PROTEOMIKA
2015
• Proteomika, proteiny, co a proč. Metody práce s bílkovinami
• Separační metody, 2-DE
• 2-DE detaily a záludnosti, identifikace bílkovin pomocí MS
• Principy hmotnostní spektrometrie
• Identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie
• Shot-gun strategie, kvantitativní metody
• Proteomika membránových proteinů, proteinové komplexy
• Klinická proteomika, zvláštní metody
• Proteomické čtení, ukázkové studie
• Co je proteomika ? Proteom? Protein?
• Experimentální strategie proteomiky
• Vlastnosti AMK a proteinů
• dezintegrace, lyzace, frakcionace
• detergenty
• srážení, precipitace, denaturace
• koncentrace, filtrace
• stanovení koncentrace
• značení bílkovin
• chromatografie
• elektroforéza
METODY PRÁCE S PROTEINY
ZNAČENÍ A ZAKOTVOVÁNÍ
PROTEINŮ
Reaktivní skupiny bílkovin
sulfhydryl (–SH)
primární amin (–NH2)
karboxyl (–COOH)
karbonyl sacharidu (–CHO)
Cys
Maleimid
SH-
Biotin Hydrazide bind to oxidized carbohydrates through the hydrazide group (–NH-NH2), forming a hydrazone linkage. Oxidation of glycoproteins generates reactive aldehydes that react specifically with hydrazide groups.
Cukry
• Co je proteomika ? Proteom? Protein?
• Experimentální strategie proteomiky
• Vlastnosti AMK a proteinů
• dezintegrace, lyzace, frakcionace
• detergenty
• srážení, precipitace, denaturace
• koncentrace, filtrace
• stanovení koncentrace
• značení bílkovin
• chromatografie
• elektroforéza
METODY PRÁCE S PROTEINY
Liquid Chromatography (LC)
Liquid flow
Liquid
flow
Time 1 2 3 4 5
Separation according to:
-molecular weight/ size
-charge
-hydrophobicity
-affinity
Sample containing
proteins or peptides
•Vzorek se rozděluje mezi mobilní a stacionární (pevnou) fázi
METODY Chromatografické SEPRACE BIOMOLEKUL
VELIKOST
HYDROFOBICITA
AKTUÁLNÍ NÁBOJ
SPECIFICKÉ
INTERAKCE
Gelová filtrace
(Size-exclusion chromatography)
Chromatografie v reverzní fázi
(Reverse phase chromatography)
Iontoměničová chromatografie
(Ion exchange chromatography)
Afinitní chromatografie
(Affinity chromatography)
•Atmosférická
•Nízkotlaká (FPLC, MPLC)
•Vysokotlaká (HPLC)
Klesá : objem vzorku, průtok
a průměr kolony
Roste: rychlost separace
MATRIX :
• kroslinkovaný dextran (Sephadex)
• kroslinkovaná celulóza (Sephacel)
• kroslinkovaná agarosa (Sepharose)
• polyakrylamid (Sepahacryl)
• silica - kyselina ortokřemičitá
• polystyren a jiné synt. polymery
KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC)
SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
GEL-PERMEATION CHROMATOGRAPHY
Částice se v porézní matrix rozdělují na základě velikosti
Lze provádět za nativních podmínek !
Separační rozmezí až do 1000-2 000 000 Da
Vhodná pro proteiny.
GELOVÁ FILTRACE
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY
IONTOMĚNIČOVÁ CHROMATOGRAFIE
• Dělí na základě aktuálního celkového náboje
+-
Anex je pozitivně nabitý
Katex je negativně nabitý
+++ (DEAE) - - - (CM)
KATEXANEX
- +
ELUCE:
Zvýšená iontová síla =
snížení ES interakcíZměna pH = chromatofokusace
+++ (DEAE)
ELUCE:
Zvýšená iontová síla =
snížení ES interakcíZměna pH = chromatofokusace
- - - (CM)
+-
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
Interakce proteinu s jeho
specifickým ligandem
metabolit, kov, DNA,
protilátka…..
