste¬rilizuje 30 minut při 121oC. Po vytemperování asi na teplotu 45-50

oC se půda rozlévá do sterilních Petriho misek. MPA

můţeme pouţít jako izolační půdu pro velký počet mikrobiálních dru¬hů, ale hlavně slouţí jako základ k přípravě obohacených, selektivních a výběrově-diagnostických půd. Různé druhy MP agarů se opět vyrábějí jako speciality v sušeném stavu. Ţivné agary se liší v typech pouţitých peptonů a infuzních sloţek (BHI agar, TS agar).

Masopeptonový krevní agar (MPKA) připravíme tak, ţe rozpustíme základ MPA vytemperovaný ve vodní lázni na 45oC se asepticky obohatí 5-10% defibrinované nebo citrátové ovčí krve, zahřáté na stejnou teplotu. Po promíchání se asepticky rozlévá do sterilních Petriho misek. Jestliţe základ krevního agaru zahřejeme ve vodní lázni alespoň na 85

oC, získáme tzv.

čokoládový agar, který je vhodný ke kultivaci hemofilů a příbuzných bakterií. Vedle ovčí krve se téţ pouţívá v indikovaných případech k přípravě krevního agaru i krve z dalších druhů zvířat (hovězí, koňské, králičí aj.) i krve lidské. Někdy, zejména pro studium hemolytických interakcí, se krevní agary připravují pouze přidáním propraných erytrocytů vhodného ţivočišného druhu.

Masopeptonový agar (MPA), masopeptonový krevní agar (MPKA), čokoládový krevní agar (ČKA).

Výběrově diagnostické půdy pro enterobakterie jsou tvořeny ţivným základem (MPA), diagnostickou přísadou (laktóza nebo jiné cukry), indikátorové sloţky (barviva, směsi chromogenních substancí, ţelezité ionty), které detekují změnu pH (např. štěpení laktózy), hromadění metabolitu (sirovodík, aldehydy, aj.). Navíc tyto půdy obsahují selektivní sloţky (barviva, směs ţlučových solí, apod.), které inhibují v růstu grampozitivní bakterie.

Endův agar(EA) - selektivní sloţkou a zároveň indikátorem štěpení laktózy je v této půdě Schifovo reagens (vyváţená směs bazického fuchsinu s kyselým siřičitanem sodným), které reaguje s aldehydy

MacConkeyův agar(MCA) - inhibiční sloţkou v médiu je speciální směs ţlučových solí. Okyselení, které vzniká rozkladem laktózy, indikuje neutrální červeň. Inhibiční rozsah má téměř shodný s Endovým agarem. Obě média umoţňují růst gramnegativním nenáročným bakteriím z č. Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Aeromonadaceae a někrerým dalším rodům (Pseudomonas, Alcaligenes).

Desoxycholát-citrátový agar (DC agar) - inhibiční sloţkou jsou v médiu tvoří ţlučové soli, avšak ve vyšší koncentraci neţ v MCA. Navíc obsahuje citronan ţelezitý, který indikuje tvorbu sirovodíku. Indikátorem okyselení je opět neutrální červeň. DCA je zvláště vhodný pro izolaci salmonel a yersinií. Podobné sloţení má i Salmonella-Shigella agar (SS agar).

Agar s briliantovou zelení (BGA) - inhibiční sloţkou je briliantová zeleň, indikátorem pH fenolová červeň. Pouţívá se hlavně pro selektivní izolaci salmonel. Přidá-li se do půdy jako diagnostická přísada vedle laktózy ještě sacharóza, zvýší se její diferenciační hodnota. Dnes je průmyslově vyráběna řada tzv. chromogenních půd na kterých lze rozlišit podle typického zabarvení kolonií vybrané rody z č. Enterobacteriaceae. Jako příklad lze uvést Rambachův agar, který je určený pro izolaci salmonel.

Selektivní pomnoţovací půdy jsou tekutá média, obsahující inhibiční sloţku(y), která inhibuje v mnoţení neţádoucí skupiny bakterií a přitom umoţňuje růst hledané skupině mikrobů nebo přímo bakteriálnímu rodu či druhu. Nejznámější z nich jsou selektivní pomnoţovací půdy:

pro salmonely: Müller-Kauffmannův tetrathionátový bujón, selenitová půd, Rappaport -

Vassiliadisova půda

pro beta-hemolytické streptokoky: SBM médium

pro grampozitivní baktérie (obecně): bujón s colistinem a kyselinou nalidixinovou

(CNB)

pro listerie (Fraserův bujón)

Půdy určené ke kultivaci určitých skupin mikroorganismů

1. Významnou skupinu představují anaeroby. Běţné tekuté pomnoţovací půdy pro anaeroby jsou východiskem pro přípravu pevných půd. Je to například jsou VL – bujón.

