Metody v ekologii mikroorganismů

Petr Baldrian

Laboratoř environmentální mikrobiologie baldrian@biomed.cas.cz; http:www.biomed.cas.cz/mbu/lbwrf

Mikroorganisy vnímaji prostředí v jiných měřítcích než makroorganismy.

Přirozené prostředí je vysoce komplexní a heterogenní.

Prostředí a mikroorganismy

L

O

Ah

Prostorová heterogeneita prostředí

Soil properties along a vertical profile of forest topsoil.

8

7

6

5

4

3

2

1

0

100 10 1 0.1

Relative value (%)

De

pth

(cm

)

Organic matter

Bacterial biomass

Fungal biomass

Respiration

100 10 1

Relative value (%)

Laccase

Mn-perox.

Endocell,

CBH

-Glucos.

NAG-ase

Phosphatase

Genomics

Classical microbiology

Transcriptomics

Proteomics

Study of nucleic acids and

proteins from the

environment:

metagenomics,

metatranscriptomics,

metaproteomics

Analysis of microbial

processes

Metodické přístupy ekologie mikroorganismů

Brock Biology of Microorganisms (2012)

Metody závislé na kultivaci

Přímá vizualizace

Analýza nukleových kyselin

• Zahrnuje všechny mikroorganismy včetně těch

nekultivovatelných a neznámých

• „druhy“ se tvoří uměle na základě matematické

podobnosti sekvencí

• Identita sekvence (příslušný gen a jeho producent) je

určena nepřímo na základě podobnosti (větší nebo

menší) k některé známé sekvenci

>IEH00WJ01BK2Y9 xy=533_195

ATTAGCAGTAAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAAACGAATAGGAATGGGGGAGCAAGACG

GCAAAGCAAAAGACTGTCGCTGGCTAGATTCATTTCTGGCATGTGCACGTCCTTGCTTTTTTCGTCGACCTTTCTC

TTTCTTTCTTTCACACCTGTGCACCCGTTGTAGGTCCTCGAAAGAGGATC

>IEH00WJ01DVNL6 xy=1473_2492

TAGTGTAGATAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAATCGTAGGCGAGGGTTGTCGCTGGCCT

CTCGGGGCATGTGCACGCCCGAGCCCTTGAATCCCAAACACCACATGTGAACCCACCGTAGGCCTTCGGGCCTA

TGTCTTATCATATAATCTGAATGTCTAATAGAATGTAAACCCATTTCGTTGC

>IEH00WJ01CDN03 xy=858_2645

CGTATGGACAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGAGCATATCAGTAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGG

AGCATATCAATAAGCGGAGGAATCCGTAGTGAACCTGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATA

AGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGT

>IEH00WJ01BNPAZ xy=562_3657

TAGTCGCATAAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGAACGCCCGGGCTTCGGCCTGGTTATTC

ATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTCTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGGTGGACACTT

CAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAAATTAAAA

>IEH00WJ01B2AI9 xy=729_323

ATACGACGTAAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAATACGTTTGGTTCTGATGCTGGCTCGTC

ACTGAGCATGTGCTCGATCCATAACTATTTATCTTCTCTTGTGCACCTTTTGTAGTCTTTCAGAGCAAGTGATAACT

CTCGCAGCAATGCGGTTTGGGGGACTTGGGCGTGAGCCCTTCCCCTTC

>IEH00WJ01DAD4P xy=1231_1655

TATCACTCAGAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAAGTAGAGGGCCCCTGGGGTCCAACCTA

CCCACCCGGTGTTTAATTGTAACCTTGTTGCTTCGGTGCGCCGCCTCACGGTCCGCCGGGGGCTTCTGCCCCGG

GTCCGCGCGCACCGGTAGACACCATTGAACTTCTTGTTCTGAACGATTGCAC

>IEH00WJ01AEBMK xy=45_4042

CTATGTACAGAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAGTGTTCTCTGCCCTCACGGGTAGAAACGCT

CACCCTTGTATATTATATCTTTGTTGCTTTGGCAGGCCGCCCTCGGGCACCGGCTCCGGCTGGATCGCGCCTGC

CAGAGGAAACCCAAACTCTGAATGTTAGTGTCGTCTGAGTACTATCTAATA

>IEH00WJ01DFSEK xy=1292_3578

TAGTGTAGATAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAGAGTTCATGCCCTTTAGGGTAGATCTCCCA

TCCTTTGTCTATATACCTCTGTTGCTTTGGCAGGCCGAACTATTAGTCTACCGGCTCTGCTGGTAAGCGCCTGCCA

GAGGACCCCCACTCTGAGAGTTAGTGTCGTCTGAGTACTATATAATAGT

>IEH00WJ01CMQ2E xy=962_500

CAGTACTGCGAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGTAAACCGAGGTGCGAGGGCTGTCGCTGA

CCTTTTTTGGTCGTGCACGCCCGAGCGCTCTCACACAATCCATCTCACCCCTTGTGCACCACCGCGTGGGTTCCC

TTTCTGGCTTGTCCGAAGGGGGCTCGCGTTTTCACACAAACTTGAATTGGT

Brock Biology of Microorganisms (2012)

Metodické přístupy ekologie mikroorganismů

Mikrobiální genomy slouží jako databáze informací o fenotypech

Brock Biology of Microorganisms (2012)

16S tRNA 23S 5S tRNA 18S ITS1

5.8S

ITS2 28S

DNA

RNA

transkript

hotová

rRNA

transkripce transkripce

štěpení štěpení

ribozóm

PCR product

(RNA as template)

PCR produkt

(templátem je RNA)

PCR produkt

(templátem je RNA)

PCR produkt

(templátem je RNA)

PCR produkt

(templátem je DNA)

PCR produkt

(templátem je DNA)

RNA amplikony:

Identifikace mikroorganismů obsahujících ribosomy RNA amplikony:

Identifikace mikroorganismů produkujících ribosomy

Prokaryota (bakterie) Eukarota (houby)

Analýza aktivního společenstva mikroorganismů

Výhody: Kromě informace o složení společenstva v půdě máme šanci analyzovat i to, které procesy právě probíhají. Porovnáním DNA a RNA zjistíme, jaké má společenstvo v půdě složení (DNA) a které mikroorganismy jsou v dané chvíli aktivní (RNA) Nevýhody: RNA je méně stabilní než DNA (štěpení RNAzami) Obsah RNA v prostředí je řádově nižší než DNA Většina RNA molekul nemusí mít informační hodnotu RNA nelze sekvenovat přímo, je nutné ji nejdříve převést na DNA

Analýza RNA umožňuje sledovat expresi genů

Metody ekologie mikroorganismů - přehled

Metody ekologie mikroorganismů

Kvantifikace mikrobiální biomasy – analýza lipidů

Charakteristika společenstvev (fingerprintové metody) – DGGE, T-RFLP

Analýza složení společenstva / metagenomu – 454 pyrosekvenace

Analýza aktivních členů společenstva - Stable Isotope Probing

DGGE je elektroforetická separační metoda, která je založená na rozdílech v

teplotách tání dvouřetězcových fragmentů DNA. Elektroforéza obvykle probíhá ve

vertikálních aparátech na polyakrylamidovém gelu ve kterém je ustaven gradient

denaturačního činidla. Elektroforéza trvá poměrně dlouho (až desítky hodin) a tak je

nutné cirkulací elektroforetického pufru zabránit vyprázdnění horní nádrže. Gel také

musí být v homogenní teplotě (obvykle 60°C), čehož se dosahuje ponořením do

média, které je ohříváno a mícháno. Elektroforetické přístroje pro DGGE jsou proto

specifické a odlišují se od běžných elektroforéz.

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

(DGGE)

Gely pro DGGE jsou gradientové,

obsahují tedy gradient denaturačního

činidla. Jako denaturační činidla se

používají například formamid a

močovina.

Výsledky separace jsou závislé na

použité koncentraci denaturačních

činidel, podobně jako při klasické

elektroforéze se používají široké

gradienty (pro studium rozdílných

DNA molekul) nebo úzké gradienty,

které jsou teoreticky schopny odlišit i

mutaci v několik málo párech bází.

Nalití gelu je klíčovým krokem pro

úspěch separace, k ustavení

gradientu je třeba použít vhodný

mixér.

