Transport látek xylémem/floémem
Transportéry
Sacharózové transportérySacharózové transportéry (SUC, SUT (např. (SUC, SUT (např. AtSUC1, HvSUT4 AtSUC1, HvSUT4 ))
Účastní se také výměny látek při symbióze (mykorhiza, Rhizobium), ale i při napadení patogenem.
Směr transportu sacharózy může být pravděpodobně měněn a závisí na sacharózovém gradientu, pH a transmembránovém potenciálu.
Definitivní důkaz účasti transportéru při nakládání do floému: SUT1 u bramboru v antisence orientaci (také u Arabidopsis a tabáku)
Transportéry a jejich role u Transportéry a jejich role u „„mix/apoplastic mix/apoplastic loaders/unloaders “loaders/unloaders “
Blokování transportu z listů zvýšení konc. sacharózy a škrobu v listech - omezení růstu, chlorotické léze, menší semena, časná senescence
• Nakládání do floému, vykládání do určitých sinků (svěrací buňky, vyvíjející se pylová zrna, vyvíjející se embrya /semena, na sacharidy bohaté plody… )
Exprese ve zdrojových listech, většina v sincích, exprese některých genů vázaná pouze na určité pletivo (např. NtSUT3 jen v pylu a pylových láčkách)
Kühn et al., 2003
Kühn a Grof, 2010
Fylogenetický strom sacharózových transportérů
jedno a dvouděložné
jedno a dvouděložné
dvouděložné
jednoděložné
jednoděložné
4
1
5
3
2 jednoděložné
dvouděložné
jedno- i dvouděložné
Sauer, 2007, Payyavula et al., 2011
Transport sacharózy- kotransport s H+
Kühn a Grof, 2010
Fylogenetický strom sacharózových transportérů
jedno a dvouděložné
jedno a dvouděložné
dvouděložné
jednoděložné
jednoděložné
4
1
5
3
2
Sauer, 2007
Transport sacharózy- kotransport s H+
Malé rodiny SUT: (Arabidopsis 9 genů – dva pseudogeny,, 7 transportéry, podle podobnosti spadají do tří subrodin, rýže 5 genů )
Subrodina 1Subrodina 1:: dvouděložné - vysoká afinita, - exprese v CC nebo SE buňkách (AtSUC1, AtSUC2, AtSUC5, AtSUC8, AtSUC9,)
Subrodina 3Subrodina 3:: jednoděložné - vysoká afinita, exprese v CC nebo SE buňkách
Subrodina 5:Subrodina 5: jen necharakterizované transportéry jednoděložných
Subrodina 2 Subrodina 2
Subrodina 4:Subrodina 4:
jednoděložné dvouděložné
nižší afinita
prodloužená centrální smyčka, lokalizace do CC a SE zdroje ve vegetativních sincích
Vakuoly, plasmalema ?
( AtSUT2)
Některé SUT nejsou specifické pro transport sacharózy, transportují také např. maltózu, turanózu, některé glukosidy, nebo i syntetické deriváty jako sukralóza – chlorovaná sacharóza, ne rafinózu
Otázka ???Otázka ??? Jak je transportována sacharóza do vakuoly ???
Všechny dosud charakterizované … H+ sympotréry se stechiometrií 1:1
rodina transportérů SWEETrodina transportérů SWEETUsnadněná difúze, 7 transmembránových domén.. (A. thalina 17 genů)
AtSUT2 senzor ?
AtSUC 2 AtSUC4
( AtSUT4)
Kühn a Grof, 2010; Schneider et al., 2012; Doidy et al., 2012; Doidy et al., 2012
Regulace SUT/SUC
Sacharózový transport přísně regulován
Regulace s vývojem listu : mladý list 0 exprese, vývoj listu exprese (vodivá pletiva), začíná v listových špičkách – pokračuje k bázi. Neúplná vazba na vývoj vodivého pletiva – zastínění - 0 exprese.
Regulace exprese pod kontrolou přísunu asimilátů z MC
Aktivita nepřímo úměrná turgorovému tlaku v SE
Za sucha -- pokles tlaku… aktivity transportérů… stabilizace tlakového gradientu
Při nedostatečném přísunu asimilátů pokles tlaku kompenzován akumulací iontů
Transportéry
regulace vnějšími podmínkami – teplotou, světelnými podmínkami, fotoperiodou, stresem, napadením patogenem..
Předpokládá se regulace fytohormony (ABA), ale ale mechanizmus ???mechanizmus ???
