UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA č. 39

Diferencované zrání bovinních oocytů využitelných pro reproduk ční biotechnologie

Autoři

Ing. Marie Machatková, CSc

Ing. Michal Ješeta, Ph.D.

MVDr. Drahomíra Čtvrtlíková Knitlová

Mgr. Kateřina Hanzalová

ISBN 978-80-86895-32-1

2013

.

Uplatněná certifikovaná metodika

Diferencované zrání bovinních oocytů využitelných pro reprodukční biotechnologie

Autoři

Ing. Marie Machatková, CSc

Ing. Michal Ješeta, Ph.D.

MVDr. Drahomíra Čtvrtlíková Knitlová

Mgr. Kateřina Hanzalová

2013

1

OBSAH

I) Úvod 2

II) Cíl metodiky 3

III) Vlastní popis metodiky 3

IV) Srovnání novosti postupů 5

V) Ekonomické přínosy 6

VI) Popis uplatnění metodiky 6

VII) Seznam použité literatury 7

VIII) Seznam publikací předcházejících metodice 8

IX) Dedikace metodiky 9

X) Návrh oponentů 9

2

I) Úvod

Aplikace biotechnologií v oblasti šlechtění hospodářských zvířat umožňují efektivněji

využít genetický potenciál chovatelsky cenných jedinců, rozšířit kombinace rodičovských

párů a modifikovat populaci zvířat požadovaným směrem pomocí nových šlechtitelských

strategií. V rámci probíhajících šlechtitelských programů jsou embrya skotu získávána

především opakovanou superovulací geneticky cenných donorek a přenášena do geneticky

bezcenných příjemkyní (MOET).

Relativně novou biotechnologickou metodou, která však již našla v oblasti šlechtění

skotu své specifické uplatnění, je metoda zrání (IVM), fertilizace (IVF) a kultivace (IVC)

oocytů in vitro a produkce in vitro embryí (IVP). Tato metoda umožňuje produkovat

geneticky cenná embrya v laboratoři z oocytů získaných buď v průběhu života donorky

technikou transvaginální aspirace (OPU) nebo post mortem po vyřazení donorky z důvodu

stáří, neplodnosti nebo jiných poruch zdraví (Machatková et al 2000, 2006, 2008). Z

celkového počtu embryotransferů, které jsou každoročně provedeny v Evropě, představují

přenosy embryí získaných metodou OPU/IVF více než 10% (Knijn, 2012). V chovatelsky

vyspělých zemích, především v Nizozemsku, Francii, Německu nebo Itálii, je metoda

OPU/IVF úspěšně kombinována s metodou hormonální superovulace dárkyní.

Předpokládá se, že produkce OPU/IVF embryí v budoucnu nahradí embrya získaná

superovulací, poněvadž umožňuje vyloučit negativní dopady superovulace na zvířata i životní

prostředí. Proto se většina subjektů, které chovatelům v EU poskytují služby v oblasti

reprodukce a šlechtění skotu, metodami produkce embryí in vitro intenzivně zabývá a ve

spolupráci s výzkumnými pracovišti je dále rozvíjí (Smidt a Niemann 1999, Merton et al

2003, Heyman 2005). Ve srovnání s embryi produkovaných pro experimentální účely je však

vývoj embryí požadovaného genotypu do přenosuschopných stádií stále málo efektivní.

Nezralé oocyty získané od hormonálně neošetřených krav jsou vysoce heterogenní

populací z hlediska meiotické a vývojové kompetence, to je schopnosti dokončit zrání a

vyvíjet se po oplození. Relativně malá část oocytů (průměrně 25%), které pocházejí z folikulů

o velikosti 6 - 10 mm, je schopna za standardních podmínek kultivace dosáhnout jaderné i

cytoplazmatické zralosti a poskytnout vyšší podíl embryí. Převážná část oocytů (průměrně 75

%), které jsou získány z folikulů o velikosti 3-5 mm, vykazuje relativně nízkou úroveň

cytoplazmatického zrání a produkce embryí.

3

Jedním z důvodů je nižší energetický potenciál vývojově méně kompetentních oocytů,

které nejsou schopny během svého zrání dostatečně aktivovat své mitochondrie, zajistit

mitochondriální reorganizaci a vyprodukovat potřebné zásoby adenosin-trifosfátu (ATP).