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Při DGGE se dělí PCR produkty

vhodné sekvence DNA - často rDNA

nebo sekvence genu,

charakteristického pro určitou skupinu

mikroorganismů. K PCR produktu se

ligázou připojuje GC-kotva (asi 20

bp), která zajišťuje vhodnou míru

denaturace dsDNA molekul a

usnadňuje migraci.

Elektroforéza probíhá po dobu

několika hodin (15-20).

Po skončení elektroforézy jsou gely

obvykle barveny ethidiumbromidem.

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

V optimálním případě by jeden pruh na gelu měl odpovídat jednomu druhu

(kmenu) mikroorganismu a intenzita pruhu (do určité míry) odpovídá zastoupení

dané molekuly v prostředí. Někdy je možné pruhy z gelu vyříznout a sekvenovat.

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Typickým výsledkem DGGE analýzy je kladogram, který umožňuje srovnat

druhovou diverzitu a podobnost mikrobiálních společenstev. Analýza sekvencí

vybraných pruhů na gelu pomůže odpovědět na otázku, které taxonomické

jednotky (druhy, kmeny) mikroorganismů se v daném vzorku vyskytují.

Výhody a nevýhody metod - metoda je vysoce citlivá (to je dáno použitím PCR kroku pro zmnožení materiálu) - ve spojení se sekvenací umožňuje taxonomickou identifikaci - dá se použít pro určitou část populace (specifické primery) - je semikvantitativní (díky PCR)

- omezený počet srovnávaných vzorků - není možné analyzovat zároveň taxonomicky vzdálené skupiny (například houby i bakterie) - příprava gelů pro DGGE je pracná a obtížná - náročná je optimalizace metody (volba vhodného primeru, vhodného rozmezí gradientu) - výsledky nemusí být úplně jednoznačné (jeden kmen může dát jako odezvu dva proužky, proužky se mohou na gelu překrývat) - ne vždy je možné použít proužek z gelu přímo k sekvenaci

Metoda volby: když potřebujeme identifikovat majoritní zástupce společenstva

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE),

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)

Metoda je založená na rozdílech v umístění restrikčních míst v sledované

sekvenci. Umístění restrikčního místa může být specifické pro daný taxon.

V prvním kroku prbíhá PCR amplifikace, při které je jeden primer označen

fluorescentní sondou.

Soubor PCR produktů je úplně naštěpen vybraným restrikčním enzymem.

Fragmenty po štěpení jsou elektroforeticky separovány. Pouze ty fragmenty,

které obsahují značený primer (tedy terminální) lze detekovat na základě

fluorescence a identifikovat jejich délku.

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)

Analýza probíhá na kapilární

elektroforéze (podobně jako

klasická sekvenace).

Výsledkem analýzy je

elektroforetogram, v němž výšky

píků (osa y) odpovídají relativní

četnosti restrikčního fragmentu

dané délky (osa x).

Jeden pík reprezentuje všechny

fragmenty stejné délky, nikoli

individuální molekuly.

Příliš krátké (ani příliš dlouhé)

fragmenty nelze kvantifikovat.

Cena: 160 Kč / vzorek.

Výhody a nevýhody metod - metoda je vysoce citlivá (to je dáno použitím PCR kroku pro zmnožení materiálu) - dá se použít pro určitou část populace (specifické primery) - je semikvantitativní (díky PCR), kvantifikace je přesnější než u DGGE - teoreticky neomezený počet srovnávaných vzorků - vyšší technická rozlišovací schopnost

- není možné analyzovat zároveň taxonomicky vzdálené skupiny (například houby i bakterie) - neumožňuje následnou sekvenaci a taxonomickou identifikaci

- část společenstva nemusí být v profilu zastoupena (chybí restrikční místo, nebo je příliš blízko značeného primeru) - jednotlivé píky často zahrnují mnoho (často příbuzných) taxonů

Metoda volby: když potřebujeme srovnat mnoho vzorků

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)

Next-generation-sequencing : porovnání sekvenačních

platforem

Mil. sekvencí Kč/milión Délka % chyb v jednom běhu sequences capillary sequencing 0.000384 80 000 000 1100 b <0.1 454 Junior 0.08-0.1 16 000 700 b 1-4% 454 FLX+ 1.0-1.2 10 000 750 b 1-4% Ion Torrent 5-8 124 250-300 b >4% Illumina MiSeq 14 116 2 x 300 b 0.2-0.5% Illumina HiSeq 2000 375 16 2 x 150 b 0.2-0.5%