Mechanismy regulace SUT/SUC
fosforylace proteinu (AtSuc 5; AtSUC1)
redox-regulace – cílení a dimerizace při oxidativním prostředí- zvýšení aktivity (StSUT1, LeSUT1)
regulace na posttranskripční úrovni- regulace pomocí miRNA (u všech At SUT s výjimkou At SUT2 a AtSUT4)
regulace interakcí protein-protein (interakce s proteiny v membráně, ale i v ER)
regulace exprese
Regulační role StSUT4 .. (ovlivnění kvetení a tuberizace)
Kühn and Grof, 2010
Transport StSUT1mRNA/SUT1 do SE
Předpoklad : transport SUT do SE je předmětem regulace
SUT1 mRNA několika druhů nalezena ve floémové tekutině ??? Mobilní signál ??
Př.: Regulace kvetení a tuberizace u bramboru
Chincinska et al., 2008
StSUT4 působí -
Přes StSUT1 na export sacharózy z listů
Přes COL3 na syntézu mobilního signálu FT
Přes ovlivnění syntézy giberelinů
Hexózové transportéryHexózové transportéry
Arabidopsis :
MST transportéry- genová rodina o 53 členech !
Monosacharidové transportéry Arabidopsis
Transportéry
Dvě genové rodiny: rodina monosacharidových (MST) transportérů
Hexózové transportéry se většinou přímo transportu na dlouhou vzdálenost neúčastní ALE!!! Nepřímo jej výrazně ovlivňují
Thompson, 2006
Slewinski, 2011
Regulace cytosolické koncentrace redukujících cukrů
Fylogenetický strom monosacharidové transportéry
53 genů Arabidopsis (černá)
62genů Medicago trunculata
(modrá)
68 genů rýže (červená)
Doidy et al., 2012GSL =ERD
AtSTP1, vysoká afinita, transportuje monosacharidy, ne fruktózulokalizace: klíčící semena; kořeny semenáčků; svěrací buňky děloh, listy růžice, stonky,
kališní lístkyexprese: stoupá za tmy, denní rytmus s vrcholem kolem poledne
AtSTP 4 : vysoká afinita lokalizace: špičky kořenů, pylové láčky, listy, exprese stoupá po poranění a napadení patogenem
AtSTP 2 lokalizace: pyl,
MST lze rozdělit do 77 skupin (uvnitř skupiny podobnost 42-96%), 12 transmembránových domén
Skupina 1Skupina 1. Nejlépe prostudovaná skupina (značení STP- sugar transport protein ) – Arabidopsis 14 genů
hexózové transportéry plazmatické membrány, H+ symportéry, transport hexóz z apoplastického prostoru do buněk
AtSTP 9 lokalizace: pyl (jediný specifický pro glukózu)
AtSTP 13: lokalizace: vodivá pletiva korunních lístků, indukce během PCD
AtSTP 3: nízká afinita lokalizace: zelená pletiva, poranění, útok patogena
AtSTP 11: lokalizace: pyl
: H+ symportéryVysoká afinita (kromě AtSTP3)Široké spektrum monosacharidů (kroměAtSTP9 a AtSTP14)Role ve vývoji sinků (kromě AtSTP3)
AtSTP 6 lokalizace: pyl
Hexózové transportéry
Transportéry
Transportované cukry: glukóza, fruktóza, galaktóza, manóza, xylóza
AtSTP 14: specificky transportuje galaktózu
AtVGT 1 a 2 na tonoplastu antiport s H+
Skupina 2Skupina 2: VGT (Vacuolar glucose transporters)- Arabidopsis 3 geny, transportuje glukózu
Skupina 4Skupina 4:pGlcT – plastidové glukózové transportéry Arabidopsis 4 geny Možná spražený transport s H+, u jednoho prokázána lokalizace na Golgi, (Přes vysokou identitu- různé funkce)
Skupina 5Skupina 5: PMT (Polyol/monosacharide transporters) Arabidopsis 6 genů
Transportují širokou škálu polyolů a monosacharidů, sorbitol, manitol, xylitol, xylóza, glukóza, fruktóza, galaktóza
AtVGT 3 ? chloroplast
Skupina 3Skupina 3: TMT– (tonoplast monosaccharide transporters) – Arabidopsis 3 geny, tonoplastové glukózové transportéry, transport za stresových podmínek
Skupina 6Skupina 6:INT (Inositol transporters) Arabidopsis 4 geny
vysoce specifické myo-inositol/H+ symportery na membráně, na tonoplastu, exprese v pylu a v CC , pravděpodobně ? syntéza RFO
Skupina 7Skupina 7: ERD-like – (early-responsive to dehydratation)- pasivní ale selektivní, glukóza, fruktóza, galaktóza, manóza, xylóza, nejméně znalostí, mobilizace výtok z vakuoly Arabidopsis 19 genů
Transportéry
SWEET-- malé proteiny (Arabidopsis -17 genů), 7 trasnsmembránových domén, oboustanný uniport glukózy, lokalizace na plazmatické membráně,
Slewinski, 2011
Doidy et al., 2012
ERD
Transportéry
Cukr v xylémuCukr v xylému
Hexózové transportéry nalezeny v xylému
sacharidy v xylému, prevence proti zmrznutí a poškození
V zimě - floémový tok téměř zastaven, rostliny v dormanci
Na jaře – obnova funkce (embolismus)
– transport mobilizovaných zásob v kmeni a kořenech
Javor cukrový
Proč Proč toliktolik různých transportérů v pylu? různých transportérů v pylu?
