STABILITA GENOMU

IV.Buněčná odpověď na poškození

DNA 

Poškození DNA může zpomalit S‐fázi či vyvolat blok v G1/S‐ nebo G2/M‐fázi buněčného cyklu

3) DDR & CELL CYCLE CONTROL

Řízení buněčného cyklu

Kontrolní body buněčného cykluCell cycle checkpoints

G1

G2

Intra S-phase checkpoint

Poškození DNA aktivuje signální dráhypůsobící na G1/S‐, S‐ nebo G2/M‐fázibuněčného cyklu

Senzorická fáze poškození DNA a aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu

1) Aktivace senzorů poškození DNA‐ interakce poškozené DNA (DSB) s proteinové komplexy jako MRN (MRE11‐NBS1‐Rad50), 53BP1, H2AX atd.  

2) Aktivace „checkpointových“ kináz – ATM, ATR  a DNA‐PK (specifickým typem) poškození DNA‐ jednovláknové zlomy DNA (SSB)‐ dvouvláknové zlomy DNA (DSB)‐ předčasně zastavená replikace

3) Aktivace transdukčních/efektorových kináz ‐ Chk1, Chk2...

Senzorická fáze poškození DNA a aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu

2) Aktivace „checkpointových“ kináz – ATM, ATR  a DNA‐PK (specifickým typem) poškození DNA‐ jednovláknové zlomy DNA (SSB)‐ dvouvláknové zlomy DNA (DSB)‐ předčasně zastavená replikace

1) Aktivace senzorů poškození DNA‐ interakce poškozené DNA (DSB) s proteinové komplexy jako MRN (MRE11‐NBS1‐Rad50), 53BP1, H2AX atd.  

3) Aktivace transdukčních/efektorových kináz ‐ Chk1, Chk2...

Přehled signálních drah kontroly buněčného cyklu u eukaryot

Fig. 1 714

ATM kináza Ataxia Telangiectasia Mutated

‐ homologní s PI3‐kinázami

‐ v klidovém stavu jako dimer

‐ aktivovaná především dvouvláknovými zlomy DNA (experimentálněnapř. ionizujícím zářením), transfosforylace Ser1891, monomerizace a vazba substrátu

‐ ATM zabraňuje v S‐fázi tvorbě nových replikačních počátků ‐ v případědosud nereparované DNA. Selhání této cesty vede k tzv. radiačněrezistentní DNA syntéze, což je fenotyp sdílený i s jinými rakovinu působícími mutacemi (např. NBS1), které ovlivňují jednak poškozením indukované kontrolní body buněčného cyklu nebo reparační funkce.

‐množství substrátů: H2AX, Rad50, NBS1, 53BP1, Chk2, c‐Abl, p53, MCM...

‐mutace způsobuje vrozené onemocnění Ataxia telangiectasia

Interakční mapa ATM 

Časná fáze rozpoznání dvouvláknového zlomuamplifikace signálu aktivitou ATM/demarkace léze 

⌧=H2AX

ATR  kináza (Ataxia Telangiectasia Mutated‐ and Rad3‐related)

‐ homologní s PI3‐kinázami

‐ aktivovaná doposud neznámým mechanismem činidly, kterépřímo interferují s progresí replikační vidlice (hydroxyurea, thymidin, UV záření a DNA–alkylačníčinidla) a jednovláknovými zlomy DNA

‐ řada substrátů: Chk1, p53, MCM proteiny...

