Sylabus Základy bioinženýrství N319002

1

Sylabus Základy bioinženýrství N319002

Sylabus obsahuje souhrn základních faktů předmětu Základů bioinženýrství. Pro jejich

správnou interpretaci, pochopení a začlenění do kontextů je třeba mít znalosti základních

předmětů, jako jsou Fyzika, Matematika, Analytická a Fyzikální chemie, Biochemie,

Mikrobiologie, Chemické inženýrství. Před každou kapitolou jsou okruhy témat, u nichž je

doporučeno si osvěžit své znalosti pro smysluplné vstřebání probírané látky. Za každou

kapitolou jsou otázky, jejichž promýšlením (a ideálně správným zodpovězením) se lze o

významný kus přiblížit k cíli absolvování tohoto předmětu, tedy získání efektivních znalostí a

dovedností pro kultivaci buněk v průmyslovém měřítku a tedy i úspěšné absolvování zkoušky.

Začlenění vašich dosavadních znalostí do nových kontextů a jejich rozšířením o oblasti

technologického a inženýrského přístupu ke kultivacím buněk bude hlavní cíl přednášek

předmětu Základy bioinženýrství.

Přednášky

1. Problematika biotechnologie a bioinženýrství, struktura biotechnologického procesu.

2. Technologické aspekty využití intaktních buněk jako producentů (rostlinné vs.

živočišné vs. mikroorganismy). Typy produktů. Možnosti použití enzymů.

3. Přípravné operace biotechnologických výrob (uchovávání mikroorganismů, příprava

inokula, příprava a sterilizace kapalného média, sterilizace bioreaktoru, SIP, filtrace a

sterilace plynů).

4. Parametry pro popis kultivace mikroorganismů. Výtěžnost a produktivita procesů.

Přehled typů kultivací.

5. Vsádková kultivace (charakteristika, hmotová bilance, použití).

6. Vsádková kultivace s postupným živením (charakteristika, způsoby přítokování

média, hmotová bilance, použití).

7. Kontinuální kultivace (charakteristika, způsoby řízení procesu, hmotová bilance,

porovnání se vsádkovou kultivací, použití). Volbu typu kultivace na základě

požadovaného produktu.

8. Aerace a přestup kyslíku (realizace aerace, mechanismus přestupu kyslíku, KLa).

9. Míchání (typy míchání v biotechnologických provozech, specifika míchání

bioreaktorů).

10. Bioreaktory (rozdělení, konstrukce, použití).

11. Měřené a regulované veličiny při kultivaci buněk. Základy regulace bioprocesů

(regulační okruh, typy regulátorů, veličiny v regulaci).

12. Dokončovací operace biotechnologických výrob (konvenční separační technologie,

dezintegrace buněk, membránové separační technologie).

13. Dokončovací operace biotechnologických výrob (extrakce, srážení, destilace, sušení,

stripování, CIP). Výrobní linka biotechnologického procesu.

14. Biotechnologie a bioreaktory pro zpracování odpadů z biotechnologických výrob.

2

1. Problematika biotechnologie a bioinženýrství, struktura

biotechnologického procesu.

Historie biotechnologií

před-Pasteur éra, před 1865

- alkoholické nápoje (pivo, víno)

- mléčné výrobky (sýry, jogurt)

- další fermentované potraviny

Pasteur éra, 1865 - 1940

- etanol, butanol, aceton, glycerol

- organické kyseliny (kyselina citronová)

- aerobní čištění odpadních vod

éra antibiotik, 1940 - 1960

- penicilin - submerzní kultivace

- rozšiřování palety druhů antibiotik

- technologie živočišných buněk; vakcíny proti virovým onemocněním

- biotransformace steroidů

post-antibiotická éra, 1960-1975

- amino kyseliny

- single cell proteiny (SCP)

- enzymy

- technologie imobilizace enzymů a buněk

- anaerobní čištění odpadních vod (bioplyn)

- bakteriální polysacharidy (xanthan, dextran)

éra nových biotechnologií, 1975-

- hybridomová technologie - monoklonální protilátky

- monoklonální diagnostické testy (1980)

- genetické inženýrství (1974)

- lidský insulin (1982)

- první klonovaný živočich - ovce Dolly (1997)

- publikování kompletního lidského genomu v Science and Nature (2001)

Historie biotechnologií je přehledně zpracována na http://biotechinstitute.org/what-is-

biotechnology/timeline?tid=98

Biotechnologie

každý proces, který využívá živé organismy nebo jejich části k tvorbě nebo úpravě

produktů, k získání rostlin nebo zvířat s lepšími vlastnostmi, nebo k získání

mikroorganismů pro speciální účely

aplikace biologických systémů a organismů v technických a průmyslových procesech

zahrnuje procesy katalyzované čistým enzymem nebo směsí enzymů, intaktní

(funkční) mikrobiální, rostlinnou nebo živočišnou buňkou, nebo jednou či více

organelami izolovanými z buněk

3

Bioinženýrství

Bioinženýrství je jedna z částí

biotechnologie - interdisciplinární obor

(biochemie, biologie, mikrobiologie,

fyzikální chemie, chemické inženýrství,

biofyzika, konstrukce a stavba zařízení,

měření a regulace).

Bioinženýr zajišťuje průmyslovou realizaci

biotechnologických procesů.

Biotechnologie je průnik tří základních

disciplín: biologie, chemie a inženýrství.

Bioinženýrství je průnik dvou základních

disciplín: biologie a inženýrství.

Pro řízení biologických procesů je tedy

nutné ovládat jednotlivé disciplíny ale umět je propojit a používat znalosti jednotlivých

disciplín v kontextu ostatních.

Základní schéma operací v biotechnologickém procesu.

4

2. Technologické aspekty využití intaktních buněk jako

producentů (rostlinné vs. živočišné vs. mikroorganismy). Typy

produktů. Možnosti použití enzymů.

Podněty k zopakování si…

Definice rychlosti; matematické a grafické vyjádření.

Kinetika chemických reakcí 0. a 1. řádu (A→B). Řešení kinetických rovnic.

Mechanismy reakcí, katalýza, řídící děj.

Mechanismus katalyzovaných reakcí a typy katalyzátorů. Porovnání chemických a

biologických katalyzátorů.

Enzymy – funkce, rozdělení, vlastnosti, kinetika enzymových reakcí. Význam a

stanovení konstant KM a vmax v kinetické rovnici Michaelis-Menten.

Řád enzymové reakce.

Inhibice enzymové reakce – druhy a význam.

Základní druhy metabolismu mikroorganismů..

Základní metabolické dráhy a jejich návaznost.

Kultivace mikroorganismů je proces, při kterém mikroorganismy spotřebovávají substrát a

živiny na rozmnožování a případné produkty. Cílem je produkce požadovaného produktu co

nejvyšší rychlostí, v co největším množství, nejjednodušší a nejlevnější cestou.

Využívají se následující schopnosti mikroorganismů:

syntetická schopnost

biokonverze

biodegradace

biosorbce (na povrchu)

bioakumulace (uvnitř buňky)

Základní rozdělení produktů kultivace:

biomasa

primární produkty

o produkty primárního (základního) metabolismu

o spojeno s růstem buněk

o etanol, kyseliny mléčná, citrónová, octová, metan

sekundární produkty

o produkty sekundárního (specifického) metabolismu; často biotransformace

o nerostoucí buňky

o antibiotika, steroidy, alkaloidy, vitamíny…

Příklady využití jednotlivých skupin mikroorganismů:

plísně – sýry, antibiotika, alkaloidy (námel – paličkovice nachová)

bakterie – mléčné kvašení, vitamíny, enzymy, rozpouštědla

kvasinky – pekařské droždí, krmná biomasa, etanol

jednobuněčné řasy – oleje, škrob, biologicky aktivní látky

Využívají formy a typy biokatalyzátorů:

intaktní buňky

o rostlinné buňky

o živočišné buňky

o mikrobní buňky

5

buněčné organely

enzymy

Intaktní buňky charakterizuje:

dlouhodobější účinek

ochrana enzymů buněčnou stěnou a membránou

možno buňky zvyknout na jiný substrát

univerzálnější (menší specifita)

mohou mutovat

Enzymy charakterizuje:

možné vyšší koncentrace substrátu

energeticky (provozně) méně náročné (než udržovat živou buňku)

ale čisté enzymy poměrně drahé

o volné enzymy - v „roztoku“

o vázané enzymy - imobilizace

nutno větší množství

vícenásobné použití

větší stabilita

Technologické aspekty specifik mikrobiálního metabolismu

Finální akceptor elektronů

Chemoorganotrofní organismy získávání energii oxidací organických látek (donory

elektronů). Jejich katabolismus produkuje vodík a elektrony (NADH+H+), které musí být

následně využity. Ať už je mechanismus nakládání s nimi jakýkoli, musí existovat – jako

poslední krok – jejich předání na finální akceptor elektronů.

Podle finálního akceptoru elektronů se metabolismus rozděluje na:

respirace akceptor - látky přijaté z prostředí za účelem použití jako finální akceptory elektronů

o aerobní (kyslík)

o anaerobní (dusičnan, síran, thiosíran), pouze některá prokaryota

fermentace

akceptor – meziprodukt odbourávání degradované molekuly (např. pyrohroznová kyselina

nebo acetaldehyd)

Respirace

Zjednodušené schéma oxidativní fosforylace včetně finálního přenosu vodíku a elektronů při

respiraci.

6

Fermentace

Finálním akceptorem elektronů je část degradované molekuly - část molekuly se oxiduje (→ -

COOH, CO2) a část redukuje (→ ethanol, laktát). Příklady jsou například alkoholové kvašení

a mléčné kvašení prováděné některými anaerobní mikroorganismy a fakultativně anaerobními

mikroorganismy (nepřítomnost O2, Crabtreeho efekt - kvasinky).

Zjednodušené schéma finálního přenosu vodíku a elektronů při fermentaci (etanolové

kvašení).

Zjednodušení schéma finálního přenosu vodíku a elektronů při fermentaci (mléčné kvašení)

prováděné homofermentativními mléčnými bakteriemi např. Pediococcus, Streptococcus,

Lactococcus, Lactobacillus (některé druhy).

Udržovací (maintenance) energie

Udržovací (maintenance) energie je energie nutná k udržení homeostáze (vnitřního prostředí)

buněk a poskytuje ji tzv. basální metabolismus. Jakákoliv živá buňka představuje systém, kde

stále běží rozkladné a syntetické děje = endogenní metabolismus spotřebovávající udržovací

energii.

Hodnota udržovací energie je téměř konstantní. Ovlivňuje ji např. koncentrace O2, limitace

jinou živinou než zdrojem E. Neideální vnější prostředí znamená nutnost vydání většího

množství energie na udržení optimálního vnitřního prostředí.

Čím nižší růstové rychlosti tím vyšší procentuální zastoupení energie pro udržovací účely v

celkovém množství spotřebované energie.

7

Příklady technologií rozdělených podle finálního akceptoru elektronů

Metabolismus Příklad

mikroorganismu

Technologie Základní

popis

Poznámka

Fermentace Methanobacterium

bryantii

produkce bioplynu

čištění odpadů

CH3-COOH →

CH4+CO2

Více viz

kapitola 14

Saccharomyces

cerevisiae

produkce etanolu Glukóza →

2CH3CH2OH +

2CO2

alkoholová

fermentace

(kvašení)

Lactococcus lactis produkce mléčné

kyseliny

Glukóza →

2CH3-CHOH-

COOH

mléčná

fermentace

(kvašení)

Clostridium

acetobutylicum

produkce

biorozpouštědel

složitý

mechanismus -

vznik směsi

CH3CH2OH,

CH3COCH3 a

CH3(CH2)2OH

aceton-

butanol-

etanolová

fermentace

Aerobní

respirace

většina

mikroorganismů

používaných v

biotechnologiích

(chemoorganotrofní)

aerobní produkce

sekundárních

metabolitů

produkce biomasy

(droždí)

aerobní čistění

odpadní vody a

plynu

C6H12O6 + 6

O2 → 6 CO2

+ 12 H2O

Uhlíkatá látka

- zisk energie

a zdroj uhlíku

Nitrosomonas sp.

(chemolitotrofní)

odstranění

amoniaku

z odpadní vody

nebo plynu

2 NH3 + 4 O2

→ 2 NO3- + 2

H+ + H2O

(dvoustupňový

proces)

Proces

nitrifikace

Anaerobní

respirace

Paracoccus

denitrificans

odstranění

dusičnanů/dusitanů

z odpadní vody

2 NO3- +

organická látka

(zdroj e-+H+)

→ N2 + (CO2 +

H2O)

(zjednodušená

rovnice)

Proces

denitrifikace

Methanothrix

soehngenii

produkce bioplynu

čištění odpadů

CO2+4H2 →

CH4+2H2O

Více viz

kapitola 14

8

Přehled metabolických efektů a jejich technologických důsledků

Pasteurův efekt

→ kvasinka Saccharomyces cerevisiae (fakultativně anaerobní) v

přítomnosti kyslíku zpomaluje kvašení (fermentace) a zrychluje se růst

kultury (využití aerobní respirace).

Crabtreeho efekt

→ kvasinka Saccharomyces cerevisiae v médiu s velkou koncentrací

glukózy provádí fermentaci i v přítomnosti kyslíku tj. místo aerobní

respirace.

Následkem je neefektivní využití glukózy-substrátu.

Kyslíkový efekt

Metabolismus fakultativně anaerobních mikroorganismů v přítomnosti

kyslíku.

Podstatou je represe metabolických drah (fermentace nebo anaerobní

respirace) v přítomnosti kyslíku a indukce drah, které jsou třeba k jeho

využití jako finálního akceptoru elektronů.

Glukózový efekt Utilizace směsi glukózy a dalšího substrátu.

Podstatou je represe ostatních metabolických drah glukózou.

Následkem je diauxie.

Katabolická

represe

Utilizace směsi různě utilizovatelných substrátů.

Podstatou je represe metabolických drah hůře utilizovatelných

substrátů těmi snáze.

Následkem je diauxie.

Způsoby technologického využití enzymů

Enzymy je možné použít jako volné („rozpustné”; disperze ve vodném médiu) enzymy nebo

imobilizované.

Volné enzymy

jednorázová aplikace

nízká stabilita volného enzymu

drahé (jednorázové použití)

Imobilizované enzymy

Důsledkem imobilizace je částečná ztráta aktivity enzymu z důvodu možné blokace aktivního

centra (zvláště při náhodné imobilizaci). Proto se snažíme používat orientovanou imobilizaci

– kdy jsou cíleně aktivní centra imobilizovaného enzymu orientována od nosiče.

Výhody imobilizovaných enzymů oproti volným:

opakované použití

zvýšení stability enzymů a prodloužení doby jejich aktivity

odpadá separace produktu a enzymu

možnost kontinuálního provozu

možnost účinnějšího řízení procesu

Způsoby imobilizace enzymů

Fyzikální adsorpce – alumina, kaolin, ionexy (jednoduché ale uvolňování enzymů)

Inkluze enzymů ve struktuře (bio)polymerního gelu (alginát, želatina…),

polopropustné membrány (semipermeabilní trubičky, ultrafiltrační membrány) nebo

nanomatric.

Kovalentní imobilizace na nosiče nesoucí vhodné funkční skupiny (-NH2, COOH, -

SH, -OH)

Příklad:

9

skupiny -NH2 na nosiči i enzymu + glutaraldehyd

-NH2 + HCO- → -N=CH-

Zesítění - spojení aminoskupin patřících k různým enzymům (např. –NH2 +

glutaraldehyd) tvorba proteinových agregátů (→ submerzní proces ale relativně

snadná separace)

Imobilizace na magnetické nosiče - polymerní částice s magnetickými oxidy železa,

silanizovaný magnetovec (→ submerzní proces imobilizovaných enzymů a zároveň

snadná separace)

Aplikace imobilizovaných enzymů

• míchané reaktory

• náplňové reaktory

• reaktory s fluidním ložem

• ultrafiltrační membránové systémy

Vlivy na enzymovou aktivitu mají:

inhibitory

aktivátory

koncentrace substrátu

koncentrace enzymu

fyzikálně-chemické vlastnosti prostředí

o pH

o teplota

o iontová síla

mechanické vlivy

o střižné síly (míchání)

Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí…

Porovnejte použití enzymů a intaktních buněk z technologického hlediska.

Jaké jsou mechanismy působení pH, teploty a střižných sil na enzymovou aktivitu?

