Společnost pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP ve spolupráci
se Společností infekčního lékařství ČLS JEP a
Českou parazitologickou společností
seminář
TOXOPLASMÓZA
Praha 2.3.2004 Lékařský dům ČLS JEP, Sokolská 31, Praha 2
Seminář sponzoruji firmy TEST-LINE a BIO-RAD
1
Společnost pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP ve spolupráci
se Společností infekčního lékařství ČLS JEP a
Českou parazitologickou společností
pořádají společný seminář na téma
"TOXOPLASMÓZA"
dne 2.března 2004 ve 13.30 hodin
ve velké posluchárně Lékařského domu ČLS JEP, Sokolská 31, Praha 2
Program:
1. prof.RNDr. Jiří Vávra, DrSc. Toxoplasma gondii: stručný portrét úspěšného parazita
2. doc.MVDr. Břetislav Koudela, CSc. Souputníci Toxoplasma gondii
3. RNDr. Petr Kodym, CSc.
Základní imunitní reakce proti infekci Toxooplasma gondii
4. RNDr. Karel Fajfrlík, MUDr. Čestmír Beneš, RNDr. Petr Kodym, CSc. Kongenitální toxoplasmóza
5. RNDr.Petr Kodym, CSc. Diagnostika toxoplasmózy
6. doc.RNDr. Jaroslav Flegr, CSc. Vliv latentní toxoplasmosy na lidský organismus
7. MUDr. Hanuš Rozsypal, CSc.. Toxoplasmová encefalitida u AIDS
Koordinátor semináře: RNDr.Petr Kodym, CSc. Sponzorem jsou firmy TEST-LINE a BIO-RAD
2
Toxoplasma gondii: stručný portrét úspěšného parazita
Prof. RNDr. Jiří Vávra, DrSc.
Parazitologický ústav AV ČR a Biologická fakulta JČU, České Budějovice;
Katedra parazitologie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze
e-mail: [email protected]
Když byla v r.1908 toxoplasma nalezena v severoafrickém hlodavci "gundi", nikdo nemohl tušit, jak významný parazit vstoupil do historie. Že toxoplasma může být též lidským parazitem, bylo objeveno až v r.1923 českým oftalmologem Josefem Janků. "Morbus Janků", jak byla kongenitální forma toxoplasmosy tehdy nazývána, a objev (1969/70, tedy po 60ti letech!), že toxoplasma je kočičí kokcidie, otevřely cestu lékařskému a biologickému výzkumu, jehož výsledkem je poznání, že toxoplasma je asi nejčastějším lidským parazitem, oportunně využívajícím prostředí lidské civilizace, snad dokonce schopným manipulovat své hostitele (viz příspěvek doc.Flégra).
Teprve současná éra molekulární biologie a biochemie však přinesla poznání toho, jak dokonale je tento parazit přizpůsoben životu uvnitř buněk teplokrevných obratlovců. Několik navzájem souvisejících témat je hlavním směrem současného biochemicky a molekulárně biologicky orientovaného výzkumu Toxoplasma gondii: zvláštní, klouzavý pohyb (zprostředkovaný komplexem proteinů „glideosom“), způsob, jakým vniká pomocí organel apikálního komplexu do buněk a z nich vystupuje, jak přetváří prostředí membránové vakuoly, do které zoit vnikl, na růstovou komůrku ("parazitoforní vakuolu"), a jak toxoplasma ovlivňuje biochemii a osud hostitelské buňky.
Je to také molekulární biologie, která přispěla rozhodujícím způsobem k pochopení evoluční historie toxoplasmy. Kmen parazitických prvoků Apicomplexa, kam biologové tento organizmus řadí (mimo toxoplasmy sem patří řada významných parazitů, např. malarická plasmodia, kryptosporidie, dobytčí babesie a theilerie, nejrůznější kokcidie), měl kdysi volně žijící předky vybavené bičíky. Tito bičíkovci napadali jiné prvoky nebo tkáně bezobratlých a užívali k tomu soubor organel umístěných na přední části buňky, což byl prototyp "apikálního komplexu" toxoplasmy a příslušníků celého kmene Apicomplexa (jméno!). Apikální komplex je souborem cytoskeletálních (konoid, polární kruh, mikrotubuly) a žláznatých (mikronemy, rhoptrie, denzní granula) komponent, sloužících k pohybu zoitu (mikronémy), nalezení vhodné hostitelské buňky (konoid, mikronémy), průniku do hostitelské buňky (konoid a rhoptrie), úpravě prostředí parazitoforní vakuoly (rhoptrie a denzní granula) a prostředí parazitované buňky a jejího osudu obecně (řada genových produktů).
Molekulárním svědkem evoluční historie toxoplasmy jsou také tři genomy v její buňce: 1. jaderná 80Mb DNA, v současnosti podrobovaná kompletní sekvenční analýze genů, 2. mitochondriální DNA, 5.9kb velká, která, tak jako u všech organizmů, je vývojovým reliktem alfa-proteobakterie, která se v dávné historii zúčastnila výstavby prvé buňky eukaryontního typu (buňky vybavené pravým jádrem). Třetí genom je kruhová molekula DNA velikosti 35kb. Je to genom plastidu, organely rostlinného původu, nazvané apikoplast. Výzkum apikoplastu, tohoto "svědka času" evoluce, jeho původu a funkce je pravděpodobně nejžhavějším tématem
3
současného výzkumu apikomplex, a Toxoplasma gondii a malarická plasmodia v něm hrají klíčovou roli.
Apikoplast je organela obklopená 4mi membránami, ležící v buňce toxoplasmy v blízkosti jádra a Golgiho aparátu. Každá buňka obsahuje jediný apikoplast, který se dělí společně s dělením buňky. Elektronoví mikroskopici tuto organelu odedávna znají pod jmény jako na př. "multimembránový měchýřek", "Golgi adjunkt". Ale teprve v letech 1996-97 molekulární biologie prokázala, že tento celkem nenápadný měchýřek má svou DNA, a ta že jasně dokazuje příslušnost k rostlinným plastidům. Spor je dosud o tom, zda apikoplast je pozůstatkem pohlcené zelené nebo červené řasy a oba názory nacházejí v genomu apikoplastu určitou podporu. V každém případě je ale apikoplast rostlinného původu: je tedy toxoplasma (a s ní ostatní apikomplexa) rostlinný organizmus?
Klíčem k odpovědi na tuto otázku a k pochopení důležitosti apikoplastu je jeho vývojová historie. Plastidy, podobně jako mitochondrie byly v prvých dobách vzniku eukaryontní buňky získány cestou symbiosy. Buňka pradávné sinice (cyanobakterie) se dostala do cytoplasmy eukaryontní buňky, nebyla tam strávena, zapojila se do metabolických procesů uvnitř buňky, předala většinu své DNA do jádra hostitele. Tak vznikly plastidy, jak je známe dnes, v podobě chloroplastů a dalších typů plastidů na př. v rostlinách, zelených a červených řasách. Tento proces je označován jako "primární endosymbiosa", takto vzniklé plastidy mají kolem sebe 2 membrány. Původ plastidu u apikomplex a toxoplasmy je však složitější. Do jejich buněk se dostal plastid teprve následnou cestou označovanou jako "sekundární endosymbiosa". Dávný předek apikomplex pohltil do své buňky jinou buňku (zelené či červené řasy?) již vybavenou plastidem. Z celého pohlceného organizmu nakonec zbyl pouze plastid (se dvěma membránami) obalený buněčnou membránou původem z pohlcené buňky a další membránou z fagocytární vakuoly. To jsou dohromady 4 membrány obalující dnešní apikoplast. Rovněž v tomto případě většina genetické informace byla z plastidu předána do jádra a zbývající DNA obsahuje jen minimum genů (převážně geny pro tvorbu rRNA, tRNA, ribosomální proteiny).
Získáním plastidu si hostitelská buňka zlepšila svou energetickou bilanci a biochemický potenciál. Například to umožnilo eukaryontním buňkám fotosyntézu a vznik říše rostlin. Plastid apikomplex a toxoplasmy však žádná fotosyntetická barviva neobsahuje. Jaká je tedy jeho funkce, je pro buňku esenciální, nepostradatelnou organelou? Skutečnost, že apikoplast se vyskytuje u všech apikomplex snad s výjimkou kryptosporidií naznačuje, že má specifické funkce. Jako ta nejvýznamnější se zdá být syntéza důležitých komponent buněčných membrán: mastných kyselin a izoprenoidů.
Jedním příkladem je metabolická dráha syntézy izoprenoidů, při níž jeden z klíčových meziproduktů (izopentenyl pyrofosfát) je syntetizován buď přes kyselinu mevalonovou (houby, živočiši) nebo alternativní cestou (bakterie, řasy, rostliny). Apicomplexa včetně toxoplasmy ztratily schopnost syntézy normální cestou a spoléhají na cestu alternativní, kterou jim zprostředkovává apikoplast. Blokáda apikoplastu proto dává naději nálezu radikální léčby toxoplasmosy a malárie, a dalších onemocnění působených prvoky apikomplexa. Díky apikoplastu je toxoplasma citlivá na herbicidy (na př. glyfosát) a řadu antibiotik (např.makrolidová antibiotika, rifampicin, klindamycin a j.). Právě při jejich aplikaci na toxoplasmu se ale objevila záhada: tyto látky působí toxoplasmacidně až po určité době, nezabraňují rozmnožení toxoplasem primárně vniklých do buněk hostitele. Tento jev dostal pojmenování "fenomén oddálené smrti" a jeho podstata byla relativně nedávno objasněna vynikajícími pokusy Davida Roose z pensylvánské univerzity.