‐mutace ATR způsobuje vrozené onemocněníSeckelův syndrom

Rozdílné a překrývající se úlohy ATM a ATR v reakci na různý typ genotoxického stresu

Rozdílné cesty aktivace ATM a ATR dvouvláknovými zlomy

‐ aktivace ATR ‐ na rozdíl od ATM ‐ vyžaduje tvorbu jednovláknové DNA recese řetězců v místězlomu

G1/S BLOK

INTRA‐S‐BLOKMechanismus bloku buněčného cyklu ATM v S‐fázi prostřednictvím kontroly degradace CDC25A fosfatázy

‐ za normálních podmínek ATR fosforyluje CDC25A, tak že rychlost ubiquitinylace a degradace CDC25A umožňuje nerušený průchod S‐fází

‐ po indukci dvouvláknových zlomů a aktivaci ATM docházík výraznější fosforylaci CDC25A a její rychlédegradaci, která způsobízpomalení S‐fáze inhibičnífosforylací cdk2

INTRA‐S‐BLOKMechanismus bloku buněčného cyklu ATM v S‐fázi prostřednictvím SMC1Fosforylace SMC1 (structural maintenance of chromosome) prostřednictvím ATM je nutná pro intra S‐fázový blok replikace DNA ‐ přesný mechanismus zástavy v S‐fázi prostřednictvím SMC1 je prozatím neznámý

G2/M ‐BLOK

Ataxia telangiectasiaDominantně recesivní onemocněnímutace ATM kinázy 

Klinický obraz:‐ zvýšená citlivost k infekcím‐ časté chromosomální aberace‐zvýšená citlivost ke tvorbě zhoubných nádorů

(100 x, především leukémie a lymfomy) a radiačnímu poškození tkání

‐ postupná ztráta cerebelárních funkcí, postižení pohybu, řeči a zraku (ataxie)

‐ rozšíření cév na neobvyklých místech – např. spojivkách (telangiektázie)

‐ diagnosticky zvýšené hladiny alfa‐fetoproteinu

Předčasně zastavená replikace – úloha RecQ helikáz

RecQ helikázy‐ vysoce homologní proteiny‐mutace vyvolávají specifické syndromy:

BLM, Bloomův syndromRECQL, Rothmund‐Thomsonův syndromWRN, Wernerův syndromXPB a XPD, Xeroderma pigmentosum

‐ u všech syndromů je pozorována zvýšená náchylnost k tvorbě zhoubných nádorů

Funkce:• ATP‐dependentní helikázy (s 3´‐5´‐exonukleázovou aktivitou ‐ pouze 

WRN)• detailní funkce v buňce nejsou známy • podílejí se na udržování stability genomu ‐ caretakers• účastní se procesů replikace, pravděpodobně i rekombinace a reparace 

DNA• působí jako senzory poškození DNA během S‐fáze buněčného cyklu

SGS1p• Saccharomyces cerevisiae homolog k savčímu WRN genu• helikáza z rodiny RecQ helikáz (Rqh1 helikáza Schizosaccharomyces pombe) • lokalizuje se přednostně v jadérku kvasinek• její mutace působí nahromadění extrachromosomálních prstenců rDNA –

souvislost se „stárnutím“ kvasinek

Biochemická funkce SGS1/WRN

• ATP‐dependentní helikáza a 3´‐5´exonukleázovou aktivitou a se substrátovouhelikázovou specifitou v 3´‐5´ směru prodsDNA

• ale mnohem efektivněji (10‐20x) rozplétá G‐G párovanou DNA

• předpokládaná úloha v rozplétáníkvadruplexové DNA in vivo

• viz Ozgenc, A. a spol., Current advances in unraveling the function of the Werner syndrome protein, Mutation Research 577 (2005) 237–251

Hogsteenovo párování G bází

Hypotetická místa vzniku kvadruplexů DNA

Předpokládaná úloha RecQ helikáz WRN a BLM v G1 a S‐fázi

Wernerův syndrom• velmi vzácné dědičné autosomálně recesivní onemocnění• příznaky stárnutí se objevují časně v dospělosti • mutace WRN helikázy, výsledkem je C‐terminálně zkrácený protein se ztrátou 