Je rozdíl v nárocích na přesnost regulace teploty a pH mezi intaktními buňkami a

enzymy? Pokud ano tak proč?

Porovnejte základní druhy metabolismu z hlediska finálního akceptoru elektronů.

V jakém stavu, z chemického hlediska, musí být látka, aby

mohla sloužit jako finální akceptor elektronů?

Jaké jsou důsledky metabolických efektů na kultivaci buněk?

Jaké jsou technologické důsledky existence udržovací (maintenance) energie?

10

3. Přípravné operace biotechnologických výrob (uchovávání

mikroorganismů, příprava inokula, příprava a sterilizace

kapalného média, sterilizace bioreaktoru, SIP, filtrace a

sterilace plynů).


Vztah mikroorganismů k teplotě a chemickým látkám v okolí, termorezistence

jednotlivých fyziologických stavů mikroorganismů.

Výměníky tepla, transport tepla, prostup a přestup tepla.

Biotechnologický proces

Obecné schéma biotechnologického procesu.

Přípravné operace (upstream procesy)

• uchovávání mikroorganismů

• příprava inokula

• příprava kapalného média

• sterilace kapalného média

• filtrace a sterilace plynů

11

Uchovávání mikroorganismů

Délka a podmínky uchovávání závisí na rychlosti změn vlastností buněk, tedy na typu a stavu

buněk a způsobu uchovávání.

Dlouhodobé - inaktivní buňky

– lyofilizace (sublimace ledu za podtlaku + kryoprotektant)

– pod vrstvou parafinu (plísně),

– hluboké zmrazení -80°C hlubokomrazící box (+ kryoprotektant)

– velmi hluboké zmrazení -140°C - tekutý dusík (+ kryoprotektant)

Krátkodobé - aktivní buňky

– lednice 4-6°C (lépe odstředěné než v médiu)

– na agaru či jiném pevném médiu (přeočkovávání každých 4-6

týdnů)

Kryoprotektanty zabraňují vzniku ledových krystalů, které by při svém vzniku zničily buňky

(její struktury). Ledové krystaly jsou ostré a mají větší objem než kapalná voda. Koncentrace

kryoprotektantů se liší podle konkrétního použití, ale jsou většinou v rozmezí 10-25 %.

glycerol (zamrazování)

dimethylsulfoxid (DMSO) (zamrazování)

sacharóza (lyofilizace)

Příprava kapalného média

Mikroorganismy vyžadují určité spektrum chemických látek využívaných jako živiny a zdroje

energie:

látky využívané pro výstavbu buněk (asimilace)

látky využívané pro získávání energie (disimilace)

některé látky plní obě funkce - často uhlíkaté látky využívané jako zdroj uhlíku a

energie (glukóza)

anorganické živiny

základní prvky (C, N, O, H)

makroprvky (zdroje S, P, Mg, K…)

stopové prvky (Fe, Mn, Cu…)

organické živiny - organické zdroje C, N, P… a specifické látky např. AMK, vitamíny -

esenciální živiny (eukaryota)

Příprava kapalného média

Rozpuštění navážených složek média v upravené vodě (demineralizace, odstranění

chloru) v míchané nádobě (vrtulové míchadlo)

Úprava pH (před někdy nutné i po sterilaci)

Odstranění O2 (anaerobní kultivace)

o sterilací (s teplotou klesá rozpustnost plynů)

o nahrazení jiným plynem (N2, CO2, H2).

o přídavek redukujících chemických látek (kyselina thioglykolová nebo

její sodné soli, cystein, redukované železo)

Sterilace

Destrukce (tepelná, chemická) nebo odstranění (filtrací) všech životaschopných forem

mikroorganismů. Je nutné ji provést co nejdříve po přípravě média (minimalizace změn média

kontaminací).

Provedení:

12

o tepelná (suché, vlhké teplo)

o (mikro)filtrace

o záření

o chemická

Sterilace teplem

Tepelná destrukce mikroorganismů - tepelná denaturace enzymů základního významu. Je

vhodná pouze pro termostabilní média!

Provedení:

Průmyslové provozy – převážně separátně sterilovat médium (průtokový sterilizátor) a

bioreaktor.

Experimentální/laboratorní reaktory - převážně sterilace reaktoru s médiem.

Účinnost sterilace je funkcí teploty, času, podmínek, druhu mikroorganismu, fyziologickém

stavu a koncentraci buněk.

Vliv vlastností média na účinnost sterilace teplem:

vlhkost (↑↑)

pH (↑↓)

obsah lipidů, bílkovin a sacharidů (↑↓)

Vlastní provedení sterilace může být in-situ nebo ex-situ:

in-situ

nepřímým ohřevem přes duplikátor (pára) nebo elektricky

přímou aplikací ostré (přehřáté) páry do reaktoru (pozor na zředění média

zkondenzovanou párou!)

ex-situ

suchá sterilace (suchým vzduchem) v sušárně -

nástroje - 160-180°C/2 hod

vlhká sterilace (párou) - média, reaktory

o autokláv 0,2 MPa/121°C/15-45 min

o sterilace přímou parou, 135°C/5 minut

Kinetika procesu

k = f (teplota, podmínky, druh mikroorganismu, fyziologický stav buněk,)

Letalitní křivka je závislost mezi letální teplotou (T) a logaritmem doby působení (log τ).

Přímka spojuje body za daných podmínek, kdy jsou všechny mikroorganismy usmrceny.

Vyjadřuje základní vztah mezi teplotou a dobou sterilace: čím vyšší teplota tím kratší čas

nutný pro usmrcení mikroorganismů.

Při sterilaci teplem je nutné věnovat pozornost:

obsahu termolabilních látek

obsahu vzájemně spolu reagujících látek

obsahu spor

obsahu ochranných látek

intenzitě vedení tepla

k… rychlostní konstanta odumírání

c… koncentrace buněk qkT log

Ckdt

dCr

13

Termolabilní látky

vitamíny, růstové faktory, bílkoviny

Řešením je jejich sterilace filtrací a aseptické přidání po zchladnutí média

ionty kovů prvky - srážení v neutrálním a zásaditém prostředí ionty OH-

a PO4

3-

Řešením je:

o přídavek chelatačního činidla (EDTA, citrát) - sníží volnou koncentraci

o oddělená sterilace stopových prvků a fosforečnanů

o snížení pH média

Vzájemně spolu reagující látky

Při sterilaci může probíhat Maillardova reakce - karamelizace cukerné složky: reakce mezi

redukujícími cukry a volnými aminoskupinami proteinů. Produkty reakce mohou působit

inhibičně na růst mikroorganismů. Řešením je cukernou složku sterilovat zvlášť a asepticky

přidat po zchlazení média.

Obsah spor

Příkladem jsou spory rodu Clostridium - C. botulinum vytváří velmi tepelně odolné i při

120°C po dlouhou dobu. Řešením je:

frakcionovaná (přerušovaná) sterilace

1. sterilace

zchlazení + čas na vyklíčení spor (~ 18-24 h)

2. sterilace

snížení pH sterilovaného média

Obsah ochranných látek

Látky lipidy, bílkoviny a sacharidy mají ochranný účinek vůči působení tepla. Řešením je

prodloužení sterilace, vyšší teplota event. odstranění těchto látek.

Intenzita vedení tepla

Nutno počítat se zpožděním dosažení sterilační teploty např. v jádru velkých objemů

(nemíchaných) kapalin, potravin v obalech (konzervy, nápoje v lahvích atd.). Sterilační čas je

nutné počítat od dosažení sterilizační teploty v celém sterilovaném objemu.

Na to je třeba brát zřetel i v laboratorní praxi např. při sterilaci reaktoru s médiem nebo

velkých baněk v autoklávu:

1. problém

Teplota v jádru kapaliny se na požadovanou hodnotu dostane až se zpožděním z důvodu

pomalého vedení tepla v nemíchané kapalině, což je nutno zohlednit. Čím větší objem tím

delší čas prohřátí a tudíž sterilaci celého objemu.

2. problém

Při skončení sterilace se kapalný obsah reaktoru (velké baňky) chladí mnohem pomaleji než

okolní prostor v klávu (vedení tepla v nemíchané kapalině). Při příliš prudkém poklesu tlaku

se kapalina dostává do nové rovnováhy (kapalina-pára) tak, že prudce vyvře.

Řešením je:

mírné a postupné snižování tlaku v klávu bez automatizace po skončení sterilace

teplotní sonda, které se umístí do referenční podobně velké nádoby a podle její teploty

kláv upravuje program sterilace (moderní automatické klávy)

vhodný teplotní program, který zohlední jak zahřívání tak chladnutí kapalného média

14

Sterilace filtrací

Používají se membránové filtry, běžné s velikosti pórů 0,2 μm (vegetativní formy a spory)

Materiál membrán:

vodné roztoky - celulózo-acetátová membrána

nevodné roztoky (ethanolové, DMSO) - hydrofóbní polymery rezistentní k

rozpouštědlům – nylon, teflon

Používají se pro:

malé objemy kapalných médií s minimem suspendovaných pevných částic (kromě

mikroorganismů)

média obsahující termolabilní látky (vitamíny, růstové faktory)

médium obsahuje kovy, které se při sterilaci teplem vysrážejí

filtrace plynů

Sterilace zářením

Používají se γ, β nebo UV záření. Mechanismus je v přímé denaturaci nebo ničení

(makro)molekul (bílkoviny, DNA) nebo rozkladu vody na peroxidy/radikály, které sterilují.

Používají se pro:

termolabilní materiály/média

γ event. β - hloubková sterilace

UV - povrchy nebo plyny/kapaliny

Sterilace chemická

Používají se např. ethylenoxid, peroxid vodíku, kyselina peroctová, oxid chloričitý,

formaldehyd. Principem je chemická reakce nukleofilů nebo radikálů s molekulami v buňkách

= destrukce (makro)molekul.

Používá se pro:

vybavení – Petriho misky (balení prázdných sterilních - kyselina peroctová)

zařízení, laboratorní přístroje

nástroje

Úprava a sterilace plynů

Vzduch z atmosféry obsahuje prachové částice, aerosol, mikroorganismy, chemické látky a je

nutné ho upravovat.

záření (UV) - spíše (výrobní) prostory – haly, laboratoře…

filtrace

1. odstranění hrubších nečistot filtrací + komprese

2. sterilace – mikrofiltrace (pro aseptické procesy)

o membránové filtry

o hloubkové filtry – dlouhý filtr naplněný sterilizovatelným vláknitým

(celuláza, skelná vata, syntetická vlákna) event. zrnitým materiálem

obohacení kyslíkem (zvýšení parciálního tlaku kyslíku)

výroba kyslíku:

o molekulová síta (adsorbce menšího O2 průchod většího N2)

o destilace vzduchu

Příprava inokula

Inokulum je startovní množství buněk nebo spor. Jeho kvalita a množství je klíčový faktor

kultivace.

15

Získání inokula

Vlastní výroba (propagační stanice) - velké podniky

Nákup od velkých podniků nebo specializovaný podniků - malé podniky, kterým by se

nevyplatila propagační stanice - typicky malé pivovary

Nadnárodní potravinářské podniky mají většinou několik provozů vyrábějících stejný výrobek

a proto je nutná unifikace = centrální zásobování inokulem (např. zmražená suspenze, která se

dávkuje přímo do reaktoru)

Propagace je několika stupňová kultivace buněk ve speciálním technologickém celku

nazývaném propagační stanice, které následně slouží jako inokulum produkčního reaktoru.

Jedná se o série kultivačních nádob (baňky následně reaktory) přičemž každá následná je cca

5-10 x větší než předešlá. Buněčná suspenze z předchozího reaktoru slouží jako inokulum

následujícího. Kultura se při propagaci přeočkovává a provozní reaktor následně inokuluje

buňkami v exponenciálním růstu. Propagační poměr je poměr objemu inokula a čerstvého

kultivačního média, většinou 1:5-1:10.

Důvody propagace respektive propagační stanice tj. samostatné produkce inokula je získání

velkého množství inokula do produkčního reaktoru, přičemž benefity jsou:

menší nebezpečí kontaminace

zkrácení lag-fáze

zkrácení doby kultivace

vyšší produktivita produkčního reaktoru

(nekultivujeme inokulum v něm = odstranění tohoto neprodukčního času)

Proces propagace lze rozdělit na propagaci:

1. laboratorní - inokulum je skladovaná kultura (zamražená, lyofilizovaná, agary)

Začíná se baňkami a následně laboratorními reaktory, přičemž získáme ~ litry

suspenze.

2. provozní - jako inokulum je suspenze z laboratorní propagace.

Používají se malé provozní reaktory, přičemž získáme ~ m3 suspenze.


Jak se při jednotlivých typech uchovávání mohou měnit vlastnosti mikroorganismů?

Jaké způsoby použijete pro krátkodobé a jaké pro dlouhodobé skladování?

Jaký je rozdíl mezi základním a komplexním medium?

Definujte složení média pro fototrofní vs. chemotrofní; aerobní vs. fakultativně

aerobní vs. anaerobní; autotrofní vs. heterotrofní; eukaryotní vs. prokaryontní

mikroorganismy. Jaké další požadavky na kultivaci - další nezbytné složky prostředí -

mají zástupci těchto skupin mikroorganismů?

V jakých chemických formách dodáte do média základní prvky (C, N, O, H, P, S, K,

Mg)? Závisí forma na druhu použitého mikroorganismu?

Jakého řádu je kinetika tepelné sterilizace?

Jaká jsou omezení použití sterilace teplem při produkčních technologiích kultivace

buněk a v potravinářských výrobách?

Jaký je rozdíl mezi pasterací a sterilací? Při jakých biotechnologických procesech se

používá pasterace a při jakých sterilace?

Uveďte postup, jaký byste použili pro sterilizaci kapalného média s tepelně labilní

složkou s využitím tepelné sterilace.

Uveďte postup přípravy sterilního reaktoru s médiem připraveného k inokulaci včetně

postupu přípravy (sterilního) média z výchozích látek.

16

4. Parametry pro popis kultivace buněk. Výtěžnost a produktivita

procesů. Přehled typů kultivací.


Základní matematické funkce (lineární, exponenciální, logaritmické, parabolická,

hyperbolická) – matematické a grafické vyjádření.

Integrace základních matematických funkcí.

Disperzní soustavy.

Lambert-Beerův zákon: matematické a grafické vyjádření, použití pro

spektrofotometrické stanovení barevných roztoků a suspenzí.

Základní vlastnosti bakterií, kvasinek a plísní (stavba, nároky na prostředí a živiny,

metabolismus, tvorba spor).

Nároky mikroorganismů na prostředí a jejich rozdělení podle jejich nároků na kyslík,

pH, vodní aktivitu, teplotu, zdroje uhlíku, zdroje energie.

Základní termíny kinetiky rozmnožování mikroorganismů: doba zdvojení, generační

doba, synchronizovaný růst, růstová křivka.

Jakými metodami lze stanovit počet buněk? Jakou vypovídací schopnost jednotlivé

metody mají?

Kultivace mikroorganismů

Faktory ovlivňující kultivaci:

Fyzikální faktory (T, p, pH)

Chemické faktory (kvantita a kvalita živin, O2, H2O, přítomnost dalších chemických

látek)

Biologické faktory (stav a množství inokula, přítomnost dalších (mikro)organismů)

Technologické faktory (uspořádání procesu – batch, fed-batch, kontinuální)

Mechanické faktory (proudění kapalin/plynů, střižné síly)

Prostorové faktory (koncentrace mikroorganismů, kontakt s pevným materiálem)

Důvody proč sledovat a regulovat parametry ovlivňující mikroorganismy jsou dvojího druhu:

Využití optimálních podmínek – optimalizace podmínek kultivace = maximální

produkce (biomasa, produkty)

Využití nepříznivých podmínek – potlačení/usmrcení nežádoucích mikroorganismů

Působení prostředí vede ke změnám ve vlastnostech mikroorganismů:

Fyziologické a metabolické změny

– krátkodobé působení faktorů

reakce organismu (přizpůsobení) v rámci aktuálních regulačních mechanismů

(založených na aktuální genetické výbavě)

= rychlé reakce na fyziologické úrovni

krátkodobé změny (závisí na době působení faktoru)

Evoluční změny

– dlouhodobé působení faktorů

selekční lépe přizpůsobených jedinců/populací

= změny na genetické úrovni

dlouhodobé změny

Podmínky a jejich působení na fyziologii mikroorganismů:

Optimální podmínky

bez fyziologických změn, optimální růst/produkce

Mírně vzdálené od optima (+ nebo -)

17

stres, produkce stresových faktorů,

fyziologické i metabolické změny,

pokles růstu/produkce

Zásadně vzdálené od optima (+ nebo -)

o mikrobistatické podmínky způsobují

zastavení rozmnožování

o mikrobicidní podmínky způsobují smrt

Přehled základních vlivů prostředí na

mikroorganismy a možnost jejich využití proti

mikroorganismům.