Roos našel způsob, jak apikoplast fluorescenčně označit (expresí zeleně fluoreskujícího proteinu původem z medusy) a jak zablokovat jeho dělení. Při množení toxoplasem uvnitř buňky pak zůstává jediná počáteční buňka s apikoplastem a všechny další dceřinné buňky (tj.
4
několik set buněk vznikajících v jediné pseudocystě) nemají apikoplast. Tyto defektní toxoplasmy jsou schopny vniknout do nové buňky, ale nejsou schopny se v ní efektivně množit a posléze hynou. Zdá se, že defektní toxoplasmy nejsou schopny si v buňce vytvořit funkční růstovou komůrku (parazitoforní vakuolu), ve které se toxoplasma a apikomplexa uvnitř buněk normálně množí a která zprostředkuje metabolickou komunikaci mezi parasitem a hostitelem. To je efektní vysvětlení "fenoménu oddálené smrti": antibiotika zřejmě blokují dělení apikoplastu nebo jeho syntetické funkce. To se však projeví až při vstupu zoitu do nové buňky a potřebě látek pro vytvoření funkční sporoforní vakuoly. Dosavadní poznatky skutečně nasvědčují tomu, že apikoplast by mohl být tou slibnou Achillovou patou toxoplasmy i malarických plasmodií. Tak třeba lze aplikací antibiotika fosmidomycinu kompletně vyléčit myši infikované hlodavčí malárií působenou druhem Plasmodium vinckei právě díky inhibici jednoho z klíčových apikoplastových enzymů ne-mevalonátové dráhy syntézy izoprenoidů.
Zásadní důležitost apikoplastu také potvrzuje skutečnost, že do apikoplastu je z cytoplasmy buňky importováno složitým způsobem velké množství proteinů, u toxoplasmy celkem snad asi 300 (u plasmodií asi 550, a asi 10% genů má co do činění s apikoplastem!). Apikoplast je tedy pro buňku rozhodně užitečný. Paradoxně ale doufáme, že zároveň představuje "Achillovu patu" důležitých parazitů, kterými apikomplexa jsou. Je to proto, že apikoplast díky svému bakteriálnímu původu má řadu metabolických pochodů odlišných od buňky, ve které sídlí.
V současné době přibývají poznatky z biologie Toxoplasma gondii lavinovitým způsobem. Všechny ukazují na to, že díky milionům let evoluční historie se toxoplasma stala organismem nesmírně dokonale přizpůsobeným intracelulárnímu životu. Stále více se potvrzuje, že toxoplasma není pouhým cizím elementem v parazitované buňce, ale partnerem důmyslně buňku manipulujícím. Vstupem toxoplasmy do buňky (je podmíněn přítomností molekul cholesterolu v buněčné membráně!) je regulováno iontové prostředí buňky a buňka sama je chráněna proti apoptóze. Toxoplasma pak ovlivňuje buňku prostřednictvím membrány
parazitoforní vakuoly (má relativně velkou plochu - asi 30 µm2- a má množství výběžků do cytoplasmy hostitelské buňky). Po vstupu toxoplasmy do hostitelské buňky se kolem parazitoforní vakuoly shlukují hostitelské mitochondrie a endoplasmatické retikulum, je blokována fúze lyzosomů s parazitoforní vakuolou, v membráně parazitoforní vakuoly se tvoří póry a membrána parazitoforní vakuoly tak působí jako molekulární síto propouštějící pouze molekuly určité velikosti. Sporoforní vakuola, ač hostitelského původu, je tak v podstatě organelou a prodlouženou "rukou" parazita a tím, co anglický biolog Richard Dawkins nazývá "prodloužený fenotyp parazita". Bude tedy jistě zajímavé sledovat, zda se někdo pokusí pěstovat toxoplasmu v bezbuněčné kultuře. Podařilo se to, i když zatím jen dočasně, u malarických plasmodií, organizmu, kde jen pomyšlení na něco podobného se zdálo iluzorní. Proč tedy ne toxoplasma? Otevřelo by to jejímu výzkumu nevídané perspektivy.
5
Souputníci Toxoplasma gondii
Doc. MVDr. Břetislav Koudela, CSc.
Ústav parazitologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1-5, 612 42 Brno, e-mail: [email protected]
Vyhledáte-li ve významovém slovníku slovo „souputník“, naleznete tři významy. První z nich označuje vrstevníky, druhým synonymem je souběžec a třetím pak spolucestující. Ve vztahu k názvu a obsahu přednášky je těžké specifikovat jednotlivé významy slova souputníci. Cílem přednášky je poskytnout základní informace o dalších vícehostitelských kokcidiích, které jsou podobné původci toxoplasmózy, přičemž nelze jednoznačně určit, zda tito parazité jsou vrstevníky, souběžci či spolucestujícími kokcidie Toxoplasma gondii. Přesto se domnívám, že termín „souputníci“ je vhodnější než označení „příbuzní“, neboť specifikovat příbuzenský vztah Toxoplasma gondii k ostatním vícehostitelským kokcidiím je nesnadné. Klasická taxonomie, založená především na biologii a morfologii, zařazuje T. gondii a její souputníky do čeledi Sarcocystidae. Zástupci této skupiny jsou vícehostitelské kokcidie charakteristické tvorbou oocyst ve střevě konečného hostitele. Tyto oocysty jsou infekční pro jiný hostitelský organismus, tzv. mezihostitele, v jehož tkáních dochází k nepohlavnímu množení. Vývojový cyklus je založen na predaci mezihostitele jako kořisti definitivním hostitelem. Čeleď Sarcocystidae je rozdělována na dvě podčeledi a hlavním kriteriem je charakter vývojového cyklu a morfologie stádií v mezihostiteli a definitivním hostiteli. Zástupci první podčeledi Sarcocystinae jsou typičtí tvorbou tkáňových cyst ve svalovině (sarkocyst) (rod Sarcocystis) nebo CNS (rod Frenkelia). Po pozření těchto cyst specifickým definitivním hostitelem (predátorem) vznikají v jeho střevní sliznici tzv. sporocysty, které jsou infekční pro dalšího mezihostitele. Také člověk může být konečným hostitelem těchto parazitů. V případě, že člověk pozře tepelně neopracované maso s cystami Sarcocystis bovihominis, proběhne v jeho střevní sliznici pohlavní část vývoje, jejímž výsledkem je vylučování sporocyst stolicí. Obdobná situace může nastat v případě, kdy člověk zkonzumuje tepelně neopracované vepřové maso se svalovými cystami druhu Sarcocystis suihominis. Zástupci podčeledi Toxoplasmatinae vytvářejí cysty v různých tkáních mezihostitele a je také možné šíření infekce mezi různými mezihostiteli pozřením tkáňových cyst. Podčeleď Toxoplasmatinae zahrnovala donedávna rod Toxoplasma, pro který je typické nepohlavní množení v různých typech buněk, a rod Besnoitia s nepohlavním množením ve fibroblastech v podkoží mezihostitele. Po pozření tkáňových cyst vznikají ve střevě definitivního hostitele oocysty, které dozrávají ve vnějším prostředí a teprve poté jsou infekční pro mezihostitele. Později byly do podčeledi Toxoplasmatinae zahrnuty další vícehostitelské kokcidie nověji vytvořeného rodu Hammondia, které mají podobnou biologii jako T. gondii a liší se od ní především patogenitou. Infekce zástupci rodu Hammondia nebyly u člověka prokázány. V nedávné době došlo v názorech na souputníky T. gondii ke dvěma významným změnám. První změna byla vyvolána popisem nového druhu Neospora caninum a druhá použitím moderních genetických metod při posuzování fylogeneze a taxonomie kokcidií. Neospora caninum byla popsána jako nový druh v roce 1988, aniž by se znala důkladně biologie, rozšíření a praktický význam tohoto parazita. Výzkum tohoto parazita v posledních desetiletích prokázal dvě základní skutečnosti. Neospora caninum je častým původcem zmetání skotu a na šíření této
6
kokcidie se podílí pes. U mladých psů se infekce tímto parazitem může projevit jako obrna končetin nebo jako kožní onemocnění. Skot se nakazí pozřením oocyst z trusu psa. Zatímco u býků se infekce neprojevuje jako výrazné klinické onemocnění, u krav způsobuje zmetání v druhé polovině březosti. Nakažená kráva je celoživotně infikována a důsledkem infekce je opakované zmetání při další březosti. Přestože je N.caninum svou biologií a vlastnostmi velmi podobná T. gondii, nebyla neosporóza člověka zjištěna. Analýza sekvencí genů malé podjednotky (SSU) ribosomální RNA různých druhů čeledi Sarcocystidae prokázala rozdíly mezi podčeleděmi Sarcocystinae a Toxoplasmatinae, a současně potvrdila platnost taxonu Sarcocystidae. V rámci podčeledi Sarcocystinae však fylogenetická analýza zpochybnila platnost rodu Frenkelia, jehož zástupci jsou ve vztahu k zástupcům rodu Sarcocystis obdobně příbuzní jako jednotlivé druhy sarkocyst mezi sebou. Obdobně jsou zpochybňovány rody Neospora a Hammondia z podčeledi Toxoplasmatinae, jejichž příbuznost s T. gondii je obdobná jako příbuznost mezi jednotlivými druhy jiných kokcidií. Dalším výsledkem analýzy genů kokcidií je zjištění, že jednohostitelské střevní kokcidie rodu Isospora ze savců jsou velmi příbuzné T. gondii. Tuto skutečnost podporuje podobná morfologie oocyst zástupců obou skupin. Výsledky genetických analýz by mohly vyústit až v návrh na vytvoření a používání „nových“ jmen parazitů, např. Toxoplasma caninum (dnes Neospora caninum), Toxoplasma heydorni (dnes Hammondia heydorni) či Toxoplasma suis (dnes Isospora suis). Potom by termín toxoplasmóza měl zcela jiný význam než má v současnosti. Další výzkum T. gondii a jejích souputníků ukáže oprávněnost nových pohledů na systematiku a taxonomii vícehostitelských kokcidií.