NLS• výskyt 1 : 4 000 000

• šedý zákal• chřadnutí pokožky ‐ ztráta elasticity• vypadávání a šedivění vlasů• slábnutí svalů• osteoporóza• ateroskleróza• zvýšená prevalence diabetu typu II • náchylnost k mnoha druhům zhoubného bujení mesenchymu (sarkomy)• mentální vývoj je nenarušený, postižení netrpí Alzheimerovou chorobou, 

zvýšeným krevním tlakem, hyperlipidémií (segmentární progeroidnísyndrom)

• úmrtí nastává mezi 40. a 47. rokem 

WS patient age 15 yrs WS patient age 48 yrs

Klinické příznaky:

Laboratorní nález:• zvýšená exkrece glykosaminoglykanu kyseliny hyaluronové do moči

(podobně jako u Hutchinson‐Gilfordovy progerie)

Biochemický a cytologický nález (WS fibroblasty):• limitovaný počet buněčných zdvojení (cca poloviční) ve srovnání s 

kulturami buněk od normálních, stejně starých jedinců• prodloužená S‐fáze buněčného cyklu• rychlejší zkracování telomer/populační zdvojení• zvýšená sensitivita k 4‐nitrochinolin‐1‐oxidu a camptothecinu (inhibitoru

topoisomeráz)• exprese podobných proteinů jako u fibroblastů z velmi starých dárců• 40‐60% snížení celkové transkripce Pol II (vrací se k původním hladinám 

návratem WRN do buněk)• obsah zvýšeného počtu somatických mutací, chromosomálních ztrát a 

delecí, chr. translokací, duplikací a fúzí

Chromosomální aberace u WS

Spektrální karyotyp jednoho buněčného klonu pacienta s WS

Buněčné procesy narušené mutací WRN

TranskripceReplikaceReparace DNAHR, NHEJ, BER, SSBRRekombinace DNAApoptóza

• S‐fázový kontrolní bod monitoruje integritu DNA– přítomnost poškozené (a nereparovatelné) DNA indukuje apoptózu nebo zástavu 

buněčného dělení– mutace ATM kinázy nebo p53 vedou k nestabilitě genomu a k buněčné imortalizaci 

následkem neschopnosti odpovědět na poškození DNA • WRN asociuje s C‐koncem p53

– tato interakce vyžaduje intaktní C‐konec WRN– může být fyziologicky důležitá, protože WRN fibroblasty jsou méně citlivé k apoptóze

• WRN je fosforylován ATM kinázou• exprese WRN je řízena p53

Příčina předčasného stárnutí u WS ‐ vztah WRN helikázy k telomerám a telomeráze

• WRN kolokalizuje s telomerickými faktory TRF1 a TRF2 v imortalizovaných lidských buňkách, kterým chybí telomeráza (ALT mechanismus)

• WRN interaguje s Ku proteinem, který je součástí telomerického chromatinu 

• WRN in vitro rozplétá komplexy telomerické DNA • senescence WS fibroblastůmůže být zvrácena expresí telomerázySymptomatologie Wernerova syndromu mutací WRN může být způsobenafunkčním defektem helikázy, který vede k poškození DNA během replikace a zhoubnému bujenía/nebo narušením kontroly progrese v S‐fázi aberantní aktivací ATM kinázy a p53 a tím k aktivaci projevů buněčné senescence

Centrální úloha p53 v DDR

DNA damage

genotoxic stress UV and γ-irradiation

DNA damage sensing mechanisms

DNA repair cell cycle arrest apoptosis

activation of p53

cellular senescence

Cancer Genes ‐ Rad51, p53p53 is the “guardian of the genome” protein and controls apoptosisp53 is the “guardian of the genome” protein and controls apoptosis

p53 protein plays a major role in cancer riskp53 protein plays a major role in cancer risk

