THE SPECTRUM OF MICROMYCETES ON TRANSGENIC AND NONTRANSGENIC MAIZE MIKROSKOPICKÉ HOUBY NA TRANSGENNÍ A NETRANSGENNÍ KUKUŘICI Remešová J 1 ., Prášil K 2 . 1 Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Česká zemědělská univerzita, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, Česká republika. 2 Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Benátská 2, 128 01 Praha 2, Česká republika. E-mail: [email protected], [email protected]ABSTRACT In 2002-2004, the efficiency of Bt-maize in comparison with biological control by the introduction of Trichogramma wasp and untreated control hybrids in two localities in the Czech Republic was proved. It was detected, that the occurence of spectrum of micromycetes on Bt-maize MON 810 and nontransgenic hybrids in dependence on different injury of plants, cause by larvae Ostrinia nubilalis in silvicultural conditions of middle Europe was similar. The frequence of micromycetes were more lower on Bt-maize after mechanical injury by 57% Fusarium species, by 48% Acremonium strictum, than on nontransgenic hybrids of maize after injury cause by larvae Ostrinia nubilalis. Keywords: Bt-maize, micromycetes, plant protection, Ostrinia nubilalis, Trichogramma. ABSTRAKT Zavíječ kukuřičný (Ostrinia nubilalis Hbn.) je hlavním škůdcem kukuřice ve střední Evropě a tedy i v České Republice. V letech 2002-2004 bylo zjišťováno druhové spektrum mikromycetů transgenní a netransgenní kukuřice. Byla zkoušena účinnost ochrany proti zavíječi kukuřičnému použitím Bt-kukuřice MON 810 v porovnání s biologickou ochranou pomocí vosičky rodu Trichogramma a kontrolní variantou na dvou lokalitách v České republice (Ivanovice na Hané a Praha-Ruzyně). Bylo zjištěno, že druhové spektrum mikromycetů vyskytujících se na Bt-kukuřici MON 810 a netransgenních variantách pokusu v závislosti na rozdílném poškození rostlin housenkami zavíječe v pěstebních podmínkách střední Evropy bylo podobné. Na Bt-kukuřici po mechanickém poškození byla frekvence výskytu výrazně nižší u druhů rodu Fusarium o 57%, u druhu Acremonium strictum o 48%, než na netransgenních variantách po poškození housenkami zavíječe kukuřičného. Klíčová slova: Bt-kukuřice, mikromycety, ochrana rostlin, Ostrinia nubilalis, Trichogramma.
Transcript
THE SPECTRUM OF MICROMYCETES ON TRANSGENIC AND NONTRANSGENIC MAIZE
MIKROSKOPICKÉ HOUBY NA TRANSGENNÍ A NETRANSGENNÍ KUKUŘICI
Remešová J1., Prášil K2. 1Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Česká zemědělská univerzita, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, Česká republika. 2Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Benátská 2, 128 01 Praha 2, Česká republika.
In 2002-2004, the efficiency of Bt-maize in comparison with biological control by the introduction of Trichogramma wasp and untreated control hybrids in two localities in the Czech Republic was proved. It was detected, that the occurence of spectrum of micromycetes on Bt-maize MON 810 and nontransgenic hybrids in dependence on different injury of plants, cause by larvae Ostrinia nubilalis in silvicultural conditions of middle Europe was similar. The frequence of micromycetes were more lower on Bt-maize after mechanical injury by 57% Fusarium species, by 48% Acremonium strictum, than on nontransgenic hybrids of maize after injury cause by larvae Ostrinia nubilalis.
Zavíječ kukuřičný (Ostrinia nubilalis Hbn.) je hlavním škůdcem kukuřice ve střední Evropě a tedy i v České Republice. V letech 2002-2004 bylo zjišťováno druhové spektrum mikromycetů transgenní a netransgenní kukuřice. Byla zkoušena účinnost ochrany proti zavíječi kukuřičnému použitím Bt-kukuřice MON 810 v porovnání s biologickou ochranou pomocí vosičky rodu Trichogramma a kontrolní variantou na dvou lokalitách v České republice (Ivanovice na Hané a Praha-Ruzyně). Bylo zjištěno, že druhové spektrum mikromycetů vyskytujících se na Bt-kukuřici MON 810 a netransgenních variantách pokusu v závislosti na rozdílném poškození rostlin housenkami zavíječe v pěstebních podmínkách střední Evropy bylo podobné. Na Bt-kukuřici po mechanickém poškození byla frekvence výskytu výrazně nižší u druhů rodu Fusarium o 57%, u druhu Acremonium strictum o 48%, než na netransgenních variantách po poškození housenkami zavíječe kukuřičného.
ÚVOD Zavíječ kukuřičný je nejvýznamnější škůdce kukuřice ve střední Evropě (Magg & al.,
2001). Postupné mírné oteplování zavíječi umožňuje dobře přečkat zimu a zároveň posouvá hranice jeho výskytu z nejjižnějších částí republiky více na sever (Sácká & Bosák 2002).