Vliv prostředí Možnost využití proti mikroorganismům

Chemické látky mytí a sanitace, dezinfekce (NaOH, detergenty, Cl2, NaClO)

antimikrobiální účinky (antibiotika, detergenty)

ovlivnění fyzikálně-chemických vlastností prostředí např. pH

Teplota sterilace

pasterace

skladování za snížené teploty nebo zamražením

pH snížení pH potravin = zvýšení trvanlivosti (hlavně proti bakteriím)

tepelná sterilace účinnější při nižším pH

Vodní aktivita snížení obsahu vody - sušení (maso, ovoce…)

zvýšení koncentrace rozpustných látek (nasolení, vysoká koncentrace

cukrů)

Oxidoredukční

potenciál

uchovávání v ochranné atmosféře (CO2, N2) - eventuální anaerobní

rozklad je mnohem pomalejší.

Záření UV záření – sterilizace prostor (laminární boxy, místnosti…); germicidní

lampy – 260-270 nm

γ-záření – speciální sterilizace – proniká do hloubky – např. potravin

(čerstvé maso) – nemění organoleptické vlastnosti potravin

Hydrostatický

tlak

vliv mají až vysoké hodnoty - tlaky vyšší než cca 10 MPa zpomalení až

zastavení rozmnožování

usmrcení až řádově stovky MPa po dlouhou dobu

Mechanické vlivy mechanická dezintegrace buněk.

Elektrický proud

střídavý – zahřívání

stejnosměrný – elektrolýza, vznik biocidních látek (Cl2, atomární kyslík)

Ultrazvuk mechanická dezintegrace buněk.

Model růstu a množení, rychlost růstu buněk, růstová křivka

Kinetické rovnice růstu mikroorganismů

Kinetické rovnice růstu mikroorganismů je ekvivalentem chemické kinetiky 1. řádu.

Kinetická konstanta se nazývá specifická růstová rychlost a značí se malým řeckým

písmenem μ. Jednotkou je čas-1.

Výpočet specifické růstové rychlosti

Úpravou (integrací) kinetické rovnice získáme rovnici přímky, kde μ je směrnicí:

xdt

dx

Xdt

dX t

X

X

0

lnt

X

X

0

ln

18

Vlastnosti specifické růstové rychlosti

μ závisí především na:

• druhu mikroorganismu

• složení média

• zdroji C a E

• zdroji N

• přítomnost O2

• teplota

• pH

Kinetika odumírání mikroorganismů

Kinetické rovnice odumírání mikroorganismů je ekvivalentem chemické kinetiky 1. řádu.

Kinetická konstanta se nazývá specifická rychlost odumírání a značí se malým řeckým

písmenem δ. Jednotkou je čas-1.

Po spojení s rovnicí pro růst získáme komplexnější popis kinetiky mikrobní populace (růst i

odmírání):

Závislost specifické růstové rychlosti na koncentraci substrátu

Závislost specifické růstové rychlosti na koncentraci substrátu vyjadřuje Monodova rovnice:

Lze vyjádřit pro každou živinu – S pak představuje koncentraci substrátu, dusíkatého zdroje,

kyslíku.

Grafickým vyjádřením je hyperbolická závislost:

KS vyjadřuje afinitu buňky k substrátu (čím menší hodnota tím větší afinita)

μmax vyjadřuje maximální hodnotu µ za daných podmínek

linearizace

→

maxmax

111

S

KS

SK

S

s max

Xdt

dX

XXXdt

dX

19

Růstová křivka

Růstová křivka je grafické vyjádření závislosti počtu mikroorganismů na čase v průběhu

vsádkové kultivace.

Růstová křivka

Pro celou růstovou křivku platí obecný vztah:

V různých fázích nabývají rychlostní konstanty různých hodnot nebo i závislosti na čase

(konstantnosti)

Změny fyziologie buněk v různých fázích růstu

Je třeba si uvědomit, že existují zásadní rozdíly ve fyziologii buněk při jednotlivých fázích

růstové křivky, které se projevují například rozdílnou citlivostí buněk ke změnám prostředí:

největší citlivost je ve fázi zrychleného růstu a exponenciální fázi (největší buněčná

aktivita – metabolická aktivita i výměna mezi buňkou a prostředím)

= řízení kontinuálních procesů je náročné

nejmenší citlivost je ve stacionární fázi a fázi odumírání (nejmenší buněčná aktivita)

1. lag-fáze

2. fáze zrychleného růstu

3. exponenciální fáze

4. fáze zpomaleného růstu

5. stacionární fáze

6. fáze odumírání

XXXdt

dX

20

Fáze Charakteristika Příčiny Mat. popis

Lag fáze Buňky se nerozmnožují, buňky rostou - zvětšují hmotnost a objem –

příprava na rozmnožování

Délka lag-fáze závisí na:

druh mikroorganismu

fyziologický stav buněk

velikost inokula

složení média

podmínkách prostředí

Obecně lze říci, že čím větší je rozdílnost podmínek v kterých je kultura

před zaočkováním a po zaočkování tím delší bývá lag-fáze.

Délka lag-fáze neovlivní zbytek růstové křivky

adaptace na nové prostředí - přestavba buňky

z klidového stavu na buňku rozmnožující se -

exponenciálně rostoucí.

μ = δ = 0

Fáze

zrychleného

růstu

Přechodová fáze

začínající rozmnožování jeho postupné zrychlování

postupný náběh metabolismu na plnou rychlost

event. rozdíly v adaptaci mezi jednotlivými

buňkami (nesynchronizované) kultury

μ ≠ 0

μ = f(t)

δ = 0

Exponenciální

fáze

Buňky se rozmnožují největší rychlostí (μ = μmax) za daných podmínek;

počet buněk roste exponenciálně.

Charakteristická veličina je specifická růstová rychlost μ.

Produkční fáze při získávání biomasy nebo primárních metabolitů.

splněny všechny požadavky buněk – fyzikálně-

chemické parametry i složení média – pro růst

maximální rychlostí

μ ≠ 0

μ ≠ f(t)

δ = 0

Fáze

zpomaleného

růstu

Přechodová fáze

zpomalování rozmnožování

začínající působení příčin zmíněných ve

stacionární fázi

μ ≠ 0

μ = f(t)

δ = 0

Stacionární

fáze

Makroskopicky se projevuje jako konstantní koncentrace buněk.

koncentrace buněk je konstantní

zastavuje se růst a poté množení

přestavba buněk z rostoucích na klidové

v buňkách se hromadí zásobní látky

může docházet k přípravě ke sporulaci

Produkční fáze při získávání sekundárních metabolitů.

spotřebovaný substrát

hromadění metabolitů (přímá nebo nepřímá

toxicita (změna pH, redox potenciálu…)

inhibice produktem

limitace živinou (jinou než substrát)

vysoká koncentrace buněk (bakterie max. 109,

kvasinky max. 108 .mL-1)

μ → 0

a buď

μ = δ = 0

stacionární stav

nebo

μ = δ ≠ 0

dynamická

rovnováha

Fáze odumírání buňky se nerozmnožují

pokles koncentrace buněk

odumírání – lyze buněk

Viz stacionární fáze. μ = 0

δ ≠ 0

21

Vliv specifický aspektů mikrobiálního metabolismu na kultivaci buněk

Diauxie

Reakce mikroorganismů na více zdrojů uhlíku, energie nebo minerálních živin může být

dvojí:

postupná utilizace = diauxie

souběžná utilizace

Obecně jde o směs různě utilizovatelných živin. Typickými příklady je utilizace směsí:

glukóza/fruktóza + laktóza/maltóza…

NH4+ + NO3

-

Podle tohoto pohledu se jednoduché cukry mohou rozdělit na dvě skupiny:

I. Glukóza, manóza, fruktóza (přednostně utilizované)

II. Laktóza, xylóza, maltóza

Směs cukrů z I a II skupiny dojde k diauxii, směs cukrů z jedné skupiny nevyvolá diauxii.

Vysvětlení jevu je efekt katabolické represe a glukózový efekt.

Jedná se o projev regulačních schopností buňky - výběr „nejekonomičtějšího“ substrátu:

• minimalizace počtu a/nebo délky metabolických drah

• přednostní využití konstitutivních enzymů

• nesyntetizování induktivních enzymů (represe přítomností lépe využitelného substrátu

nebo nějakého meziproduktu jeho metabolické dráhy)

Represe ostatních drah je na úrovni transportu, syntézy enzymů i genetické.

Růstová křivka pro dva růstové substráty bez diauxie (vlevo) s diauxií (vpravo).

Růstová křivka pro tři růstové substráty s diauxií – polyauxie

(více než 2 substráty).

22

Inhibice růstu substrátem

Vysoká (inhibiční) koncentrace substrátu se vyskytuje:

typicky u batch-kultivací na počátku

typicky pro alkoholy, organické kyseliny, uhlovodíky

Důsledkem je:

prodlužuje se lag-fáze

snižuje hodnoty μ v exponenciální fázi

snížení celkového nárůstu buněk

Řešením je použití fed-batch kultivace.

Pokud je cílem produkce biomasy je pro požadovanou koncentraci biomasy (vysokou) je

potřeba dodat odpovídající množství substrátu. Tudíž požadovaná vysoká konečná

koncentrace biomasy znamená i nutnost vysoké počáteční koncentrace při batch procesu. Tato

koncentrace substrátu by téměř jistě byla inhibiční. Proto se používá fed-batch kultivace, tedy

přítokovaná, kdy se substrát přidává postupně tak aby jeho koncentrace nedosáhla inhibiční

hodnoty.

Tento jen lze i využít například při konzervaci potravin vysokými koncentracemi cukru

(inhibice + osmotický efekt). Konzervace vysokou koncentrací soli způsobí pouze osmotický

efekt.

Grafické znázornění Monodovy rovnice při inhibici substrátem (bez fáze růstu v přebytku).

Toxický substrát jako například fenol.

i

sK

SSK

S2max

23

Grafické znázornění Monodovy rovnice při inhibici substrátem (s fází růstu v přebytku). Pro

substrát typu glukóza.

Inhibice růstu produktem

Hromadění jednoho nebo více produktu metabolismu při kultivaci (hlavně u batch kultivací)

může vyvolat inhibice růstu produktem.

Mechanismus je dvojí:

přímá inhibice produktem (toxicita, zpětnovazebný efekt)

nepřímá inhibice změnou parametrů prostředí zapříčiněnou produktem (změna pH

(kyseliny), redox potenciálu…)

Důsledky jsou:

Nižší tvorba produktu nebo biomasy

Nevyužití limitující živiny (ztráty)

Pozor: Neovlivňuje délku lag-fáze ani hodnotu μ v exponenciální fázi.

Řešením může být:

kontinuální kultivace (vyplavování metabolitů)

kontinuální odstraňování produktu

o srážení (kys. citronová)

o mikrofiltrace – odstraňování média (v podstatě recykl buněk)

o stripování těkavých metabolitů (ethanol, biorozpouštědla)

24

Růstová křivka pro kultivaci s inhibicí produktem.

Parametry kultivace

biologické

růstová rychlost

výtěžnostní koeficienty

produktivita Pr

fyzikálně-chemické

pH, T, redox potenciál

koncentrace X, S, P, CL

technologické

parametry reaktoru/kultivační nádoby (objem celkový a pracovní, výška hladiny,

pracovní tlak, typ míchadla, typ distributoru vzduchu…)

RPM (revolutions per minute) otáčky míchadla za minutu

VVM (volume per volume per minute) míra aerace - objem plynu na objem vsádky za

minutu

fyzikální

V, m, ρ

Výtěžnostní koeficienty

Fm,.

SPY /SXY / XPY / 2/OPY2/OXY

SK,max

i

sK

PSK

Smax

25

Typy kultivací podle stavu buněk

povrchová kultivace

na povrchu kapaliny nebo imobilizované na pevném médiu - biofilm

submerzní kultivace

suspenze mikroorganismů - jednotlivé buňky nebo shluky buněk - flokule

Typy kultivací podle technologie

jednorázová (batch)

jednorázová s postupným živením (fed-batch)

semikontinuální

kontinuální


Vysvětlete pojmy asimilace i disimilace živiny a uveďte příklady.

Z jakého důvodu je potřeba ke konstatování „Buňky se rozmnožují největší rychlostí (μ

= μmax)“ přidat „za daných podmínek“?

Rozveďte jednotlivé body seznamu vlivů na specifickou růstovou rychlost (μ) – str. 18

nahoře.

Jak lze vyjádřit a jaké jsou jednotky „X“ při měření růstové křivky?

Jaké metody stanovení množství buněk byste pro měření růstové křivky použily a jaké

jsou jejich výhody a omezení?

Jaké je limit využití Lambert-Beerova zákona při měření koncentrace buněk (obecně

suspenzí)?

Jaký je rozdíl mezi termíny „historie“ buněk a „stáří“ buněk.

Je možné nastavit podmínky tak aby růstová křivka začínala přímo exponenciální fází,

a tedy nebyla lag-fáze? Jak byste to případně realizovali?

Z jakého parametru kultivace poznáte, že se jedná o inhibici produktem?

Jakých hodnot dosahuje koeficient výtěžností YX/S a na jakých parametrech to závisí?

Jaké jsou příčiny a podstata lýze buněk a jaké jsou její technologické důsledky?

Popište postup laboratorního experimentu a jeho vyhodnocení pro získání závislosti

specifické růstové rychlosti na neinhibičním a inhibičním substrátu.

26

5. Vsádková kultivace (charakteristika, hmotová bilance, použití).


Diferenciální rovnice: metody řešení, počáteční a okrajové podmínky. Totální

diferenciál.

Řešení soustav diferenciálních rovnic.

Základní pojmy bilancování hmoty a energie: výchozí vztahy, bilancovaný systém,

období a veličina, předpoklady a zjednodušení.

Vsádkový chemický reaktor.

Ideálně míchaný reaktor.

Charakteristika vsádkové kultivace

• nazývá se také jednorázová nebo batch kultivace

• jednorázová kultivace

• inokulace na začátku kultivace

• kompletní médium na počátku kultivace; celý pracovní objem reaktoru

• koncentrace extracelulárních produktů na počátku kultivace je nulová

Realizace vsádkové kultivace

1. naplnění reaktoru médiem o finálním složení i objemu

2. sterilace (přímá, nepřímá pára + míchání)

3. ochlazení média na kultivační teplotu

4. konečná úprava pH

5. očkování (zahájení kultivace)

6. spuštění aerace (přetlak oproti atmosféře)

7. kultivace (kontrola, měření, regulace, vzorkování)

Měří se a případně reguluje: pH, kyslík, redox potenciál, teplota, koncentrace

biomasy, substrátů, živin, složení plynů (O2, CO2…).

8. ukončení kultivace (vypnutí měřících a regulačních obvodů, aerace a míchání)

9. vypuštění vsádky

10. mytí, čištění a výplach reaktoru (zbavení pevných nečistot, v případě kontaminace

desinfekce a provedení perfektního výplachu, aby se odstranily iontově aktivní mycí

prostředky a desinfekce)

Použití vsádkové kultivace

produkce biomasy (ne vždy vhodné – inhibice substrátem)

produkce primárních metabolitů

produkce sekundárních metabolitů

Hodnocení vsádkové kultivace

Výhody

mírně nižší investiční náklady

relativně jednoduchý proces

flexibilní

Nevýhody

vysoké náklady na opakovanou přípravu inokula

malá produktivita

jednotlivé kultivace se mohou dost lišit

27

zatěžování zařízení opakovaným mytím a sterilacemi

nevhodné v případě:

o inhibice substrátem

o inhibice produktem

o glukózový efekt

Hmotová bilance jednorázové kultivace

Předpoklady a zjednodušení bilance

dokonale míchaný reaktor

bilanční období: začátek je právě inokulovaný reaktor a konec ukončení kultivace

(nezahrnuty přípravné operace jako napouštění media, inokulace, finální úprava media

ani následné operace jako vypouštění, zpracování suspenze aj.)

ρ = konstantní

zanedbání úbytku objemu v důsledku odparu vody (aerovaný systém) a odběru vzorků

zanedbání zvýšení objemu v důsledku přídavků kyseliny/hydroxidu při pH regulaci

Akumulace

mcelk (ρ = konst.)