7
Základní imunitní reakce proti infekci Toxooplasma gondii
RNDr. Petr Kodym, CSc.
Národní referenční laboratoř pro toxoplasmózu, CEM, Státní zdravotní ústav, Šrobárova 48, 100 42 Praha 10, email: [email protected]
Z toho, jak je člověk v porovnání s jinými tvory vůči invazi Toxoplasma gondii velice odolný (u dospělého imunokompetentního netěhotného jedince proběhne toxoplasmóza obvykle bez závažnějších příznaků a následků, aniž by bylo potřeba sahat k terapii), je zřejmé, jak je naše imunologická obrana vysoce účinná. A to navzdory vysoce sofistikovaným trikům, které intracelulární parazit proti hostiteli zkouší.
Imunitní odpověď (ale i sám parazit) má úplně jinou podobu v akutní a chronické či latentní fázi toxoplasmózy. V akutní fázi je většina toxoplasem ve stadiu tachyzoitů, které jsou schopny se rychle dělit a zaplavit všechny orgány hostitele. V expansi jim zpočátku téměř nic nestojí v cestě, specifická imunita není vytvořena. Buňky makrofágové řady neschopné toxoplasmy zabíjet jim slouží jako útočiště a jako „dopravní prostředek“ je rozvážejí po těle. Invazi čelí pouze méně účinné nespecifické (vrozené) prostředky: vedle slizniční imunity bránící pronikání toxoplasem do těla nesou hlavní tíhu NK buňky „přirození zabíječi“, které rovněž produkují interferon gama (IFN-γ). Ten bývá označován jako hlavní mediátor rezistence vůči toxoplasmám. Jeho účinky se brzy projeví – nejenže dále stimuluje NK buňky, ale společně s tumor necrosis faktorem alfa (TNF-α) aktivuje mikrofágy. Ty aktivací nabudou schopnosti toxoplasmy ničit a navíc produkcí cytokinů (včetně TNF-α) aktivují další prostředky imunitní obrany.
Až několik dní po infekci se objeví klony T buněk specificky odpovídajících na antigen Toxoplasma gondii. Klíčovou úlohu postupně přejímají CD8+T lymfocyty vázané na MHC 1 antigen parazitované buňky. Jsou schopny buňku i s parazitem lyzovat a produkují cytokiny potřebné k modulaci imunologického boje – mimo jiné i IFN-γ. Produkované cytokiny rovněž stimulují maturaci B buněk, které vyzrávají v plasmatické buňky schopné produkce protilátek specifických vůči toxoplasmovým antigenům. První protilátky (nejdříve třídy IgM, příp. IgA) lze zjistit 2-3 týdny po infekci, jejich hladiny prudce stoupají. Protilátky třídy IgG se objevují o cca. 1-2 týdny později a vzestup jejich hladin je výrazně pomalejší.
Aktivované mikrofágy, specifické T buňky, vysoká hladina IFN-γ a dalších cytokinů, stoupající hladiny specifických protilátek atd. vystaví tachyzoity (ty jsou sice agresivní, ale ve své podstatě značně citlivé a zranitelné) nesnesitelnému tlaku, kterému buď podlehnou, anebo včas, vedeny zlou předtuchou, totálně změní životní strategii – přemění se v bradyzoity a usadí se ve tkáni, do které ve „zlatých časech“ na počátku infekce doputovaly.
Infekce tak ovšem postupně přechází do latentní fáze. Toxoplasmy jsou jako vyměněné. Ty, které ve vybraných tkáních přežily (ne všude jsou podmínky stejně příznivé) se ukrývají v tkáňových cystách. Cysty jsou lokalizovány intracelulárně, navíc je jejich stěna maskována zbytky membrány hostitelské buňky a dalšími produkty hostitele. Imunitní systém hostitele si není jistý, jestli se jedná o element cizí či vlastní, navíc bradyzoity uvnitř mají minimální metabolismus a snaží se hostitele co nejméně provokovat. Hostitel proto proti cystám přímo neútočí, i když jejich produkty imunitu permanentně stimulují a ta je na obranu proti toxoplasmám dobře připravena. Pokud by některá cysta praskla a toxoplasmy se dostaly ven,
8
následoval by rychlý a účinný zásah aktivovaných makrofágú a dalších složek imunity. Klíčovou roli mají T lymfocyty, zejména CD4+, které též z velké části zabezpečují udržení potřebné hladiny IFN-γ. Cytokiny, a především IFN-γ a TNF-α, se zasloužily o zvýšenou prezentaci MHC1 na povrchu antigen prezentujících buněk, což klíčovou roli CD4+T lymfocytů podporuje - vazba na specifický antigen a na MHC1 je podmínkou jejich stimulace. Pokračuje tvorba protilátek, IgM postupně nahrazuje IgG, které nejprve rovněž cirkuluje ve velmi vysokých hladinách. Po odeznění akutní toxoplasmózy postačí nízké hladiny IgG, ovšem výrazně naroste avidita protilátek.
Při latentní toxoplasmóze se vytvoří zvláštní rovnováha mezi hostitelem a parazitem. Hostitel nemá prostředky na to, aby toxoplasmy zcela zlikvidoval. V podmínkách aktivované specifické imunity však parazit nemá šanci proliferovat a hostitele nepoškozuje. Projektivní imunita chrání infikovaného člověka i před zopakováním akutní toxoplasmózy při reinfekci. Imunita je pravděpodobně ve většině případů doživotní, lze ji prokázat sérologickým vyšetřením a/nebo například intradermálním testem s toxoplasmickým antigenem.
Idylické soužití hostitele a parazita může narušit pouze poškození imunity. Nutno zdůraznit, že pouze poškození velmi drastické, protože imunita má velkou rezervu (například pokles klíčových CD4+T lymfocytů při infekci HIV třeba na 1/5 původního stavu se obvykle neprojeví). Jakmile poklesne hladina IFN-γ a dalších klíčových nástrojů imunity pod kritickou mez, cysty popraskají, bradyzoity se zpětně změní v tachyzoity a může se zopakovat akutní fáze např. ve formě toxoplasmické encefalitidy.
Jelikož je Toxoplasma gondii parazit intracelulární, hrají v obraně proti ní hlavní roli mechanismy buněčné imunity. Samozřejmě že i protilátky zde mají svou funkci – např. při přestupu z tkáně do tkáně mohou tachyzoit opsonizovat a usnadnit tak jeho fagocytózu, mohou spustit jeho lýzi pomocí komplementu, mohou neutralizovat některé důležité produkty toxoplasem. Není náhodou, že antigeny, proti kterým se tvoří většina antitoxoplasmických protilátek, jsou z největší části produkty apikálního komplexu toxoplasem, nezbytné pro pronikání do buňky a tvorbu parazitoforní vakuoly.
Toxoplasmy jsou schopny u svého hostitele vyvolat imunosupresi. U HIV positivních pacientů jsou podezřívány ze zesilování účinku HIV na imunitu – ze stimulace přesmyku od původní odpovědi typu Th1 spíše k typu Th2, čímž se zhoršuje prognóza pacienta. Závažnost průběhu toxoplasmózy, vedle virulence kmene, záleží do značné míry na stavu imunity pacienta. U osob s problematickým průběhem toxoplasmózy je proto třeba pátrat po defektech imunity. Projeví se drobné nuance v prezentaci antigenu či schopnosti na ně odpovídat, ať už jsou způsobeny hormonálně (i proto je žen s těžším průběhem toxoplasmózy více než mužů) a geneticky (některé alely jsou spojeny s určitými klinickými formami toxoplasmózy). Více než u jiných patogenů se souboj Toxoplasma gondii a jejího hostitele odehrává a rozhoduje na poli imunologickém.
9
Kongenitální toxoplasmóza
RNDr. Karel Fajfrlík 1) , MUDr.Čestmír Beneš 2) , RNDr.Petr Kodym,CSc. 3)
1) Mikrobiologický ústav, Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova v Praze a Fakultní nemocnice
v Plzni; e-mail:[email protected] 2) Centrum pro analýzu epidemiologických dat, CEM, Státní zdravotní ústav Praha
3) Národní referenční laboratoř pro toxoplasmózu, CEM, Státní zdravotní ústav Praha
Kongenitální toxoplasmóza je vedle postižení imunokompromitovaných pacientů nejzávaž-nější formou tohoto onemocnění. Pouze u těchto forem totiž může dojít k velice vážným poškozením až k fatálním koncům. Definice říká, že se jedná o přenos nákazy z matky na plod jako následek: a) primoinfekce matky těsně před otěhotněním nebo v graviditě b) vzácně u imunosuprimovaných žen jako následek reaktivace latentního onemocnění (u
imunokompetentních žen k této variantě přenosu nedochází) Podíváme-li se na graf nemocnosti podle věku a pohlaví, vidíme, že u žen je nejvyšší výskyt právě „rizikové skupiny“ nastávajících matek. (Viz graf). (Otázka zní, zda to není způsobeno právě vyšším počtem vyšetření v této věkové skupině.) Většinou bývají tyto infekce inaparentní (až 90 %), a tak není varován ani lékař ani matka. Pokud se neprovádí sérologická vyšetření.
