SLOŽENÍ MÉDIÍSLOŽENÍ MÉDIÍ

Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Složení médií Aseptická kultivace Ošetření mateřských rostlin Typ

explantátu

Koncentrace živin v médiu [mmol/l]

 Živina

 

 Knop

  

 Hoagland a Snyder

 Murashige a Skoog

 Gamborg

 

 Shenk a

Hildebrandt

NO3- 10,94 15,00 39,40 24,72 24,72

NH4+ - - 20,61 2,02 2,06

celkový N 10,94 15,00 60,01 26,74 27,32

PO43- 1,84 1,00 1,24 1,08 2,6

SO42- 1,01 2,00 1,50 2,03 1,62

Cl- - - 5,98 2,04 2,72

K+ 4,30 6,00 20,04 24,72 24,72

Na+ - - - 1,08 -

Mg2+ 1,01 2,00 1,50 1,01 1,62

Ca2+ 4,23 5,00 2,99 1,02 1,35

Hydroponická média Média pro kultivaci in vitro

SLOŽENÍ MÉDIÍ pro kultivaci rostlin SLOŽENÍ MÉDIÍ pro kultivaci rostlin in vitroin vitro

a) Makroprvky

b) Mikroprvky Nezbytné

Prospěšné až nezbytné

c) Vitaminy

d) Aminokyseliny

e) Sacharidy

f) Doplňky

g) Pufry

h) Růstové regulátory

i) Zpevňující složky

SLOŽENÍ MÉDIÍ

a)a) Makroprvky – N, P, K, Ca, Mg, S Makroprvky – N, P, K, Ca, Mg, S

Důležitá jak koncentrace, tak vzájemná vyváženost.

N N – nejprve jako zdroj N používány NONO33-- ; přidání redukované formy NHNH44

++

může být prospěšné

NO3- NH4

+

energie

SLOŽENÍ MÉDIÍ

Proč ne jen NH4+ ??????

• toxicita při vyšších koncentracích

(kompenzovat přídavkem kyselin Krebsova cyklu)

• příjem vede k poklesu pH potřeba pufrovat média

2- oxoglutarát

Cyklus kyseliny

citrónové

glutamát

glutamin

glutamát (2)

NHNH4+

pHpH

Příjem NONO33-- při pHpH, ……………. příjem NHNH44

++ při pH

NO3-

OH-

NH4+

H+

NO3- OH-

NH4+

H+

pHpH

V médiu NONO33-- + NHNH44

++ (počáteční pH média 5,4 -5,8)

nejdříve příjem NHNH44++ pH následuje příjem NONO33

-- pH

SLOŽENÍ MÉDIÍ

SLOŽENÍ MÉDIÍ

b) Mikroprvky – Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo b) Mikroprvky – Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo

Jsou součástí metabolicky a fyziologicky důležitých proteinů

Chelatony - EDTA

c) Vitaminyc) Vitaminy

Rostliny jsou schopny vitaminy syntetizovat, rostlinné explantáty často nejsou soběstačné

d) Aminokyselinyd) Aminokyseliny

Okamžitě dostupný zdroj N; rychlejší příjem;

organické a anorganické zdroje N nejsou zaměnitelné !!!

Hydrolyzát kaseinuHydrolyzát kaseinu – směs aminokyselin a peptidů

Samostatně : glycin glycin, pro některé kultury k.k. glutamová, glutamin, k.glutamová, glutamin, k. asparagováasparagová, asparaginasparagin, … ostatní výjimečně

B1, B6, kys. nikotinová, (inositol)B1, B6, kys. nikotinová, (inositol)

e)e) SacharidySacharidy

Explantátové kultury nejsou většinou autotrofní nutnost dodat zdroj C a energie z média

SLOŽENÍ MÉDIÍ

???? Navození autotrofie v podmínkách in vitro – typ kultury

• vynechání sacharidu z média

• zvýšení koncentrace CO2 ( konc. CO2 v okolí nádob, propustné uzávěry

kultivačních nádob)

• zvýšení ozářenosti, spektrum použitého světla

Zdroj C a energieZdroj C a energie

???? Vliv sacharidů v médiu na schopnost kultury fotosyntetizovat

Heterotrofní kultury – plně závislé na vnějším zdroji C

Mixotrofní kultury – fotosyntetizující + zásobované z média

???? Mixotrofie X úspěšnost přenosu do ex vitro podmínek

???? Jaký sacharid a v jaké koncentraci

Nejčastěji: sacharózasacharóza 1-3 % - floémem transportovatelný sacharid u všech rostlin