2. Půdy pro kultivaci mykobakterií : Loewenstein - Jensenova půda – jedná se o směs 10 dílů homogenizovaných vajec a 6 dílů solného roztoku s glycerinem a malachitovou zelen, která se nechá v šikmé poloze koagulovat ve zkumavce při teplotě 80oC. Petragnaniho půda: obsahuje vedle vaječné hmoty, solí a malachitové zeleně ještě mléko, bramborovou moučku a glycerin.Kultivační média pro mykobakterie (zleva tekutá pomnoţovací Šulova půda a šikmé izolační vaječné půdy).

3. Půdy pro kultivaci mikroskopických hub plísní a kvasinek: Sabouraudův agar (čti Saburódův): obsahuje 1% peptonu a 3% glukózy jako ţivné sloţky a 2-3% agaru; pH se upravuje na 5,6. Czapek-Doxův agar: neobsahuje pepton, ale směs anorganických solí. Sladinkový agar: je vhodný zejména ke kultivaci kvasinek.

4. Značný počet diagnostických půd se vyuţíval v rámci tradičního určování biochemické aktivity studované kultury izolátu bakterií v tzv. pestré řadě. Ty budou zmíněny v další části návodů.

Transportní média

Jedná se o polotuhá agarová média, která se rozplňují do zkumavek. Tato média neobsahují ţivné sloţky a svým sloţením jsou blízké pufrům, které jsou obohaceny o další sloţky např. aktivní uhlí (médium dle Amiese) thioglykolát sodný aj. Tato média udrţují ţivotaschopnost náročnějších bakterií (neiserie, pasteurely, hemofily, anaeroby) ve vzorku, zabraňují během transportu vzorků jejich přerůstání doprovodnou mikroflórou a udrţují tak kvantitativní poměry mezi jednotlivými mikrobními druhy, coţ je důleţité při posuzování a interpretaci výsledků (bakteriologických nálezů).

Příprava kultivačních půd je dnes podstatně zjednoduše¬na tím, ţe řada základních, speciálních půd i jednotlivých sloţek půd (agar, kvasnicový extrakt, peptony, masový extrakt) se dnes vyrábí a expeduje, jak jiţ bylo zmíněno, ve formě sušených půd(sušené základy pro přípravu masopeptonových krevních agarů), t.j. ve formě prášku, který se v předepsaném mnoţství rozpustí v destilované vodě a sterilizuje. Hlavními producenty těchto půd jsou fy DIFCO, BBL, OXOID, MERCK, BIO-RAD a další. V návaznosti na otázku komerční výroby půd je nutno poznamenat, ţe v současném vývoji mikrobiologické diagnostiky je zřejmý trend selektivní mikrobiologie, s jednoznačným důrazem na selektivní izolaci patogenních mikroorganismů přímo z klinického materiálu a potravin. Diferenciaci hledaných fpatogenů usnadňují i nově zaváděná chromogení média. Pro zjednodušení přípravy médií pouţívaných k tomuto účelu jsou komerčně vyráběny tzv. suplementy s obsahem inhibitorů, nejčastěji antibiotik.

Úspěšná kultivace bakterií je rovněţ závislá i na dodrţování nezbytných technických podmínek:

a) Sklo a jiné pomůcky: nejčastěji pouţívaným sklem při bakteriální kultivaci jsou Petriho misky, Erlenmayerovy baň¬ky a tlustostěnné zkumavky. Sklo s infekčním materiálem dekontaminujeme v autoklávu, varem nebo chemicky. Potom čistíme mechanicky s pomo¬cí detergenčních prostředků. Po opláchnutí pod proudící vo¬dou se pak provádí neutralizace slabým roztokem kyselin a následuje důkladné opláchnutí pod proudící vodou, případně ještě v destilované vodě. Čisté a suché sklo uzavíráme zát¬kami z vaty, kovovými uzávěry nebo hliníkovou fólií (aloba¬lem). Petriho misky skládáme. Sterilizujeme horkým vzduchem (1 - 2 h při 160o C).