Z mnohaletých zkušeností a mnohých studií vyplývá, k jakým následkům může infekce (primoinfekce) ženy během gravidity vést. Rozvíjí se obrovská škála možností: A. plod není infikován B. dojde k infekci plodu
1. plod je infikován a narodí se zdravé dítě 2. narodí se „zdánlivě zdravé“ dítě a příznaky se objeví až po několika letech života
[hovoří se o poruchách zraku (ale stále méně často), problémech při vzdělávání atd.] 3. narodí se poškozené dítě (chorioretinitida, mikrocefalie, vnitřní hydrocefalus,
kalcifikace v mozku, jaterní poškození s ikterem, rozštěpové vady?, vrozená hluchota) 4. žena plod potratí
Dnes jsou známá i čísla, která vypočítávají pravděpodobnosti a rozsah poškození plodu při infekci v jednotlivých obdobích gravidity. Tak pravděpodobnost přenosu je nejnižší v prvním trimestru (10 – 15 %) a stoupá až k 65 % ve třetím trimestru. Naproti tomu jde rozsah poškození plodu, kdy nejvyšší je v prvním trimestru (těžké poškození nebo odumření plodu). Při přenosu infekce ve třetím trimestru dochází k rozvoji postižení výjimečně.
Mluvíme–li o problému, musíme říci, jak velký tento problém je a kolik máme případů. Ze známé studie dr.Paličky vyplývá, kolik asi můžeme očekávat případů na patřičný počet porodů. Tato studie říká, že je zhruba 5,1‰ (promile) těhotenství ohrožených toxoplasmózou, 2,8‰ žen se infikuje těsně před těhotenstvím (u těchto žen dojde k porodu poškozeného dítěte jen velice zřídka), 2,3‰ tvoří infekce v graviditě. Z nich 1,1‰ končí spontánním potratem a 1,2‰ porodem dítěte s kongenitální infekcí. Ale i tato čísla se v různých studiích liší. Jedno ale mají společné. Poslední dobou se jejich hodnota snižuje a nelze jednoznačně vyřknout závěr, zda je to díky prenatálnímu screeningu a následné terapii či nikoliv.
10
Podíváme-li se do zpráv CEM na hlášení o epidemiologické situaci v ČR (Komentáře podle měsíčních hlášení KHS), tak poslední rok, kdy zde byla toxoplasmóza komentována, byl rok 2000. Objevily se zde čísla s tímto zařazením: primoinfekce v graviditě – 19 případů, infekce v graviditě – 3 případy (asi nejpřesnější), gynekologická forma – 21 případů. Ani jedna kongenitální toxoplasmóza, ale 43 možných přenosů a výše jmenovaných následků. Takže zásadní otázka zní: „Jsme schopni vlastně dopátrat, kolik těchto onemocnění v ČR je?“ Asi ano. Od dr.Beneše (SZÚ) byla získána tabulka s počty různých forem infekce v jednotlivých letech (Tab.1).
V naší nedávné studii jsme ve spolupráci s infekční klinikou vyšetřili 385 těhotných žen, z nichž 30 bylo od titru 1:64 při pozitivitě imunoglobulinů IgM, někdy IgA. 3 byly bez terapie, 27 bylo léčeno. Jaký byl osud těchto sledovaných žen a jejich dětí: 3 x neznámý 16 x porod zdravého dítěte 8 x přerušení těhotenství ze zdravotní indikace 3 x předčasný porod 1 x těžké poškození plodu (nebylo v příčinné souvislosti s toxoplasmózou) 1 x narození živého dítěte, umírá do dvou hodin po porodu na těžké poškození plic
(nebylo v příčinné souvislosti s toxoplasmózou) 1 x hydrocephalus u dítěte ve třech měsících věku, prokázány pouze mateřské protilátky
Prokazatelná kongenitální toxoplasmóza ani jedna. Můžeme se pozastavit nad poměrně vysokým počtem interrupcí, ale nezřídka se stává, že rodiče jsou spíše tomuto zákroku nakloněni a hledá se pouze „zdravotní důvod“.
Otázka interrupce (ano či ne, popřípadě kdy a při jakých laboratorních výsledcích) je velice závažná. V Plzeňském kraji všechny „pozitivní ženy“ řeší genetická pracoviště. Vyjmeme-li výše zmíněnou skupinu, je samozřejmě strategie vždy taková, abychom využili všech diagnostických možností (vyšetření co nejširšího spektra protilátek, přímý průkaz pomocí metody PCR a je-li to možné, sledování vývoje plodu). Při vyslovení prognózy je hlavním problémem rozpoznat na 100% primární infekci, nemáme-li k dispozici vyšetření před graviditou.
Jaká je situace s vyšetřováním gravidních ve světě? Situace není přehledná a jednotná. Ve vyspělejších zemích Evropy se vyšetřuje téměř všude. Velká tradice je ve Skandinávii, Francii, Rakousku, zapojilo se Slovinsko. Omezené studie časově i místně však probíhají neustále v různých zemích (Belgie, USA). Problém je jeden hlavní – ekonomika versus etika. Zatímco v některých zemích ekonomové spočetli, že program vyšetřování gravidních žen na protilátky proti toxoplasmóze je jednoznačně ztrátový, jinde došli k závěrům, že zkalkulují-li náklady na narozené toxoplasmózou postižené dítě, vyplatí se preventivní vyšetřování. Výsledky těchto studií se v různých zemích někdy výrazně liší. V ČR tento program povinný není.
Ideálem je vyšetřit každou ženu 3x během gravidity (jednou v každém trimestru). Vezmeme-li v úvahu, že v ČR se séropozitivita u populace pohybuje mezi 25 až 38 procenty, zbytek žen je ohrožen. Málokdy je to možné, ale pro zjištění, do jaké kategorie žena patří, by bylo ideální, vyšetřit ji před otěhotněním.
Při detekci protilátek proti toxoplasmóze používáme komplement fixační reakci (KFR), a detekci imunoglobulinů IgM a IgA. Vyžádá-li si to situace, využíváme služeb nemocnice v Hradci Králové, kde provádí přímý průkaz pomocí PCR.
11
Nebudu se šířit o jednotlivých technikách a spoléhám na následující fundovanější přednášku dr.Kodyma. Jedno ale je jisté. Používáme-li zatracovanou a pro někoho zastaralou KFR, jsme schopni ušetřit na 100 vyšetření 30 000 “bodů“. Hodnotíme-li používané laboratorní metody, jeví se nám z hlediska průkaznosti, spolehlivosti, z hlediska podání co nejobjektivnějšího aktuálního obrazu imunitního stavu nemocného ve vztahu k toxoplasmóze nejlepší kombinace KFR jako screeningové metody a v návaznosti na její výsledky průkaz IgM, IgA, popřípadě IgE ELISA metodami.
Jaká je interpretace dosažených výsledků z hlediska dalšího laboratorního dohledu. (1) Negativní žena patří do „ohrožené skupiny“. Taková by se měla pravidelně vyšetřovat (3x během gravidity; ve Francii vyšetřují každý měsíc), a samozřejmě by měla být citlivým způsobem seznámena s možnostmi osobních preventivních opatření. (2) U žen s titrem 1:16 opakujeme vyšetření za 2-3 týdny, při stejném výsledku za 3 měsíce. Je pravděpodobně chráněna. (3) Ženy s titrem 1:32 a více: vyšetřujeme IgM a IgA, žádáme další krev za 2-3 týdny. Ani při vyšších titrech v KFR a pozitivitě IgM se nemusí jednat o akutní toxoplasmózu (až 5% žen si může držet vysoké hladiny těchto imunoglobulinů roky). (4) Při vysokých titrech KFR, pozitivitě IgM i IgA je žádoucí provést vyšetření PCR.
Řekl bych, že naše schéma je ještě poněkud přísnější než doporučované NRL. Toto schéma je nutné gynekologům neustále opakovat a připomínat. Velice často se stává, že gynekolog má v povědomí výsledky ostatních průkazů protilátek a negativní výsledek chápe jako výborný. Je bohužel běžné, že nemáme problémy s opakovaným vyšetřením žen s titrem (tudíž tzv. chráněných), ale často se neopakuje vyšetření negativních gravidních – nejohroženějších.
V naší oblasti vyšetřujeme systematicky gravidní ženy od roku 1990. V minulosti jsme obsáhli celou spádovou oblast (PM, PJ, PS, RO, DO). V současné době vyšetřuje protilátky proti toxoplasmóze 5 laboratoří. Od počátečních diskrepancí jsme se spontánně dostali do stavu, kdy každá pozitivní žena (vysoký titr v KFR, pozitivita IgM, IgA) je odeslána na infekční kliniku FN v Plzni nebo na některé genetické pracoviště (Ústav genetiky FN, Genetika Plzeň s.r.o.) a odtud k druhému laboratornímu vyšetření na naše pracoviště. Máme tak výhodu dvojího nezávislého vyšetření a tudíž minimalizace laboratorní chyby. Názory na terapii matky v těhotenství se rovněž různí. Francouzští odborníci se odvolávají na mnohaleté zkušenosti s terapií malárie pyrimethaminem a tvrdí, že lidský zárodek není ohrožen teratogenním účinkem při podávání terapeutické dávky. Doporučují tedy kombinaci pyrimethaminu (+ kyselina listová) a sulfadiazinu. Spiramycin používají pouze k zabránění přechodu T.gondii přes placentu. Nikoliv k vyléčení plodu.