Eluce:
• ligand
• pH
• iontová síla
• denatuační činidlo
Aktivované matrice:
NHS Sepharose……lze vázat za aminoskupinu (succiimid)
CNBr Sepharose…..lze vázat za aminoskupinu
EAH Sepharose …..lze vázat protein za karboxyl (karbodiimid)
Thiol sepharose……lze vázat za SH cysteinu
Matrice s afinitou pro IgG
Protein G Sepharose
Protein A sepharose
Protein A, G magnetic beads
Matrice s afinitou pro glykoproteiny
ConA Sepharose
Velké ligandy (DNA, protein) lze vázat přímo na matrix.
Malé ligandy (nukleotid, NADP, hormon…) se váží přes inertní „spacer arm“.
AFINITNÍ MATRIX
REVERZNÍ FÁZE (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY)
Dělení na základě interakce s hydrofobní matricí
(na základě odlišné hydrofobicity peptidů/proteinů)
•Matrice a ligand:
vysoce hydrofobní
alifatické řetězce
•Vzorek je v hydrofilním
rozpouštědle
•Eluce: gradientem
organického rozpouštědla
H3
Matrice - nerozpustná, odolná organice a vysokému tlaku
– silica, polystyren…
Ligandy – hydrofobní alifatické řetězce C2-C18
Vhodnost: proteiny, peptidy
Kompatibilita s MS!
C18
Nano
HPLC25-100 μm 24-4000 nL/min
Capillary
HPLC
100-100
μm0.4-200 μL/min
Micro
HPLC
1.0-2.1
mm50-1000 μL/min
Normal
HPLC
4.0-5.0
mm1.0 -10.0 mL/min
Vnitřní průměr
kolony Průtok
HPLC podle průtoku
LC-MALDI
ESI-MS
Prezentace z přednášek budou ke stažení na adrese:
http://patf.lf1.cuni.cz/proteomika
včetne pdf souborů s doporučenou literaturou
R. Scopes – Protein purification. Principles
and practice. Springer Verlag
Komplexita proteomu – Kolik je proteinů?
~20 600 lidských genů
Kódující
gen
mRNA
mRNA
mRNA
mRNA
mRNA
? mRNA ?
x 10 variant
??? Proteinů ???
JAK JE DEFINOVÁN PROTEIN?
GENOCENTRICKÝ vs. PROTEOCENTRICKÝ POHLED
PROTEIN a PROTEOFORMA
Jaká je koncentrace jednotlivých proteinů
a dynamický rozsah?
V savčí buňce: 10-10 000 000 kopií/buňku (107)
V séru/plazmě: pg/ml až mg/ml (1010)
Separace směsi BÍLKOVIN
Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace
Štěpení vybraných
bílkovin + čištění
peptidů
Získání hmotnostních
spekter
Měření přesné hmotnosti peptidů
( a jejich fragmentů)
Identifikace bílkovin (+ kvantifikace)
Porovnání hmotností sady
peptidů (jejich fragmentů) s
údaji o všech dostupných
ORFs v databázích
PROTEOMICKÝ EXPERIMENT
Štěpení všech
bílkovin (trypsin)
Separace směsi PEPTIDŮ
„SHOT-GUN“
STRATEGIE
„KLASICKÁ“
STRATEGIE
• chromatografie
• elektroforézy
SEPARAČNÍ METODY
2-DE • příprava vzorků
• izoelektrická fokusace
• ekvilibrace
• SDS-PAGE
• detekce bílkovin a DIGE
• zpracování dat a vyhodnocení
• digesce vzorku a extrakce peptidů
• limty a záludnosti 2-DE
z
6phrSpecifická mobilita u =
z - náboj
h viskozita
r Stokes průměr čátice
Elektroforéza
Elektroforéza v roztoku
Elektroforéza v gelu
Izoelektrická fokusace
1807 F.F. Reuss
1930 Arne Tiselius – volná a papírová elektroforéza
(1948 Nobelova cena)
1955 O. Smithies – škrobový gel
1959 Raymond and Weintraub - polyakrylamidový gel
1961 Svensson and Vesterberg – IEF a amfolyty
1970 U.K. Laemli – SDS –PAGE
1975 Patrick O´Farrell – 2-DE
Složení a příprava gelu:
• akrylamid (monomerní)
• bis-akrylamid (zesíťování polymeru)
• APS (peroxodisíran amonný,katalyzátor, produkuje volné radikály),
• TEMED (tetramethylethylenediamine, stabilizuje volné radikály)
• pufr a SDS
Celková koncentrace akrylamidu a bis-akrylamidu určuje KONCENTRACI (T) gelu v procentech (2-20 %)
Poměr bis-akrylamidu a akrylamidu POROZITU (C) gelu.