Nejběžnější sekvenační platformy

© Tomáš Větrovský

Sekvenace poskytuje detailní obrázek složení mikrobiálního společenstva

Složení bakteriálního

společenstva ve vzorku půdy

Brock Biology of Microorganisms (2012)

Pro každou sekvenci lze teoreticky najít jejího producenta a funkci

Metagenomika ukazuje teoretický potenciál společenstva

Metatranskriptomika napovídá, které procesy právě probíhají

Výhody a nevýhody metod - umožňuje velkou taxonomickou hloubku (identifikace sekvencí, přítomných ve velmi malém množství – několik setin procenta) - rychlá a (relativně) levná sekvenace genomů - vysoký poměr množství informace / cena - jediná alternativa pro tvorbu metagenomů (které skupiny genů jsou v daném prostředí dominantní ?)

- nelze technicky použít pro omezené množství sekvencí (nejmenší množství cca 25 000 sekvencí) - poměr informace / cena stoupá s velikostí vzorku - metoda je více chybující než klasická sekvenace

Metoda volby: analýza metagenomů, transkriptomů a genomů

454 pyrosekvenace a sekvenace na Illumina MiSeq

Analýza mikrobiálních lipidů

Podnětem pro využití analýzy mikrobiálních lipidů bylo zjištění, že složení

lipidické frakce mikroorganismů se odlišuje a je taxonomicky specifické, obvykle

pro vyšší taxony (G+ a G- bakterie, houby). I jednotlivé druhy mají specifické

složení lipidické frakce, které je ovšem do určité míry modifikováno podmínkami

prostředí.

Na podobném principu je založena stará metoda pro kvantifikaci biomasy hub na

základě obsahu lipidu ergosterolu ve vzorku.

Fakt, že složení lipidické frakce je závislé na nutričním stavu buňky (buňka v

příznivých a nepříznivých podmínkách se velmi liší obsahem zásobních lipidů)

vede k úvahám, zda by analýza mohla také určit fysiologický stav buňky.

Analýza lipidů se obvykle provádí jako:

- analýza všech lipidů (TLA)

- analýza membrávých lipidů (PLFA, phospoholipid fatty acids)

- analýza methylesterů mastných kyselin (FAME, důvodem je nutnost

esterifikace při analýze na plynovém chromatografu).

Analýza methylesterů mastných kyselin (FAME)

Mastné kyseliny jsou v mikrobiální buňce obvykle složkou buněčných a dalších

membrán.

Volné mastné kyseliny jsou obvykle označovány kódy, které znázorňují délku

řetězce, počet a umístění dvojných vazeb, větvení, přítomnost cyklopropanového

kruhu atd.

Analýza mikrobiálních lipidů

1 .Extrakce lipidů z půdního vzorku 2. SPE –frakcionace lipidů

Fosfolipidy (PL) Glykolipidy Neutrální lipidy

4. Separace & identifikace

PLFA/ PLEL

(GC-MS)

5. Specifické profily PLEL a PLFA půdního mikrobního společenstva

Uvolnění lipidů z buněk do chloroformu

i14:0

PLEL i20:1

PLEL i20:0 3A. Uvolnění isoprenoidních

řetězců archaeálních fosfolipidů (PLEL)

Základní kroky analýzy polárních lipidů Postup získání profilů mikrobiálního společenstva na základě analýzy lipidů

HI

KOH

3B. Uvolnění mastných kyselin z bakteriálních a mikroeukaryotních PLFA

& 3C. PLFA frakcionace na

základě přítomnosti esterově a neesterově

vázaných skupin

PLEL

EL-PLFA

NEL-PLFA

Original slide courtesy of Dana Elhottová

Analýza methylesterů

mastných kyselin (FAME)

Výsledkem stanovení na GC je

chromatogram, na jehož základě

se stanoví relativní a absolutní

množství jednotlivých MK ve

vzorku.

Vzhledem k tomu, že jednotlivé

mastné kyseliny jsou

charakteristické pro určité taxony,

umožňuje FAME určit podíl

biomasy G+ či G- bakterií nebo

hub.