V našem souboru byly matky v raném stadiu těhotenství léčeny monoterapií Rowamycinem v dávce 4,5 gramu denně po dobu 4 týdnů. Po ukončení organogeneze (16.týden) byl podáván Daraprim a kyselina listová. Sulfonamidy jsou používány s opatrností, neboť jsou v prvním a třetím trimestru kontraindikovány. Matky po přerušení těhotenství a předčasných porodech byly následně přeléčeny komplexní léčbou.
U dětí s kongenitální toxoplasmózou Francouzi doporučují pokračovat i po porodu (pyrimethamin + sulfadiazin) po dobu jednoho roku. První půlrok pouze pyrimethamin a sulfadiazin, druhý půlrok se po měsících střídá tato kombinace s podáváním spiramycinu. U subklinické kongenitální infekce se po dobu prvních šesti týdnů podává pyrimethamin a sulfadiazin. Pak pokračuje roční terapie v intervalech 4-6 týdnů střídáním spiramycinu s pyrimethaminem + sulfadiazinem.
12
V našem souboru máme pouze jedno dítě přeléčené kombinací spiramycinu s pyrimethaminem. Vývoj dítěte byl zcela normální. Takže nelze v našem případě mluvit o zkušenostech s terapií novorozenců. Podíváme-li se na názory odborníků v jiných zemích, najdeme i v těchto schématech mírné rozdíly.
Výše popsané zkušenosti patří mezi opatření tzv. sekundární prevence kongenitální toxoplasmózy. Té by samozřejmě měla předcházet primární prevence, která spočívá v osvětě populace jak této infekci zabránit. Tato opatření spočívají v důsledné hygieně potravy, vyloučení konzumace nedostatečně tepelně zpracovaného masa, důkladné omývání ovoce a zeleniny. Rovněž je nutné upozornit na zvýšenou pozornost a hygienu při kontaktu s kočkami.
Těchto informací není nikdy dost. Rozhodně by ale měla být poučena každá „toxo-negativní“ těhotná žena.
Když sledujeme všechna možná postižení plodu jako následek infekce matky během těhotenství, patří jednoznačně toxoplasmóza mezi závažná infekční onemocnění. Chceme-li poukázat na incidenci kongenitální toxoplasmózy, vidíme, že ve vyspělých státech díky různým opatřením toto číslo není nijak závratné a je argumentem v rukou odpůrců systematického screeningu. Ale možná je nízké právě díky tomuto vyšetřování.
Při diskusích s gynekology o jejich zkušenostech a názorech na zavedení povinného vyšetřování těhotných žen se často setkáváme s názorem, že vítají možnost tohoto vyšetřování, ale plošné zavedení se patrně v ČR prosadit nepodaří. Tabulka 1: Přehled toxoplasmóz hlášených v létech 1997-2003 v EPIDATu podle forem. Nízké počty hlášených primoinfekcí v graviditě, kongenitálních a očních toxoplasmóz svědčí pro to, že v některých oblastech se zdaleka ne všechny případy dostanou do hlášení.
13
rok
forma 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 Celkem
GYNEKOLOGICKA JINA 52 47 38 37 0 0 0 174
HEPATITIDA 3 4 0 1 0 0 1 9
INAPARENTNI 62 40 50 51 31 58 61 353
JINA 45 33 38 31 25 30 19 221
KONGENITALNI 11 2 3 3 4 5 2 30
MENINGOENCEFALITIDA 0 0 0 1 0 0 1 2
OCNI 37 30 41 31 24 29 34 226
PLICNI TOXO 3 0 0 0 0 0 2 5
PRIMOINF.V GRAVIDITE 27 24 20 38 33 39 23 204
U IMUNODEFIC. OSOBY 2 0 1 0 0 2 1 6
UZLINOVA 696 595 664 474 399 480 310 3618
Celkem 938 775 855 667 516 643 454 4848
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1-4 5-9 10-14 15-19 20-24 25-34 35-44 45-54 55-64 65-74 75 +
nem
iocn
ost
na
100
000
ob
yvat
el
Toxoplasmóza, ČR, 2003, nemocnost podle věku a pohlaví
muži
ženy
celkem
14
Diagnostika toxoplasmózy
RNDr. Petr Kodym, CSc.
Národní referenční laboratoř pro toxoplasmózu, CEM, Státní zdravotní ústav, Šrobárova 48, 100 42 Praha 10; email: [email protected]
Jelikož nelze žádná stadia Toxoplasma gondii zjistit ve stolici či moči a i výskyt tachyzoitů v krvi musíme považovat spíše za epizodický, nelze (až na malé, ale velice významné výjimky) při diagnostice toxoplasmózy spoléhat na metody přímého průkazu parazita. Hlavní tíhu rutinní diagnostiky proto stále nesou (a asi ještě dlouho ponesou) metody sérologické. Jejich nevýhodou a současně i výhodou je, že výsledky ve skutečnosti nevypovídají ani o přítomnosti ani o kvantitě parazitů, ale o tom, zda a jak hostitel proti nim tvoří protilátky.
Volba metod se řídí podle otázky, na kterou má vyšetření přinést odpověď. Tato otázka (a také základní údaje o pacientovi) by měla být zřejmá z průvodních dokladů zasílaných s materiálem k vyšetření. V některých případech (podezření na oční toxoplasmózu, předtransplantační vyšetření dárce a příjemce orgánů, HIV positivní pacienti, epidemiologické studie…) je důležité vědět, zdali je vyšetřovaná osoba infikována Toxoplasma gondii. V takových případech zpravidla postačí stanovení celkových protilátek (komplement fixační reakce (KFR), nepřímá imunofluorescenční reakce, Sabinův-Feldmanův test…) doplněná o stanovení antitoxoplasmických IgG. Jelikož se může jednat o pacienty se sníženou tvorbou protilátek, je vhodné použít citlivé metody a i nízce positivní výsledek již brát za bernou minci.
Pokud však potřebujeme zjistit, zdali potíže, na které si pacient stěžuje, jsou nebo nejsou zapříčiněny toxoplasmózou, výsledky (třeba i semikvantitativní) testu „ano/ne“ nám v případě positivního výsledku neodpovědí na otázku, zda jsme jen náhodou nenarazili na latentně infikovanou osobu (u nás asi 1/3 žen a ¼ mužů). A ani relativně vysoké hladiny protilátek nic neprokazují – titry KFR 1:256 a vyšší doprovázené stovkovými hladinami mezinárodních jednotek IgG se nezřídka objevují u osob, které prodělaly toxoplasmózu prokazatelně před několika lety a žádné klinické příznaky již dávno nemají.
Abychom mohli rozlišit, zdali má pacient akutní toxoplasmózu spojenou s klinickými příznaky a u těhotných žen s rizikem přenosu infekce na plod, musíme nasadit další testy. Za hlavní marker akutní toxoplasmózy bývá považována positivita antitoxoplasmických IgM. Skutečně platí, že negativní IgM akutní toxoplasmózu téměř vylučuje. Jenže IgM u většiny pacientů přetrvávají v positivních hodnotách déle než rok po infekci, poměrně často je můžeme zjistit i několik let po odeznění toxoplasmózy. Zavedením citlivých metod se tato doba ještě prodloužila. A tak naše studie ukázala, že pouze ve 43,3 % případů s positivním IgM se jednalo skutečně o akutní toxoplasmózu (viz tabulka 1). Obdobně vysokou citlivost a nízkou předpovědní hodnotu positivního výsledku vykázala i KFR (pokud byl za marker akutní toxoplasmózy považován titr 1:256 a vyšší), ELISA IgA byla jen o málo specifičtější a poněkud méně citlivá. Nezbývá tedy, než výsledky upřesnit doplňujícím vyšetřením vysoce specifickými metodami, které však mají nižší citlivost: stanovením avidity antitoxoplasmických IgG a/nebo IgE ELISA testem. Avidita IgG se používá k určení času infekce. Musíme však počítat s tím, že avidita dosáhne „vysokých“ hodnot během 3-4 měsíců bez ohledu na to, jestli u pacienta klinické příznaky odezněly anebo ještě přetrvávají. Nejlepší korelaci s klinikou (86% shoda) vyjádřenou nejmenším počtem falešně positivních plus falešně negativních výsledků vykazuje
15
IgE ELISA, jejíž positivita u většiny pacientů nepřetrvává déle než 6 měsíců. Bohužel u více než 5 % osob se protilátky třídy IgE v počáteční fázi toxoplasmózy netvoří vůbec nebo se tvoří se zpožděním.