APS v zásaditém prostředí může reagovat s Trisem, koncentrace co nejnižší ve prospěch TEMEDu.
POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY
1959 Raymond and Winstraub- první AA gel
NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA
dělení na základě velikosti (průměru částice) a
náboje
DENATURUJÍCÍ SDS-ELEKTROFORÉZA
dělení na základě MW proteinu
IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE
dělení na základě izoelektrického bodu v
gradientu pH
POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY
SDS ELEKTROFORÉZA
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
PUFR:
Tris-Cl/Tris-glycin
0.1 % SDS
pH 8.8
Redukce disulfidických můstků
(Dithiothreitol, Dithioerythrol, TCEP,
beta-mercaptoethanol)
•Bílkoviny se rozdělují na základě jejich MW
•Záporně nabité SDS tvoří komplexy s bílkovinami a stíní náboje proteinu (1,4g SDS :1g proteinu)
•Komplex má jednotkový náboj na hmotnostní jednotku.
•Všechny komplexy jsou záporně nabité a migrují k anodě
Izoelektrická fokusace - pohyb nabité částice v gradientu pH
• Celkový náboj proteinu (net charge) je součtem všech jeho
negativních i pozitivních nábojů.
• Kyselé a zásadité skupiny polypeptidu jsou protonovány a deprotonovány
v závislosti na pH prostředí.
•Amfoterní molekula (bílkovina) v elektrickém poli v gradientu pH migruje do bodu ,
kde je její celkový náboj rovný nule.
• pH tohoto bodu odpovídá izoelektrickému bodu (pI) dané bílkoviny.
pH < pI pH=pI pH > pI
migruje k - migruje k +
3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH
Net charge
pH pufru se vzorkem
pIpI
+3
-4
TEORETICKÁ DISOCIAČNÍ KŘIVKA DVOU BÍLKOVIN
pH 3 pH 11
+ -+ -+-pI pI
Bílkovina v elektrickém poli v
gradientu pH migruje do bodu, kde je
její celkový náboj rovnen nule.
NH3 +
COO-
NH3 +
COO-
Jaterní homogenát,
2 mg, barvení
koloidní Coomassie
Blue
1025 spotů
pH 4 pH 7
150 kDa
10 kDa
DVOJROZMĚRNÁ ELEKTROFORÉZA (2-DE)
Rozděluje proteiny nejdříve podle jejich náboje a následně
kolmo na směr původní migrace dle jejich MW
Typický 2-DE experiment
solubilizace
pH gradient
IEF
Vizualizace
redukce/alkylace
SDS
elektroforéza
Diferenční obrazová analýza
Vyříznutí
vybraných skvrn
Štěpení trypsinem a
identifikace pomocí MS
• chromatografie
• elektroforézy
SEPARAČNÍ METODY
2-DE • příprava vzorků
• izoelektrická fokusace
• ekvilibrace
• SDS-PAGE
• detekce bílkovin a DIGE
• zpracování dat a vyhodnocení
• digesce vzorku a extrakce peptidů
• limty a záludnosti 2-DE
LYZAČNÍ PUFR PRO IEF:
solubilizace
Močovina, thiomočovina – chaotropní činidlo, zvýšení rozpustnosti,
denaturace bílkovin
solubilizace
Detergent (CHAPS) – čistý zwitteriontový detergent – zvýšení rozpustnosti
snížení agregace bílkovin
redukce –S-S-
Redukční činidlo (DTT) – redukce disulfidický můstků (ionizují se nad pH 8,
migrují pryč ze stripu na alkalickém konci)
DTT, DTE versus TCEP (Tris[2-carboxyethyl] phosphine ,
tributylphosphine
běh elektroforézy a pH gradient
Nosičové amfolyty -- (carrier ampholytes, IPG buffers) – jsou náhražkou
pufrů, je to směs ionizovatelných látek vytvářejí
potřebný pH gardient
Pigment (BFB) – pro snazší manipulaci Typický lyzační/rehydratační pufr
• 7 M Močovina
• 2 M Thiomočovina
• 2 - 4 % CHAPS
• 0.2 % DTT (TCEP, tributylfosfin)
• 0.5 – 1 % Nosičové amfolyty (IPG pufr)
• 0.002 % BFB
Každá sůl škodí vaší separaci!