𝑑(𝜌 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝜌 ∙

𝑑𝑉

𝑑𝑡= 0 𝑉 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡. =>

𝑑𝑉

𝑑𝑡= 0

ms

𝑑(𝑆 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙

𝑑𝑆

𝑑𝑡

mx

𝑑(𝑋 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙

𝑑𝑋

𝑑𝑡

mp

𝑑(𝑃 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙

𝑑𝑃

𝑑𝑡

Bilance celkové hmoty

[vstup] + [zdroj] = [výstup] + [akumulace]

Bilance biomasy

Bilance substrátu

dt

dXVVX .0..0

Xdt

dX

0dt

dV

dt

dV000

dt

dSVV

Y

X

SX

.0..

0/

SXY

X

dt

dS

/

28

Bilance produktu vázaného na růst

[0] + [𝑌𝑃/𝑆

𝜇 ∙ 𝑋

𝑌𝑋/𝑆∙ 𝑉] = [0] + [𝑉 ∙

𝑑𝑃

𝑑𝑡]

𝑑𝑃

𝑑𝑡= 𝑌𝑃/𝑆

𝜇 ∙ 𝑋

𝑌𝑋/𝑆

Bilance produktu nevázaného na růst – probíhá ve stacionární fázi

[0] + [𝛽 ∙ 𝑋 ∙ 𝑉] = [0] + [𝑉 ∙𝑑𝑃

𝑑𝑡]

𝑑𝑃

𝑑𝑡= 𝛽 ∙ 𝑋

Produktivita jednorázové kultivace

Množství biomasy

Výtěžnost

Produktivita

𝑃𝑅 =𝛥𝑚𝑋

𝑉 ∙ 𝑡=

(𝑋 − 𝑋𝑠𝑡𝑎𝑟𝑡) ∙ 𝑉

𝑉 ∙ (𝑡𝑔 + 𝑡𝑑) (𝑔 ∙ 𝑙−1 ∙ ℎ−1)

𝑃𝑅 =𝛥𝑚𝑃

𝑉 ∙ 𝑡=

(𝑃 − 𝑃𝑠𝑡𝑎𝑟𝑡) ∙ 𝑉

𝑉 ∙ (𝑡𝑔 + 𝑡𝑑) (𝑔 ∙ 𝑙−1 ∙ ℎ−1)


Definujte posloupnost základních kroků spuštění a provozování vsádkové kultivace od

reaktoru připraveného na inokulaci (vychlazeného a sterilního včetně média) až po

konec kultivace.

Nakreslete graf časových průběhů X, S, V pro vsádkovou kultivaci. Klaďte důraz na

přesné kreslení – tvar a umístění křivek jednotlivých závislostí v kontextu osy x a y

(začátek, konec, průběh, sklon) včetně vztahu jednotlivých závislostí mezi sebou.

Ujasněte si, jak se při vsádkové kultivaci mění hodnoty základních parametrů (S, X, V,

P) jak v čase a tak v objemu reaktoru.

Před sestavováním vlastní bilance si nakreslete schéma bilancovaného systému včetně

definování a zakreslení bilancovaných veličin.

Definujte, pro jaké bilancované období bude bilance sestavována.

Ujasněte si člen akumulace ve hmotové bilanci vsádkové kultivace.

Vyplňte následující tabulku jednotlivými členy hmotové bilance pro jednorázovou

kultivaci a porovnejte ji s tabulkou ostatních typů kultivací.

td - mrtvý čas (čištění, sterilace,

lag fáze, zpomalení růstu)

tg - exponenciální fáze

)(0 gVXXm Lfinal

g

g

SS

XX

S

XY

final

final

SX

0

0

/

29

vstup zdroj výstup akumulace

mX

mS

mP

mcelk

Jaké jednotky mají jednotlivé členy bilance?

Jaké jsou počáteční a okrajové podmínky pro odvozené kinetické rovnice bilance?

Je potřeba doplnit výsledné bilanční rovnice ještě dalšími vztahy, a pokud ano tak

jakými?

30

6. Vsádková kultivace s postupným živením (charakteristika,

způsoby přítokování média, hmotová bilance, použití).

Charakteristika vsádkové kultivace s postupným živením

nazývá se také jednorázová s postupným živením nebo fed-batch kultivace

vsádková kultivace s řízeným přítokem média (většinou koncentrát substránu event. i s

minerálními živinami) - do zaplnění pracovního objemu reaktoru.

start jako batch kultivace ale pouze s částečně naplněným reaktorem (např ¼)

koncentrace extracelulárních produktů na počátku kultivace je nulová

Použití vsádkové kultivace s postupným živením

produkce biomasy


produkce sekundárních metabolitů – výhody:

o možnost řízení nástupu stacionární fáze (limitace živinou např. fosforečnanem)

o možnost na začátku stacionární fáze začít dávkovat prekurzor

o možnost řízeného základního živení (maitenance energy) během stacionární fáze

Hodnocení vsádkové kultivace s postupným živením

Výhody

eliminace inhibice substrátem, glukózového efektu nebo problémům s viskozitou

média (viskózní substrát) na počátku kultivace

zkrácení lag-fáze

možnost lepší optimalizace procesu produkce biomasy a primárních i sekundárních

metabolitů (optimální přísun živin)

možnost přítokovat další látky ve vhodnou dobu např. prekurzory - sekundární

metabolity ve stacionární fázi

Nevýhody

větší riziko kontaminace (přítokování)

komplikovanější technologie (regulace)

Realizace přítokování média

Cílem je zajistit optimální živení. Příliš velká

koncentrace substrátu způsobí inhibici naopak

příliš malá koncentrace limitaci. Optimální je

růst v (mírném) přebytku pak je maximální růst

přítoku média lze realizovat jako:

Konstantní

stálá hodnota přítoku média

Exponenciální

zvyšování rychlosti přítoku média s

časem kultivace, tak aby se zajistil

exponenciální růst

hodnota přítoku se spočítá pro

µ=µmax (nejen exponenciální ale i maximální růst)

Proměnná (regulovaná)

31

hodnota přítoku média na základě aktuálních požadavků procesu

Konstantní přítokování média

Konstantní přítok média se vyznačuje:

nejjednodušší provedení

postupné plynulé zvyšování objemu bioreaktoru = zředění produkovaného metabolitu.

vhodné pro kultivace, kde má koncentrace produktu negativní vliv na metabolickou

aktivitu.

Má ale značné nevýhody:

nejméně efektivní přítokování média (µ<µmax)

nereaguje na aktuální stav buněk

se vzrůstající koncentrací buněk roste spotřeba substrátu, ale dodávka je konstantní.

Exponenciální přítokování média

přítok limitujícího substrátu zvyšován úměrně k rychlosti exponenciálního růstu

(matematický vztah pro kinetiku zvyšování lze vyjádřit z bilance pro µmax)

konstantní μ, konstantní S, exponenciální přítok

možnost udržet vysokou růstovou rychlost po dlouhou dobu

získání maximálního množství buněk za nejkratší čas v systémech se substrátovou

inhibicí

Má ale nevýhodu v tom, že nereaguje na aktuální stav a potřeby buněk – je založená na

předpokládaném chování buněk.

32

Proměnná rychlost přítokování média

Proměnná rychlost přítokování média se vyznačuje:

přítokování média se během kultivace mění podle požadavků mikroorganismů

(regulovaný kontinuální nebo diskontinuální přítok)

cílem je optimalizace procesu - růstové rychlosti, výtěžku metabolitu, produktivity

procesu na základě skutečných a aktuálních (ne vypočtených nebo předpokládaných)

požadavků mikroorganismů

použití pro speciální produkty - enzymy, antibiotika, aminokyseliny, rekombinantních

proteiny (regulace nákladná investičně i provozně)

Eliminuje všechny nevýhody předešlých způsobů přítokování ale za cenu vyšších nákladů.

Je nutné zvolit vhodnou veličinu pro měření a použití pro následnou regulaci přítoku, která

nejlépe vypovídá o aktuálním stavu systému. Optimální je měřit koncentraci substrátu ale

možné je měřit i jiné (nepřímé) parametry:

Přímé stanovení koncentrace substrátu

o přímé měření koncentrace substrátu (periodické vzorkování nebo kontinuální

měření)

o optimální ale ne vždy snadno proveditelné

Nepřímé stanovení - parametry úzce spojené s růstem a metabolismem buněk (lineární

závislost změn a minimální prodleva reakce na změnu) a optimálně snadno a on-line

měřitelné a zárověň s vysokou přesností a citlivostí měřitelné

o měření vznikajících metabolitů (S↓ P↓)

o CO2; měření v odplynech (S↓ CO2↓)

o měření rozpuštěného kyslíku (S↓ CL↑)

o měření kyslíku v odplynech (S↓ Cg↑)

o měření pH (S↓ pH↑)

33

Příklad diskontinuálního regulovaného přítokování včetně časového průběhu výstupu

z regulátoru (regulace 0/1). Vlastní provedení regulace je podrobně popsáno v Kapitole 11.

Hmotová bilance vsádkové kultivace s postupným živením

Předpoklady, zjednodušení a bilanční období viz vsádková kultivace.

Akumulace

mcelk (ρ = konst.) 𝑑(𝜌 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝜌 ∙

𝑑𝑉

𝑑𝑡

ms 𝑑(𝑆 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑆 ∙

𝑑𝑉

𝑑𝑡+ 𝑉 ∙

𝑑𝑆

𝑑𝑡

mx 𝑑(𝑋 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑋 ∙

𝑑𝑉

𝑑𝑡+ 𝑉 ∙

𝑑𝑋

𝑑𝑡

mp 𝑑(𝑃 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑃 ∙

𝑑𝑉

𝑑𝑡+ 𝑉 ∙

𝑑𝑃

𝑑𝑡

Bilance celkové hmoty


Bilance biomasy

Fdt

dV

dt

dV

dt

dVF

00

V

XFX

dt

dX ..

dt

dVX

dt

dXVVX ..0..0

34

Bilance substrátu

Bilance produktu vázaného na růst

[0] + [𝑌𝑃/𝑆

𝜇 ∙ 𝑋

𝑌𝑋/𝑆∙ 𝑉] = [0] + [𝑉 ∙

𝑑𝑃

𝑑𝑡+ 𝑃 ∙

𝑑𝑉

𝑑𝑡]

𝑑𝑃

𝑑𝑡= 𝑌𝑃/𝑆

𝜇 ∙ 𝑋

𝑌𝑋/𝑆−

𝐹 ∙ 𝑃

𝑉

Bilance produktu nevázaného na růst – probíhá pouze ve stacionární fázi

[0] + [𝛽 ∙ 𝑋 ∙ 𝑉] = [0] + [𝑉 ∙𝑑𝑃

𝑑𝑡+ 𝑃 ∙

𝑑𝑉

𝑑𝑡]

𝑑𝑃

𝑑𝑡= 𝛽 ∙ 𝑋 −

𝐹 ∙ 𝑃

𝑉

Produktivita

Viz vsádková kultivace.


Definujte posloupnost základních kroků spuštění a provozování vsádkové kultivace

s postupným živením od fáze reaktoru připraveného na inokulaci (vychlazeného a

sterilního včetně média) až po konec kultivace.

Nakreslete graf časových průběhů X, S, V pro vsádkovou kultivaci s postupným

živením. Klaďte důraz na přesné kreslení – tvar a umístění křivek jednotlivých

závislostí v kontextu osy x a y (začátek, konec, průběh, sklon) včetně vztahu

jednotlivých závislostí mezi sebou.

Ujasněte si, jak se při vsádkové kultivaci s postupným živením mění hodnoty

základních parametrů (S, X, V, P) jak v čase a tak v objemu reaktoru.

V jaké fázi růstové křivky a proč v ní se začíná s přítokováním média.

Jaké vlastnosti musí splňovat měřený parametr, aby ho bylo možné použít pro

nepřímou regulaci? Uveďte příklady.




Ujasněte si člen akumulace ve hmotové bilanci vsádkové kultivace s postupným

živením.

Vyplňte následující tabulku jednotlivými členy hmotové bilance pro jednorázovou

kultivaci s postupným živením a porovnejte ji s tabulkou ostatních typů kultivací.

SX

in

Y

X

V

SF

V

SF

dt

dS

/

dt

dVS

dt

dSVV

Y

XSF

SX

in ..0..

/

35


mX

mS

mP

mcelk




jakými?

Z bilance celkové hmoty získáte výslednou diferenciální rovnice dv/dt=F. Jak přítok

(F) zrealizujete a jakou konkrétní hodnotu/vztah dosadíte do rovnice za F?

36

7. Kontinuální a semikontinuální kultivace (charakteristika,

způsoby řízení procesu, hmotová bilance, porovnání se

vsádkovou kultivací, použití). Volbu typu kultivace na základě

požadovaného produktu.


Kontinuální chemický reaktor.

Doba zdržení, zřeďovací rychlost.

Terminologie: ustálený a neustálený stav, rovnováha, dynamická rovnováha.

Semikontinuální kultivace

Charakteristika semikontinuální kultivace

řada batch kultivací bez nutnosti inokulace (pouze první)

start jako batch kultivace

inokulace se provádí jen u startovní vsádky

inokulum každé následné vsádky je část objemu předchozí vsádky

bez dávkování média v průběhu jednotlivých kultivací

buňky v exponenciální fázi růstu (kromě startu – lag fáze)

koncentrace extracelulárních produktů na počátku první kultivace je nulová, další

kultivace už ne

Realizace semikontinuální kultivace 1. batch kultivace

2. ve vhodnou dobu (cca v 1/2 exponenciální fáze

– za inflexním bodem = vysoká koncentrace

biomasy) se vypustí 20-80 % obsahu reaktoru a

doplní na původní objem novým médiem

3. Před koncem exponenciální fáze (před

vyčerpáním substrátu – aby buňky byly v exp.

fázi) se opakuje vypuštění části média a

doplnění novým

periodické odebírání a zpracovávání produktu

(4. ukončení, vypuštění, mytí, dezinfekce…

(teoreticky nikdy)

Hodnocení semikontinuální kultivace Výhody

snížení nákladů na inokulum (pouze na startu)

úspora času a provozních prostředků

„nekonečné“ udržování exponenciální (= produkční) fáze

eliminace inhibice produktem (ředění)

žádná lag fáze mezi jednotlivými vsádkami (pouze na startu)

vysoká produktivita

Nevýhody

nebezpečí kontaminace

37

nebezpečí mutací buněk při dlouhodobém provozu

pouze produkce biomasy a primárních metabolitů

Použití semikontinuální kultivace Produkce biomasy

Produkce primárních metabolitů

Kontinuální kultivace

Charakteristika kontinuální kultivace

„nekonečná” kultivace

inokulace se provádí jen na začátku

start jako batch kultivace

buňky v exponenciální fázi růstu (kromě startu – lag fáze)

kontinuální přívod živin a odvod buněk, produktů a metabolitů

koncentrace produktů není nulová (kromě startu)

Realizace kontinuální kultivace

1. batch kultivace

2. ve vhodnou dobu (konec exponenciální fáze – za inflexním bodem = vysoká

koncentrace biomasy) se začne přítokovat čerstvé médium + otevřít přepad –

tranzientní stav

3. provozování kultivace - udržování dynamické rovnováhy + následující kontinuální

odebírání a zpracovávání produktu

(4. ukončení, vypuštění, mytí, dezinfekce… teoreticky nikdy)

Hodnocení kontinuální kultivace

Výhody

snížení nákladů na inokulum (pouze na startu)

odstranění lag-fáze (pouze na startu)

úspora času a provozních prostředků

38

„nekonečné“ udržování exponenciální (= produkční) fáze

eliminace inhibice produktem (vyplavování)

velmi vysoká produktivita, nízké provozní náklady

Nevýhody

nebezpečí kontaminace

nebezpečí mutací buněk při dlouhodobém provozu

pouze produkce biomasy a primárních metabolitů (jednostupňová)

málo flexibilní

Použití kontinuální kultivace (jednostupňové)

produkce biomasy


Obecně pro:

nízká koncentrace substrátu zvláště v kombinaci s velkou D

o nízká záměrně, z důvodu zamezení inhibice vznikajícím produktem

o nízká vyplívající ze specifik použitého média (např. odpadní vody)

o nízká z důvodu špatně rozpustného substrátu

inhibiční substrát

kultivace mikroorganismů s nízkým μ

Parametry pro popis kontinuální kultivace

Zřeďovací rychlost (D)

𝐷 =𝐹

𝑉 [ℎ−1]

Doba zdržení (t)

𝑡 =𝑉

𝐹=

1

𝐷 [ℎ]

Stavy systému při kontinuální kultivaci

neustálený (tranzientní) stav

o parametry kultivace jsou časově závislé

o přechod mezi vsádkovou a kontinuální kultivací v ustáleném stavu

o přechodový stav při změně podmínek - D, koncentrace živin, teplota, pH...

ustálený stav – stav dynamické rovnováhy, anglicky „steady state“

o parametry kultivace jsou časově nezávislé

Způsoby řízení kontinuální kultivace

chemostat

samoregulace pomocí limitace jednou živinou

turbidistat

regulace přítoku (D) na základě měření X

není limitace

Chemostat

• platí, že D = μ a zároveň μ < μmax

• koncentrace všech živin na vstupu jsou konstantní

• zřeďovací rychlost je konstantní

• jedna živina je limitující a její koncentrace je pak → 0; ostatní živiny nelimitující

39

• řídící reakce je v katabolismu a je jí rychlost spotřeby limitující živiny (S je mnohem

menší než KS)

• za daných podmínek se ustaví ustálený

stav a systém schopný samoregulace

Turbidistat

• platí, že D = μ a zároveň μ = μmax

= buňky rostou maximální rychlostí

• koncentrace všech živin na vstupu jsou

konstantní

• zřeďovací rychlost není konstantní (je

regulována) - měření X a podle toho

regulace F (a tedy D)

• všechny živiny v přebytku - žádná není

limitující

• řídící reakce nemusí být v katabolismu

(S může být i větší než KS)

• použití je při vysokých hodnotách D,

kdy malá změna D znamená velkou změnu koncentrace buněk což je potenciálně

nestabilní, špatně samoregulovatelný systém.

