Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita

Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita

Průmyslová toxikologie (C867)

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT)

Testovací metody

• LLNA – Local Lymph Node Assay (Test regionálních mízních uzlin) - OECD 429

• GMPT - Maximalizační test na morčatech - OECD 406


LLNA – OECD 429

• Vyvolání alergické reakce vyžaduje aktivaci a následnou expanzi T-lymfocytů

• Střet kůže se senzibilizátorem vyvolá transport antigenů z kůže do lymfatických uzlin

• Antigenem řízená aktivace T-lymfocytů má za následek dělení a diferenciaci alergen-specifických T-lymfocytů

• Nárůst počtu T-lymfocytů je měřitelným ukazatelem reakce organismu na kontakt s látkou mající senzibilizační potenciále


LLNA – OECD 429

• Pokusná zvířata – samice myší staré 8 – 12 týdnů, kmen BALB/c, NMRI

Postup

• testovaná látka – 3 různé koncentrace• negativní kontrola – aceton/olivový olej, dimethysulfoxid aj.• pozitivní kontrola - dinitrochlorbenzen aj.


LLNA – OECD 429

DEN 1 – 3

•aplikace test. látky na dorsální stranu obou uší , aplikační objem 25 mL na ucho

DEN 6

•aplikace fyziologického roztoku obsahujícího předepsané množství radionuklidu

– (3H thymidin nebo 125I deoxyuridin)

•5 hodin po aplikaci utracení zvířat a odběr uzlin


LLNA – OECD 429


LLNA – OECD 429


LLNA – OECD 429

Vyhodnocení

•Příprava buněčné suspenze

•Měření inkorporované aktivity v dpm

Výpočet Indexu stimulace:

•průměrná hodnota dpm exponované skupiny/ průměrná hodnota dpm kontrolní skupiny

•je-li IS větší nebo roven 3 je látka považována za senzibilizující.

•dávková závislost


GMPT - OECD 406

Indukční fáze:

•kontaktem kůže se senzibilizátorem jsou aktivovány T-lymfocyty a dochází k jejich proliferaci (jako u testu LLNA)

Provokační fáze:

•opakovaným kontaktem se senzibilizátorem je u zvířete vyvolána alergická reakce – kontaktní dermatitida

Pokusná zvířata:

•albinotická morčata obou pohlaví, váha 150 – 250 g, kmen BFC, ve studii 30 zvířat (20 exponovaných + 10 kontrolních)


GMPT - OECD 406Metodika:

•DEN 1 - indukční expozice intradermální

•DEN 7 - lokální indukce dermální

•DEN 21 - provokace

•DEN 23 a 24 – odečet kožní reakce

Vyhodnocení:

•24 a 48 hodin po aplikaci se vyhodnotí kožní reakce (zarudnutí, otok)•Porovnává se reakce kůže exponované testovanou látkou a reakce kůže exponované vehikulem•Pozitivní výsledek = 30% morčat má pozitivní reakci na kůži tj. zarudnutí případně otok


Porovnání GPMT a LLNA testu

GMPT :

1.Manipulace: holení, injekční aplikace, opakovaná bandáž

2.Test trvá 25 dní

3.Výsledek = subjektivní hodnocení

LLNA:

1.Manipulace: přímá aplikace test. látky neinvazivní formou

2.Test trvá 6 dnů

3.Výsledek = číslo

4.U některých látek nelze použít

Genotoxicita

Rozdělení mutací

• Studie poskytují informace o možných genotoxických vlastnostech látek tj. o schopnosti způsobovat změny genetického materiálu - mutace

• genové - změny v molekule DNA

• chromozomální - chromozomální aberace (změny struktury a tvaru chromozómu)

• genomové - změny v chromozomálním počtu

• nechromozomální - mimojaderné

Genotoxicita - testovací metody• Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro

• Mutagenita - test chromozómových aberací v kostní dřeni savců in vivo

• Mutagenita in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech

• Mutagenita-test reverzních mutací u baktérií

• Genové mutace-Saccharomyces cerevisiae

• Mitotické rekombinace Saccharomyces cerevisiae

• Mutagenita-test genových mutací v savčích buňkách in vitro

• Poškození DNA reparace- neplánovaná syntéza DNA-savčí buňky in vitro

• SCE - výměna sesterských chromatid in vitro

• Recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophilla melanogaster

• Test transformace savčích buněk in vitro

• Dominantní letální test u hlodavců

Mutagenita - test reverzních mutací u baktérií – OECD 471

• Detekce genových mutací – mutace v genu pro syntézu aminokyselin His (Trp)

– zkouška pro počáteční vyšetření genotoxické aktivity

– pět kmenů bakterií je vystaveno působení zkoušené látky za přítomnosti i bez přítomnosti metabolického aktivačního systému

– aktivační systém – posmitochondrionální frakce z jater hlodavců ošetřených prostředkem indukujícím enzymy

• Kontrola počtu narostlých kolonií po 48-72 hod – porovnání počtu kolonií revertantů (v přítomnosti testované látky) s počtem kolonií spontánních revertantů (NK)

Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473

• Identifikace látek způsobující strukturní chromozomové aberace = změny ve struktuře nebo počtu chromozomů

– zjištění možných mutagenů a karcinogenů u savců

Základní rozdělení aberací:

• Chromatidového typu

• Chromozomového typu

• Pro test se používají stabilizované buněčné linie, buněčné kmeny nebo primární buněčné kultury


• Kultury jsou vystaveny zkoušené látce (a to s metabolickou aktivací i bez ní), v předem stanovených intervalech se přidává látka zastavující metafázi (např. Kolchicin)

• Hodnocení přítomnosti chromozomových aberací - nejméně 200 mitóz (46±2 centromery)

• Stanoven Mitotický index - buňky v metafázi : celkový počet buněk v populaci

• Procento aberentních buněk vůči negativní kontrole


Chromozomové aberace - příklady

Prstencový chromozom (kruhový fragment)

Chromozomový zlom


Chromozomové aberace - příklady

Dicentrický chromozom

Acentrický fragment

Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474

• Mikronukleus test zjišťuje poškození, jež testovaná látka způsobuje v chromozómech nebo mitotickém aparátu erytroblastů.

• Výsledkem cytogenetického poškození je vznik mikrojader – chromozómových fragmentů v erytrocytech a současně změna v poměru zralých a nezralých erytrocytů v kostní dřeni.

• Pro tento test existuje in vitro metoda – v současné době je ve fázi schvalování

• Metodika in vivo – pokusné zvíře potkan

– testovaná látka v 1 – 3 koncentracích

– negativní kontrola + pozitivní kontrola

– jednorázová aplikace

– vyšetření kostní dřeně 24 a 48 hodin po aplikaci


Hodnocení kostní dřeně

Normochromní erytrocyt:

•zralý erytrocyt, barvící se eosinofilně – červenooranžově

Polychromní erytrocyt:

•nezralý erytrocyt, barvící se bazofilně - šedomodře

Mikrojádra:

•fragmenty jádra vznikající během dělení buňky z chromozómů opožděných v dělení

Hodnocení

•poměr zralých a nezralých erytrocytů

•přítomnost nezralých erytrocytů s mikrojádry


savčí buňky s mikrojádry – in vitro test - příklady

Mutagenita – kometový test (Comet assay)

Date post:	13-Jan-2016
Category:	Documents
Upload:	kynan
View:	54 times
Download:	0 times

Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita

Documents