SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ)

METODY

•využívají se k izolování (separaci) dokazované nebo stanovované

složky z analyzované směsi a k odstranění rušivých (interferujících)

komponent analyzovaného roztoku (účel získání čistých složek)

•Separace (dělení) → operace, při níž se vzorek dělí alespoň na dva

podíly odlišného složení

• k získání co nejčistší biologické látky v dostatečném množství.

Dříve – dílo náhody, dnes – vysoce racionální postup.

Podmínka oddělení dvou látek – odlišnost alespoň v jedné fyzikální nebo chemické vlastnosti. Např.

•v bodu varu - destilace, lyofilizace,

•v rozpustnosti – krystalizace, srážení, extrakce,

•v rozdělovací konstantě – rozdělovací chromatografie LLC, GLC,

•v disociační konstantě – chromatografie na iontoměničích,

•v iontové pohyblivosti – elektroforéza,

•ve velikosti a hmotnosti molekul – centrifugace, gelová chromatografie, dialýza, ultracentrifugace.

Po separaci se mohou tyto složky:

•izolovat,

•kvalitativně nebo kvantitativně vyhodnocovat záznam jejich

rozdělení.

•Nejjednodušší separace – destilace, sublimace, filtrace.

•V mezních případech se využívají mnohastupňové separační

metody. Jejich provedení povětšině bývá kontinuální.

Hodnocení dokonalosti a účinnosti dělení

distribuční poměr D.

distribuční koeficient.

rozdělovací poměr koncentrační Dc.

IAc

IIAc

CD

)(

)(

•Rozdělení separačních metod

Metody založené na různé:

• distribuci jednotlivých složek mezi dvě fáze

• rychlosti pohybu jednotlivých složek v téže fázi

rozdělovací poměr hmotnostní Dm

I

II

mAm

AmD

)(

)(

m(A) je hmotnost složky A v příslušné fázi I nebo II.

Distribuční koeficienty se užívají nejčastěji v chromatografii

V chromatografii je fází II fáze stacionární a fází I fáze mobilní.

mI

sII

gVAm

mAmD

/)(

/)(

ms - hmotnost sušiny stacionární fáze v gramech

Vm - objem mobilní fáze v ml,

mI

cII

vVAm

VAmD

/)(

/)(

Vc je objem náplně kolony v ml

mI

sII

sVAm

AAmD

/)(

/)(

As - povrch stacionární fáze (sorbentu) v m2.

distribuční nebo rozdělovací konstanta KD.

V tomto případě platí, že c(A)I = A I a c(A)II = A II, takže

I

II

DA

AK

fáze vodná- považujeme za fázi I,

fází II organické rozpouštědlo, při výměně iontů měničová

fáze, při adsorpci adsorbent.

výtěžek dělení R:

III

II

pů

II

AmAm

Am

Am

AmR

)()(

)(

)(

)(

m(A)pů - hmotnost látky A ve vzorku před dělením.

Dělení lze několikrát (n-krát) opakovat, potom výtěžek dělení

Rn je

n

nRR )1(1

Z tohoto vztahu lze vypočítat, kolikrát je třeba dělení

opakovat, aby se dosáhlo výtěžku Rn, je-li výtěžek jedné

separace R

)1log(

)1log(

R

Rn n

1)(/)(

)(/)(

)(/)(

)(/)()(

)( BD

AD

III

III

I

II

c

c

BcBc

AcAc

BcAc

BcAc

Veličina - separační faktor

pů

pů

BA

II

II

Bm

AmS

Bm

Am

)(

)(

)(

)(/

m - hmotnost oddělené složky

mpů - hmotnost téže složky ve vzorku před dělením.

obohacovací faktor

B

A

BAR

RS

/

Separační metody založené na fázových

rovnováhách

Fázový diagram

Fázový přechod je fyzikální

pojem, označující skokovou

změnu makroskopických

vlastností termodynamického

systému (fáze) při změně

termodynamické proměnné

(např. teploty).

fázový diagram jednosložkové soustavy (vody)

Separační metody založené na fázových

rovnováhách

Extrakce

• selektivní separační metoda založená na přenosu látky z jedné

kapalné fáze do druhé, která je v podstatě nemísitelná s první fází

• použitelná pro vzorky kapalné i tuhé (přenos z pevné fáze do

kapalné), pro org. látky a biochemické materiály

• provedení v děličce (nejjednodušší), v extraktoru (např. Soxhletův)

Požadavky na extrakční činidlo

•musí být nemísitelné nebo omezeně mísitelné s původním

rozpouštědlem

• mělo by lépe rozpouštět extrahovanou složku než původní

rozpouštědlo

•nemělo by být hořlavé, drahé a korozívní

•v potravinářství nesmí být jedovaté, životu nebezpečné

EXTRAKCE

Převod dané látky z tuhého nebo kapalného homogenátu do

kapaliny.