???? ???? Otázky kolem hexózových transportérůOtázky kolem hexózových transportérů
Jak se liší funkce u těch lokalizovaných na Jak se liší funkce u těch lokalizovaných na stejné místostejné místo ? ?
Proč v pylu hexózové transportéry ?Proč v pylu hexózové transportéry ?
Jak Jak fruktózafruktóza z rozštěpené sacharózy vstupuje do buňky ? z rozštěpené sacharózy vstupuje do buňky ?
RegulaceRegulace jak na transkripční, tak post-transktipční úrovni ? jak na transkripční, tak post-transktipční úrovni ?
Transportéry
Malý efekt Malý efekt vyřazení vyřazení jednotlivých transportérů ???jednotlivých transportérů ???
Jak je zajištěn transport glukózy přes plastidové membrány ??? Jak je zajištěn transport glukózy přes plastidové membrány ???
Jak jsou vykládány RFO .. účast hexózových transportérů ??? Jak jsou vykládány RFO .. účast hexózových transportérů ???
Jak se děje transport do vakuoly ??? Jak se děje transport do vakuoly ???
Př.: Transgenní rostliny bramboruTransgenní rostliny bramboru
Transport z listu (nakládání do floému) apoplastem nebo symplastem ?
Transportéry
Př.: Transgenní rostliny bramboruTransgenní rostliny bramboru
Transport z listu (nakládání do floému) apoplastem nebo symplastem ?
floémMC
sacharóza
invertázahexózy
transformace : exprese invertázy v buněčné stěně ve zdrojovém listu
Transport do floému za účasti apoplastu,
transport sacharózy
Redukovaný růst kořenůRedukovaný výnos hlízHromadění cukrů a škrobu v listech
Transportéry
Př.: Transgenní rostliny bramboruTransgenní rostliny bramboru
Transport z listu (nakládání do floému) apoplastem nebo symplastem ?
floémMC
sacharóza
invertázahexózy
transformace : exprese invertázy v buněčné stěně ve zdrojovém listu
Transport do floému za účasti apoplastu,
transport sacharózy
Transport asimilátů (vykládání floému) do buněk sinku ??
Redukovaný růst kořenůRedukovaný výnos hlízHromadění cukrů a škrobu v listech
Transportéry
Zvýšená akumulace hexózZvýšení výnosu hlíz
Př.: Transgenní rostliny bramboruTransgenní rostliny bramboru
Transport z listu (nakládání do floému) apoplastem nebo symplastem ?
floémMC
sacharóza
invertázahexózy
transformace : exprese invertázy v buněčné stěně ve zdrojovém listu
Transport do floému za účasti apoplastu,
transport sacharózy
Transport asimilátů (vykládání floému) do buněk sinku ??
transformace : exprese invertázy v buněčné stěně v sinku- hlíze
sacharóza
invertáza
hexózy
Redukovaný růst kořenůRedukovaný výnos hlízHromadění cukrů a škrobu v listech
Transport do sinku – účast apoplastu, transport hexóz
floém
parenchym
inhibice sacharózového transportéru v sinku mírný výnosu
Př. : kukuřice – mutant bez invertázové aktivity v sinku maličká semena
Transportéry
Transportéry sacharidů a interakce – rostlina houba Transportéry sacharidů a interakce – rostlina houba
Protonové pumpy: H+ ATPázy plazmatické membrány Podmiňují sekundární aktivní transport přes membrány
Účastní se kontroly získávání a rozdělování živin po rostlině
Arabidopsis thaliana (AHA)
AHA 1 – všude, více v nadzemních částech AHA 2 – všude, více v kořenech AHA 3 – všude, zejména v CC
AHA 4 – všude, hlavně v endodermis v kořenech
AHA 5 - nízká exprese všude, snad specif. pro svěrací. b. AHA 6 - prašníky
AHA 7 – výhradně pyl AHA 8 – výhradně pyl
AHA 9 - prašníky
AHA 10 – nejvíce v šešulích AHA 11 – všude
AHA 12 – pseudogen, pylu
Otázka ?Otázka ?
Jedna buňka může mít i několik Jedna buňka může mít i několik isoforem genů ? Proč ? isoforem genů ? Proč ?
Svěrací buňky :Vicia faba, tabák: 2 isoformy
Arabidopsis – všech 11, nejvíc AHA 1,2,5
Regulace exprese na úrovni transkripce/ translace: velmi malá !!!