Vzorky lze na základě profilů MK

srovnávat a stanovovat jejich

podobnost či diverzitu.

U čistých kultur je do určité míry

možno použít výsledků k

identifikaci ve spojení s databází

kmenů (např. systém Sherlock).

Analýza methylesterů mastných

kyselin (FAME)

Mastné kyseliny jsou v mikrobiální buňce obvykle

složkou buněčných a dalších membrán.

Volné mastné kyseliny jsou obvykle označovány

kódy, které znázorňují délku řetězce, počet a

umístění dvojných vazeb, větvení, přítomnost

cyklopropanového kruhu atd.

např.

18:0 je mastná kyselina s osmnáctiuhlíkatým

řetězcem, bez dvojných vazeb

18:2 ω 6,9 je rovněž osmnáctiuhlíkatá MK se

dvěma dvojnými vazbami na šestém a devátém

uhlíku od methylového konce molekuly

br označuje větvení

cy označuje pozici cyklopropanového kruhu

Před analýzou na plynovém chromatografu jsou

MK esterifikovány methylovou skupinou.

Analýza lipidů: Přeměna listového opadu

-8 -6 -4 -2 0 2 4

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

Month

2 10

4 12

6 18

8

PC

2 (

17

.1%

)

PC 1 (52.4%)

Analýza hlavních komponent složení mikrobiálního společenstva v opadovém sáčku na základě profilů PLFA. Enzymové aktivity na rozkládajícím se opadu ukazují sukcesivní změny: pokles aktivity β-glukosidázy, vzestup aktivity endoglukanázy a maximum produkce ligninolytických enzymům mezi 8.-10. měsícem. Mikrobiální společenstvo na rozkládaném opadu se rovněž v čase vyvíjí.

Výhody a nevýhody metody - metoda je založena na použití biomasy, nikoli nukleových kyselin; extrakce je proto obvykle jednodušší, produkuje reprezentativnější vzorek a vzorek je analyzován přímo (x PCR) - umožňuje studovat zároveň populace bakterií, půdních hub i dalších mikroorganismů

- poměrně nízká citlivost (metoda nezávislá na kultivaci) -náročnost na vybavení (kapalinový nebo plynový chromatograf) - zastoupení mikroorganismů v prostředí nemusí být homogenní (odebrání reprezentativního vzorku) - nerozlišuje se živá a mrtvá, aktivní a pasivní biomasa - nemá vysokou taxonomickou diskriminační schopnost - složení biomasy může odrážet fyziologický stav mikroorganismu

Analýza mikrobiálních lipidů

Stable Isotope Probing (SIP)

Metoda je založená na studiu inkorporace stabilního (neradioaktivního) isotopu

uhlíku 13C do mikrobiální biomasy. Umožňuje spojit studium funkce společenstva s

taxonomickou detekcí aktivních druhů (označených 13C). Do studovaného

systému se přidá 13C-značený substrát (například glukóza). Po inkubaci se

stanovuje obsah 13C v markerových molekulách.

Jako markerové molekuly se používají mastné kyseliny (ve spojení s analýzou

lipidů), 16S rDNA či 16S rRNA (rozdělení „lehkých“ a „těžkých“ molekul

diferenciální centrifugací).

Metoda SIP byla vyvinuta ve spojení s analýzou mastných kyselin. Využití DNA

umožnilo taxonomickou identifikaci mikroorganizmů. Nejnověji (v roce 2002) byla

popsána metoda RNA-SIP, která přinesla vysoké zvýšení citlivosti – protože

aktivně rostoucí bakteriální buňky mají až 18,000 kopií 16S rRNA namísto pouze

12 kopií 16S rDNA. Proto RNA-SIP umožňuje detekci využití substrátu v kratším

časovém úseku než se buňky stačí rozdělit, tedy dříve, než může přidání

substrátu ovlivnit složení společenstva.

Nutné vybavení: značený substrát, centrifuga o požadovaných parametrech.

Po přidání substrátu, značeného

stabilním isotopem 13C, se

značený isotop akumuluje v

biomase aktivně metabolizujících

mikroorganismů. Složení

„aktivního“ společenstva lze pak

vyhodnotit při analýze lipidů

anebo – po separaci „těžkých“

(značených) a „lehkých“ molekul

DNA pomocí molekulárních

metod.