Základní typy extrakcí:

Pevná fáze → kapalina

Macerace – luhování do jedné dávky kapaliny při normální

teplotě,

Digesce – luhování do jedné dávky kapaliny při zvýšené teplotě

(čaj),

Perkolace – luhování za normální teploty do protékající kapaliny,

Kontinuální extrakce – perkolace v průmyslovém provedení.

EXTRAKCE

Pevná fáze → kapalina

REALIZACE

Zabezpečení dobrého kontaktu mezi fázemi(přenos hmoty):

•TŘEPÁNÍ (A ZÁHŘEV) –třepačka(vyhřívaná)

•HOMOGENIZACE –homogenizátory

•SONIKACE –ultrazvuk

•VAR POD ZPĚTNÝM CHLADIČEM –reflux rozpouštědla

(termostabilní analyty)

Vyluhování s nuceným tokem (Forced-FlowLeaching)

•vzorek naplněn do ocelové kolony, kterou je pumpováno za

zvýšeného tlaku extr. rozpouštědlo při záhřevu k jeho b. varu

•výsledky srovnatelné se Soxhletovou extrakcí, ale rychlejší

EXTRAKCE

Pevná fáze → kapalina

Soxhletova extrakce

•pevný vzorek umístěn do Soxhletovy extrakční patrony (tvrzený

filtrační papír nebo sklo s fritou místo dna)

•patrona umístěna do Soxhletovy aparatury; rozpouštědlo po

záhřevu na svůj bod varu kondenzuje v patroně, vymývá

analyty,vrací se s nimi do varné baňky, opět se odpařuje...

•POČET CYKLŮ/ hod

•max.teplota omezena b.varu rozpouštědla (stabilita analytů)

•Složení extrakční směsi v roztoku nemusí odpovídat složení v

parách HEX:ACET (1:1) x AZEOTROP (3:1)

•vysoká výtěžnost x velice pomalé

•dobře zavedená metoda, relativně nenáročná a levná

Aparatura pro extrakci

Chladič

Soxhletův extraktor

Varná baňka

Extrakční patrona se

směsí pro extrakci

Funkce extraktoru

Při zahřívání baňky jsou páry rozpouštědla vedeny spojovací

trubicí do chladiče, kde kondenzují.

Kondenzované rozpouštědlo stéká na extrahovanou směs

v patroně, rozpouští ji a hromadí se v extrakčním prostoru.

Když hladina roztoku dosáhne horního ohybu patrony, steče

zpět do varné baňky.

Z baňky se opět odpařuje rozpouštědlo a celý proces se

opakuje.

Na extrahovanou směs tak působí stále nové rozpouštědlo, je

tedy možné dosáhnout dokonalé extrakce poměrně malým

množstvím rozpouštědla.

Pevná fáze → kapalina

Extrakce podporovaná mikrovlnným ohřevem (Microwave-

Assisted Solvent Extraction, MASE)

Mikrovlny –elektromagnetické vlnění, frekvence 300 MHz –300

GHz, používaná frekvence 2450 MHz

Pevná fáze → kapalina

MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)

Používaná frekvence 2450 MHz:

Záhřev – dipól rotace-molekuly s vysokou dielektrickou

konstantou se snaží orientovat v el. poli, to se ale mění tak rychle,

že začnou vibrovat a v důsledku tření (srážky sousedních molekul)

se zahřívat.

Jiná frekvence nezpůsobí

záhřev:

↓frekvence molekuly se

zorientují

↑frekvence molekuly se ani

nezačnou orientovat

Pevná fáze → kapalina

MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)

•Rozpouštědlo absorbující mikrovlnnou energii

rozpouštědlo se v uzavřené nádobě zahřívá nad bod varu,

urychlení extrakce analytu-vysoká teplota a tlak (do 200oC a 175

psi (libra síly na čtverečný palec) = 1,2.106 Pa = 12,3 at)

•Rozpouštědlo neabsorbující mikrovlnnou energii

rozpouštědlo se nezahřívá, selektivní záhřev určitých látek ve

vzorku→uvolnění zahřátých analytů do chladné kapaliny

uzavřená či otevřená nádoba

mírnější-pro termolabilní látky

možnost použití kapalného CO2-neabsorbuje, náhrada SFE (↓p, t)

Pevná fáze → kapalina

MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)