Pokud po vyšetření základními i nadstavbovými metodami není jasné, zda se jedná či nejedná o akutní toxoplasmózu a nepomůže ani rozšíření spektra použitých metod, může pomoci pohled na kvantitativní výsledky. Při akutní toxoplasmóze bývají hladiny IgM výrazně positivní; pokud jsme zjistili hodnoty menší než alespoň dvojnásobek cut-off, půjde spíše o přetrvávající zbytkové protilátky. Naopak maximální hladiny IgG a titry KFR vyšší než 1:1024 nesvědčí pro počátek infekce a jsou charakteristické spíše pro postakutní fázi. V případě pochybností se doporučuje zopakovat vyšetření za 2-3 týdny, přičemž předchozí odběr by měl být znovu vyšetřen současně s odběrem novým, aby případný rozdíl nemohl být způsoben odlišnými podmínkami provedení testu. Prokazatelný vzestup titru KFR a/nebo hladin IgG či dokonce protilátek ostatních tříd je důkazem probíhající akutní toxoplasmózy; pokud se hladiny protilátek nezmění anebo zaznamenáme v některé třídě pokles, je toxoplasmóza již v pozdější fázi. Pokud ani opakování testu naše obavy nerozptýlí a jednoznačná interpretace se nenaskýtá, je lepší počítat s tím, že alternativa akutní toxoplasmózy není vyloučena a že například u těhotné ženy bude vhodné zahájit terapii. Nejasné vzorky je možno poslat ke konfirmaci do NRL.
Poměrně obtížná bývá diagnostika toxoplasmózy u novorozenců. Jelikož se obvykle jedná o děti matek, které mají vysoké hladiny antitoxoplasmických protilátek, pročež bylo u nich vzneseno podezření na primoinfekci v graviditě, lze u nich ve většině případů počítat s positivitou testů na celkové protilátky (třeba i vysoké titry KFR) a na IgG. Tyto protilátky mohou být přeneseny od matky. Dítě je třeba vyšetřovat paralelně s matkou. Jelikož protilátky třídy IgM neprocházejí placentou, znamená positivní výsledek testu na antitoxoplasmické IgM, že dítě je infikováno a tvoří si vlastní protilátky. Na rozdíl od diagnostiky akutní toxoplasmózy se zde musíme spokojit i s velmi nízkými hladinami těsně nad cut-off. Totéž platí pro IgA, které by rovněž nemělo placentou prostupovat; přesto se vyskytly názory (i naše zkušenosti v některých případech), které spolehlivost nízkých hladin IgA jakožto markeru infekce dítěte trochu zpochybňují. Moderní metodou pro tyto případy je Western blot (nejčastěji IgG), který porovnává tvorbu protilátek vůči jednotlivým frakcím antigenu Toxoplasma gondii u matky a dítěte. Pokud se na profilu dítěte vytvoří proužek u některé antigenní determinanty, na kterou matka nereaguje (anebo je u dítěte výrazně silnější než u matky), znamená to, že dítě si tvoří protilátky IgG vlastní, což svědčí pro jeho infekci.
Pokud se prvním vyšetřením infekce novorozence neprokáže, je vhodné pro jistotu vyšetření zopakovat za cca. 3-4 týdny, případně i opakovaně. Potvrdí se tak, že ani opožděně nezačalo dítě antitoxoplasmické IgM tvořit. IgG mateřského původu by mělo být postupně odbouráváno a měl by se zde projevit pokles hladin (vzestup by svědčil pro infekci). Neinfikované dítě by mělo být negativní na antitoxoplasmické IgG až za půl roku, při hodně vysokých hladinách možná i později.
Snadná není ani diagnostika oční formy toxoplasmózy. Zde je však rozhodující oftalmologický nález – zkušený oční lékař zpravidla pozná toxoplasmózu podle charakteristických lézí na sítnici. Sérologické vyšetření má jen podpůrný význam. Séropositivita svědčí pro toxoplasmovou etiologii postižení oka, je však docela dobře možné, že pacient je čirou náhodou positivní, aniž by to nějak souviselo s jeho očním nálezem. U séronegativních osob je toxoplasmová etiologie lézí na sítnici krajně nepravděpodobná, leč není zcela vyloučena. Oční toxoplasmóza obvykle propukne až za delší dobu po proběhnutí získané toxoplasmózy či jako opožděný následek toxoplasmózy kongenitální a jsou pro ní charakteristické spíše nízké titry celkových protilátek a nevysoké hladiny IgG s negativním nálezem IgA, IgE a IgM. Objevují se však i méně časté případy, kdy se postižení oka projeví
16
již v průběhu akutní fáze infekce nebo bezprostředně po jejím odeznění, takže IgM a někdy též IgA a IgE je při oční toxoplasmóze positivní.
Velký význam pro diagnostiku oční toxoplasmózy má zjištění, že se v oku spustila lokální produkce antitoxoplasmických protilátek. To lze prokázat vyšetřením oční tekutiny, nejlépe v porovnání se sérem. Vhodnou metodou je Western blot, princip je obdobný jako při vyšetřování novorozenců. Charakteristická bývá například tvorba lokálních protilátek proti 28kD antigenu (GRA-2); naopak u sérových protilátek bývá tento antigen bez výrazné odezvy. Své místo má i kvantitativní stanovení obsahu antitoxoplasmického IgG v oční tekutině. Jelikož je jeho obsah menší než v séru, je třeba vyšetřovat oční tekutinu co nejméně ředěnou (v NRL používáme 3 ředění: 1:100, 1:20 a 1:5). Pro porovnání proporce lokálních a systémových antitoxoplasmických protilátek se jejich obsah vždy nejprve vztahuje k obsahu veškerých imunoglobulínů G (např. v mg/ml)v materiálu a poté se vydělením hodnoty pro oční tekutinu hodnotou pro sérum vypočítá Goldmann-Witmerův koeficient. Za důkaz oční toxoplasmózy (s citlivostí 70%) se považuje koeficient 3 a vyšší. Výpočet komplikuje fakt, že oční tekutina vždy přichází ředěná a obvykle není přesně známo, v jakém poměru. Příliš se neosvědčila detekce toxoplasmické DNA v oční tekutině – různí autoři uvádějí citlivost metody jen 16 - 33%.
Pro prenatální diagnostiku toxoplasmózy má velký význam vyšetření plodové vody. I zde můžeme pátrat po protilátkách, které si plod tvoří sám a z výsledku usuzovat, je-li infikován. Co se týče „rušivého vlivu“ prostupu protilátek přes placentu, vhodných metod a interpretace výsledků, je zde situace obdobná jako při vyšetřování novorozenců, pouze nemůžeme počítat s poklesem hladin mateřských IgG a s možností vyšetření třeba i několikrát opakovat. Obsah protilátek v plodové vodě je navíc výrazně nižší než v séru. Proto především protilátky IgM stanovujeme z méně ředěných vzorků. V NRL vyšetřujeme při ředění: 1:100, 1:20 a 1:5 (poslední vysoká koncentrace je spíše jen pro srovnání, zde již nelze vyloučit nespecifickou positivitu) citlivými metodami; i zde se musíme smířit s tím, že výsledek bude nejspíše jen velmi slabě positivní. Plodová voda je jedním z mála materiálů (jako ještě mozkomíšní mok, případně i oční tekutina), jejichž vyšetřování si vyžaduje i metody přímé detekce toxoplasem, jmenovitě isolační pokus na zvířeti (materiál je inokulován do laboratorní myši, u které se sleduje, zda se infikovala toxoplasmózou) a také detekci toxoplasmové DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Positivní výsledek obou těchto metod znamená, že se v plodové vodě pohybují tachyzoity Toxoplasma gondii a že plod je s největší pravděpodobností infikován. Isolační pokus provádí NRL TOXO, PCR pracoviště Fakultní nemocnice Hradec Králové (dr.Zuzana Čermáková, ved. dr.Lenka Plíšková). Pro zachování citlivosti těchto metod je třeba, aby materiál byl dodán na místo vyšetření co nejrychleji, nebyl zbytečně ředěn, konzervován desinfekčními činidly nebo zmrazován. Pokud je to jen trochu možné, měla by být plodová voda odebrána před zahájením terapie. Už i první dávky léčiv mohou snadno zahubit (nečetné) tachyzoity v plodové vodě, DNA podléhá rychlé degradaci a výsledky testů pak mohou být falešně negativní.
Závěr: Žádná z používaných metod není dokonalá, každá má své výhody a nevýhody. Řešením jsou kombinace metod vhodné pro daný typ vyšetření. I při nasazení nejlepších kombinací špičkových metod však musíme počítat s tím, že se čas od času objeví případ (např. pacient aberantně odpovídající v důsledku poruchy imunity), který bude velice těžké jednoznačně interpretovat.
17
Tabulka 1: Parametry sérologických testů pro detekci akutní toxoplasmózy, zjištěné na základě vyšetření panelu celkem 491 anti-Toxoplasma positivních sér odebraných od osob s akutní (105) a latentní (386) toxoplasmózou. Za hlavní kritérium rozlišení akutní a latentní toxoplasmózy bylo zvoleno přetrvávání klinických příznaků – především zduření lymfatických uzlin. Byly použity soupravy TEST-LINE EIA IgA, IgE a IgM a ingredience pro KFR od firmy SEVAPHARMA; avidita IgG byla stanovena tříbodovým testem vyvinutým v NRL TOXO. Nelze však předpokládat, že při použití systémů od jiných výrobců se budou výsledky nějak zásadně lišit.