b) Sterilita je základní podmínkou úspěšné kultivace. Ved¬le pouţívání sterilního skla, sterilizujeme všechny zhotove¬né půdy a to podle jejich povahy buď v autoklávu (20-30 min při přetlaku 0,1-0,15 MPa), nebo v proudící páře (v Kochově hrnci) buď jednorázově po dobu 30 min, nebo tzv. frakciono¬vanou sterilizací (3 dny po sobě 20 min). U půd, kde je ste¬rilizace teplem vyloučena, lze pouţít sterilizaci filtrací přes membránové filtry. Dodrţujeme sterilní postupy při očkování. Půdy otvíráme jen na nejkratší dobu nutnou k naoč¬kování vyšetřovaného materiálu. Další otevření půd můţe vést ke kontaminaci vzdušnými mikroby. Pečlivě vypalujeme očkova¬cí kličky před kaţdým pouţitím. Vypalování má být po celé délce kličky, nejlépe skoro ve svislé poloze. K očkování však nesmí být pouţito příliš teplých kliček - jejich pouţi¬tí vede k usmrcení mikrobů v materiálu. Proto je nutno vyţí¬hanou kličku nechat vychladnout, nejlépe tak, ţe pracujeme s několika kličkami v určitém pořádku. Při očkování půd ve zkumavce je potřeba po vyjmutí zátky, nejlépe v šikmé poloze, opálit okraje zkumavky. Stej¬ně tak je třeba po vyjmutí zátky, nebo odstranění jiného uzávěru, opalovat hrdla Erlenmayerových láhví před vyléváním kultivační půdy do misek nebo před očkováním. Zátku není moţno pokládat na laboratorní stůl, ale drţíme ji malíčkem levé nebo pravé ruky tak, aby se nekontaminovala.

c) Očkování (inokulace) je přenesení kultury nebo infekčního vzorku do tekuté půdy nebo na pevnou půdu. Kultivační půdy, pokud je hned nepouţíváme, jsou obvykle uloţeny v chladničce. Před pouţitím je potom třeba pevné půdy osušit v termostatu při 37-45o C po dobu 15-30 min. Při sušení se misky skládají do sušárny otevřené, kultivační půdou dolů, aby nebezpečí kontaminace bylo co nejmenší. Půdy však nesmí¬me přesušit!! Půdy, které jsou připravené k pouţívání nepo¬necháváme na přímém slunečním světle. Před očkováním nádobky s půdami popíšeme číslem pod nímţ je materiál veden v proto¬kolu vyšetřující laboratoře a datem očkování.

Očkování do tekuté půdy - vypálenou a chladnou kličkou nabereme materi¬ál, asepticky otevřeme zkumavku, opálíme její okraje a kličku s nabraným inokulem ponoříme do média a dotyky o stěnu zkumavky s následným zatřepáním rozptýlíme nanesené mikroby. Po sterilním uzavření naočkované zkumavky vysterilizujeme pouţitou kličku vypálením.

Očkování na pevné půdy - nám umoţňuje postupným ředěním inokula získat izolované bakteriální kolonie. Jsou to viditelné útvary vzniklé mno¬ţením jediné baktérie. Přenesením izolované kolonie na novou půdu pak vede k získání čisté bakteriální kultury. Očkovací postup, kterým získáme izolované kolonie označujeme jako izolační očkování. Ředění inokula při izolačním očkování na pevnou půdu v Petriho misce dosahujeme tak, ţe na vypálenou a vychladlou kličku nabereme inokulum, které pak naneseme hustou vlnitou čarou na výseč

představující asi 1/5 povrchu půdy. Potom další vypálenou a ochlazenou kličkou přenášíme materiál na sousední výseč půdy hustou vlnitou čarou, nebo hustě vedle sebe kladenými čarami. Toto opakujeme ještě 2 - 3x, vţdy po novém vypálení kličky, aţ celou plochu misky vyplníme očkovací čarou, jejíţ konec se nesmí dotknout začátku očkování. V konečných parti¬ích dobře vedené očkovací čáry nanášíme na půdu jednotlivé bakteriální jedince vzdálené od sebe a jejich pomnoţením vzniká izolovaná bakteriální kolonie. Vlastních postupů tohoto způsobu existuje několik (viz. obrázek č. 4). Je lhostejné, který z nich si kaţdý pracovník vyvolí. Cílem je získat jednotlivé samostatně rostoucí kolonie organismů, které je moţno povaţovat za čistou kulturu. Obvykle rostou aţ na třetím nebo aţ ve čtvrtém stupni očkování.

Obrázek č. 4 : Postupy izolačního očkování

Obrázek č. 5: Očkování šikmého agaru

Očkování na šikmý agar provedeme tak, ţe nabereme inokulum vypálenou a chladnou kličkou, zavedeme ji bez dotyku půdy aţ na dno zkumavky - do kondenzní vody, která je v malém mnoţství v úhlu mezi agarem a zkumavkou. Potom hranou kličky vedeme co nejhustší vlnitou čáru po celé agarové ploše směrem nahoru. Inokulace do vysokého agaru se provádí vpichem.

RŮST BAKTERIÍ NA ŽIVNÝCH PŮDÁCH A JEHO HODNOCENÍ

V tekutých půdách se růst bakterií projevuje nejčastěji tvorbou zákalu, případně tvorbou sedimentu nebo povrchové blanky.