Body varu a teploty rozpouštědel v nádobce:

Pevná fáze → kapalina

MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)

Záhřev rozpouštědel v závislosti na čase:

Pevná fáze → kapalina

MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)

Fokusované pole:

-μ-vlny zacíleny na dno nádobky se vzorkem, hrdlo chladné

-účinný reflux (možný přídavek reagencií), magnet. míchadlo

-μ-vlnná frekvence: 2450 MHz, proměnný výkon 30 -300 W

-0,1 -15 g vzorku, cca 30 -50 ml rozpouštědla, do 30 min

Pevná fáze → kapalina

MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)

Výhody:

-malá množství rozpouštědel (30 -50 ml)

-rychlost(minuty x hodiny Soxhletova extrakce)

–přímý záhřev vzorku, ne nádoby

-účinnost,reprodukovatelnost

-selektivita -lze ovlivnit výběrem rozpouštědla, dobou záhřevu

-lokální záhřev a selektivní extrakce a migrace určitých

látek z matrice do rozpouštědla

X

Soxhletova extrakce záhřev celé matrice a difùze

rozpouštědla do matrice

-simultánní extrakce více vzorků

Kapalina → kapalina

Vytřepávání – jedinou dávkou (lepšího) rozpouštědla (dnes již

téměř nepoužívané),

Perforace – (lepší) rozpouštědlo, do něhož má přejít dělená látka

je v neustálém oběhu. Prostupuje kapalným homogenátem,

odebírá z něj dělenou látku a hromadí se v oddělené baňce. V ní

se odpařuje a po kondenzaci v chladiči prostupuje homogenátem

znovu. Dělená látka se hromadí v destilačním zbytku.

Roztřepávání – jedna z prvních účinných metod umožňující

dělení látek, jejichž rozdělovací konstanty jsou velmi podobné.

Jejím zdokonalením je

Rozdělovací chromatografie (bude probráno později).

Kapalina → kapalina

Princip dělicích metod při přechodu kapalina → kapalina:

Požadovaná látka je (spolu s dalšími látkami) v kapalném

homogenátu – v nějakém rozpouštědle použitém při homogenizaci

nebo luhování. Při vytřepávání, perforaci, roztřepávání nebo

rozdělovací chromatografii musíme najít a použít další rozpouštědlo,

které se

•nemísí s prvním rozpouštědlem,

•v němž je daná látka (a pokud možno jen ona) rozpustná lépe, než v

rozpouštědle prvním.

Hlavním problémem extrakce z kapaliny do kapaliny je tedy volba

vhodného (druhého) rozpouštědla.

Kapalina → kapalina Hlediska a požadavky:

•Co nejmenší vzájemná mísitelnost obou rozpouštědel.

Východisko – mixotropní (eluotropická) řada organických

rozpouštědel seřazených podle rostoucí polarity (podle rostoucí

relativní permitivity, vzájemné rozpustnosti) – uhlovodíky <

alkoholy < voda – např.:

pentan < benzen < dietyléter < chloroform < aceton < dioxan < <

etylacetát < pyridin < etanol < metanol < voda

Platí - čím větší je rozdíl relativních permitivit - čím jsou

rozpouštědla v mixotropické řadě od sebe dále, tím hůře se mísí.

• Co nejvyšší rozpustnost dané látky. Pravidlo: podobné rozpouští

podobném. Pro látky lipofilní (hydrofóbní – bojící se vody), které

jsou nepolární, používáme uhlovodíky. Látky hydrofilní (polární)

se naopak velmi dobře rozpouštějí v polárních rozpouštědlech –

alkoholy, voda.

•Chemická stálost. Rozpouštědlo nesmí chemicky reagovat s

prvním rozpouštědlem ani s danou látkou

Kapalina → kapalina

Extrakce kapalina-kapalina (LLE) –TEORIE

Nernstův distribuční zákon -Jakákoliv sloučenina se rozdělí mezi

dvě nemísitelná rozpouštědla takovým způsobem, aby poměr

koncentrací v obou fázích zůstal konstantní:

KD.…distribuční konstanta

co....koncentrace analytu v organické fázi

caq....koncentrace analytu ve vodné fázi

•KD popisuje rovnováhu mezi koncentracemi analytu v obou fázích

(charakteristická pro daný analyt v daném systému)

•k separaci dvou látek dojde, jestliže se jejich KD liší

Kapalina → kapalina

Extrakce kapalina-kapalina (LLE) –TEORIE

Extrahované množství analytu(E):