Porovnání chemostatu a turbidistatu a řízení procesu v kontextu závislosti μ na S

40

Časový průběh hodnot S, X, V při řízení procesu pomocí chemostatu

Časový průběh hodnot X, S a V při startu a následného provozování kontinuální kultivace

řízené na principu chemostatu. Dva mezní stavy po spuštění čerpadla pro (I) D a (II) D

Hmotová bilance kontinuální kultivace - produkce biomasy

Předpoklady, zjednodušení a bilanční období viz vsádková kultivace.

Akumulace

mcelk (ρ = konst.)

𝑑(𝜌 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝜌 ∙

𝑑𝑉

𝑑𝑡= 0 𝑝𝑟𝑜 𝑉 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡.

ms

𝑑(𝑆 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙

𝑑𝑆

𝑑𝑡 (𝑛𝑒𝑢𝑠𝑡á𝑙𝑒𝑛ý 𝑠𝑡𝑎𝑣)

𝑑(𝑆 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙

𝑑𝑆

𝑑𝑡= 0 (𝑢𝑠𝑡á𝑙𝑒𝑛ý 𝑠𝑡𝑎𝑣)

mx

𝑑(𝑋 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙

𝑑𝑋


𝑑(𝑋 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙

𝑑𝑋


mp

𝑑(𝑃 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙

𝑑𝑃


𝑑(𝑃 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙

𝑑𝑃


Bilance celkové hmoty (ustálený stav)


41

[𝜌 ∙ 𝐹] + [0] = [𝜌 ∙ 𝐹] + [𝜌 ∙𝑑𝑉

𝑑𝑡]

𝑑𝑉

𝑑𝑡= 0

Bilance biomasy (ustálený stav)

Bilance (limitujícího) substrátu (ustálený stav)

Bilance produktu vázaného na růst (ustálený stav)

[0] + [𝑌𝑃/𝑆

𝜇 ∙ 𝑋

𝑌𝑋/𝑆∙ 𝑉] = [𝐹 ∙ 𝑃] + 𝑉 ∙

𝑑𝑃

𝑑𝑡

𝑑𝑃

𝑑𝑡= 0 = 𝑌𝑃/𝑆

𝜇 ∙ 𝑋

𝑌𝑋/𝑆− 𝐷 ∙ 𝑃

Produktivita kontinuální kultivace (ustálený stav)

𝑃𝑅 = 𝐷 ∙ 𝑋 (𝑔 ∙ 𝑙−1 ∙ ℎ−1)

𝑃𝑅 = 𝐷 ∙ 𝑃 (𝑔 ∙ 𝑙−1 ∙ ℎ−1)

Porovnání kontinuální a batch kultivace

Výhody kontinuální kultivace oproti batch:

minimum ztrátových časů = vyšší produktivita

homogennější produkce (jednotlivé vsádky batch kultivace se mohou dosti lišit) =

menší nároky na dokončovací operace

vhodnější pro produkci biomasy a primárních metabolitů

obecně řečeno čím vyšší µ tím vhodnější kontinuální kultivace

nicméně kontinuální kultivace má i nevýhody:

jednostupňovou kontinuální kultivaci nelze použít pro produkci sekundárních

metabolitů (možno ale použít vícestupňovou kontinuální kultivaci)

dlouhodobý kontinuální provoz technologie je náročný na údržbu zařízení a s časem

roste riziko poruchy (kdekoli v celé technologii)

vysoké nároky na sterilitu

nebezpečí mutací buněk

nevhodný (těžko řiditelný) pro kultivace buněk s malým µ (možno ale použít recykl

biomasy)

malá flexibilita systému – spíše pro dlouhodobé a velkotonážní výroby

Kontinuální vícestupňová kultivace

Kontinuální vícestupňová kultivace znamená zapojení dvou a více reaktorů v sérii. Má dvě

základní využití a to produkce sekundárních metabolitů a v případě směsí substrátů

vyvolávajících diauxii.

XDdt

dX 0

dt

dXVXFVX ..0

dt

dSVSFV

Y

XSF

SX

in ..

/

SX

inY

XDSS

dt

dS

/

0

XDPR

42

Produkce sekundárních metabolitů

První reaktor nárůst biomasy čímž se spotřebuje substrát (exponenciální fáze) ve druhém

reaktoru kultura přejde do stacionární fáze a produkce sekundárních metabolitů. Možný je

přídavek prekurzorů před druhým reaktorem.

Použití při diauxii

Je možno nastavit různá D pro jednotlivé reaktory. Například pokud při F=konst. a ustáleném

stavu je μ1=2.μ2 pak musí D1=2D2 a tedy V1=1/2V2.

Kontinuální kultivace s recyklem biomasy

Cílem je zvýšit koncentraci buněk v reaktoru což vede k vyšší produktivitě a možnosti využít

vyšší D, protože vyplavené buňky se do reaktoru vrací (externí recykl) nebo v něm zůstávají

(interní recykl). Umožňuje tedy kultivaci za podmínek D > μ.

interní recykl (mikrofiltrační modul)

externí recykl (mikrofiltrace, sedimentace, kontinuální odstředivka)

Použití

Viz obecně kontinuální kultivace a speciálně pro kultivace mikroorganismů kde μ je velmi

malé – mikroorganismy s malou μ nebo malé μ jako důsledek nepříznivého prostředí (média)

např. limitace nebo inhibice (toxická substrát), obtížně degradovatelný substrát. Nízké

hodnoty μ zapříčiňují nestabilitu a špatnou regulovatelnost kontinuální kultivace – malé μ

znamená i malá D. Typické použití je v technologii čištění odpadních vod.

43

Výhody

rychlejší start kultivace

dosažení vysoké koncentrace produktu

snížení spotřeby C-zdroje (odpadá tvorba části biomasy)

úspora jednoho kroku dokončovacích operací - separace buněk od média


Definujte posloupnost základních kroků spuštění a provozování kontinuální kultivace

od fáze reaktoru připraveného na inokulaci (vychlazeného a sterilního včetně média)

až po konec kultivace.

Nakreslete graf časových průběhů X, S, V pro kontinuální kultivaci provozovanou jako

chemostat. Klaďte důraz na přesné kreslení – tvar a umístění křivek jednotlivých

závislostí v kontextu osy x a y (začátek, konec, průběh, sklon) včetně vztahu

jednotlivých závislostí mezi sebou.

Porovnejte ztrátové časy všech tří typů kultivací. V jakém klíčovém parametru pro

popis kultivace se případné rozdíly projeví?

Ujasněte si rozdíl mezi startovními (Xstart, Sstart, Vstart, Pstart), aktuálními (X, S, V, P) a

vstupní (Xin, Sin, Pin) hodnotami parametrů kultivace nejen u kontinuální kultivace ale i

obou předchozích.

Ujasněte si, jak se při kontinuální kultivaci mění hodnoty základních parametrů (S, X,

V, P) jak v čase a tak v objemu reaktoru. Jaký na to má vliv to, jestli se systém nachází

v ustáleném nebo neustáleném stavu?

V jaké fázi růstové křivky a proč v ní se začíná se startem kontinuální kultivace

(spuštění čerpadla)? Porovnejte start jednotlivých typů kultivací.

Vysvětlete podstatu samoregulace u chemostatu.




Ujasněte si člen akumulace ve hmotové bilanci kontinuální kultivace.

Vyplňte následující tabulku jednotlivými členy hmotové bilance pro kontinuální

kultivaci v ustáleném stavu a porovnejte ji s tabulkou ostatních typů kultivací.


mX

mS

mP

mcelk



44


jakými?

Jak by se změnily výsledné rovnice bilance, pokud by měly být použity pro neustálený

stav?

Jaká živina a z jakého důvodu se nejčastěji v chemostatu používá jako limitující?

Uvědomte si rozdílné nároky na přípravné a dokončovací operace pro jednotlivé typy

kultivací (vsádkové vs. kontinuální)

Jaké jsou důvody pro použití kontinuální kultivace s recyklem biomasy a kontinuální

vícestupňové kultivace?

45

8. Aerace a přestup kyslíku (realizace aerace, mechanismus

přestupu kyslíku, KLa).


Vlivy na rozpustnost plynů ve vodě. Henryho zákon.

Kinetika sdílení hmoty. Difuze, konvekce, přestup a prostup hmoty.

Disperzní soustavy – plyn-kapalina.

Jaké jsou funkce kyslíku v (mikro)organismu?

Distributory vzduchu

Systémy bez mechanického míchání

• porézní materiály (keramika, sklo, sintrovaná legovaná ocel)

• trubkové distributory

Systémy s mechanickým mícháním

• trysky (menší průtoky vzduchu)

• aerační věnce (větší průtoky vzduchu)

(otvory 1-5 mm podle typu mikroorganismu – riziko zarůstání)

Umístěny jsou centrálně pod míchadlem a alespoň jedna řada otvorů je

na spodní straně aby mohla kapalina vytéct.

46

Vliv rychlosti proudění na přestup hmoty

Proudění v kapalině

Proudění v plynu

Dispergace

Dispergací se rozumí rozbíjení plynových bublin na menší. Tímto procesem se větší

mezifázového rozhraní a intenzifikuje přestup hmoty (a tepla).

Smykové napětí

Vyvolání smykového napětí:

vysoká výtoková rychlost plynu do kapaliny (otvory – aerační věnec, frita, tryska…)

systémy s pneumatickým mícháním (nutný vysoký tlak plynu)

mechanické míchadlo (malá výtoková rychlost plynu = menší tlak = menší náklady na

aeraci)

Vlastnosti disperze (z hlediska přenosu hmoty)

stupeň dispergace

velikost zádrže dispergované fáze

doba zdržení zádrže plynu v kapalině

stabilita disperze (koalescence bublin)

Koalescence

Koalescencí se rozumí spojování se plynových bublin ve větší, čímž dochází ke zmenšení

mezifázového rozhraní a tím snížení přestupu hmoty (a tepla). Oba procesy dispergace i

koalescence probíhají ve vsádce souběžně.

Disperzní systémy z hlediska koalescence bublin jsou:

koalescentní systémy (čistá voda)

nekoalescentní systémy (voda + sole, alkoholy, povrchově aktivní látky)

Velikost bublin

Velikost bublin je jedním ze základních parametrů ovlivňujících přestup hmoty.

Bubliny se podle velikosti dělí na:

malé bubliny

o dlouhá doba zdržení

o malý objem

mm 0,5

bD

47

o rigidní povrch

o velké mezifázové rozhraní

střední bubliny

o nejlepší pro přestup hmoty - optimální kombinace velikosti mezifázového

povrchu, objemu a velikosti (umožňující deformace bubliny při pohybu)

o optimální velikost je

velké bubliny

o krátká doba zdržení

o velký objem

o oscilace tvaru při pohybu

o malé mezifázové rozhraní

Mechanismus přenosu kyslíku

Podle typu proudění je možné rozdělit sdílení hmoty difúzí nebo konvekcí (prouděním).

Čím turbulentnější proudění tím slabší stacionární vrstva a tím lepší přestup hmoty přes

fázové rozhraní a zároveň lepší sdílení hmoty konvekcí (prouděním) v kapalině.

Veličiny pro kvantitativní popis spotřeby kyslíku

Výtěžnostní koeficienty (O2)

vztažený na biomasu

vztažený na produkt

Spotřeba kyslíku

𝑞𝑂2

, Celková rychlost spotřeby kyslíku vztažená na jednotkový objem reaktoru [mg.gsuš

-1.h-1]

mm 6-0,5

bD

mm 6

bD

mm 3-2

bD

XY

qOX

O 2

2

/

, 1

XYdt

dX

Ydt

dCúprava

dC

dXY

OXOX

L

L

OX 22

2

//

/

11

dt

dP

Ydt

dCúprava

dC

dPY

OP

L

L

OP

2

2

/

/

1

48

𝑞𝑂2 Specifická (měrná) rychlost spotřeby kyslíku tzv. respirace buněk vztažená na jednotku

sušiny buněk [mg.L-1.h-1]

𝑞𝑂2

, = 𝑞𝑂2∙𝑋

Kinetika přestupu kyslíku přes mezifázové rozhraní g/l

Přestup hmoty přes mezifázové rozhraní závisí na:

plocha mezifázového rozhraní

rozdíl koncentrací (hnací síla)

konstanta úměrnosti (závisí na látce, prostředí a podmínkách)

Kinetickou rovnici popisující kinetiku přestup kyslíku (hmotnostní tok) lze tedy napsat ve

tvaru:

𝑑𝑚𝑂2

𝑑𝑡= 𝐾𝐿𝑎 ∙ (𝐶∗ − 𝐶𝐿) ∙ 𝑉

Kde:

KLa je objemový součinitel přestupu kyslíku (h-1)

KL je celkový součinitel přestupu kyslíku z plynu do kapaliny (m.h-1)

a je měrný mezifázový povrch (m-1) (m2/m3)

C* je rovnovážná koncentrace rozpuštěného kyslíku (mg.L-1)

CL je aktuální koncentrace rozpuštěného kyslíku (mg.L-1)

Hmotová bilance kyslíku

Za předpokladu že není produkt a není chemická reakce spotřebovávající kyslík, můžeme pro

jednotlivé kultivace sestavit rovnice popisující změnu koncentrace kyslíku v čase:

Vsádková kultivace


Akumulace (vsádková kultivace)

𝑑(𝐶𝐿 ∙ 𝑉)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙

𝑑𝐶𝐿

𝑑𝑡

Bilance kyslíku (vsádková kultivace)

[𝐾𝐿𝑎 ∙ (𝐶∗ − 𝐶𝐿) ∙ 𝑉] + [−1

𝑌𝑋/𝑂2

∙ 𝜇 ∙ 𝑋] = [0] + [𝑉 ∙𝑑𝐶𝐿

𝑑𝑡]

𝑑𝐶𝐿

𝑑𝑡= 𝐾𝐿𝑎 ∙ (𝐶∗ − 𝐶𝐿) −

1

𝑌𝑋/𝑂2

∙ 𝜇 ∙ 𝑋

Rovnovážná koncentrace kyslíku ve vodě je v závislá především na teplotě a množství solí a

její hodnota je ~ 9 mg.L-1 (POUZE!).

Bilance kyslíku pro vsádkovou kultivaci s postupným živením a kontinuální kultivaci se

odvodí postupem ekvivalentním k bilanci substrátu pro tyto typy kultivací. Není třeba je znát

u zkoušky.

Pěnění média

Pěna vzniká aerací nebo vývinem plynu v médiu obsahujícím pěnotvorné činidlo, které se

hromadí na mezifázovém rozhraní a tvoří tam stabilizující film a tím podporuje vznik a

stabilitu pěny. Pěnotvorná činidla jsou především proteiny a jiné látky (detergenty, saponiny).