IgA (positivní)
IgE (positivní)
IgM (positivní)
Avidita IgG (nízká)
KFR (titr ≥ 256)
Citlivost (%)
96.2 94.3 98.1 72.4 97.1
Specificita (%)
82.6 91.7 65.0 97.7 64.5
Předpovědní hodnota positivního testu (%)
60.1 75.6 43.3 89.4 42.7
Předpovědní hodnota negativního testu (%)
98.8 98.3 99.2 92.9 98.8
18
Vliv latentní toxoplasmosy na lidský organismus
Doc. RNDr. Jaroslav Flegr, CSc.
Katedra parazitologie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze e-mail:[email protected]
Úvod Postnatálně získaná toxoplasmosa, na rozdíl od kongenitální toxoplasmosy, nepředstavuje u drtivé většiny imunokompetentních osob žádný vážnější zdravotní problém. Po krátké akutní fázi přechází u jinak zdravých osob do fáze latentní nákazy. Během ní parazité ve stádiu pomalu se množících bradyzoitů přetrvávají mnoho let ve formě tkáňových cyst především ve svalové a nervové tkáni. Nakažené osoby jsou zřejmě imunní vůči nové nákaze. Latentní toxoplasmosa je obvykle považována za bezpříznakovou. Některá starší pozorování a dále výsledky cíleně zaměřených studií provedených v posledních deseti letech však ukazují, že latentní toxoplasmosa může ve skutečnosti ovlivňovat zdravotní stav, psychiku a chování nakažených osob. Vliv latentní toxoplasmosy na výkonnost nakažených osob Pokusy prováděné na hlodavcích ukázaly, že zvířata dlouhodobě infikovaná prvokem Toxoplasma gondii vykazují horší výkony v testech psychomotoriky. Proto jsme se pokusili porovnat psychomotoriku nakažených a nenakažených osob. Pokusy byly provedeny na dárcích krve (dva nezávislé soubory) a na vojácích základní služby. Ve všech případech se ukázalo, že osoby s latentní toxoplasmosou dosahují statisticky významně horších výsledků než osoby zdravé. Rozdíly jsou minimální na začátku pokusu a projevují se výrazněji ke konci testů. To ukazuje že nakažené osoby mají zřejmě horší schopnost dlouhodobé koncentrace, dříve se unaví. Pokles výkonnosti je větší u osob s nižšími titry protilátek. To ukazuje, že se negativní vlivy toxoplasmosy s délkou infekce patrně prohlubují. Vliv latentní toxoplasmosy na riziko dopravní nehody Zhoršená schopnost dlouhodobé koncentrace a prodloužené reakční časy nakažených osob se mohou v běžném životě projevit ve zvýšeném riziku dopravních nehod. Proto jsme provedli studii případů a kontrol zaměřenou na odhalení tohoto efektu. Výsledky ukázaly, že mezi 146 obětmi dopravních nehod, chodci i řidiči, je signifikantně vyšší zastoupení osob s latentní toxoplasmosou než v kontrolním vzorku lidí žijících na stejném území. Po statistickém odfiltrování vlivu věku a pohlaví osob v obou vzorcích se ukázalo, že nakažené osoby mají přibližně 2,6 × větší riziko dopravní nehody než osoby nenakažené. Vliv latentní toxoplasmosy na psychiku nakažených osob Tkáňové cysty parazita Toxoplasma gondii se u dlouhodobě nakažených osob vyskytují v mozkové tkáni. U hlodavců bylo přitom zjištěno, že parazit mění chování nakažených jedinců. Pozorované změny se většinou interpretují jako cílená manipulace ze strany parazita zvyšující pravděpodobnost jeho přenosu z mezihostitele (hlodavce) do definitivního hostitele (kočkovité šelmy) prostřednictvím predace. V našich studiích jsme se snažili prokázat korelaci latentní
19
toxoplasmosy a posunu ve psychice infikovaných osob. Použili jsme jednak Cattelův 16 faktorový dotazník a jednak Cloningerův TCI dotazník. Celkem jsme studovali 9 nezávislých souborů čítajících od 200 do 3000 osob. V osmi z devíti studií jsme prokázali statisticky významné rozdíly v osobnostních faktorech nakažených a nenakažených osob. Tyto rozdíly se většinou lišily u mužů a u žen, obvykle probíhaly u obou pohlaví dokonce v opačných směrech. Nakažené ženy byly v průměru společenštější, vřelejší, lehkovážnější, důvěřivější, naproti tomu nakažení muži byli uzavřenější, podezřívavější, neochotní respektovat společenské normy. U mužů i žen se projevovala nižší tendence vyhledávat nové podněty. Tento faktor je významný tím, že by jeho úroveň měla negativně korelovat s bazální hladinou neurotransmiteru dopaminu v mozku. Zvýšená hladina dopaminu byla zjištěna u myší dlouhodobě nakažených prvokem Toxoplasma gondii. Vysoká hladina dopaminu v příslušných partiích mozku se zároveň považuje za možnou příčinu schizofrenie. Řada studií přitom opakovaně prokázala zvýšenou frekvenci toxoplasmosy u psychiatrických pacientů se schizofrenií případně korelaci toxoplasmosy i schizofrenie se stejným rizikovým faktorem, chovem kočky. Je proto možné, že parazitem indukovaný vzestup hladiny dopaminu v některých partiích mozku nakažených osob by mohl hrát roli při vzniku některých forem schizofrenie. Vliv latentní toxoplasmosy na chování nakažených osob Osobnostní rozdíly zjišťované pomocí psychologických dotazníků nemusí pravdivě odrážet chování osob ve skutečném životě. Proto jsme velký soubor osob otestovaných na latentní toxoplasmosu podrobili dvojnásobně slepé observační studii a panelu jednoduchých behaviorálních pokusů zaměřených na chování, které by mohlo odrážet změny ve faktorech, jimiž se nakažené a nenakažené osoby lišily v dotazníkových studiích. Výsledky ukázaly, že infikovaní muži jsou méně svědomití a spolehliví, například se méně přesně dostavují na sjednané vyšetření, hůře se oblékají a méně pečují o svůj vzhled. Naproti tomu infikované ženy jsou spolehlivější a svědomitější, nosí novější a dražší oblečení a lépe pečují o svůj vzhled. Infikovaní muži i ženy mají méně uvolněné držení těla v průběhu rozhovoru a mají pomalejší pohyby a dokonce i déle vyplňují počítačové dotazníky. Změny chování měřené v pokusech a observačních studiích jsou výraznější, než změny v psychice zjišťované pomocí dotazníků. Vliv latentní toxoplasmosy na průběh těhotenství infikovaných žen Naše výsledky neukázaly, že by latentní toxoplasmosa signifikantně zvyšovala riziko potratu nebo snižovala porodní váhu novorozených dětí. Těhotenství toxoplasma-pozitivních matek však trvá signifikantně déle než těhotenství matek nenakažených a v jeho průběhu dochází k pomalejšímu růstu plodu. Nejvýraznější rozdíl mezi nakaženými a nenakaženými ženami se týká posunu v pohlavním indexu nakažených dětí. Nakaženým ženám se rodí přibližně dvakrát tolik chlapců než dívek. Závěr Cíleně zaměřené studie ukazují, že latentní toxoplasmosa významně ovlivňuje organismus infikovaných osob. Většina změn se projevuje změnami chování nakažených osob a nemá charakter zhoršování zdravotního stavu. Na individuální úrovni jsou tyto rozdíly překryty přirozenou vnitropopulační variabilitou. Jestliže je však sledujeme na větších souborech osob lišících se vzájemně právě jen přítomností či nepřítomností infekce, projevují se v řadě sledovaných parametrů a často i velmi výrazně. Vzhledem k vysoké prevalenci toxoplasmosy v populaci tak může mít latentní toxoplasmosa podstatně větší význam, než se obvykle předpokládá.
20
LITERATURA Flegr J, Hrdý I (1994). Influence of chronic toxoplasmosis on some human personality factors. Folia Parasitol. 41:122-126 Flegr J, Zitková Š, Kodym P, Frynta D (1996). Induction of changes in human behaviour by the parasitic protozoan Toxoplasma gondii. Parasitology, 113:49-54
Flegr J, Havlíček J (1999). Changes in the personality profile of young women with latent toxoplasmosis. Folia Parasitol. 46:22-28 Flegr J, Kodym P, Tolarová V (2000). Correlation of duration of latent Toxoplasma gondii infection with personality changes in women. Biol.Psychology 53:57-68 Havlíček J, Gašová Z, Smith AP, Zvára KJ, Flegr J (2001). Decrease of psychomotor performance in subjects with latent “asymptomatic“ toxoplasmosis. Parasitology 122:515-520 Flegr J, Havlíček J, Kodym P, Malý M, Šmahel Z (2002). Increased risk of traffic accidents in subjects with latent toxoplasmosis: a retrospective case-control study. BMC Infectious Diseases 2:1-13 Flegr J, Preiss M, Klose J, Havlíček J, Vitáková M, Kodym P .Decreased level of psychobiological factor novelty seeking and lower intelligence in men latently infected with the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Dopamine, a missing link between schizophrenia and toxoplasmosis? Biological Psychology, 63, 253-268.
21
Toxoplasmová encefalitida u AIDS
MUDr. Hanuš Rozsypal, CSc.