Housenky zavíječe přezimují v posklizňových zbytcích kukuřice a v květnu se kuklí. Líhnutí motýlů probíhá asi od poloviny června do konce srpna. Motýli nalétávají do porostu kukuřice a samice kladou vajíčka po deseti až třiceti na spodní stranu listů. Za svůj život samička naklade 250-350 vajíček. Housenky se líhnou za 10 až 15 dní a zpočátku ožírají listy nebo prašníky květů. Po druhém svlékání pronikají do stébel a palic. Dospělé housenky prodělávají ve zbytcích rostlin diapauzu do příštího května, kdy se kuklí. V České republice má zpravidla jen jednu generaci (Bosák 2002).
V posledních 10 letech se zavíječ kukuřičný postupně šíří z původních oblastí výskytu na další území. Míra napadení kukuřice zavíječem je v oblastech pěstování kukuřice vysoká. Ve všech oblastech pěstování kukuřice významně vzrůstá jeho hospodářský význam. V teplých oblastech je běžně poškozeno 70-100% rostlin, v ostatních oblastech v průměru 50% rostlin. Vlivem globálního oteplování a zaváděním ranných hybridů lze očekávat další zvyšování výskytu zavíječe (Munkvold & Desjardins 1997).
Stále častější střídání kukuřice s obilovinami vedla ke zvýšenému výskytu mikromycetů na kukuřici i obilovinách. Kukuřice je kolonizována různými druhy hub, jež můžeme z ekologického pohledu klasifikovat podle různých hledisek (výživa, místo výskytu, typ vztahů s hostitelem). Jedním ze základních rozdělení je členění na endofyty a epifyty. Endofyty jsou druhy žijící uvnitř rostlin a epifyty na povrchu. Vnitřní mykobiotu zahrnují parazitické a saprotrofní houby, přítomné v epidermální vrstvě, vzácněji v aleuronových buňkách, endospermu, klíčku. Zatímco parazité aktivně prorůstají obilkou, saprotrofní houby se dostávají do obilky většinou při jejím mechanickém poškození. Vnější mykobiota na povrchu obilek je tvořena relativně velkým množstvím mikromycetů. Bylo prokázáno více než sto různých druhů. Tato studie byla zaměřena na zjištění druhů vyskytujících se na povrchu kukuřice.
Většina autorů se shoduje v tom, že v největší míře jsou na obilkách kukuřice před sklizní zastoupeny mikromycety rodů Fusarium, Alternaria, Cladosporium a Epicoccum. Tyto mikromycety jsou hojně rozšířené na širokém spektru rostlinných zbytků v půdě i ve vzduchu (Fischer & al. 1992, González & al. 2001, Ono & al. 1999, 2002, Pitt & al. 1993, 1998).
Druhy rodu Fusarium infikují kukuřici při vzcházení nebo po poškození rostlin hmyzem nebo ptáky (Reid 1999). Mikromycety rodu Fusarium způsobují choroby klíčících rostlin, kořenů, stébel a palic kukuřice, které způsobují ztráty na výnosech. Mykotoxiny produkované zejména druhy rodu Fusarium kontaminují obilky kukuřice. Výskyt mykotoxinů v obilkách kukuřice snižuje kvalitu produktu a může mít nepříznivý vliv na zdraví člověka a hospodářských zvířat (Broggi & al. 2002, Castella & al. 1999, Chu & Li 1994, IARC 1993, Munimbazi & Bullerman 1996).
Mezi náchylností hybridů kukuřice k poškození housenkami zavíječe kukuřičného a výskytem houbových chorob způsobených druhy rodu Fusarium existuje úzká souvislost (Jarvis & al. 1984). Housenky zavíječe kukuřičného otvírají cestu pro přenos mikromycetů z povrchu listů dovnitř rostlin (Munkvold 1997, Sobek & Munkvold 1999). Poškození kukuřice housenkami zavíječe je tak častou příčinou následných infekcí houbami rodu Fusarium (Lew & al. 1991, Munkvold & al. 1997b, 1999). Účinná ochrana kukuřice vůči zavíječi kukuřičnému vede ke snížení výskytu toxinogenních mikromycetů rodu Fusarium na kukuřici.