Během inkubace naočkovaných agarových médií se za vhodných podmínek z kaţdé buňky vytváří kolonie. Kolonie tedy představuje bakteriální masu, která je potomstvem jedné buňky (klon). Za konstantních podmínek je vzhled kolonií charakteristický pro určitou skupinu nebo dokonce rod, případně druh bakterií. Proto hodnocení morfologie kolonií představuje důleţitý diagnostický krok. Při posuzování bakteriálních kolonií si všímáme následujících znaků.

1. Velikost – kolonie mohou být tečkovité nebo se jejich velikost vyjadřuje průměrem v mm (různě velké bakteriální kolonie na MPKA).

2. Tvar – kolonie pravidelně okrouhlá, nepravidelná …

3. Okraje – rovné, zvlněné, výběţkaté, kořenovité

4. Profil - plochý, mírně vypouklý, vypouklý, výrazně vypouklý, pupkovitý, vyvýšené okraje…(obr)

5. Povrch – lesklý, hladký, matný, drsný, zvrásnělý ..

6. Transparence – průhledná, průsvitná, neprůsvitná

7. Barva – bezbarvé, šedobílé, barva daná tvorbou pigmentu (Micrococcus luteus– ţlutá, M. roseus, Serratia rubidea – růţová) nebo změnou barevného indikátoru v ţivné půdě (laktózu štěpící a neštěpící enterobakterie na selektivně diagnostických půdách s laktózou) Hodnocení tvorby pigmentu na mléčném agaru.

8. Změny okolí – posuzujeme změnu barvy (produkce ve vodě rozpustných pigmentů, změna pH média – změna barvy indikátoru), na MPKA si všímáme stupně hemolýzy erytrocytů (částečná hemolýza - alfa, úplná - beta, dvojitá, zelenání - viridace)(obr)

9. Konzistence – mazlavá, máslovitá, drobivá, vosková, hlenovitá

10. Zápach – značně subjektivní znak (fekální, hnilobný, kyselý, nasládlý…)

Obrázek č. 6: Morfologie bakteriálních kolonií

Je třeba si uvědomit, ţe kolonie téhoţ bakteriálního druhu, ba i téhoţ bakteriálního kmene mohou mít na pevných půdách různý charakter tzv. růstové či disociační fáze.Zpravidla rozeznáváme tři základní růstové fáze, označované jako fáze M, S, R.

Kolonie v M-fázi (mucous - hlenovitý) jsou kolonie hlenovitého vzhledu a konzistence, polokulovitě vypouklé, ostře ohraničené, mají tendenci se slévat. V preparátu z těchto kolonií jsou bakterie opouzdřené, tyčinkovité bakterie jsou kratší, streptokoky v této fázi jsou častěji po dvou nebo, jen v krátkých řetízcích.

Mikroby rostoucí v této fázi jsou zpravidla nejvirulentnější, především díky přítomnosti pouzdra. V tekuté půdě rostou tyto mikroby difúzním zákalem. Kolonie v S-fázi (smooth - rovný, hladký) jsou hladké, lesklé a plošší neţ kolonie v M-fázi. Mikroskopicky jde o delší tyčinky, u streptokoků o delší řetízky koků. Jednot¬livé bakterie nemají pouzdra. Virulence kmenů v S-fázi je niţší neţ kmenů v M-fázi. V tekuté půdě rostou tyto mikroby nejčastěji rovněţ difúzním zákalem.

Kolonie v R-fázi(rough - drsný) jsou drsného povrchu, nepravidelných okrajů, bývají často radikálně rozbrázděné, s vyvýšeným středem. Tyto mikroby rostou v tekuté kultivační půdě nejčastěji ve formě zrnitého sedimentu. Mikroskopicky jde o dlouhé tyčinky aţ vlákna, koky bývají mnohdy protaţené, uspořádané do dlouhých řetízků. Virulence těchto mikrobů je sníţena, aţ úplně chybí. Mikroby v R-fázi se liší od mikrobů téhoţ kmene v M-fázi nebo S-fázi i antigenně. Mají omezenou antigenní výbavu.

Fáze, v níţ roste určitý bakteriální kmen, není ovšem jeho stabilní vlastností. Řada vlivů můţe vést ke změně disociační fáze jedním či druhým směrem. Tak i pouhé pasáţování kultury na pevných půdách vede mnohdy k postupné degradaci původní M-fáze ve fázi S nebo R, podobně jako pasáţování na nevnímavých jedincích. Naopak pasáţování na vnímavých jedincích, např. vhodných laboratorních zvířatech, vede ke zvýšení virulence mikrobní kultury.