Separace nukleových kyselin mezi 12C a 13C není obvykle v praxi úplně

bezproblémová, protože část

mikroorganizmů je značena pouze

částečně. Proto mezi frakcemi s 12C a 13C obvykle bývá postupný přechod.

Stable Isotope Probing (SIP)

Metody: Stable Isotope Probing (SIP)

identifikace frakcí v kterých je přítomna DNA pomocí qPCR

Vzorek CO2

Podíl 13C-CO2

Celková respirace

DNA

extrakce

13C DNA

neoznačená 12C-DNA

Rozdělení DNA ultracentrifugací na základě vznášivé

hustoty

vysráženi DNA ve

frakcích

• DGGE

• T-RFLP

• Klonování a sekvenace

vzorky obsahující 13C, nebo 12C DNA

Mikrobiální společenstvo

13C-značená celulóza

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

13C DNA

Original slide courtesy of Mary Beth Leigh

11

11

14

11

71

45

14

71

70

18

72

13

23

12

64

32

13

53

36

13

94

39

53

96

39

83

99

40

14

04

40

74

09

41

34

15

42

04

22

43

04

31

43

84

40

44

34

48

44

94

53

46

14

77

48

44

90

49

8

0

100

200

600

Aktivní část mikrobiálního společenstva:

Označení druhů, využívajících celulózu isotopem 13C

Podíl DNA mikroorganismů (qPCR),

využívajících celulózu (zeleně)

0

100

200

300

400

Analýza společenstva hub pomocí T-RFLP

Zelené sloupce: houby využívající celulózu

Červené sloupce: ostatní druhy Bakterie L horizont Houby

Bakterie O horizont Houby

L horizont

O horizont

12C-DNA

13C-DNA

Výhody a nevýhody metody - rozlišuje aktivní a neaktivní mikroorganismy (biomasu) - umožňuje selektivně sledovat využití určitého (značeného) substrátu - ve spojení s RT-PCR je extrémně citlivá a umožňuje detekci složení

nerostoucího společenstva

- vyžaduje spojení s dalšími technikami (PCR nebo RT-PCR a DGGE, RFLP nebo FAME) - nutné speciální vybavení (ultracentrufuga a nejlépe také RT-PCR) - substráty značené stabilními isotopy jsou drahé (13C glukóza – 2.000 Kč/g, 13C celulóza – 36.000 Kč/g, 13C lignin – 500.000 Kč/g) a je jich k dispozici omezený počet

Stable Isotope Probing (SIP)

Alef K a Nannipieri P 1995. Methods in Applied Soil Microbiology and

Biochemistry. Academic Press – půdní mikrobiologie a biochemie.

Kowalchuk GA a kol. 2004. Molecular Microbial Ecology Manual. Kluwer

Academic Publishers – podrobné protokoly molekulárních (DNA)

metod.

Burns RG a Dick RP 2002. Enzymes in the Environment – Activity, Ecology

and Applications. Dekker – půdní enzymy.

Madsen EL 2008. Environmental Microbiology – From Genes to

Biogeochemistry. Wiley-VCH – environmentální mikrobiologie.

Paul EA a kol. 2007. Soil Microbiology, Ecology, and Biochemistry. Academic

Press, 3rd edition – metody v půdní ekologii, mikrobiologie půdy.

De Bruijn et al. 2011. Handbook of Molecular Microbial Ecology. Wiley –

molecular methods and metagenomics

Literatura k dalšímu studiu – metody v ekologii

mikroorganizmů

DIPLOMOVÉ PRÁCE - EKOLOGIE MIKROORGANISMŮ

LABORATOŘ ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGIE

Mikrobiologický ústav AV ČR

Saprotrofní houby v půdě • Exprese a aktivita enzymů v prostředí • Přeměna

organických látek v půdě • Interakce miroorganizmů • Procesy cyklu C a N

• Ekosystémy narušené lidskou činností

Více informací:

Petr Baldrian (baldrian@biomed.cas.cz, 723770570)

sránky skupiny a nabídka témat online: http://www.biomed.cas.cz/mbu/lbwrf