Human Papillomavirus (HPV) causes cervical cancer (Sexually Transmitted Cancer)HPV makes E6 oncoprotein which attacks and inactivates p53, preventing apoptosis and causing cancerWhen p53 is genetically inactivated “Knocked Out” in the cells of a mouse, the mouse has a higher spontaneous cancer risk and is also more prone to radiation‐induced cancer

p53 “Knockout” MiceKemp et al. Nature Genetics 8:66-69, 1994

One bad p53 copyOne good copyHeterozygous

Normal p53Two good copies

Homozygous

Normal p53Two good copies

Homozygous

No p53Two Bad Copies

Knockout

No p53Two Bad Copies

Knockout

70 weekstumours

> 100 Weeksno tumours

> 100 Weeksno tumours

21 weekstumors

21 weekstumors

4 Gy4 Gy

> 100 Weeksno tumours

> 100 Weeksno tumours

4 Gy 1 Gy1 Gy

40 Weekstumours

40 Weekstumours

14 Weekstumours

14 Weekstumours

Nádorový supresor p53‐ transkripční faktor, lokalizovaný v jádře, váže se na specifické

DNA sekvence a působí jako transkripční regulátor

‐ jeden z nejčastěji mutovaných genů v nádorech (ve více nežpolovině nemelanomových nádorů kůže a v poloviněvšech  lidských nádorů)

‐ účastní se tří fundamentálních buněčných mechanismů: kontroly buněčného cykluapoptózy audržování genetické stability

‐ vrozené mutace p53 jsou odpovědné za Li‐Fraumeniho syndrom

Centrální úloha p53 v odpovědi na (geno)toxický stres 

Poškození DNA vede ke stabilizaci a aktivaci p53‐ za normálních okolností je p53 v komplexu s Mdm2 a je urychleně ubiqitinylován a degradován

‐ pokud je DNA poškozena, např. UV zářením, dojde k aktivaci proteinových kináz (Chk1, Chk2, DNA‐PK...)

‐ protein kinázy fosforylují p53‐ p53 nemůže dále vázat Mdm2 (snížení degradace p53)‐ p53 je acetylován a takto dále stabilizován a dojde k akumulaci vysokých hladin p53 v jádře

‐ p53 stimuluje transkripci p21, inhibitoru cyklin‐dependentních kináz

‐ p21 váže a inaktivuje G1/S‐Cdk a S‐Cdk komplexy‐ buňka je blokována v G1

Pokud tedy dojde k mutaci genu p53 a buňka se nezastaví v jiném kontrolním bodě, bude se dále dělit, což může vést k nekontrolovanému buněčnému dělení a nádorovému bujení. 

Schéma aktivace a stabilizace p53

Mechanismus zástavy buněčného cyklu v G1/S‐fázi aktivovaným p53

p53

indukce exprese

p21

P

pRb

CDK4

CDK2

XE2F

+pRbP

E2F

Postranslační modifikace p53 

DEATH FROM IONIZING RADIATION• post‐mitotic death

– loss of genetic material » metabolic death» delayed apoptotic death

– genetic instability» delayed apoptotic death

• interphase death– immediate (rapid) apoptosis

• reproductive death– long‐term arrest (exit cell cycle, senesce, differentiate)– remain metabolically viable for long time 

Mutace p53 jsou příčinou vzniku rakovinných buněk

více než 50% lidských nádorů nese ve svých buňkách mutaci p53

ZÁVĚR‐ k poškození genomové DNA dochází neustále vlivem 

endogenních a exogenních vlivů

‐ léze DNA jsou opravovány s vysokou účinností specifickými reparačními mechanismy

‐ poškození DNA ovlivňuje průběh buněčného cyklu a osud buňky

‐ dědičné mutace proteinů účastnících se reparace DNA vyvolávají specifické nemoci charakterizovanénestabilitou genomu a sklonem k zvýšené incidenci zhoubného bujení na úrovni organismu

‐ získané mutace genů reparačních a kontrolních proteinůmajíobdobný efekt na buněčné a tkáňové úrovni, vedou k zániku buňky, jejímu stárnutí či nádorovému zvrhnutí