Ve studii byly použity tři způsoby ochrany: 1. orba, 2. parazitické vosička rodu Trichogramma a 3. Bt-kukuřice. Účinnost nejrozšířenějšího způsobu ochrany vůči zavíječi, provádění hluboké orby, je nedostatečné. Hluboká orba je problematická s ohledem k možné erozi půdy a poměrně vysokým nákladům. Současný trend minimalizace zpracování půdy a pěstování kukuřice po kukuřici vyžaduje zavádění nových způsobů ochrany vůči zavíječi a vyhodnocování jejich účinnosti. Metoda ochrany kukuřice pomocí parazitické vosičky rodu Trichogramma se v posledních letech v České republice významně rozšířila. Vosičky rodu Trichogramma prodělávají svůj vývoj ve vajíčkách různých druhů motýlů. Samičky čichem vyhledávají snůšky zavíječe kukuřičného a kladou svá vajíčka do vajíček škůdce. Ve vajíčku hostitele se líhne nová generace. Vylíhlé larvy se živí vaječným obsahem. Vosičky rodu Trichogramma se aplikují jako přípravek formulovaný do kapsle okrouhlého tvaru. Přestože ochrana pomocí vosičky je ekonomicky efektivní, není vliv na kvalitu produktů dostatečně dokumentován. Přestože existuje řada poznatků o použití vosičky rodu Trichogramma (Hassan & Wühner 1997) je stále možno zvyšovat efektivitu používání technikou masových chovů, formulací prostředku ochrany, časováním aplikace a zdokonalením aplikační techniky. Třetí nejúčinnější způsob ochrany kukuřice vůči zavíječi kukuřičnému je využití transgenní kukuřice (Bt-kukuřice), která obsahuje geny Cry původem z bakterie Bacillus thuringiensis. Převážná většina dnes existujících transgenních rostlin rezistentních vůči hmyzu má do svého genomu zaveden gen, kódující protein z Bacillus thuringiensis (Bt). Jedná se o ubiquistickou grampozitivní bakterii, která způsobuje v půdě drobné epizootie hmyzu. Bakterie produkuje krystalinní protein, který v sobě obsahuje insekticidní složku. V těle hmyzu po pozření bakterie s potravou se receptor proteinu naváže na epitel středního střeva, což obvykle vede k jeho lyzi. Příjem potravy se zastaví a hmyz během několika hodin nebo dnů umírá. Po přenesení genu z bakterie Bt do rostliny, jsou rostlinné buňky schopny produkovat toxin pro hmyz. Aby rostlina vykazovala dostatečné insekticidní účinky, je třeba dosáhnout koncentrace 0,1 až 1% insekticidního proteinu z celkového objemu proteinů. Místo přímého postřiku přípravkem na bázi Bt, které se u řady plodin u nás dlouhodobě používá, se rostlina dokáže proti škodlivému hmyzu bránit sama (Kocourek 2000).
Na Bt-kukuřici je oproti netransgenním hybridům výrazně redukováno poškození rostlin zavíječem, výrazně nižší je napadení houbami rodu Fusarium (Munkvold & al. 1999, Clements & al. 2003). V produktech Bt-kukuřice je také oproti netransgenním hybridům výrazně nižší obsah mykotoxinů (Magg & al. 2002, 2003). Munkvold & Hellmich (1999) uvádějí, že množství mykotoxinů je ovlivněno stupněm poškození rostlin zavíječem.
V produktech Bt-kukuřice se oproti klasickým hybridům může obsah mykotoxinů snížit až o 80%.
Počet mykotoxinů a jejich koncentrace v obilkách kukuřice závisí na výskytu toxinogenních druhů mikromycetů, intenzitě napadení palic a konkrétních podmínkách průběhu počasí v daném roce (Munkvold & al. 1999).
Cílem práce bylo zjistit druhové spektrum mikromycetů transgenní a netransgenní kukuřice v závislosti na rozdílném poškození rostlin housenkami zavíječe. Studium druhového spektra mikromycetů Bt-kukuřice zatím nebylo zjišťováno. Výzkumná hypotéza vycházela z předpokladu, že hybridy Bt-kukuřice nejsou poškozovány zavíječem kukuřičným oproti hybridům netransgenním. Poškození rostlin otvírá vstupní brány pro větší napadení mikroskopickými houbami. Na Bt-kukuřici jsme očekávali nižší stupeň napadení mikroskopickými houbami a jiné druhové spektrum než na hybridech kukuřice, které zavíječ kukuřičný napadá.
MATERIÁL A METODIKA Polní pokusy byly prováděny na dvou lokalitách Ivanovice na Hané a Praha-Ruzyně v letech 2002, 2003 a 2004. Na každé lokalitě byly použity 3 způsoby ochrany vůči zavíječi kukuřičnému: 1) insektrezistentní Bt-kukuřice MON 810 DKC3421YG, 2) netransgenní hybridy ošetřené biologickou ochranou pomocí vosičky rodu Trichogramma ve dvou hybridech 2a) Monumental-izolinie DKC3420 a 2b) Raissa, 3) netransgenní kukuřice bez ochrany proti zavíječi (kontrolní varianta-orba) ve dvou hybridech 3a) Monumental-izolinie DKC3420 a 3b) Raissa místní hybrid.
Každá ze 3 způsobů ochrany kukuřice byla aplikována na ploše 0,3 ha. Varianta ošetřená biologickou ochranou vosičkou rodu Trichogramma byla umístěna na konci pozemku po směru převládajících větrů. Celkem bylo hodnoceno 5 variant pokusu: 1) Bt-kukuřice, 2) Monumental izolinie ošetřená vosičkou rodu Trichogramma, 3) Raissa ošetřená vosičkou rodu Trichogramma, 4) Momumental izolinie, 5) Raissa.