III. klinika infekčních a tropických nemocí 1. LF UK v Praze; e-mail:[email protected]
Toxoplasmová infekce je častou příčinou encefalitidy u pacientů s AIDS. V USA se vyskytuje u 3-10% pacientů s AIDS, v evropských zemích je incidence vyšší, což je dáno i vyšší séroprevalencí toxoplasmózy. V rozvinutých zemích je zaznamenán trend snížení výskytu díky profylaxi pneumocystové pneumonie cotrimoxazolem a efektem vysoce aktivní antiretrovirové terapie (HAART). Toxoplasmová encefalitida u pacientů s AIDS vzniká reaktivací latentní toxoplasmové infekce. Tachyzoity se krátce po expozici dostávají do mnoha tkání, zejména do mozku, a zde přežívají ve formě cyst. V podmínkách imunodeficitu toxoplasmy v cystě začínají proliferovat; základní význam pro reaktivaci infekce má selhání funkce buněk produkujících interferon-γ (IFN-γ), a to nejen T lymfocytů, ale i dalších lymfocytů, NK buněk a neidentifikovaných producentů interferonu-γ. (1) V mozku dochází k formaci abscesů, nezřídka mnohočetných. Vznik difúzní encefalitidy je rovněž možný, ale neobvyklý. Příznaky: Onemocnění začíná pozvolna během několika týdnů, vzácně je začátek náhlý. K hlavním subjektivním příznakům patří bolest hlavy (někdy lokalizovaná), slabost až porucha hybnosti končetin a porucha vědomí (dezorientace, kóma) nebo porucha kognitivních funkcí (psychotické příznaky). Jindy se onemocnění ohlásí záchvatem křečí (většinou jacksonského typu). Často bývá horečka. Objektivně je významným fokální neurologický nález - podle lokalizace lézí se objevuje hemiparéza, parézy mozkových nervů, hemisenzitivní výpadek, intenční tremor či ataxie. Pro mozkovou toxoplasmózu charakteristická choreoatetóza je vzácná. Meningeální jevy bývají jen vzácně pozitivní. Diagnóza se stanoví z klinického obrazu a typického nálezu na CT či MRI vyšetření. Diagnózu potvrdí dobrý efekt léčby po 2, popř. 3 týdnech, kdy dojde ke klinickému zlepšení a zmenšení mozkových lézí ve zobrazovacích vyšetřeních (na MRI do 2 týdnů). Sérologie toxoplasmózy – průkaz anamnestických protilátek – dovoluje identifikovat riziko diagnózy u sugestivního klinického obrazu a nálezu při CT či MRI vyšetření. Mozková biopsie se vyžaduje jen při diagnostických rozpacích a špatném efektu léčby. Vzhledem k dobrým výsledkům léčby se protitoxoplasmová kombinace nasazuje i v případech, že diagnóza je méně pravděpodobná. Lumbální punkce se plánovaně neprovádí (může být dokonce nebezpečná). Pokud se uskuteční z jiných důvodů, likvor je možné vyšetřit na přítomnost DNA metodou PCR. Specifita je vysoká, ale senzitivita jen asi 50%. Větší význam má molekulárně biologický průkaz EBV DNA svědčící pro mozkový lymfom (zde se uvádí i vysoká senzitivita). Diferenciální diagnóza: Nejpodobnější CT či MRI obraz poskytuje primární mozkový lymfom. Rozdíly v CT obraze uvádí tabulka č. 1. Z ostatních ložiskových lézí mozku mohou HIV infikované postihnout zejména progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML) a ischemická cévní mozková příhoda, raritně tuberkulomy či kryptokokomy, bakteriální absces mozku a některé mozkové tumory či nádorové metastázy. (2)
22
Tab. 1. Diferenciální diagnostika fokálního postižení mozku u HIV infikovaných Diagnóza Toxoplasmová
encefalitida Primární lymfom mozku
Progresivní multifokální leukoencefalopatie
Podíl na výskytu
70% 20% 10%
Počet lézí multifokální, často bilaterální
solitární, unilaterální
multifokální, bilaterální
Lokalizace medulokortikální junkce
periventrikulární bílá hmota
bílá hmota
Expanzívní chování bývá bývá Není Postkontrastní lem obvykle přítomen někdy Není Normální CT vzácně bývá Není
Prognóza onemocnění je bez léčby vždy infaustní, včasná léčba bývá úspěšná. Terapie: Nejúčinnějším léčebným režimem je kombinace pyrimethaminu se sulfadiazinem. Vzhledem k hematotoxicitě pyrimethaminu se přidává kalcium folinát (Leucovorin Ca) 15mg/d (1x/d) p.o., event. i.m. V akutní fázi stejně účinnou léčbou je kombinace pyrimethaminu s klindamycinem, nevýhodou je ale vyšší riziko recidivy při přechodu na chronickou supresívní terapii. (3) Dalšími alternativami – vždy lépe v kombinaci s pyrimethaminem – jsou atovaquon, claritromycin, azitromycin, doxycyklin, minocyklin, dapson nebo co-trimoxazol, 5-fluorouracil s klindamycinem nebo pyrimethamin v monoterapii. Délka útočné fáze léčby se řídí ústupem klinických obtíží a regresí nálezu na CT či MRI, obvykle však trvá 6 (4-8) týdnů, u alternativních režimů by léčba rozhodně neměla být kratší než 6 týdnů. Tab. 2. Dávkování léčiv v terapii mozkové toxoplasmózy pyrimethamin (Daraprim) bolus 200mg p.o., dále 75 (50-100) mg/d (1x/d) p.o. sulfadiazin (Sulfadiazin) 4(-6) g/d (4x/d) p.o. klindamycin (Dalacin C Phosphate) 2,4-4,8 g/d (4x/d) p.o., event. 1,8-2,4 g/d (4x/d) p.o. atovaquon (Wellvone, Mepron) 4x 750 mg/d p.o. (s jídly) clarithromycin (Klacid) 1 g/d (2x/d) p.o. azitromycin (Sumamed, Azithrox) 1,0-1,5 g/d (1x/d) p.o. dapson (Disulone) 100 mg/d (2x/d) p.o.
Protitoxoplasmová chemoterapeutika jsou účinná proti tachyzoitům, ale ne proti cystám. To je důvod nutnosti celoživotní protirelapsové léčby po prodělané toxoplasmové encefalitidě. Sekundární profylaxe, resp. chronická supresívní terapie se provádí obvykle monoterapií pyrimethaminem 50mg/d nebo kombinací pyrimethaminu 25-50mg/d se sulfadiazinem 4x 0,5-1 g/d či klindamycinem 3-4 x 300-450mg/d. Jsou popisovány i experimentální režimy s azitromycinem (4), klaritromycinem nebo kombinací atovaquonu s pyrimethaminem (5). Udržovací terapii je možno ukončit 6 měsíců po dosažení počtu CD4+ lymfocytů nad 200/µl. (6)
23
Při mozkovém edému se podává dexamethazon 2-4x 8 mg/d i.v. 5 dní. Steroidy mohou vést k přechodnému zlepšení u mozkového lymfomu, což může být chybně interpretováno jako účinek protitoxoplasmové léčby a nádor považován za mozkovou toxoplasmózu. K symptomatickým opatřením patří podání manitolu, analgetik, antikonvulzív apod. Profylaxe: Primární profylaxe je indikována při poklesu CD4+ lymfocytů pod 150/µl a pozitivních titrech proti toxoplasmóze. Podává se cotrimoxazol 1x 960 mg/d jako současná profylaxe pneumocystové pneumonie. Alternativou je dapson 1x 50-100 mg/d nebo 1x 200 mg/týden s pyrimethaminem 1x 50-75 mg/týden a leucovorinem 1x 25 mg/týden, popř. sulfadoxin s pyrimethaminem v preparátu Fansidar 1-2 x 525mg/týden. (7) Obecně prevence toxoplasmózy u osob s imunodeficitem zahrnuje požívání důkladně tepelně zpracovaného masa a vyloučení kontaktu s kočkami. LITERATURA (1) Suzuki Y. Immunopathogenesis of cerebral toxoplasmosis. J Infect Dis 2002;186 Suppl 2:S234-S240 (2) Walot I, Miller BL, Chang L, Mehringer CM. Neuroimaging findings in patients with AIDS. Clin Infect Dis 1996;22:906-919 (3) Katlama C, De Wit S, O'Doherty E, Van Glabeke M, Clumeck N. Pyrimethamine-clindamycin vs. pyrimethamine-sulfadiazine as acute and long-term therapy for toxoplasmic encephalitis in patients with AIDS. Clin Infect Dis 1996;22:268-275 (4) Jacobson JM, Hafner R, Remington J, et al. Dose-escalation, phase I/II study of azithromycin and pyrimethamine for the treatment of toxoplasmic encephalitis in AIDS. AIDS 2001;15:583-589 (5) Chirgwin K, Hafner R, Leport C, et al. Randomized phase II trial of atovaquone with pyrimethamine or sulfadiazine for treatment of toxoplasmic encephalitis in patients with acquired immunodeficiency syndrome: ACTG 237/ANRS 039 Study. AIDS Clinical Trials Group 237/Agence Nationale de Recherche sur le SIDA, Essai 039. Clin Infect Dis 2002;34:1243-1250 (6) Kirk O, Reiss P, Uberti-Foppa C, et al. Safe interruption of maintenance therapy against previous infection with four common HIV-associated opportunistic pathogens during potent antiretroviral therapy. Ann Intern Med 2002;137:239-250 (7) Masur PH, Kaplan JE, Holmes KK. Guidelines for preventing opportunistic infections among HIV-infected persons-2002: Recommendations of the U.S. Public Health Service and the Infectious Diseases Society of America. Ann Intern Med 2002;137:435-478
