Kolektiv autorů: Miroslav Pospíšil a Richard Novák
Šlechtění lesních dřevin -
izoenzymy
ČZU - Fakulta lesnická a environmentální
Co jsou enzymy?Co jsou enzymy?
● Jedná se o jednoduché či složené bílkoviny ( proteiny ).● Jejich hlavní funkcí je katalýza chemické
přeměny v živých rostlinných a živočišných buňkách.
● Přičemž určují povahu i rychlost chemických reakcí a vytvářejí tak v živých organismech harmonickou souhru chemických funkcí.
● V současné době je známo více než 2000 různých druhů enzymů.
Struktura enzymůStruktura enzymů
● aminokyseliny – záporně nebo kladně nabité, příp. neutrální
● primární struktura – sekvence aminokyselin, určena geneticky
● sekundární a tercierní struktura (tvar molekuly) – ovlivněna velikostí molekuly, nábojem a stupněm hydrofility
– udržována S-S můstky, H-můstky, iontovými a hydrofobními interakcemi
● kvartérní struktura – složení z více podjednotek, monomer až tetramer apod.
Podle reakcí, které ovlivňují svou katalytickou činnostíPodle reakcí, které ovlivňují svou katalytickou činností
●Oxidoreduktasy - reakce při níž je jedna látka oxidována a druhá redukována ●Transfery - reakce při níž je přenášena skupina obsahující uhlík, dusík, fosfor
nebo síru z jednoho substrátu na jiný. ● Hydrolasy - katalyzují hydrolitické štěpení substrátu. ● Lyasy - štěpí vazbu C-C, C-O, C-N ● Isomerasy - přestavby skupin uvnitř molekuly (geometrické struktury) ● Lygasy - dochází ke spojení dvou molekul substrátu za současného využití
energie ATP či jiných zdrojů
Klasifikace enzymůKlasifikace enzymů
Co jsou izoenzymy? Co jsou izoenzymy?
● Polymorfní molekulární formy enzymů
● Enzymy se stejnou funkcí v metabolismu, katalyzující stejnou reakci.
● Lišící se (primární) strukturou.
● Tvorba izoenzymů je geneticky podmíněna.
● Závislé na stádiu ontogeneze.
Způsoby zkoumání izoenzymůZpůsoby zkoumání izoenzymů
a) Extrakcí b) Elektroforézou – separací (odlišnou
pohyblivostí jednotlivých izoenzymů v elektrickém poli)
c) Detekcí - zaznamenávání proteinů na zaznamenávání proteinů na substrátu gelusubstrátu gelu
a) Extrakce
Zdroje získání:
● z čerstvého materiálu (např. pupen)
● pomocí homogenizace s extrakčním pufrem
● centrifugací ( k získání čisté vrstvy DNA )
● supernatant můžeme zmrazit na ( –70 °C ) a uchovat
b) Metoda elektroforézyb) Metoda elektroforézy
● rozdělení molekul podle jejich pohyblivosti v elektrickém poli.
● dochází k pohybu molekul k anodě, která je zde kladně nabitá
● rychlost pohybu závisí na: ● velikosti a tvaru molekuly. ● náboji molekuly.
● je velmi citlivá – rozeznává i stejné molekuly lišící se pouze o jednotkový náboj, který je patrný na elektroforetickém zařízení a zymogramu.
● vertikální – na polyakrylamidovém gelu
● horizontální – na škrobovém gelu
c) Detekcec) Detekce
● v případě, že na gelu není nic vidět. Potom je možno nespecificky obarvit všechny proteiny.
● enzymovou aktivitu lze zaznamenat např. specifickým barvením, které je založené na reakci, kterou enzym katalyzuje.
● různé typy detekce proteinů:● produkt je barevný – v místě enzymu se objeví
barevný pruh
● substrát je barevný – v místě enzymu gel ztratí svoji barvu, odbarví se.
Příklady detekce enzymuPříklady detekce enzymu
LAP SOD
Na gelu je patrné:Na gelu je patrné:● zymogram – obrazec proužků na gelu
● proužky izoenzymů – zóny enzymatické aktivity (patterny)
● předpoklady interpretace:● rozdílná pohyblivost odráží rozdíly v DNA
(rozdíl je dědičný)
● komigrující ( jdoucí přímo pospolu ) proužky jsou homologní
● kodominantní exprese● odlišíme homozygoty od heterozygotů
● znalost kvartérní struktury enzymů ( tvar molekuly, která ovlivňuje rychlost enzymu v elektroforezním poli ).
Vyhodnocení a interpretace izoenzymových dat
Prosté porovnání pattern proužků● naprosto shodná – identifikace klonů
A B B C D E D
Alelická interpretace izoenzymů1. zjistit počet lokusů
• různé lokusy – izoenzymy např. z různých složek buňky (cytosol, chloroplast apod.)
2. zjistit počet alel v lokusu• kodominance• tvarová struktura• ploidie organismu
allozymy
izoenzymy
izoenzymy – katalyzují stejnou reakci
allozymy – produkty (alely) jednoho genu
Výhody analýzy izoenzymů● rychlá metoda – možno analyzovat mnoho
individuí najednou
● levná technika (n. v porovnání s DNA technikami)
● srovnatelná data mezi různými studiemi
● snadná interpretace výsledků
● nižší nutná kvalifikovanost, než u gen.markerů
● malá mutační rychlost (výhoda oproti např. mikrosatelitům)+ 10-7 /lokus*rok
Nevýhody
● potřeba čerstvého materiálu● omezená variabilita – málo alel v lokusu –
často jen 2-4● s porovnaním gen. markerů (přes 2000):
málo izoenzymů(40) a jen 20 je jich dostupných na levných postupech
● variabilita v kodující části genomu – podléhá selekčnímu tlaku, a proto jsou lokusy často monomorfní
Možnosti využití izoenzymůMožnosti využití izoenzymů
● identifikace klonů● porovnání pattern (sloupce) na zymogramu
● populační úroveň - populační genetika ( určující především pro genetickou charakteristiku populace) …
● certifikace a identifikace vzorků semen● studium genetické efektivnosti semenných
plantáží● pomůcka v selekci ekonomicky důležitých znaků● Teoretické: -fylogenetické vztahy
● vhodná metoda maximálně na druhové úrovni -stanovení genetické variability a
charakteru sprášení přirozených a šlechtitelských populací
Použité materiályPoužité materiály
LiteraturaLiteratura
● Fér (2005): Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin
Internetové odkazyInternetové odkazy
http://botany.natur.cuni.cz/fer/markers/
www.etext.czu.cz/www.etext.czu.cz/