Lokalita Ivanovice na Hané se nachází v oblasti typické pro pěstování kukuřice na zrno s pravidelným vysokým výskytem zavíječe kukuřičného. Lokalita Praha-Ruzyně se nachází v okrajové oblasti pěstování kukuřice na zrno s nepravidelným škodlivým výskytem zavíječe kukuřičného. Ve všech experimentech bylo přirozené napadení porostů zavíječem kukuřičným. Na obou lokalitách byly polní pokusy ve třech letech za sebou prováděny na stejné ploše, jako monokultura kukuřice. Také jednotlivé způsoby ochrany např. Bt-kukuřice byla ve třech letech umístěna na stejné ploše. Aplikace vosičky rodu Trichogramma byla prováděna přípravkem Trichoplus na počátku letu dospělců zavíječe, který byl určen podle náletu dospělců do světelného lapače.
Z jednotlivých variant pokusu byly odebírány palice ze kterých bylo izolováno houbové mycelium a vzorky obilek pro stanovení druhového spektra mikromycetů.
Pro odběr byly vybírány palice s viditelným požerkem zavíječe a s patrným myceliem na povrchu. Pouze u hybridu Bt-kukuřice byly odebírány palice s mechanickým poškozením nebo viditelným myceliem na povrchu. V důsledku odolnosti Bt-kukuřice vůči zavíječi nebyly nalezeny palice napadené zavíječem. V průběhu let 2002-2004 bylo celkem odebráno 180 palic, tedy 36 palic z jednotlivých variant pokusu.
Pro zjištění druhového spektra mikromycetů byly použity dvě metody izolace: 1) přímá izolace viditelného mycelia z povrchu palice (přenos mycelia patrného pod binokulární lupou sterilní jehlou z povrchu palice na izolační média) a 2) metoda omytí obilek (náhodně vybrané tři obilky z palice byly následně ponořeny do 5 ml sterilní vody a po dobu 2 minut třikrát třepány v ultrasonické třepačce). Omyté obilky byly přeneseny sterilní pinzetou na izolační média. Jako izolační média byla použita: agar se sladovým extraktem (MEA), kukuřičný agar (CMA) a půdní agar s glukózou a bengálskou červení (SEGA). Petriho misky byly inkubovány v termostatu ve tmě při 25°C.
VÝSLEDKY A DISKUZE V Tab. 1 uvádíme celkové frekvence výskytu druhů, které byly izolovány za celou
dobu našeho zkoumání.
Celkem bylo izolováno 31 druhů vláknitých mikromycetů. Systematicky se jednalo o 8 zástupců zygomycetů a 23 askomycetů (v anamorfním stádiu).
Bez ohledu na variantu pokusu jsme v našich podmínkách nejčastěji izolovali druhy Acremonium strictum (s frekvencí výskytu 38,61%), Alternaria alternata (26,94%), Cladosporium cladosporioides (39,17%), Mucor circinelloides f. circinelloides (29,72%) a druhy rodu Fusarium (63,06%).
Zvýrazněné druhy v tabulce Acremonium strictum, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Fusarium sp. div. a Mucor circinelloides f. circinelloides, byly izolovány ze všech variant pokusu po tři roky.
Pouze z Bt-kukuřice byl izolován druh Bipolaris bicolor, B. spicifera a Humicola fuscoatra var. fuscoatra. Pouze na variantě pokusu Monumental-izolinie byly izolovány druhy Coniothyrium sporulosum a Geotrichum candidum. Druhy Alternaria tenuissima, Curvularia eragrostidis a Harzia acremonioides byly izolovány jen z kukuřice typu Monumental-izolinie s ošetřením parazitickou vosičkou rodu Trichogramma. Druhy, které se vyskytovaly jen na variantě pokusu Raissa s ošetřením parazitickou vosičkou rodu Trichogramma byly Clonostachys rosea f. catenulata, Lecanicillium cf. longisporum a Mucor hiemalis f. corticolus.
Byly izolovány druhy, které jsou v ČR vzácně nalézány. Do této skupiny bezesporu patří Bipolaris bicolor, B. spicifera, Coniothyrium sporulosum, Curvularia eragrostidis a Pithomyces chartarum.
Bylo zjištěno, že druhové spektrum mikromycetů Bt-kukuřice MON 810 a její netransgenní izolinie v závislosti na rozdílném poškození rostlin housenkami zavíječe v
pěstebních podmínkách střední Evropy bylo podobné. Na Bt-kukuřici po mechanickém poškození (způsobeném například ptáky, hmyzem nebo hnilobou vrcholové části klasu) byla frekvence výskytu výrazně nižší u druhů rodu Fusarium o 57%, u druhu Acremonium strictum o 48% než na netransgenních variantách po poškození housenkami zavíječe kukuřičného.
Z přímých ordinačních technik byla zvolena analýza RDA. Do analýzy vstupovaly následující proměnné prostředí (environmental variables, nezávislé proměnné): varianta pokusu (Bt, Monumental-izolinie, Raissa, Monumental-izolinie s ošetřením, Raissa s ošetřením vosičkou Trichogramma), sezóna (2002, 2003), lokalita (Praha-Ruzyně, Ivanovice na Hané). Všechny proměnné byly kategoriální a nabývaly hodnot 0/1. Jako závislé proměnné byly použity hodnoty četnosti jednotlivých druhů (druhy, tj. species, izolované z jednotlivých variant pokusu). Do statistického zpracování výsledků nebyly zařazeny druhy, které se vyskytovaly pouze 1× v celém souboru. Jednalo se o procentuální hodnoty, které nabývaly rozpětí 0-100. Testovali jsme závislost mykobioty na sezóně, lokalitě a variantě pokusu. Test kanonických os vyšel průkazný u všech testovaných proměnných (P-value = 0,002).