49

Metody odpěňování

mechanické – nástavec na hřídeli míchadla nad hladinou = mechanické rozbíjení pěny

chemické – přídavek povrchově aktivních látek – odpěňovadel (vyšší alkoholy,

mastné kyseliny, speciální minerální oleje)

Narušují film nebo vytěsňují pěnotvorné činidlo z fázového rozhraní l-g nebo

mění povrchové napětí v opačném směru než pěnotvorné činidlo a tím

destabilizují pěnu. Často ale výrazně zhoršují přestup hmoty mezi plynnou a

kapalnou fází (zvyšují odpor tím, že tvoří vrstvu na mezifázovém rozhraní) a

tím především zhoršují přestup kyslíku.

Stanovení KLa, c* a 𝒒𝑶𝟐

,.

Existuje několik metod stanovení konstant pro popis přestupu kyslíku, jednou z nich je

dynamická metoda.

Provedení dynamické metody

Výpočty konstant

50

Příklad Vypočtěte konstanty C*, q,

O2 a KLa z hodnot naměřených při dynamické metodě:

Přerušení dodávky vzduchu:

čas s 0 6 12 18 24 30 36

DOC mg.L-1 5,2 4,6 4,0 3,3 2,5 1,8 1,1

Obnovení vzdušnění:

čas s 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 102 108 114

DOC mg.L-1 1,2 2,3 3,1 3,7 4,0 4,3 4,5 4,7 5,0 5,1 5,2 5,3 5,4


Jakými způsoby je možné zvýšit dodávku kyslíku buňkám při kultivaci?

Za jakých podmínek kultivace se zvyšuje riziko limitace kyslíkem?

Z čeho se skládá člen bilanční rovnice popisující kinetiku přestupu kyslíku z plynu do

kapaliny?

Jaké jsou pozitivní a negativní vlastnosti jednotlivých velkostí bublin (malé, střední a

velké) z hlediska přestupu kyslíku z plynné do kapalné fáze? Proč je velikost 2-3 mm

nejlepší?

Cvičně sestavte bilanční rovnice pro kyslík pro vsádkovou kultivaci s postupným

živením a kontinuální kultivaci (nebudou vyžadovány u zkoušky).

Definujte pěnu z hlediska disperzních soustav.

Jaké látky způsobují pěnění média při kultivaci? Jaký je zdroj těchto látek při kultivaci

buněk? Jaký vliv má aerace na pěnění média?

Popište laboratorní pokus (dynamická metoda) a jeho vyhodnocení pro získání

konstant KLa, c* a 𝑞𝑂2

,.

51

9. Míchání (typy míchání v biotechnologických provozech,

specifika míchání bioreaktorů).


Newtonowské vs. nenewtonovské kapaliny.

Hydromechanické procesy. Proudění tekutin.

Bezrozměrná kritéria podobnosti.

Míchání je hydromechanický proces, při němž dochází k přemisťování částic systému, aby se

získala nebo zachovala rovnoměrnost rozložení vlastností

Účel míchání

homogenizace (koncentrace, teplota)

suspendace

dispergace (jedné fáze do druhé)

intenzifikace (sdílení hybnosti, tepla a hmoty – snížení tloušťky laminární podvrstvy)

Typy míchání

o Mechanické

vibrační

rotační

o Pneumatické

o Hydraulické

Mechanické míchání – rotační míchadla

Typy rotačních míchadel

• Pomaloběžná

o kotvové

o šnekové

• Rychloběžná

o axiální – vrtulové

o radiální – turbínové (otevřené, uzavřené),

lopatkové, listové

Rotační pomaloběžná míchadla

kotvové míchadlo šnekové míchadlo

Použití: husté, viskózní, nenewtonovské kapaliny

52

Rotační rychloběžná míchadla

Axiální

lopatkové míchadlo vrtulové míchadlo

Radiální

turbínové míchadlo bez dělícího kotouče turbínové míchadlo s dělícím kotoučem

Schéma mechanicky míchaného reaktoru – geometrie

systému s turbínovým míchadlem

b - šířka narážek b = 0,1D

C - vzdálenost míchadla nade dnem C = 0,2D – 0,5D

d - průměr míchadla d = 0,25D – 0,5D

h - výška lopatek míchadla h = 0,2d

H - výška plnění vsádky H = D

viskózní kapaliny = větší d

Proudění v mechanicky míchaném

reaktoru (turbínové míchadlo)

primární (většina E)

o tangenciální (rotační)

sekundární (kvalita míchání)

o radiální

o axiální

53

Použití vrtulového a turbínového míchadla v biotechnologických procesech

Turbínové míchadlo

větší střižné síly → dispergace plynu

lepší distribuce bublin

v aerovaných bioreaktorech

Vrtulové míchadlo

intenzivnější míchání, lepší

homogenizace - velká tzv. čerpací

kapacita

příprava médií (rozpouštění solí),

příprava suspenze křemeliny (viz

filtrace)

Narážky

Narážky brání vzniku středového výru a roztočení kapaliny tj. tangenciálnímu proudění.

Standardně jsou osazovány 4

narážky o šířce 0,1D.

Mechanické míchání - vibrační míchadla a kývavé míchání

54

Výpočet příkonu rotačního míchadla - příkonová charakteristika

kritéria Re, Fr, Eu

Re Reynoldsovo

Fr Froudovo

Po příkonové kritérium

Turbínové míchadlo vyžaduje vyšší příkon.

Míchání v aerovaném bioreaktoru

V aerovaném systému je menší hustota promíchávané vsádky tj.

příkon míchadla může být menší. Čím větší je

plynová zádrž tím menší příkon je potřebný.

(graf a funkce jsou ilustrativní – není třeba je

znát u zkoušky)

Smykové napětí

V okolí míchadla je velké smykové napětí, které vyvolává střižné

síly, což může vést až k poškození buněk. Náchylné tento typ

mechanického namáhání hlavně vláknité mikroorganismy. Ty

reagují změna morfologie - vytvářejí tzv. klubíčka (pelety).

Velikost poškození závisí na:

• intenzitě

• době setrvání

• frekvenci průchodu

N – počet otáček

D – průměr míchadla

– objemový průtok plynu gV

)(...,,Re, 21 PfFrfPo

55

Hydraulické a hydrodynamické míchání

V případě hydraulického míchání se přečerpává

velký objem kapaliny za malého tlaku. V případě

hydrodynamického míchání malý objem kapaliny

za velkého tlaku přičemž vstup do reaktoru je řešen

tryskou. Kapalina je do reaktoru přiváděna

tangenciálně, což způsobí tangenciální proudění.

Pneumatické míchání

U aerovaných systémů jde zároveň o míchání i

aeraci. Využívá se i u anaerobních systémů např.

metanogeneze, kdy je plynem (vznikajícím

metanem) přiváděným dospod reaktoru

promícháván obsah.

Méně účinný systém míchání i přestupu kyslíku ale

pro řadu biotechnologických procesů dostačující.

Výhodou je jednoduchost, nízké investiční i

provozní náklady a absence pohyblivých částí

(menší poruchovost).


Do jakého typu proudění se transformuje většina mechanické energie dodané

míchadlem? Je to žádoucí? Lze to ovlivnit?

Promyslete rozdíly funkce vrtulového a lopatkového míchadla a vhodnosti jejich

použití.

Jaký typ míchadla byste použily v aerovaném mechanicky míchaném reaktoru a proč?

Jaké jsou důvody odolnosti mikroorganismů proti mechanickým vlivům prostředí? Jak

se liší mechanická odolnost základních typů mikroorganismů (bakterie, kvasinky,

plísně)?

Jaká je reakce vláknitých mikroorganismů na mechanický stres při míchání? Jaké má

tato reakce negativní důsledky? Jaké vláknité mikroorganismy jsou technologicky

významné?

Jakému mechanicky míchanému systému je třeba dodat více energie (příkon

míchadla)? Systému bez nebo s narážkami. Systému aretovanému nebo bez aerace.

Jaké jsou důvody?

Jak vysoká koncentrace buněk, především vláknitých mikroorganismů, ovlivňuje

hydromechanické vlastnosti vsádky?

56

10. Bioreaktory (rozdělení, konstrukce, použití).


Chemické reaktory.

Pístovým tok.

Rozdělení bioreaktorů

Z hlediska velikosti

• na laboratorní (asi do 30 dm3)

• čtvrtprovozní (30 – 100 dm3)

• poloprovozní (100 dm3 – 5 m3)

• provozní (větší než 5 m3)

Podle způsobu provádění procesu

• vsádkové reaktory

• vsádkové reaktory s postupným živením

• kontinuální reaktory

Podle druhu použitého biokatalyzátoru

• reaktory pro kultivaci buněk

• reaktory pro enzymové reakce

Podle formy použitého biokatalyzátoru

• reaktory pro kultivaci volných buněk nebo enzymů

• reaktory s vázanými buňkami nebo enzymy

Z hlediska potřebnosti aerace

• aerobní

• anaerobní

Podle způsobu míchání

• s mechanickým mícháním

• s pneumatickým mícháním

• s hydraulickým mícháním

Konstrukční materiály bioreaktorů

Požadavky na konstrukční materiály bioreaktorů:

kvalita povrchu (leštěné)

mechanické odolnost - tvrdost (tlakové nádoby)

chemická odolnost (pH médií, pH při mytí)

produkty metabolismu - pH 1 (citronová kyselina) – 10 (lyze buněk)

(naleptání = ztenčení, nerovnosti povrchu, uvolňování iontů do média)

Při projektování a realizaci reaktorů je třeba se vyvarovat rohů (konstrukce) a štěrbin nebo

spár (spojování materiálů).

57

Materiál Charakteristika Použití

Železo

litina – C ~ 1%, S ~ 0,5%

křehká, poměrně odolná proti korozi

méně ušlechtilý materiál, některé konstrukční

prvky

ocel – snížený obsah C a S

kujná, tažná – vlastnosti podle obsahu C a S a

legujících prvků

• uhlíková

• legovaná

Označení a rozdělení ocelí - třídy oceli 10-19 (první

dvojčíslí z pětimístného kódu) XX XXX

Třída 17 (17 XXX) zahrnuje legované „nerez“ oceli –

mimo jiné pro výrobu potravinářských strojů a zařízení.

Legujícími prvky jsou převážně Cr, V, W, Mo, Ni, Mn.

• odolné proti korozi

• legování způsobí, že jsou mechanicky

méně odolné s horší vodivostí tepla,

houževnatější (hůře se obrábí), náročnější

na svařování

hlavní konstrukční

materiál bioreaktorů

a dalšího

přístrojového

vybavení

biotechnologického

provozu

Měď

pružná, tažná, málo mechanicky odolná, pasivuje se

vrstvou oxidu/hydroxidu

dnes specifická

uplatnění – varny,

destilační aparatury

Hliník tažný, poměrně málo mechanicky a chemicky odolný

(rozpouští se v zásaditém prostředí)

téměř nepoužívaný

Sklo

průhledné, chemicky odolné, relativně levné, tlakově

odolné

potrubí, průhledy,

laboratorní

fermentory,

kultivace

fototrofních

organismů

Plasty

PE, PP, PVC, Teflon

podle technologie výroby a použitého monomeru široká

škála vlastností a tím i použití, levné, klávovatelné (PP,

teflon)

potrubí, hadičky,

membrány, kyvety,

laboratorní vybavení

Pryže = vulkanizovaný kaučuk

pružné, chemicky méně odolné

zátky, těsnění

Silikonové

pryže

chemicky odolné, stárnutí pomalejší oproti pryžím

sterilovatelné zátky,

hadičky, těsnění

Keramika chemicky a mechanicky (pevnost) velmi odolné

filtry, (malé)

distributory vzduchu

Dřevo

mechanicky poměrně odolné, pružné, podléhá zkáze

specifické použití -

starší ocetnice, sudy,

kádě (pivo, víno…)

58

Osazení nádoby reaktoru

Vlastní nádoba reaktoru je osazena množstvím prvků:

měřící sondy

vstupy/výstupy kapalných médií

vstupy/výstupy plynů

pojistný ventil

armatury

narážky

distributor vzduchu

míchadlo + pohon/převodovka

duplikátor/chladící registry

Základní typy bioreaktorů podle konstrukce

Vsádkový míchaný reaktor (submerzní)

Základní charakteristiky jsou:

• Koncentrace živin, buněk i

metabolických produktů se

mění v čase je ale shodná

v celém objemu reaktoru.

• Cyklický provoz, nízká

produktivita, náročné na

obsluhu, nejčastěji

průmyslově používané.

• Speciální a aseptické

technologie – výroby

antibiotik, organických

kyselin, potravinářský

průmysl…

Kontinuální míchaný reaktor (submerzní)

• Koncentrace všech složek se nemění v čase

(ustálený stav) ani s polohou v reaktoru.

• Kontinuální provoz, vysoká produktivita,

většinou technologie méně náročné na

asepticitu procesu.

• Průmyslová aplikace pro produkci

mikrobiální biomasy nebo primárních

produktů; čištění odpadních vod (v

kombinaci s recyklem biomasy).

59

Biofilmový reaktor (náplňový s imobilizovanými

buňkami)

• Koncentrace všech složek není časově závislá

(ustálený stav). Koncentrace všech složek závisí na

poloze v systému (obdoba pístového toku).

• Poměrně obtížná regulace množství biomasy

v systému.

• Průmyslová aplikace pro starší způsob výrobu octa

(moderní submerzně) a zpracování odpadních vod

nebo plynů.

Reaktor s fluidní vrstvou

Fluidní vrstvu tvoří s vločky aktivovaného kalu nebo

shluky buněk nebo buňky imobilizované na nosiči.

• Koncentrace všech složek není časově závislá

(ustálený stav). Koncentrace všech složek

nezávisí na poloze v systému (obdoba

mechanicky míchaného reaktoru).

• Vsádkový - výroba piva (CKT)

(vznos – vývin CO2, konvexní proudění –

rozdíly teplot)

Kontinuální - čištění odpadních vod.

(vznos – vzestupné proudění média)


Proč jsou vyžadovány materiály pro konstrukci bioreaktorů s co nejhladším

povrchem?

Proč se snažíme minimalizovat počet koutů a vestaveb uvnitř bioreaktoru?

Jakými základními prvky je bioreaktor osazen?

Ujasněte si rozdíl mezi celkovým a pracovním objemem reaktoru. Jaké jsou důvody

jejich rozdílných hodnot?

Ujasněte si, jak mění základní parametry (S, X, V, T) jednak v čase a jednak v objemu

reaktoru a výšce nebo délce lože reaktoru v jednotlivých typech bioreaktorů.

60

11. Měřené a regulované veličiny při kultivaci buněk. Základy

regulace bioprocesů (regulační okruh, typy regulátorů, veličiny

v regulaci).


Čidla pro měření teploty, pH, redox potenciálu, kyslíku.

Základní pojmy regulace

Regulační obvod

regulovaná soustava

zařízení, na kterém se provádí regulace (reaktor)

regulátor

zařízení, které uskutečňuje regulaci. Na základě změřených veličin rozhoduje

jak reagovat na danou situaci a v jaké intenzitě

akční člen

zařízení, které na základě výstupu z regulátoru vlastní akci provede (ventil,

čerpadlo)

Veličiny v regulaci

regulovaná veličina – y

je výstupní veličinou regulované soustavy

řídicí veličina – w

její hodnota vyjadřuje požadovanou hodnotu veličiny regulované

poruchová veličina - z

každá veličina, jejíž změna způsobí změnu regulované veličiny

akční veličina – u

akční člen převádí výstup z regulátoru (v) na akční veličinu, jejímž působením

na regulovanou soustavu se uskutečňuje regulace

Regulační odchylka

Regulační odchylka (e) je základem regulace a vypočítá se jako rozdíl mezi veličinou řídící

(požadovanou) a aktuální hodnotou regulované veličiny.

e = w - y

Regulační odchylka může být kladná nebo záporná s různě velkou absolutní hodnotou,

vyhodnocuje ji regulátor a na jejím základě rozhodne o zásahu. Znaménko určuje směr zásahu

(např. zvýšení nebo snížení průtoku dávkovacího čerpadla) a velikost absolutní hodnoty

určuje intenzitu zásahu (↑↑).

Cílem regulace je odstranit (minimalizovat) regulační odchylku.