KD.…distribuční konstanta

Vo.…objem organické fáze

Vaq.…objem vodné fáze

V.…fázový poměr Vo/Vaq

Kapalina → kapalina Extrakce kapalina-kapalina (LLE) –TEORIE

Distribuční konstanta KD:

Extrahované množství analytu:

Kapalina → kapalina Extrakce kapalina-kapalina (LLE) –TEORIE

JEDNOKROKOVÁ EXTRAKCE:

Pro kvantitativní výtěžnost KD musí být >10, protože praktické je 0,1

<V < 10

KD= 10, V = 1: E = ((10*1) / (1 + 10*1)) *100 =91 %

KD= 10, V = 0,1: E = ((10*0,1) / (1 + 10*0,1)) *100 =50 %

VÍCEKROKOVÁ EXTRAKCE:

Není-li splněna podmínka KD>10

Vícenásobná extrakce menším objemem rozpouštědla je účinnější než

jedna extrakce sumárním objemem

Kapalina → kapalina

Extrakce rozpouštědlem

Kontinuální extrakce

KDvelmi malévícekroková

extrakce nepraktická (mnoho

opakování, velký extrakční objem,

pomalé ustalování rovnováhy)

Kontinuální extraktor - rozpouštědla

těžší než voda

Kapalina → kapalina

Extrakce rozpouštědlem

Mikroextrakce (ME) X In vial extrakce

V 1

miniaturizace: V (0,001 – 0,01)

•malý objem rozp. lehčích než voda

•vysoká zakoncentrace

•nižší výtěžnost

•riziko emulzí (čisté vzorky)

•vhodné pro nepolární analyty

•vhodné vysolování

Aparatura pro vytřepávání

Dělící nálevka

Zátka

Voda

Chloroform

( s jodem)

Jímací nádoba

Zásady pro vytřepávání

•Extrakce kapaliny z kapalné směsi přidáním rozpouštědla,

v němž je extrahovaná složka velmi dobře rozpustná.

•Provádí se protřepáváním směsi s vhodným rozpouštědlem.

• Čím větší je tzv. rozdělovací koeficient (r.k.) a větší rozpustnost

složky v použitém rozpouštědle, tím lépe se extrahovaná složka

oddělí od směsi. Účinnost extrakce se zvýši také opakováním

extrakce.

•Rozdělovací koeficient je poměr koncentrací látky rozpuštěné

ve dvou různých, navzájem nerozpustných a nemísitelných

rozpouštědlech (kapalinách A, B); r.k. = cA / cB.

•Rozdělovací koeficient závisí pouze na teplotě a je pro danou

látku v daných rozpouštědlech konstantní.

•Jako příklad možno uvést vytřepávání bromu nebo jodu

z jejich vodných roztoků např. sirouhlíkem, benzínem,

chloroformem nebo petroletherem.

Destilace • neselektivní separační metoda k dělení složek kapalné směsi

•část směsi převedena odpařením do parní fáze, odděleně

•zkondenzována, získá se kondenzát obohacený těkavějšími složkami,

•v neodpařené části se koncentrují méně těkavé složky

•nejčastější využití destilace, resp. rektifikace při analýze ropy,

•ropných produktů, org. rozpouštědel apod.

•Látky destilují postupně podle zvyšujícího se bodu varu. Jejich páry se v chladiči postupně kondenzují (sráží) a odkapávají do jímadla

•Aby při jednorázové, tzv. jednoduché destilaci došlo k úplnému oddělení dvou látek ze směsi, musí být jedna buď úplně netěkavá, nebo se musí lišit teplotou varu alespoň o 150 oC.

•Některé kapaliny při určité koncentraci tvoří tzv. azeotropní směsi, tj. směsi, které mají konstantní bod varu, destilují spolu a jednoduchou destilací se nedají od sebe oddělit. Např. směs ethanol – voda tvoří tuto směs při poměru 96% lihu a 4 % vody ( přesně 95,57 % ethanolu) a bod varu je 78,15 oC.

Destilace

Filtrační metody

Kritérium pro dělení: velikost molekul a použitý tlak.

•reverzní osmóza – Mr <500; p (1 MPa - 10 MPa);

•ultrafiltrace – Mr (500 - 300000); p ( 0,1 MPa - 1 MPa);

• mikrofiltrace – velikost molekul 1 < mμ; p 0,1 MPa;

•filtrace – velikost molekul > 1 mμ; p 0,1 MPa.

Možnost kombinace těchto metod s použitím elektrického pole:

elektrodialýza, elektrodekantace (frakcionace vysokomolekulárních

látek).