Z analýzy vyplývá, že celkovou variabilitu mykobioty kukuřice lze nejvíce vysvětlit proměnnou prostředí – sezóna, tedy mykobiota kukuřice byla nejvíce rozdílná v jednotlivých rocích. Statisticky průkazný je i vliv ostatních proměnných prostředí.
Při analýze proměnné sezóna, byly jako kovariáty použity lokalita a varianta pokusu. Druh Lecanicillium muscarium se nejvíce vyskytoval v roce 2002 a nejvyšší výskyt v roce 2003 měly druhy rodů Aspergillus, Penicillium a druh Rhizopus stolonifer. V roce 2004 byly s největší frekvencí izolovány druhy Rhizopus oryzae a druhy rodu Fusarium. Druhy se vzdálenými šipkami od proměnné prostředí se vyskytovaly po tři roky, ale jsou ovlivněny dalšími proměnnými prostředí. Viz graf. 1.
Graf 1 - Grafický výstup z přímé analýzy RDA. Znázornění pozice jednotlivých druhů ve vztahu k proměnné prostředí – sezóně.
Při analýze závislosti mykobioty na lokalitě jsme jako kovariáty použily varianty pokusu a roky
V grafu. 2 jsou druhy odděleny podle výskytu na lokalitách. Druhy nejsou výrazně rozděleny k jednotlivým lokalitám, protože se většinou vyskytovaly na obou. Např. druhy rodu Fusarium se v důsledku vyššího napadení rostlin zavíječem kukuřičným vyskytovaly na obou lokalitách, ale na lokalitě L2 (Ivanovice na Hané) se vyskytovaly ve vyšších frekvencích. Graf 2 - Grafický výstup z přímé analýzy RDA. Znázornění pozice jednotlivých druhů ve vztahu k proměnné prostředí – lokalitě (L1- Praha-Ruzyně, L2- Ivanovice na Hané).
0.8 Alalt Clcla Epicoc
AcsMhihiMcici
Penic
Clsphtr
Lecm
Asper Humi
Pitho Alten Gonat
RhiorClheMcilu
FusaL1 L2
Leclo -0.2 RhistMhilu-1.0 1.0
Nejnižší procento variability vysvětluje proměnná varianta pokusu. Výsledky analýz hodnot četností druhů pro proměnnou varianta pokusu vedou k předpokladu, že hlavní rozdíly mezi variantami pokusu jsou dány frekvencí jednotlivých druhů. Při analýze proměnné varianta pokusu, byly jako kovariáty použity lokalita a roky.
Bylo zjištěno, že druhové spektrum mikromycetů vyskytujících se v palicích Bt-kukuřice a netransgenních variant bylo podobné. Frekvence výskytu druhového spektra hub izolovaných z kukuřice byla nejvíce odlišná na Bt-kukuřici oproti frekvenci výskytu hub na netransgenních hybridech Monumental-izolinie a Raissa s různými režimy ošetření.
Frekvence výskytu druhů rodu Fusarium a Acremonium strictum byla výrazně nižší na Bt-kukuřici než na netransgenních variantách. Frekvence výskytu druhu Alternaria alternata byla vyšší na Bt-kukuřici. Viz graf 3.
Graf 3 - Grafický výstup z přímé analýzy RDA. Znázornění pozice jednotlivých druhů ve vztahu k proměnné varianta pokusu. 1 - Bt-kukuřice, 2 – Monumental-izolinie+ Trichogramma, 3 - Raissa+ Trichogramma, 4 - Monumental-izolinie, 5 - Raissa
1.0
4
Acstr Fusar Alalt
Alten Leclo
Asper Mcilu 2
Pith5
Clcla CMhihi lher MciPenic ci
Clsph E
Gonat Mhilu Rhist
HumicLecmu
Rhior
picoc 1
3 -0.8
-1.0 1.0
V roce 2002 až 2004 jsme provedly odběry palic transgenní a netransgenní kukuřice a izolace druhového spektra hub. Odebírali jsme palice s viditelným požerkem zavíječe a s patrným myceliem na povrchu. Pouze u hybridu Bt-kukuřice byly odebírány palice s mechanickým poškozením nebo viditelným myceliem na povrchu. V důsledku odolnosti Bt-kukuřice vůči zavíječi nebyly nalezeny palice napadené zavíječem. Byly vybrány dvě odběrové plochy lišící se svým napadením zavíječem kukuřičným. Lokalita Ivanovice na Hané se nacházela v oblasti typické pro pěstování kukuřice na zrno s pravidelným vysokým výskytem zavíječe kukuřičného. Lokalita Praha-Ruzyně se nachází v okrajové oblasti pěstování kukuřice na zrno s nepravidelným škodlivým výskytem zavíječe kukuřičného. Ve všech experimentech bylo přirozené napadení porostů zavíječem kukuřičným. Studium druhového spektra Bt-kukuřice zatím nebylo zjišťováno. Většina prací o Bt-kukuřici srovnává většinou poškození rostlin kukuřice ve vztahu k zavíječi kukuřičnému (Magg & al. 2001). Munkvold & Hellmich (1999), Munkvold & Desjardins (1997), Munkvold & al. (1997), Clements & al. (2003) uvádějí, že Bt-kukuřice má výrazně nižší koncetraci fumonisinů a nižší napadení palic zástupci rodu Fusarium, oproti netransgenní kukuřici ve stejných podmínkách. Výsledkem jejich práce je, že Bt-kukuřice MON-810 (použitá i v práci), je účinná v redukci koncentrace mykotoxinů v kukuřičných obilkách, díky snížení napadení kukuřice zavíječem kukuřičným. Gatch & Munkvold (2002) uvádějí rozdílné množství druhů působící hniloby stébel kukuřice mezi transgenní a netransgenní kukuřicí. Bt-kukuřice byla méně napadena druhy rodu Fusarium než netransgenní kukuřice.