61

Blokové schéma zpětnovazebního regulačního obvodu

Základní druhy regulace

Spojitá regulace

o spojitá změna akční veličiny (PID regulátory)

o regulátor ovládá akční člen spojitě

o příklad: turbidistat, regulace teploty

Nespojitá regulace

Dvoupolohová regulace (0/1 – zavřeno/otevřeno)

o regulátor ovládá akční člen dvoupolohově

o příklad: regulace pH, teploty (na obrázku)

Spojitý PID regulátor

Výstup z regulátoru se počítá na základě aktuální hodnoty

regulační odchylky pomocí matematické funkce, jejíž obecný

tvar je (netřeba umět):

Má Proporcionální, Integrační a Derivační složku proto PID regulátor.

Velmi přesná regulace ale také náročná na nastavení (konstanty regulátoru); ne vždy nutná.

Dvoupolohový regulátor

Regulátor ovládá akční člen dvoupolohově - vypnuto/zapnuto, zavřeno/otevřeno. Regulátor

musí být vybaven hysterezí (necitlivostí ) aby neustále nekmital okolo požadované

hodnoty.

Jednoduchá, méně přesná ale často dostačující regulace.

DIP

dt

tderdtterterv

0

110

)(.).(.)(.

62

Typový příklad - regulace pH

Příklad regulace pH na 70,2. To znamená, že pokud pH klesá tak regulátor sepne (= reguluje

= spustí přítok zásady) až na 6,8 (ne na 7) a pokud dojde k vzestupu hodnoty pH regulátor

sepne (= reguluje = spustí přítok kyseliny) při pH 7,2 (ne na 7). Pásmo necitlivosti regulátoru

(hystereze) je tedy mezi 6,8 a 7,2.

Typový příklad - regulace turbidistatu

Kontinuální míchaný reaktor v režimu turbidistat – produkce biomasy:

regulovaná veličina (y) = koncentrace buněk

poruchová veličina (z) = změna růstové rychlosti buněk => změna koncentrace buněk

výstup z regulátoru (v) = impulz do regulačního ventilu (akční člen), který se více

nebo méně otevře a tím ovlivní akční veličinu v tomto případě průtok média

akční veličina (u) = zvýšení nebo snížení průtoku média, které má za následek

zvětšení nebo zmenšení hodnoty zřeďovací rychlost a tím změnu koncentrace buněk

na požadovanou hodnotu

1. Zvolíme, jakou hodnotu koncentrace v reaktoru požadujeme např. 5 mg.L-1 (= řídící

veličina)

2. Měřící člen regulátoru zaznamenává aktuální hodnotu koncentrace buněk v reaktoru a

porovnávací člen kontinuálně počítá regulační odchylku. Pokud je například aktuální

koncentrace buněk v reaktoru 5,2 mg.L-1 je regulační odchylka 5-5,2 = -0,2 mg.L-1.

Ústřední člen regulátoru na základě matematického vztahu vypočítá, jaký signál se má poslat

do akčního členu.

(podstatné je znaménko – podle toho rozhodne, jestli akční člen sníží nebo zvýší hodnotu

akční veličiny = např. otevře více nebo přivře regulační ventil na přívodním potrubí

kapalného média a také absolutní hodnota odchylky – čím je větší tím více otevře nebo přivře

ventil)

3. Akční člen na základě informace ústředního členu regulátoru upraví akční veličinu v našem

případě průtok kapalného média konkrétně při regulační odchylce -0,2 sníží přítok média a

tím sníží zřeďovací rychlost, čímž se přítokuje méně substrátu a tím klesne koncentrace buněk

v reaktoru (optimálně přesně na požadovaných 5 mg.L-1).

Obdobný postup je pro ostatní regulované veličiny - pH, teplotu, výšku hladiny, rozpuštěný

kyslík.

Typový příklad - regulace na základě hodnoty rozpuštěného kyslíku

Pro účinnou regulaci koncentrace

substrátu (udržování

koncentrace v optimálním intervalu)

pomocí CL je potřeba znát vztah mezi

mini. Stanoví se empiricky změřením

nebo i výpočtem z matematického

modelu.

63

Regulované veličiny a k nim náležející akční veličiny

regulovaná veličina akční veličina

teplota Q nebo 0/1 chladícího/ohřevného média nebo elektrický příkon

pH Q nebo 0/1 kyseliny nebo louhu

rozpuštěný kyslík Q vzduchu/O2

výška hladiny Q nebo 0/1 přítok média

množství pěny 0/1 dávkování odpěňovacího prostředku

koncentrace substrátu Q nebo 0/1 přítok média

koncentrace produktu Q nebo 0/1 přítok média

koncentrace buněk Q nebo 0/1 přítok média (Q - turbidistat)

akční člen (změna): Q… průtok 0/1… vypnuto/zapnuto

Regulace technologického procesu jako celku

Technologická linka obsahuje množství jednotlivých technologií, které je potřeba regulovat

jednak jednotlivě, tak i jako celek. Regulace jednotlivých technologií/procesů se vzájemně

ovlivňují a proto je velmi náročné sladit regulace jednotlivých procesů tak aby bylo dosaženo

dlouhodobě optimálního a stabilního provozu dané technologie. Většinou je tato regulace

realizována na zakázku specializovanými firmami s dlouholetými zkušenostmi.


Vysvětlete pojem „zpětnovazebná regulace“.

Popište regulaci teploty, pěnění, rozpuštěného kyslíku, výšku hladiny v bioreaktoru.

Koncentrace rozpuštěného kyslíku se často využívá při regulaci procesu. Proč právě

ona je vhodná pro tento účel? U jakých typů kultivací byste tento způsob použili?

Uveďte příklady poruchových veličin (z).

Jak vzrůst koncentrace buněk v průběhu kultivace ovlivňuje parametry kultivace a její

regulaci?

64

12. – 13. Dokončovací operace biotechnologických výrob

(konvenční separační technologie, dezintegrace buněk,

membránové separační technologie, extrakce, srážení, destilace,

sušení, stripování, CIP). Výrobní linka biotechnologického

procesu.


Základy procesů a popis zařízení filtrace, odstřeďování, destilace, extrakce, srážení,

sušení, výměníky tepla – chemické inženýrství.

Integrované systémy biotechnologického procesu

Integrované systémy znamenají spojení bioprocesu a separace produktu. Výsledkem je

snížení nákladů na dokončovací operace a tím i celé výroby. Mohou být realizovány:

interním recyklem buněk

kontinuálním stripováním těkavého produktu z média vhodným plynem (vzduch, N2)

a jeho následnou separací z plynu (kondenzace, vymražení, sorpční nebo membránové

procesy). Jedná se např. o produkci kyselin, ethanolu, biorozpouštědel (aceton,

butanol).

Dokončovací operace biotechnologických výrob (downstream procesy)

Dokončovací operace obecně zahrnují:

separace biomasy z médií po fermentaci

(usazování, odstřeďování, filtrace)

izolace, čištění a stabilizace produktů

o extracelulární produkty - separační procesy jako filtrace, srážení,

membránové a chromatografické techniky

o intracelulární produkty - dezintegrace buněk + separační procesy

čištění odpadních produktů (pevných, kapalných a plynných)

Separační procesy

• separace buněk z kultivačního média

• separace produktu z kultivačního média

• separace produktu z buněk

• separace produktu od nečistot

Filtrace

Odstranění pevných částic z plynu nebo kapaliny

65

Dělení filtrace podle velikosti pórů

Základní pojmy separačních technik. Filtrace - dělení suspenzí a membránové procesy –

dělení převážně roztoků.

Účelem procesu filtrace může být:

• získání plynu nebo kapaliny

• získání pevných částic

• získání plynu nebo kapaliny i pevných částic

Z hlediska provedení se rozděluje na:

• kontinuální

• diskontinuální

Hnací síla je rozdíl tlaků (Δp); může být i gravitace. Realizace rozdílu tlaků je možná dvojí:

• přetlak nad filtrační přepážkou

• podtlak pod filtrační přepážkou (vakuový filtr)

Materiál filtrační přepážky:

• vrstva zrnitého materiálu (písek, koks, naplavovací filtry)

• porézní materiály (porézní keramika, plasty, kov)

• vláknité materiály (filtrační plachetky – textilní, papírové, skleněná vlákna)

66

Filtrace kapalin

Pískový filtr

Provozuje se v cyklu filtrace – zpětný proplach.

Náplní je praný písek o definované velikosti (a specifickém

vrstvení).

Typické nasazení je při úpravě pitné vody nebo v čističkách

odpadních vod.

Svíčkový filtr

Materiál svíček jsou speciální syntetické vláknité materiály.

Provozuje se v cyklu filtrace - výměna svíček

Svíčkový naplavovací filtr

Materiál svíček je keramika nebo legovaná ocel. Vlastní filtrační vrstva je naplavená vrstva

zrnitého materiálu typicky křemelina.

Provozuje se v cyklu naplavení křemeliny - filtrace - odstřelení křemeliny a filtračního koláče

67

Deskový filtr

Podstatou konstrukce je střídání desky a rámu, mezi nimiž je tzv. plachetka jako filtrační

materiál.

Provozuje se v cyklu filtrace – rozebrání + vyčištění.

Vakuový rotační filtr

Konstrukčně může být realizován jako bubnový nebo pásový.

Provozuje se v cyklu přisátí suspenze ve vaně – propláchnutí – odříznutí filtračního koláče.

Filtrace plynů

Rukávový filtr

Materiál svíček jsou speciální textilie.

Provozuje se v cyklu filtrace – oklepání* nebo výměna filtrační textilie

Svíčkový filtr

Viz filtrace kapalin.

68

Usazování

Oddělení dispergovaných částic od plynu nebo kapaliny působením objemové síly (gravitační

nebo odstředivá síla).

Účelem procesu může být:

• získání plynu nebo kapaliny

• získání pevných částic

• získání plynu nebo kapaliny i pevných částic

• roztřídění částic různých vlastností (různá rychlost usazování)

Hnací síla procesu je gravitační zrychlení (g).

g gravitační zrychlení

Vu rychlost usazování

Vf rychlost proudění

Vp výsledná rychlost usazování

Usazováky vertikální a horizontální Usazováky s rotací suspenze

Usazováky se změnou toku suspenze

Usazováky se provozují s periodickým nebo

kontinuálním odebíráním separovaných pevných

částí.

69

Odstřeďování

Oddělení dispergovaných částic od plynu nebo kapaliny působením objemové síly (odstředivá

síla).

Hnací síla je odstředivé zrychlení (ω2r).

Odstředivá síla (P)

𝑃 = 𝑚. 𝑟. 𝜔2 Relativní odstředivá síla (R)

• Vyjadřuje poměr mezi odstředivým zrychlením a zrychlením tíhovým = násobky g

(bezrozměrné). Různé „g“ v různých částech kyvety!

𝑃 = 1,117. 𝑟. 𝑁2. 10−5 Monogram pro zjištění „g“

Provozují se ve:

• vsádkovém (diskontinuálním) uspořádání

cyklus odstředění – oddělení odstředěné kapaliny a pevného podílu

• kontinuálním uspořádání

kontinuální odvádění odstředěné kapaliny a pevného podílu

Speciální odstředivky (v mikrobiologii a biochemii)

• Chlazené

ω úhlová rychlost

r poloměr

Vu rychlost usazování

Vt tečná rychlost

Vp výsledná rychlost usazování

70

• Ultracentrifugy (100 000 x g - oddělení biopolymerů a subcelulárních částic v

hustotním gradientu - diskontinuální a kontinuální - (glukóza…) - nutno

podtlak/vakuum v prostoru s rotorem!

izopyknický bod – stejná hustota prostředí a částice

separace fragmentů buněk

• gradientová centrifugace (gradient hustoty v kyvetě)

• diferenciální centrifugace (postupné zvyšování otáček)

Oddělení

• Suspenzí (buňky, fragmenty buněk, kaly…)

• Emulzí (extrakce, odstřeďování mléka)

•

Podle konstrukce rotory

• úhlové

o úhel k ose otáčení 45-50°

o pro větší otáčky („g“)

• výkyvné

o kyvety volně zavěšeny v čepech (kyveta vodorovně při

centrifugaci)

o velké tření

o dlouhá sedimentační dráha částice

Membránové procesy

Hnací silou každého membránového procesu je transmembránový gradient.

• procesy s gradientem tlaku

o mikrofiltrace

o ultrafiltrace

o nanofiltrace

o reversní osmóza - transport rozpouštědla membránou (díky vysokému tlaku –

vyššímu než osmotický), soli a nízkomolekulární složky neprocházejí

• procesy s gradientem chemického potenciálu

o pervaporace – dělení kapalné směsi organických látek průchodem membránou

do vakua nebo nosného plynu na principu různé rozpustnosti a rychlosti

migrace par směsi membránou

o permeace plynů – oddělení plynů na základě různé rychlosti pronikání

jednotlivých plynů skrze membránu

o dialýsa - oddělení látek s různou rozpustností a velikostí přes polopropustnou

membránu

o osmósa – přechod rozpouštědla přes polopropustnou membránu proti směru

koncentračního spádu (do roztoku s vyšší koncentrací látek)

• procesy s gradientem elektrického potenciálu

o elektrodialýza migrace iontů v elektrickém poli mezi katodou a anodou. Mezi

roztoky jsou dvě membrány polopropustné ionexové membrány, které

propouštějí selektivně pouze kationty (katexové membrány) nebo anionty

(anexové membrány) – v prostoru mezi nimi se kumuluje rozpuštěná látka

(sůl)

o membránová elektrolysa – produkty elektrolýzy (na katodě a anodě jsou

oddělené dvěma polopropustnými membránami (pro ionty migrující k

elektrodám)

71

• procesy s gradientem teploty

o membránová destilace - dělení par horké směsi látek průchodem mikroporézní

nesmáčivou membránou do chladnějšího prostoru (např. šetrné odvodňování)

Dezintegrace buněk

Slouží k získání intracelulárních produktů (enzymy, organely).

Mechanické způsoby dezintegrace

• Střídavé zmražování a rozmražování

• French press

(protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)

• X-press

(protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)

• Ultrazvuk

• Mlýnek se skleněnými balotinami (kuličky)

Fyzikální, chemické způsoby dezintegrace

• Osmotický šok (koncentrovaný roztok → velmi zředěný extrakce intracelulárních

látek)

• Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány)

• Přídavek toluenu (rozpouštění fosfolipidů buň. stěny a cytoplazmatické membrány)

Enzymové způsoby dezintegrace

• Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem)

enzym z vaječného bílku (dále např. krev, sliny) selektivně štěpící glykosidové

vazby v peptidoglykanech v buněčné stěně bakterií

Extrakce

Antibiotika, nepolární látky, organické makromolekuly mohou být isolovány/čištěny extrakcí

vhodným rozpouštědlem a jeho následným odpařením.

Srážení

Srážení znamená převedení rozpustné formy na nerozpustnou s následnou filtrací. Sráží je

buď produkt nebo naopak nečistoty.

• Ca(OH)2 - organické kyseliny

• změnou pH, zvýšení obsahu vody - organické makromolekuly

Destilace

Destilace znamená oddělení těkavých produktů od média a jejich zakoncentrování.

ethanol, kyselina octová, biorozpouštědla (aceton, butanol)

Stripování

Stripování těkavých produktů (těkavé kyseliny, biorozpouštědla, ethanol) plynem např.

dusíkem.

Stabilizace

Pro stabilizaci se používá sušení, lyofilizace, navázání na nosič a jiné metody.

Sanitace

Souhrn činností, které zabezpečují plnění hygienických a technologických požadavků

biotechnologických výrob:

• Úklid - odstranění nečistot (nejen) v interiéru technologické haly

• Čištění - odstranění nečistot (zbytky média, biomasy, stěnové nárůsty…)

72

• Dezinfekce – odstranění/usmrcení mikroorganismů

• Dezinsekce - odstranění/usmrcení hmyzu

• Deratizace - odstranění/usmrcení hlodavců

Důležité je pořadí kroků:

1. čištění

2. výplach/oplach vodou

odstranění sanitačních látek - agresivní a často mikrobicidní/mikrobistatické látky

3. dezinfekce/sterilace (vždy pouze čistého zařízení)

Postup čištění reaktoru

(propaření)

(výplach)

čištění cirkulací čistícího roztoku (vhodně umístěné trysky)

výplach

Čistící (sanitační) činidla lze rozdělit do tří skupin:

• kyselé prostředky HNO3 (~ 0,5%), H3PO4

• zásadité prostředky NaOH (~ 1%)

• detergenty

Většinou se čištění prování za vyšších teplot, někdy téměř 100°C z důvodu vyšší účinnosti.