Vše nabité pryč!
PŘÍPRAVA VZORKŮ
DNA a RNA
LIPIDY
SOLI
PROTEÁZY
Ultrafiltrace, mikrodialýza, precipitace
Inhibitory proteáz – PMSF, koktejly
Precipitace
Detergent nebo precipitace
Sonikace, DNázy, RNázy,
Precipitace, komplexování s amfolytyZhoršená separace
Barví se v kyselé oblasti gelu
Zhoršená separace
Špatná separace
Degradace bílkovin
PROTEÁZY A KONTAMINACE VE VZORKU
UNIVERZÁLNÍ ŘEŠENÍ ?
Precipitace acetonem, TCA nebo kombinací.
Problém s rozpustostí pelety!
PROTEÁZY stále aktivní i ve vysoké koncentraci močoviny !!!
• Stanovení koncentrace bílkovin
• Analytická versus preparativní nanáška (10-3000 mikrogramů)
• chromatografie
• elektroforézy
SEPARAČNÍ METODY
2-DE • příprava vzorků
• izoelektrická fokusace
• ekvilibrace
• SDS-PAGE
• detekce bílkovin a DIGE
• zpracování dat a vyhodnocení
• digesce vzorku a extrakce peptidů
• limty a záludnosti 2-DE
3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH
Net charge
pH pufru se vzorkem
pIpI
+3
-4
TEORETICKÁ DISOCIAČNÍ KŘIVKA DVOU BÍLKOVIN
pH 3 pH 11
+ -+ -+-pI pI
Bílkovina v elektrickém poli v
gradientu pH migruje do bodu, kde je
její celkový náboj rovnen nule.
NH3 +
COO-
NH3 +
COO-
NOSIČOVÉ AMFOLYTY (CARRIER AMPHOLYTES)
Vlastnosti:
•Vysoká pufrační kapacita a rozpustnost při vlastním pI
•Dostatečná a stálá elektrická vodivost
•Absence biologických efektů
•Nízká MW
Původně: směsi různě dlouhých řetězců
Oligoamino-oligokarboxylových kyselin
MIGRACE a nestabilní gradient !!!
Zakotvené pH gradienty (Immobilized pH gradients – IPG )
Amfoterní molekuly nesoucí disociovatelné bazické i kyselé skupiny
Zajišťují vytvoření stabilního a hladkého gradientu pH v elektrickém poli
1982 Bjellqvist(derivovaný akrylamid)
ZAKOTVENÉ PH GRADIENTY (IMMOBILIZED pH GRADIENTS – IPG)
Derivovaný akrylamid s disociovatelnými karboxy- a aminoskupinami
3 mm široké, 0.5 mm silné, dehydrované - trvanlivost , reproducibilita, plastova podložka,
stabilita, nemigrují, neinterferují s nimi redukční činidla.