Bylo zjištěno, že druhové spektrum mikromycetů vyskytujících se v palicích Bt-kukuřice MON 810 a ostatních variantách pokusu v závislosti na rozdílném poškození rostlin housenkami zavíječe v pěstebních podmínkách střední Evropy bylo podobné. Na Bt-kukuřici po mechanickém poškození byla frekvence výskytu výrazně nižší u druhů rodu Fusarium o 57% než na netransgenních variantách po poškození housenkami zavíječe kukuřičného.
Řešení práce potvrdilo nejvyšší účinnost Bt-kukuřice vůči zavíječi a toxinogenním houbám rodu Fusarium. Celkové výsledky pro proměnnou variantu pokusu vedou k předpokladu, že hlavní rozdíly jsou dány frekvencí jednotlivých druhů na variantách. Je pravděpodobné, že substrátová preference hraje v případě rozdílné mykobioty mezi jednotlivými variantami malou úlohu (El-Maghraby & al. 1995). Z výsledků vyplývá, že druhové spektrum mikromycetů v obilkách kukuřice závisí na klimatických podmínkách během roku. Záchyt toxinogenních druhů hub ještě neznamená přítomnost mykotoxinů a všechny kmeny potenciálně toxinogenních mikromycetů nemusí být toxinogenní. Na produkci mykotoxinů má vliv mnoho faktorů, a to např. vlhkost, teplota, přítomnost kyslíku, oxidu uhličitého, složení substrátu, převaha toxinogenních druhů mikromycetů, mikrobiální interakce a přítomnost hmyzu (Lacey & Magan 1991, Doohan & al. 2003).
Výsledky jsou ve shodě s druhy, které byly nejčastěji izolovány z netransgenní kukuřice také v jiných studiích. Jedná se o druhy Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Epicoccum nigrum a druhy rodu Fusarium. Jsou to běžné saprotrofní druhy vyskytující se na obilovinách (Fischer & al. 1992, González & al. 2001, Ono & al. 1999, 2002, Pitt & al. 1993, 1998, Lacey & Magan 1991). Kromě těchto mikromycetů byly dále izolovány další druhy hub: Lecanicillium cf. longisporum a L. muscarium, které byly dříve řazeny do široce pojatého druhu Verticillium lecanii (Zimm.) Viégas, jsou entomopatogenní. Dále jsou uváděni zástupci rodů Bipolaris, Mucor a Rhizopus (Broggi & al. 2002). Mikromycety těchto rodů jsme taktéž izolovali, především taxony Mucor circinelloides, M. hiemalis, Rhizopus oryzae a R. stolonifer. Tyto druhy jsou saprotrofní, využívající jednodušší sacharidy. Ze zástupců rodů Bipolaris jsme izolovali pouze jednou druhy Bipolaris bicolor, B. spicifera. Krivobok & al. (1995) uvádějí také mikromycety Coniothyrium sporulosum a Pithomyces chartarum, které byly také izolovány. Druhy Bipolaris bicolor, B. spicifera, Coniothyrium sporulosum, Curvularia eragrostidis a Pithomyces chartarum jsou v ČR vzácně nalézány.
Z potencionálně fytopatogenních mikroskopických hub byly izolovány pouze druhy rodu Fusarium a druhy Acremonium strictum a Alternaria alternata. Druhy jsou zjištěné podle slovníku fytopatogenních hub Holliday (1989), který uvádí přehled druhů s potencionálními fytopatogenními vlastnostmi.
Z hlediska možné produkce toxinu byly nejvýznamnější druhy rodu Fusarium, (izolovány s frekvencí 63,06%) a mikroskopická houba Alternaria alternata (26,94%). Druhy jsou uvedeny podle publikací Samson (1996), Kendric (1992), které uvádějí houby, potencionálně schopné produkovat mykotoxiny.