Filtrace membránou

Ultrafiltrace: selektivní oddělování molekul protlačováním roztoku membránou s přesně definovanými póry: 0,1 nm - 50 nm. Přetlak, chlazení. Ultrafiltry: anizotropní membrány (kruhové, dutá vlákna). Základní charakteristika ultrafiltru: molekulový limit - hmotnost nejmenší částice, která je filtrem zadržena. Limit nebývá ostrý, jeho stanovení se provádí globulárními bílkovinami.

Použití: čištění a frakcionace labilních biomolekul (NK, enzymy, protilátky aj.).

Účinnost dělení: největší pro molekuly, jejichž hmotnost se liší o jeden řád.

Mikrofiltrace: podobná ultrafiltraci. Póry mikrofiltrů jsou však podstatně větší (0,05 μm - 10 μm ) . Použití podtlaku

Použití: separace buněčných organel, buněk, mikroorganizmů a virů sterilizace kapalin, izolace buněk pro cytologická vyšetření; koncentrování virů; odstraňování sorbentu – aktivního uhlí z reakčních směsí apod.

.

Molekulová síta Speciální membrány – látky anorganického nebo organického původu, jejichž

struktura a fyzikální vlastnosti umožňují selektivní oddělování látek s rozdílnou

hmotností molekul. Výhoda – jemnější dělení. Forma molekulových sít – prášek,

granule, gel. Dělení molekulovými síty je proces opačný k filtraci – malé molekuly

dělené látky vnikají do pórů a sítem procházejí velké molekuly.

Anorganická molekulová síta: Přírodní nebo syntetické zeolity- hlinitokřemičitany

(hydratované alumosilikáty alkalických kovů).

Použití:

•čištění a vysušování rozpouštědel (po zaplnění pórů molekulami H2O je nutná

aktivace síta vysušením při teplotě 300C-400 0C, jako adsorbenty v chromatografii.

Pórovitá skla – vyšší odolnost vůči chemikáliím a vyšším teplotám než u zeolitů

(BIOGLAS).

•separace virů, NK, také jako iontoměniče.

Organická molekulová síta: Makromolekulární látky se složitou vnitřní strukturou

(sítování) – dutiny definované velikosti – škrobové, želatinové a agarové gely ve

formě granulí (agar – komerčně dostupná látka z mořských ruduchovitých řas

rozpustná ve vroucí vodě. Při teplotě pod 50 0C tuhne v rosol – gel). Hydrofilní a

hydrofóbní forma. Značná dělící schopnost. Nevýhoda – snadná možnost

mechanického nebo chemického poškození.

Filtrace

Filtrace - separační metoda, která umožňuje oddělit pevnou látku od

kapaliny. Pevná látka se zachytí na filtru, kapalina proteče jako filtrát. V

laboratoři se jako filtru používá nejčastěji tzv. filtrační papír, který je

podobný obyčejnému papíru, ale má mnohem větší propustnost kapalin a

je dosti savý. Rozlišuje se několik druhů těchto papírů podle vlastností

materiálu, který chceme filtrovat.

Provedení filtrace •Nálevku s filtračním papírem upevníme do držáku

•Její stopka se musí dotýkat stěny kádinky postavené pod ní na jímání filtrátu.

•Filtrát musí stékat po stěně kádinky a nesmí se rozstřikovat.

•Roztok filtrujeme (pokud to látce nevadí) vždy horký, protože je filtrace za horka

mnohem rychlejší.

•Vléváme jej z kádinky do nálevky po tyčince přiložené ke stěně nálevky (pokud

používáme hladký filtr, přikládá se zpravidla ke trojité vrstvě filtračního papíru), aby se

kapalina nerozstřikovala a nepotřísnila stěny kádinky. Protože kapalina na filtru vzlíná,

nenaléváme jí více než centimetr pod okraj filtru.

Filtrace s odsáváním

slouží k filtraci tehdy, kdy účelem filtrace je získat nerozpustný produkt.

Filtrační nálevka (Büchnerova nálevka) bývá obvykle porcelánová, ale

existují i plastové. Její dno je ploché s mnoha malými otvory. Na dno

pokládáme kruhový filtrační papír, na kterém se při filtraci zachytí pevná

látka, zatímco roztok proteče do odsávací baňky pod nálevkou.

Pokud nám záleží na filtrátu (nikoli na sraženině zachycené na filtru), je

vhodné mezi odsávací baňku a vývěvu zapojit ještě promývací baňku

(viz následující obrázek).

Byla pojmenována po německém chemiku Eduardu Büchnerovi, který

roku 1907 získal Nobelovu cenu.

Schéma doporučeného zapojení vývěvy (1) k aparatuře (3,

4) přes pojistnou (promývací) láhev (2).