Hlavní regulace : posttranslační posttranslační změny !změny !
Změny aktivity v závislosti na vnějších faktorech:
Aktivace: salinita, chladová aklimace
Inhibice: houbové elicitory, nízká teplota, vyčerpání cukrů
Transport látek floémem
Posttranslační změnyPosttranslační změny
Fosforylace/defosforylace
Fosforylace C-koncové domény
Vazba 14-3-3 proteinu
aktivace
P- fosforylační doména
N-doména vážící nukleotid
A - řídící doména
Padersen et al., 2007
Transport látek floémem
Posttranslační změnyPosttranslační změny
Fosforylace C-koncové domény
Vazba 14-3-3 proteinu
aktivace
Ottmann et al., 2007
Hexamer: ATPáza + 14-3-3
protein
Fosforylace/defosforylace
Transport látek floémem
Posttranslační změnyPosttranslační změny
Fosforylace/defosforylace
Fosforylace C-koncové domény
Vazba 14-3-3 proteinu
aktivace
Modulační fosforylace
Inhibiční fosforylace
Otázka ?Otázka ?
Proč regulace na Proč regulace na úrovní úrovní posttranslační ??posttranslační ??
Otázka ?Otázka ?
Jaké kinázy a Jaké kinázy a fosfatázy? Jaká jejich fosfatázy? Jaká jejich regulace ?? regulace ??
Ottmann et al., 2007
Hexamer: ATPáza + 14-3-3
protein
Změna množství enzymu
Změna lokalizace v membráně
Transport do vakuolyTransport do vakuoly
Aktivní transport do vakuoly … závislý na protonovém gradientu (transport antiportemantiportem s H+)
důležitá role H+ pump
(„starší“ a komplikovanější ) Vakuolární H+-ATPázy
dva komplexy
V1 - hydrolýza ATP
V0 - translokace protonu.
Subjednotky – s výjimkou subjednotek „VHA-a“ a „WHA-c“ jsou ostatní subjednotky často kódovány jedním genem
periferní V1 – 8 subjednotek (A,B,C,D,E,F,G,H)
integrální V0- 6 subjednotek a,c,c´c´´, d,e)
Ztrátové mutace některých genů se projeví významně, jiné se téměř neprojeví
Lokalizace také na Golgi
Interace subjednotky A s 14-3-3 proteinem závislá na fosforylaci
AHA-B1 nalezena v jaderném komplexu s AHA-B1 nalezena v jaderném komplexu s HXK ! Účastní se glukózové signalizaceHXK ! Účastní se glukózové signalizace
Nedostatečné informace o tonoplastových transportérech, Nedostatečné informace o tonoplastových transportérech, exprese identifikovaných hlavně v sincích, exprese identifikovaných hlavně v sincích,
Zdrojová buňka
(H+ pyrofosfatázy)
Jedna subjednotka, funkční homodimer
lokalizace: vakuola, Golgi, plazmatická membrána
Dva typy – typ I – závislá na K+ v cytosolu, mírně citlivá k Ca2+ inhibici
Oba typy vyžadují Mg2+ jako kofaktor
Nalezen interakční motiv pro vazbu s 14-3-3 proteinem
Vakuolární HVakuolární H++-PPázy-PPázy
typ II – necitlivá k K+, extrémně citlivá k Ca2+ inhibici
??? Jaký je fyziologický význam Jaký je fyziologický význam těchto rozdílů v citlivostitěchto rozdílů v citlivosti??
Zdrojová buňka
?? Ovlivňuje přesun PM H+-ATPáz na plazmatickou membránu.
(H+ pyrofosfatázy)
Jedna subjednotka, funkční homodimer
lokalizace: vakuola, Golgi, plazmatická membrána
Dva typy – typ I – závislá na K+ v cytosolu, mírně citlivá k Ca2+ inhibici
Oba typy vyžadují Mg2+ jako kofaktor
Nalezen interakční motiv pro vazbu s 14 -3-3 proteinem,
Vakuolární H+-PPázyVakuolární H+-PPázy
typ II – necitlivá k K+, extrémně citlivá k Ca2+ inhibici
??? Jaký je fyziologický význam Jaký je fyziologický význam těchto rozdílů v citlivostitěchto rozdílů v citlivosti??
Př:Př: Arabidopsis, H+ PPáza typu I, A – nadexprese B – ztrátová mutace
! U jiných ekotypů výrazně menší odezva
A
B
??? Jaké další funkceJaké další funkce ??
?? Vysoká citlivost k IAA ?? Přenos IAA signálu ???
?? Aktivace ostatních H+ pump ??
PřPř:: Rajče s expresí H+ PPázy typu I z Arabidopsis:
Odolnost k nedostatku vody, patrně díky většímu rozvoji kořenového systému, podobné výsledky i u jiných rostlin.
Zdrojová buňka