Dále: glukóza, maltóza, fruktóza, galaktóza, manóza, laktóza, glukóza, maltóza, fruktóza, galaktóza, manóza, laktóza, manitol, manitol,

sorbitol, rafinózasorbitol, rafinóza.. Požadavky se mohou velmi lišit v závislosti na rostlinném druhu i typu kultury a jejím vývoji

Využitelnost sacharidu závisí na schopnosti

kultury :

transportovat daný sacharid (z buňky do buňky x vodivými pletivy)

rozkládat daný sacharid vně buněk (sacharóza glukóza + fruktóza, rafinóza ? fruktóza + melibióza nebo sacharóza + galaktóza) přijímat daný sacharid (pasivní transport X aktivní transport)

utilizovat daný sacharid (např. manitol, sorbitol, RFO)

! Výběr vhodného sacharidu často na základě empirického přístupu

Př:Př: Listové disky Capsicum annum tvorba výhonů - glukóza

Př:Př: kultury izolovaných kořenů pšenice (a dalších jednoděložných) – glukóza

Př:Př: některé orchideje - fruktóza

Př:Př: kalus fazolu, somatická embrya jedle - maltóza

Př:Př: Rosaceae – sorbitol, jasan, celer, oliva – manitol

Př:Př: embryogenese u citrusů - galaktóza

Př:Př: kalus okurky - rafinóza

SLOŽENÍ MÉDIÍ

OsmotikumOsmotikum

Přítomnost sacharidu v médiu snižuje osmotický potenciál média osmotický stres (morfogenní signál)Př: Somatická embryogeneze jehličnanů – pozitivní vliv vysokých koncentrací sacharózy lze nahradit osmotickým stresem vyvolaným manitolem

SLOŽENÍ MÉDIÍ

Přítomnost sacharidu v buňkách osmotické přizpůsobení (zachování transpotru vody při osmotickém stresu)

osmoprotekce (ochrana membrán a makromolekul při nedostatku vody)

OsmoprotektantOsmoprotektant

Signální molekulaSignální molekula

přímé působení sacharidu

signál generován transportérem ? - rozhoduje míra transportu přes membránu

sacharózové transportéry ( X jiné systémy vázané na membráně) hexózové transportéry hexokinázový systém – rozhoduje „rychlost“ fosforylace

?

apoplastická invertáza

invertáza x SuSy

obsah sacharidů se promítá do hladiny sacharidu se signálním potenciálem (trehalóza-6-P) nebo jiné signální molekuly (SnRK1)

přímé působení sacharidu

signál generován transportérem ? - rozhoduje míra transportu přes membránu

sacharózové transportéry ( X jiné systémy vázané na membráně) hexózové transportéry hexokinázový systém – rozhoduje „rychlost“ fosforylace

?

apoplastická invertáza

invertáza x SuSy

Cukr může indukovat změny hladin fytohormonů (auxinů a cytokininů)

h) Růstové regulátoryh) Růstové regulátory

Funkce nikoli nutriční, ale regulační

Účinné ve velmi nízkých koncentracích.

Ovlivňují současně velký počet rozdílných procesů.

Nejdůležitější in vitro : auxiny, cytokininy, kys. abscisová, gibereliny

SLOŽENÍ MÉDIÍ

f) Doplňkyf) Doplňky

Dodávají báze NK, NK, aminokyseliny, vitaminy, růstové regulátory …

Extrakty : bramborový, kvasničný extrakt

Tekuté endospermy: rajčatová šťáva, banánová šťáva, nejčastěji… kokosové mléko

g) pH média- g) pH média- PufryPufry

Stabilizace pH médií užitím organických pufrů

pH ovlivňuje rozpustnost solí

pH ovlivňuje příjem látek z média (živin i hormonů)

pH ovlivňuje gelační schopnosti agaru (pod pH 5 nedostatečná gelace)

SLOŽENÍ MÉDIÍ

auxinauxin

cytokinicytokininn

Tvorba kořenů na řízcích

Embryogeneze

Tvorba adventivních kořenů v kalusu

Tvorba adventivních výhonů

Proliferace úžlabních výhonů

Iniciace kalusu

Auxin cytokininový modelAuxin cytokininový model - tabák, Skoog a Miller, 1957

Rozhoduje:

endogenní hladina růstových regulátorů, která je výsledkem interakce endogenních hladin fytohormonů a exogenní aplikace růstových regulátorů. volba vhodného fytohormonu a nebo růstového regulátoru s obdobným účinkem

HabituaceHabituace

=tkáňová kultura po opakovaných =tkáňová kultura po opakovaných pasážích pasážích

ztrácí závislost na exogenním ztrácí závislost na exogenním cytokininu cytokininu cytokinincytokinin

auxinauxin

Iniciace kalusu

Habituace je mitoticky přenosná vlastnost

syntézy syntézy

cytokininůcytokininů ?