IPG STRIPY (IPG STRIPS)
wpH-rangeReadyStripIPGstripsenhanceandincreaseresolutionbycreatingoverlappingdataequivalent t
PRO:
•Rehydratace a nanáška spojena v jeden
krok
•Proteiny rovnoměrně rozložené,
neprecipitují v místě nanášky
•Aktivní rehydratace zlepšuje vstup velkých
bílkovin do gelu
PRO:
IEF ve vysoce kyselých a zásaditých gradientech
probíhá lépe
PROTI:
Vzorek je dlouhodobě při pokojové teplotě
PROTI:
Proteiny s pI blízko bodu nanášky mají nízkou
rozpustnost a mobilitu a mají tendenci precipitovat
na povrchu gelu
REHYDRATAČNÍ NANÁŠKA versus CUP LOADING
REHYDRATACE IPG STRIPŮ A NANÁŠKA VZORKU
PODMÍNKY IZOELEKTRICKÉ FOKUSACE
Optimalizace podmínek pro každý vzorek, typ stripu a nanášky.
Platí zvlášť pro: větší nanášky, a větší a hydrofobnější proteiny.
Teplota: kolem 20 oC ( PREVENCE KARBAMYLACE ! versus krystalizace močoviny za nízkých teplot)
Aktivní chlazení !!! Dochází k přehřívání na tzv. HOT SPOTS
Elektrické podmínky : 50-70 microA na
strip, U co nejvyšší, kroky nebo pozvolný
vzestup
V praxi až 10 kV. Celková fokusace pro 18-
24 cm stripy 40-80 kVh
Prevence oxidace a vysychání stripu : parafinový olej
N´konec nebo
epsilon aminoskupina lyzinu
Kyselina
izokyanatá
Nízký proud!
Vysoké napětí
Soli a ionty pufrů
E
PŘEHŘÍVÁNÍ IPG STRIPŮ NA TZV. HOT SPOTS
(HOT SPOTS jsou hrany iontových pásů - hranice oblasti s nízkou a vysokou vodivostí)
V
5000
3000
1000
1 3 6 9 12 24 t [h]
BIO-RAD Protean IEF Cell
18 cm strip pH 3-10
Rehydratační nanáška 1mg
50 microA / strip
Celkem 51 000 Vh
+ “hold”
TYPICKÝ IEF BĚH
EKVILIBRACE STRIPŮ PŘED DRUHÝM ROZMĚREM
Cíle ekvilibrace:
Převést bílkoviny do pufrů vhodných pro redukci, alkylaci a SDS separaci
• Maximalizovat přenos bílkovin ze stripu
• Redukovat disulfidické můstky
• Alkylovat cysteiny
Thiol-disulfidová výměna DTT s proteinem
Protein Protein
Pro
tein
Protein
Redukce disulfidických vazeb
EKVILIBRACE STRIPŮ PŘED DRUHÝM ROZMĚREM
Cíle ekvilibrace:
Převést bílkoviny do pufrů vhodných pro redukci, alkylaci a SDS separaci
• Maximalizovat přenos bílkovin ze stripu
• Redukovat disulfidické můstky
• Alkylovat cysteiny
EKVILIBRAČNÍ PUFR (EQP):
50 mM Tris pH 8.8
2% SDS,
6 M močovina
30 % glycerol
15-20 min EQP + 1% DTT (dithiothreitol)
15-20 min EQP + 2.5 % iodacetamid (!)
Redukce:
Alkylace:
ELEKTROENDOOSMOTICKÝ EFEKT
Nepohyblivé (zakotvené) nabité skupiny v elektrickém poli !!
Po ekvilibraci v neutrálním nebo zásaditém pufru:
• COOH disociovaná na COO-,
• aminoskupiny zůstávají nedisociované
Disociovaný karboxyl je přitahována k anodě (+), ale nemůže…….
To je kompenzováno migrací H3O+ ke katodě (-)
Voda nese rozpuštěné částice směrem ke katodě !
COO-
H3O +
H3O +
katoda
+anoda
Následky:
IEF : bobtnání katodického (bazického) konce
zhošená separace
SDS-PAGE : ztráta bílkovin na vstupu do gelu
zhoršená separace
WITA
Small (8x7 cm), large (24x32 cm) and giant gels (48x32 cm)
(mouse ovary total protein extract, 5000-8000 spots).
Trubičky a obří gely