Polní pokusy s Bt-kukuřicí rezistentní k zavíječi kukuřičnému v podmínkách České republiky ukazují na významné zvýšení efektivnosti pěstování ve srovnání s dosud pěstovanými hybridy kukuřice. Bt-kukuřice je dosud nejúčinnější metodou ochrany proti zavíječi kukuřičnému. V důsledku toho se minimalizuje výskyt toxinogenních mikromycetů, zejména druhů rodu Fusarium.
Ke snížení výskytu mikromycetů je také nutno dodržovat zásady integrovaného systému pěstování rostlin. Patří sem především volba optimálního stanoviště pro pěstovanou plodinu, výběr vhodné odrůdy pro konkrétní pěstitelskou oblast, harmonická výživa či přiměřená pesticidní ochrana proti houbovým chorobám a hmyzím škůdcům, kteří svojí činností vytvářejí vstupní bránu pro patogeny produkující toxické látky. Velmi důležitá je také dobře načasovaná a provedená sklizeň plodiny.
ZÁVĚR Srovnání spektra hub na Bt-kukuřici a na netransgenních hybridech s různou
intenzitou poškození rostlin zavíječem ukázalo, že na transgenní Bt-kukuřici byly izolovány houby s nejmenší frekvencí výskytu, s větší frekvencí na hybridech ošetřených parazitickou vosičkou Trichogramma a největší frekvence výskytu na netransgenních neošetřených hybridech.
Celkem jsme izolovali 31 druhů vláknitých mikromycetů. Systematicky se jednalo o 8 zástupců zygomycetů a 23 askomycetů (v anamorfním stádiu). Na všech hybridech kukuřice byly izolovány taxony: Acremonium strictum, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Mucor circinelloides f. circinelloides a druhy rodu Fusarium. Pouze na transgenní Bt-kukuřici byly izolovány druhy: Bipolaris bicolor, B. spicifera, a Ulocladium chartarum. Pouze na netransgenních hybridech byly izolovány druhy Alternaria tenuissima, Cladosporium herbarum, Clonostachys rosea f. catenulata, Coniothyrium sporulosum, Curvularia eragrostidis, Engyodontium album, Geotrichum candidum, Gonatobotrys simplex, Harzia acremonioides, Mucor circinelloides f. lusitanicus, M. hiemalis f. corticolus, M. hiemalis f. hiemalis a Pithomyces chartarum.
Statistické zpracování výsledků ukázalo, že největší vliv na frekvenci výskytu hub na kukuřici měla sezóna, druhý největší vliv měla lokalita a třetí varianta pokusu.
Na Bt-kukuřici byly před sklizní byly izolovány s nižší frekvencí výskytu mikromycety: Acremonium strictum o 48% a druhy rodu Fusarium o 57%.
Z mikromycetů schopných produkovat mykotoxiny byly s největší frekvencí zjištěny druhy rodů Fusarium a druh Alternaria alternata. Z potencionálně fytopatogenních mikroskopických hub jsme izolovali pouze druhy rodu Fusarium a druhy Acremonium strictum a Alternaria alternata.
LITERATURA Bagar M. (2002): Ochrana před zavíječem kukuřičným. - Agromagazín 3(1): 32.
Broggi L. E., González H. H. L., Resnik S. L. & Pacin A. M. (2002): Mycoflora distribution in dry-milled fractions of corn in Argentina. - Cereal. Chem. 79(5): 741-744.
Castella G., Bragulat M. R. & Cabanes F. J. (1999): Surveillance of fumonisins in maize - based feeds and cereals from Spain. - J. Agric. Food Chem. 47: 4707-4710.
Clements M. J., Campbell K. W., Maragos C. M., Pilcher C., Headrick J. M., Pataky J. K. & White D. G. (2003): Influence of Cry 1Ab protein and hybrid genotype on fumonisin contamination and Fusarium ear rot of corn. – Crop Sci. 43(4): 1283-1293.
Doohan F. M., Brennan J. & Cooke B. M. (2003): Influence of climatic factors on Fusarium species pathogenic tocereals. – Europ. J. Plant Pathol. 109(7): 755-768.
El-Maghraby O. M. O., El-Kady I. A. & Soliman S. (1995): Mycoflora and Fusarium toxins of three types of corn grains in Egypt with special reference to production of trichothecene toxins. - Microbiol. Res. 150: 225-232.
Fisher P. J., Petrini O. & Scott H. M. L. (1992): The distribution fungal and bacterial endophytes in maize. - New Phytol. 122: 299-305.
Gatch E. W. & Munkvold G. P. (2002): Fungal species composition in maize stalks in relation to European corn borer injury and transgenic insect protection. – Plant Dis. 86(10): 1156-1162.
González H. H. L., Resnik S. L. & Pacin A. M. (2001): Mycoflora of freshly harvested flint corn from northwestern provinces in Argentina. - Mycopathologia 155: 207-211.
Hassan S. A. & Wühner B. G. (1997): Present status of research and commercial utilisation of egg parasitoids of the genus Trichogramma in Germany. - Gesunde Pflanzen 49: 68-75.