reverzibilní epigenetická komplexní změna

? mechanismus habituace ?

exprese cytokininového receptoru exprese cytokininového receptoru CRE CRE 11

exprese genů účastnících se cytokininové signalizaceexprese genů účastnících se cytokininové signalizace

exprese receptorů exprese receptorů AHK3, AHK2AHK3, AHK2

Analýza transkriptomu u Arabidopsis

up-regulace transkripčních faktorů, transposonům příbuzných elementů, up-regulace transkripčních faktorů, transposonům příbuzných elementů,

DNA- a chromatin modifikujících enzymů… DNA- a chromatin modifikujících enzymů… změna asi 800 genů

Pravděpodobně NE

SLOŽENÍ MÉDIÍ

ABA ABA

snižuje transpiraci během aklimatizace rostlin ex vitro snižuje transpiraci během aklimatizace rostlin ex vitro

zvyšuje stresovou toleranci zvyšuje stresovou toleranci

zvyšuje frekvenci přežívajících explantátů po zvyšuje frekvenci přežívajících explantátů po kryoprezervaci kryoprezervaci

zpomaluje růst udržovacích kultur zpomaluje růst udržovacích kultur

zlepšení kvality somatických embryízlepšení kvality somatických embryí

zabránění předčasnému klíčení somatických embryí zabránění předčasnému klíčení somatických embryí

navození klidového stádia při přípravě umělých semen navození klidového stádia při přípravě umělých semen

regulace syntézy zásobních látek v embryích regulace syntézy zásobních látek v embryích

zvýšení desikační tolerance zvýšení desikační tolerance

synchronizace somatické embryogeneze synchronizace somatické embryogeneze

Rai et al., 2011Rai et al., 2011

SLOŽENÍ MÉDIÍ

Interakce:Interakce: minerální výživa XX růstové regulátory

?????? optimální obsah minerálních složek média;

?????? mohou minerální živiny částečně nahradit roli R.R.

?????? mohou R.R. kompenzovat disbalanci v minerální výživě

Rozhoduje hlavně NN a jeho forma :

Poměr HNHN44+: NONO33

- má vliv na :

• dediferenciaci

• růst

• morfogenezi

Důležitý také poměr N:cukrN:cukr

NN IAAIAA

N N ABAABA GAGA

Př: Kořenění segmentů

Cizrna

WH +IBA 70 % zakořeněných segmentů

WH + 20 % -,,-

½ WH +IBA 47 % zakořeněných segmentů

½ WH + 46 % -,,-

NN cytokinin

NN etylén

SLOŽENÍ MÉDIÍ

i) Zpevňující složka

Nejčastěji : agar (agaróza)agar (agaróza)

Tvoří gel, taje při 100 °C a tuhne při 45 °C; není tráven rostlinnými enzymy, nereaguje se složkami médií ( ?? inertní )

XX Tekutá média – prámky, můstky, zavěšené kapky, „temporary immersion systems“.

Př: Kořenění segmentů:

Leucopogon (extrém)

soli + R.R 70 % zakořeněných segmentů

MS + NAA 38 % -,,-

Př: Produkce adventivních výhonů:

Jalovec

MS + BA + NAA 9 % segmentů tvořících výhony

HS + BA 18 % -,,-

Př: Produkce somatických embryí :

Jasan

MS + BA + NAA 17 % explantátů tvořících SE

DKW + 20 % -,,-

ASEPTICKÁ KULTIVACEASEPTICKÁ KULTIVACE

Sterilizace výchozího materiálu

Sterilizace médií, nástrojů

Detekce kontaminace

Citlivost kontaminujících organismů

Použití antibiotik

Sterilizace výchozího materiáluSterilizace výchozího materiálu• Omytí ředěným roztokem detergentu

• Omytí tekoucí vodou

• Ošetření sterilizačním činidlem : NaClO, Ca(ClO)2 AgNO3, H2O2, HgCl2, EtOH kontakt činidlo-sterilizovaný materiál (EtOH, smáčedlo,

snížený tlak, míchání) trvání sterilizace – krátké nedostatečná sterilizace

dlouhé poškození rostlinných pletiv

koncentrace sterilizačního roztoku, vysoká X nízká

• Závěrečné omytí sterilní vodou

ASEPTICKÁ KULTIVACE Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Složení médií Aseptická

kultivace Typ explantátu Ošetření mateřských rostlin

ASEPTICKÁ KULTIVACE

Sterilizace je úspěšná při co nejnižší výchozí hladině kontaminace

• části rostlin ve styku s půdou - silně kontaminovány

důležitý je výběr explantátu

• rostliny rostoucí za nízké rel. vlhkosti a nezalévané na list – málo kontaminovány

• kontaminace se mění výrazně v závislosti na ročním období

• úspěch jen když vnitřní pletiva jsou prosta kontaminace

Sterilizace médií, nástrojůSterilizace médií, nástrojů• autoklávování – 120 °C; 0,1 MPa, doba sterilizace závisí na objemu média.