Z výše uvedeného je evidentní, že konstrukční materiály bioreaktorů, armatur, elektrod, sond

musejí být značně odolné.

CIP stanice

CIP (Cleaning In Place) je technologický celek pro provádění sanitace technologie. Skládá se

ze zásobníků sanitačních prostředků a vody, ohřevu, čerpadel, potrubí a armatur.

Je nutné satinovat celou výrobní technologii:

• reaktor, pomocná zařízení (tlakové mytí, vestavěné trysky)

• potrubí, armatury (cirkulace sanitačního prostředku)

Příklad průmyslové CIP stanice

Sterilizace – SIP stanice

SIP (Sterilization In Place) je technologický celek pro provádění sterilizace technologie.

Někdy je SIP a CIP jeden technologický celek.

73

Pro udržení asepticity procesu je nutné dezinfikovat/sterilovat celou část výrobní technologie

kde je aseptický provoz:

• celá technologie párou (reaktor často znovu se sterilací média)

• potrubí/armatury párou a reaktor spolu s médiem nepřímím ohřevem (sterilace média)


Jaká je hnací síla filtrace, odstřeďování, usazování a jak ji zrealizujete.

Jaký je mechanismus působení kyselých, zásaditých látek a detergentů na buňky?

Uveďte sled kroků dokončovacích operací včetně používaných zařízení pro získání

biomasy jako finálního produktu.

Uveďte sled kroků dokončovacích operací včetně používaných zařízení při produkci

primárního produktu s ohledem na to.

Uveďte sled kroků dokončovacích operací včetně používaných zařízení při produkci

sekundárního produktu s ohledem na to, jestli jsou intracelulární nebo extracelulární.

74

14. Biotechnologie a bioreaktory pro zpracování odpadů

z biotechnologických výrob.


Rozpustnost organických látek ve vodě, hydrofobicita, Henryho zákon.

Porovnání produkčních a dekontaminačních biotechnologií

Biotechnologie a bioreaktory při čištění odpadů mají specifické odlišnosti v porovnání

s technologiemi produkčními:

Substrát a minerální živiny

Jako substrát (zdroj uhlíku a energie) pro mikroorganismy jsou polutanty – často

toxické nebo inhibující, což způsobuje malé μ.

V některých případech polutant slouží jako finální akceptor elektronů – odstraňování

dusičnanů/dusitanů z vody nebo vysoce halogenovaných látek; je tedy nutná

přítomnost substrátu – zdroje uhlíku a energie.

Často směsné polutanty, někdy vyžadující významně odlišné degradační schopnosti

nebo podmínky prostředí. Příklady:

o H2S + NH3 + VOCs – emise z ČOV: H2S degradují chemolitotrofové a VOCs

chemoorganotrofové mikroorganismy; navíc degradací H2S vzniká H2SO4,

výrazně snižující pH, což nevyhovuje většině chemoorganotrofů.

o Methanogeneze (viz níže).

o Jednotlivé polutanty ve směsi

Často pouze částečná znalost složení polutantů a přítomnosti minerálních živin.

Mikroorganismy

Téměř vždy použití směsných mikrobiálních kultur

o nelze udržet aseptický provoz

o směs mikroorganismů má mnohem širší spektrum degradačních schopností a je

mnohem flexibilnější při změnách prostředí, polutantů a parametrů odpadních

plynů nebo kapalin

Změny (často výrazné) v poměru a zastoupení jednotlivých taxonů směsné

mikrobiální kultury v průběhu dlouhodobého provozu.

Často ustavení komplexního ekosystému - mikrobiální eukaryota a prokaryota

(degradéři; z pohledu ekosystému - producenti, kořist), protozoa a někdy i členovci

(z pohledu ekosystému - dravci).

Parametry a řízení procesu

Kolísání parametrů vstupujících médií způsobuje stres mikrobiální populaci a obtížné

řízení procesu:

o průtok (mění se zřeďovací rychlost a doby zdržení!)

o koncentrace a přítomnost jednotlivých složek – minerální živiny, substrát,

toxické látky…

o fyzikálně-chemické vlastnosti média (pH, T, redox potenciál…)

o periody bez vstupující odpadní vody nebo vzduchu nebo s malou až žádnou

koncentrací polutantů a tedy hladovění - mikroorganismy bez zdroje

energie nebo i kyslíku (směnné nebo periodicky pracující technologie-

zdroje znečištění).

Omezené možnosti ovlivnění a úpravy parametrů vstupujících médií.

Omezené možnosti řízení procesu.

75

Často kombinace nízké koncentrace polutantu (limitace), špatně degradovatelného

polutantu (= malá μ) a vysokých průtoků kapaliny (= velká D) tj. nutnost použití

recyklu biomasy nebo imobilizovaných buněk.

Reaktory

Většinou konstrukčně jednoduché a provozně nenáročné bioreaktory.

Převážně kontinuální (i když kolísavá) produkce znečištěné odpadní vody nebo

vzduchu tj. použití kontinuálních procesů a reaktorů.

Často využívané náplňové reaktory a submerzní reaktory s recyklem biomasy.

Z těchto odlišností vyplívají specifika přístupu k návrhu a provozování dekontaminačních

technologií v porovnání s produkčními technologiemi.

Čištění odpadních vod

Čistírny odpadních vod (ČOV)

Odpadní vody podniků se mohou smluvně čistit v komunální ČOV (malé podniky, málo

toxické nebo hygienicky závadné odpadní vody) nebo v podnikové ČOV (velké podniky,

toxické nebo hygienicky závadné odpadní vody). Podnikové ČOV někdy smluvně čistí i

komunální odpadní vody vesnic/měst, kde stojí.

Vodu znečišťuje široké spektrum organických látek biologického (biomakromolekuly nebo

jejich fragmenty) nebo průmyslového (uhlovodíky nebo kyslíkaté, halogenované nebo

nitrované organické látky) původu nebo anorganických látek (dusičnany, dusitany,

fosforečnany, rozpuštěný amoniak nebo sulfan, těžko kovy). Často je chemické znečištění

doprovázeno mikrobiálním – například přítomnost koliformních bakterií.

Vyjadřování znečištění vody

CHSK

Udává množství kyslíku (mg.L-1), které se přepočte ze spotřeby oxidačního činidla

(manganistan nebo dichroman draselný), a které je třeba k úplné oxidaci organických látek

obsažených ve vodě.

BSK5

Udává množství kyslíku (mg.L-1), které je třeba k degradaci biologicky odbouratelných

organických látek obsažených ve vodě za pět dní za pomoci mikrobiální populace.

Čím vyšší hodnoty parametrů tím větší organické znečištění vody. Pouze v některých

případech specifických nebo vysoce toxických látek se používá jejich koncentrace (mg.L-1).

Technologická linka malých ČOV

Č česle

LP lapač písku

BČ biologické čištění

DN dosazovací nádrž

TČ terciální čištění

UN uskladňovací nádrž

na přebytečný kal

76

Technologická linka velkých ČOV

Biologické čištění

Aerobní (organické znečištění → CO2 a H2O)

Skrápěný náplňový reaktor (biofilm)

Rotační biofilmové reaktory (biofilm) – malé ČOV u rodinných domků

Aktivační nádrž = submerzní probublávaný reaktor (aktivovaný kal)

Vegetační čištění (kořenové čistírny)

Anaerobní (organické znečištění → CO2 a CH4)

Anaerobní submerzní reaktory

Terciální čištění

Stabilizační nádrže (anaerobní, aerobní – převážně bakterie a řasy)

Vegetační čištění (kořenové čistírny)

Metanogeneze

Metanogeneze (produkce bioplynu z biomasy) není jeden proces, ale skládá se z několika

procesů, vyžadujících značně rozdílné podmínky i mikroorganismy. Řízení tohoto procesu je

tedy technologicky náročné.

Proces Popis procesu Mikroorganismy

Hydrolýza hydrolýza biopolymerů na monomery, spotřeba

O2, částečná acidogeneze

Fermentační -

fakultativně

anaerobní bakterie

Bacillus,

Clostridium,

Micrococcus,

Pseudomonas

Acidogeneze Produkce octové kyseliny a dalších nižších

mastných kyselin z monomerů

Produkce octové kyseliny z nižších mastných

kyselin

syntrofní druhy - acidogeneze, acetogeneze,

produkce CO2 a H2

homoacetogeny - acetogeneze, acidogeneze,

Syntrofní

Syntrophobacter,

Syntrophomonas,

Syntrophus

Acetogeneze

Acetogenní

Clostridium,

Lactobacillus,

Bifidobacterium,

česle

vyrovnávací nádrž

lapač písku

usazovací nádrž

lapač tuku

biologické čištění

dosazovací nádrž

terciální čištění

kalové hospodářství

odstředivka

Č

VN

LP

UN

LT

BČ

DN

TČ

KH

OD

77

produkce CO2 Butyribacterium

Metanogeneze Hydrogenotrofní metanogeny

CO2 + 4H2 → CH4 + 2H2O

Acetotrofní metanogeny

CH3COOH → CH4 + CO2

Metanogenní

Methanobacterium,

Methanocuccus,

Methanobacter,

Methanogenium

(striktně anaerobní

bakterie)

Kalové hospodářství (stabilizace kalu)

Aktivovaný kal je podle legislativy odpad a musí se s ním také tak zacházet.

Zpracování

• kompostování

• anaerobní zpracování (methanogeneze)

Čištění odpadních plynů

Znečišťující látky plynů jsou těkavé organické (uhlovodíky, kyslíkaté, halogenované sirné

organické látky) nebo anorganické látky (NH3, H2S). Těkavé organické látky jsou známé pod

zkratkou VOCs (Volatile Organic Compounds). Vedle jejich přímé toxicity, zapojení do

chemických a fotochemických v atmosféře (vznik toxických produktů a finálně smogu) nebo

negativního ovlivňování funkcí atmosféry (skleníkový efekt, ničení stratosférického ozónu) se

sleduje i obtěžování zápachem.

Vyjadřování znečištění plynu

Většinou se vyjadřuje jako kombinace hmotnostního toku z kontaminující technologie a

maximální dosahované koncentrace a často bez rozlišení jednotlivých látek ze směsi

polutantů – například tzv. suma VOCs – těkavých organických látek (Volatile Organic

Compounds). V případech specifických nebo vysoce toxických látek se používá a sleduje

jejich přesná koncentrace (např. u tzv. dioxinů).

Bioreaktory pro čištění odpadních plynů

Biofilmové reaktory

náplňové

biofiltr

biotrickling filtr (skrápěná kolona)

rotační diskový filtr

Submerzní reaktory

biologická pračka plynů

probublávaná kolona

airlift

Vedle přestupu kyslíku do vodné fáze a následně do buněk je klíčový proces dekontaminace i

kinetika přestupu polutantů do vodné fáze a do buněk (na rozdíl od čištění odpadních vod).

V tomto ohledu jsou při dekontaminaci zvýhodněné dobře rozpustné polutanty a kinetika

přestupu hmoty špatně rozpustných polutantů (např. uhlovodíky) může být limitujícím

faktorem celého procesu.

Základní typy reaktorů používaných při čištění odpadní vody a plynu

Čištění odpadních vod má mnohem hlubší historii a vzhledem k podobnosti (aerobních)

procesů byly základní typy reaktorů pro čištění vody převzaty a modifikovány pro použití při

čištění odpadních plynů.

78

Při zpracovávání odpadních plynů je vedle přestupu kyslíku z plynné fáze do kapalné (stejně

jako při čištění odpadní vody) klíčový i přestup polutantů z plynné fáze do kapalné (není u

čištění odpadní vody). Rozpustnost ve vodě a Henryho konstanta polutantu hrají zásadní roli

v přestupu hmoty a tím i v odstranění polutantu z odpadního plynu. Polutanty s malou

rozpustností a vysokou Henryho konstantou jsou tedy znevýhodněny a kinetika jejich

přestupu do kapalné fáze může být limitující proces pro dekontaminační technologii. Většinou

však je limitujícím krokem vlastní biodegradace nebo kinetika přestupu kyslíku. Z důvodu

kinetiky přestupu polutantu z plynné fáze do kapalné jsou bioreaktory s nízkým obsahem

vodné fáze (biofiltr) vhodnější pro špatně rozpustné polutanty (uhlovodíky) zatímco

bioreaktory s vysokým obsahem vodné fáze (skrápěný bioreaktor, probublávaná kolona,

airlift) jsou vhodnější pro velmi dobře rozpustné polutanty.

Odpadní vody Odpadní plyny

Biofiltr

Znečištěná voda kontinuálně proudí skrze

náplňový materiál lože s imobilizovanou

mikrobiální kulturou, která degraduje

obsažené polutanty (tzv. ponořené lože).

Nutno použít imobilizaci buněk – D > μ.

Aerace má za úkol pouze dodávku kyslíku.

Znečištěný vzduch kontinuálně proudí skrze

lože, kde polutanty přestupují do vodné fáze a

jsou degradovány imobilizovanou mikrobiální

kulturou.

Voda s přídavkem minerálních živin je

periodicky dávkována (1-2 x denně) a zajišťuje

dostatečnou vlhkost lože (biofilmu) a přísun

minerálních živin.

Skrápěný bioreaktor (biotrickling filtr)

Znečištěná voda kontinuálně stéká po

náplňovém materiálu s imobilizovanou

mikrobiální kulturou, která degraduje

obsažené polutanty.

Nutno použít imobilizaci buněk – D > μ.

Aerace má za úkol pouze dodávku kyslíku;

může být i pasivní s využitím komínového

efektu.

Znečištěný vzduch kontinuálně proudí skrze

lože, kde polutanty přestupují do vodné fáze a

jsou degradovány imobilizovanou mikrobiální

kulturou.

Voda s přídavkem minerálních živin je

cirkulována a zajišťuje dostatečnou vlhkost lože

(biofilmu) a přísun minerálních živin a lepší

distribuci kyslíku a polutantů.

79

Submerzní bioreaktory - probublávaná kolona; airlift

Do znečištěné vody je před vstupem do

reaktoru dávkována biomasa pomocí

recyklu biomasy (tzv. aktivace/aktivační

technologie – využití aktivovaného kalu).

Vzniklá suspenze pak kontinuálně proudí

reaktorem, kde jsou degradovány obsažené

polutanty. Po výstupu je biomasa oddělena

od vyčištěné vody a vracena na začátek

procesu.

Nutno použít recykl buněk – D > μ.

Aerace má za úkol míchání (pneumatické)

a dodávku kyslíku.

Znečištěný vzduch je kontinuálně probubláván

skrze vodu s přídavkem minerálních živin, kde

polutanty přestupují z bublin plynu do vodné

fáze a jsou degradovány suspendovanou

mikrobiální kulturou (submerzní proces).

Voda slouží jako prostředí pro mikroorganismy

a pro rozpuštění polutantů a kyslíku.

Poznámka: - kapalina; - plyn (vzduch)

80


Jaké typy mikroorganismů byste museli použít pro odstranění H2S, NH3, VOCs z

plynných emisí z čističek odpadních vod z hlediska jejich rozdělení na základě

získávání energie.

Jaký je účel jednotlivých výchozích látek v metabolismu vzniku metanu při

metanogenezi (4H2 + CO2 → CH4 + H2O a CH3COOH → CH4 + CO2) z hlediska

zisku energie a finálního akceptoru elektronů. Jak byste pojmenovali tyto bioreakce

z hlediska finálního akceptoru elektronů?

Co způsobuje kolísání zřeďovací rychlosti v biologickém stupni - submerzním reaktoru

- ČOV? Jaké problémy v řízení procesu to způsobuje? Jak lze toto kolísání (alespoň

částečně) omezit?

Jak se projeví různý obsah vody u různých typů bioreaktorů na čištění odpadních

plynů na odstraňování hydrofobních a hydrofilních polutantů? Jak to ovlivní

transportní pochody?

Charakterizujte typ reaktoru, stav biomasy a typ procesu u jednotlivých bioreaktorů

pro čištění odpadních vod a vzduchu.

Ujasněte si, jak mění základní parametry (S, X, V, T, CL) jednak v čase a jednak v

objemu/výšce nebo délce lože reaktoru v bioreaktorech pro čištění odpadních vod a

plynu pro vzduch i vodu. V čem se z tohoto hlediska liší submerzní reaktory pro čištění

odpadní vody a plynu?

Date post:	26-Oct-2021
Category:	Documents
Upload:	others
View:	5 times
Download:	0 times

Sylabus Základy bioinženýrství N319002

Documents