Holliday P. (1989): A dictionary of plant pathology. - 369 p., New York.
Chu F. S. & Li G. Y. (1994): Simultaneous occurence of fumonisin B1 and other mycotoxins in moldy corn collected from the People’s Republic of China in regions with high incidence of esophageal cancer. - Appl. Environ. Microbiol. 60: 847-852.
IARC, 1993: IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. Vol 56. Some Naturally Occuring Substances: Food Items and Constituents, Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins. International Agency for Research on Cancer, Lyon, France.
Jarvis J. L., Clark R. L., Guthrie W. D., Berry E. C. & Russell W. A. (1984): The relationship between second-generation European corn borers and stalk root fungi in maize hybrids. – Maydica 24: 247-263.
Kocourek F. (2000): Biotechnologie v ochraně rostlin před škodlivými mikroorganismy. - Úroda 48(1): 25-27.
Krivobok S., Seigle-Murandi F., Steiman R. & al. (1995): Fungal flora and ochratoxin A in various food and feed in France. - System. Appl. Microbiol. 18: 455-459.
Lacey J. & Magann N. (1991): Fungi in cereal grains: their occurence and water and temperature relationship. - In: Chelkowski J. [ed.], Cereal grain, mycotoxins, fungi and quality in drying and storage, p. 77-118, Amstrodam etc.
Lew H., Adler A. & Edinger E. (1991): Moniliformin and the European corn borer (Ostrinia nubilalis). – Mycotox. Res. 7A 71-76.
Magg T., Bohn M., Klein D., Merditaj V., & Melchinger A. E. (2003): Concentration of moniliformin produced by Fusarium species in grains of transgenic Bt maize hybrids compared to their isogenic counterparts and commercial varieties under European corn borer pressure. – Pl. Breed. 122: 322-327.
Magg T., Melchinger A. E., Klein D. & al. (2001): Comparison of Bt-maize hybrids with their non-transgenic counterparts and commercial varieties for resistance to European corn borer and for agronomic traits. - Pl. Breed. 120: 397-403.
Magg T., Melchinger A. E., Klein D. & Bohn M. (2002): Relationship between European corn borer resistance and concentration of mycotoxins produced by Fusarium spp. in grains of transgenic Bt maize hybrids, their isogenic counterparts, and commercial varieties. – Pl. Breed. 121(2): 146-154.
Munimbazi C. & Bullerman L. B. (1996): Molds and mycotoxins in foods from Burundi. - J. Food Protect. 59(8): 869-875.
Munkvold G. P. & Hellmich R. L. (1999): Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize and nontransgenic hybrids. - Plant Dis. 2: 130-138.
Munkvold G. P. & Desjardins A. E. (1997a): Fumonisins in maize: Can we reduce their occurence? - Plant Dis. 81: 556-565.
Munkvold G. P., Hellmich R. L. & Showers W. B. (1997b): Reduced fusarium ear rot and symptomless infection in kernels of maize fenetically engineered for European corn borer resistance. - Phytopathology 87: 1071-1077.
Ono E. Y. S., Sasaki E. Y. & Hashimoto E. H. & al. (2002): Post-harvest storage of corn: effect of beginning moisture content on mycoflora and fumonisins contamination. - Food Add. Contam. 19(11): 1081-1090.
Ono E. Y. S., Sugiura Y., Homechin M. & al. (1999): Effect of climatic conditions on natural mycoflora and fumonisins in freshly harvested corn of the State of Paraná, Brazil. - 147: 139-148.
Pacin A. M., González H. H. L., Etcheverry S. L. & al. (2002): Fungi associated with food and feed commodities from Ecuador. - Mycopathologia 156: 87-92.
Pitt J. I., Hocking A. D. & Miscamble B. F. (1998): The mycoflora of food commodities from Indonesia. - J. Food Mycol. 1: 41-60.
Pitt J. I., Hocking A. D., Bhudhasamai K. & al. (1993): The normal mycoflora of commodities from Thailand. 1. Nuts and oilseeds. - Inter. J. Food Microbiol. 20: 211-226.
Reid L. M. (1999): Breeding for resistance to ear rot in corn. In: Proc. Canadian Workshop on Fusarium Head Blight. Holiday Inn Crown Plaza, Canada, 28.-30. Nov. 1999, 67-69.
Sácká J. & Bosák J. (2002): Zavíječ kukuřičný (Ostrinia nubilalis) - nebezpečný škůdce kukuřice a ochrana proti němu. - In: Zeman L. [ed.], Kukuřice v praxi, p. 25-30, Brno.
Samson R. A., Hoekstra E. S., Frisvad J. C. & Filtenborg O. (1996): Introduction to food-borne fungi. - 322 p., Baarn & Delft.
Sobek E. A. & Munkvold G. P. (1999): European corn borer (Lepidoptera: Pyralidae) larvae as vectors of Fusarium moniliforme, causing kernel rot and symptomless infection of maize kernels. - J. Econ. Entomol. 92: 503-509.