( pokles pH o 0,3-0,5 ) • filtrace – skleněné frity, membránové filtry

• suché teplo – 3h 150 °C

• - radiace, páry kys. peroctové

ASEPTICKÁ KULTIVACE Detekce Detekce kontaminacekontaminace • viditelný růst

• latentní kontaminace zpomalený růst, špatné zakořeňování, náhlý úhyn rostlin po mnoha subkultivacích kontaminace napadá pletiva, snižuje pH, vyčerpává živiny, produkuje fytotoxické látky detekce – přeočkování na různé půdy

- někdy lze detekovat jen sérologicky nebo e- mikroskopií

• většina kontaminací nepřečká běžné sterilizační postupy

Citlivost kontaminujících Citlivost kontaminujících organismůorganismů

• ale !! Někdy velká odolnost: rod Bacillus : 5 min ponoření do EtOH, opálení lihovým

kahanem, ale i 1 týden v EtOH, i 20 min při 110 °C, výjimečně 20 min při 120 °C. Použití antibiotikPoužití antibiotik

• nemají nahradit pečlivost aseptické práce !

• některá antibiotika podporují růst

• častěji – fytotoxicita - antibiotika, která interferují se syntézou DNA, RNA

působí i na eukaryota; výhodné pokud specificky působí na mikroorganismy • nejlépe znát citlivost kontaminujícího mikroorganismu

• antibiotika působí na aktivně rostoucí organismy

• rezistence

TYP EXPLANTÁTUTYP EXPLANTÁTU

GenotyGenotypp:

Dvouděložné

Jednoděložné

Nahosemenné

Nejlépe reagují: Solanaceae, Begoniaceae,

Crassulaceae, Brassicaceae

Stáří:Stáří: a) stáří jedince

„skutečné stáří“--- počet dní od vyklíčení rostliny

„fyziologické stáří“----fáze růstu a vývoje rostliny

c) u již založené kultury in vitro rozhoduje subkultivační interval

b) relativní stáří pletiva

(hodnocení velmi obtížné např.: Vzrostný vrchol z 50 let staré rostliny v juvenilním stavu je „ mladý“. U dřevin nejlepší výsledky s výhony u báze kmene)

Většinou nejvhodnější explantát z nově založených orgánů Méně často - z plně vyvinutých orgánů

V některých případech jen změna postupu morfogeneze:

explantát z mladých listů nejprve koření

z dospělých listů nejprve tvoří pupeny

Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Složení médií Aseptická kultivace Typ explantátu Ošetření mateřských rostlin

Velikost explantátuVelikost explantátu třeba zvolit optimální

!! vhodné umístění vzhledem k médiu, zachovaná polarita včetně směru transportu látek

-- příliš malý explantát velké hynutí, ---- malé zásoby živin, hormonů,

poměr poraněná : neporaněná část povrchu, produkce etylénu -- příliš velký explantát špatná manipulace, horší styk s médiem, malý

množitelský efekt

Polarita explantátuPolarita explantátu

OŠETŘENÍ MATEŘSKÝCH ROSTLINOŠETŘENÍ MATEŘSKÝCH ROSTLIN

• Dormance: většinou aktivně rostoucí, ne vždy ! Př:Př: tvorba náhradních pupenů na kořen. řízcích dřevin --- jen z dormantních rostlin

• Stav rostlin: zdravé, aktivně rostoucí, bez stresu, dostatek živin

• Termín odběru: změny v teplotě, fotoperiodě, osvětlení hladiny cukrů, proteinů, R.R

• Působení teploty: teplota při kultivaci mateřské rostliny ovlivňuje chování explantátu Př:Př: % vytvořených pupenů slivoně je úměrné době udržování mat.r. při

4°C

• Působení světla: promítá se do hladin zásobních látek, R.R. změny v chování explantátu

• Působení R.R: ovlivňuje jak růst, tak morfogenezi

Př:Př: rajče, ošetření chlormequatem (inhibice syntézy giberelinů) zvýšení tvorby pupenů na listových explantátech

Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Složení médií Aseptická kultivace Typ explantátu Ošetření mateřských rostlin