V naší nedávné studii jsme potvrdili, že zralé, vývojově méně kompetentní oocyty jsou

deficitní z hlediska některých mitochondriálních funkcí a produkce ATP (Machatková et al

2012). Přitom obsah ATP v cytoplazmě fertilizovaných oocytů je velmi významný pro

úspěšný průběh oplození a nástup embryonálního vývoje. Relativně nízký podíl

cytoplazmaticky zralých oocytů s nedostatečnými zdroji energie patří mezi základní

problémy, které limitují využití metody IVP embryí , jak v oblasti šlechtění skotu, tak i

v dalších oblastech reprodukčních biotechnologií. Aby bylo možno získat požadovaný počet

embryí od geneticky cenných rodičů, je nezbytné zvýšit kvalitu cytoplazmy zralých oocytů.

Navrhovaná metodika je založena na dvoustupňové izolaci oocytů a diferenciaci

podmínek zrání na základě jejich vývojové kompetence. Umožňuje zvýšit energetický status

vývojově méně kompetentních oocytů a zlepšit kvalitu jejich cytoplazmy na základě aktivace

jejich mitochondrií pomocí specifického stimulans. Stav zralých oocytů je významný pro

zvýšení účinosti normálního oplození, vývoje oplozených oocytů do přenosuschoných

embryonálních stádií a zachování vývojové schopnosti embryí po embryotransferu.

II) Cíl metodiky

Záměrem předložené metodiky bylo zlepšit kvalitu vývojově méně kompetentních

oocytů skotu na úroveň vývojově více kompetentních oocytů. Finálním cílem metodiky bylo

vyvinout efektivnější postup zrání pro vývojově méně kompetentních oocyty, které budou

využitelné pro produkci embryí od geneticky cenných rodičů i v dalších oblastech

reprodukčních biotechnologií.

III) Vlastní popis metodiky

1.1 Příprava donorek oocytů

Před odběrem oocytů je nezbytné nejdříve ověřit reprodukční status donorky

sonografickým vyšetřením. Podle nálezu na ováriích indukovat říji, využít lze i říji spontánní.

Nástup říje potvrdit rutinní kontrolou, ovulaci a růst folikulární vlny je vhodné opět ověřit

sonograficky. Oocyty mohou být aspirovány opakovaně, 5 - 6 krát v jednom cyklu.

4

U březích krav je možno využít folikulární vlny vznikající na ováriích spontánně mezi

60. - 90. dnem březosti.

Pokud jsou jako donorky oocytů používány vyřazené krávy post mortem je vhodné

pohlavní cyklus synchronizovat.

1.2 Odběr a izolace oocytů

1.2.1 Technika OPU

Folikuly o velikosti od 3 mm do 5 mm jsou punktovány a oocyty jsou aspirovány do

zkumavky s ekvilibrovaným Tyrodovým médiem. Aspirační médium s folikulární tekutinou

je filtrováno přes nylonový filtr (Uhelon 130 extra) o porezitě 100 μm, na kterém jsou

aspirované oocyty zachyceny.

1.2.2 Post mortem

Vaječníky jsou transportovány do laboratoře v termosce při teplotě mezi 30-35°C.

Ovária jsou nejdříve dekontaminována opakovaným oplachem sterilní redestilovanou vodou a

následně fyziologickým roztokem PBS-Dulbecco s antibiotiky.

Nejdříve jsou punktovány folikuly o velikosti 6-10 mm, ze kterých jsou aspirovány

vývojově více kompetentní oocyty. Následně jsou technikou disekce ovariálního cortexu

otevřeny folikuly o velikosti 3-5 mm, ze kterých jsou vyplaveny vývojově méně kompetentní

oocyty. Obě subpopulace jsou zachyceny na filtru a uchovávány odděleně po celou dobu

manipulace.

1.3. Selekce nezralých oocytů

Izolované oocyty jsou přeneseny do média TCM-199, a hodnoceny na základě své

morfologické kvality. Pro zrání jsou selektovány oocyty s ukončeným růstem, o velikosti 130

μm, bez výraznějších defektů v cytoplazmě, obklopené intaktní zonou pellucidou a coronou

radiatou a nejméně jednou vrstvou buněk cumulu.

1.4 Diferencované zrání oocytů

Oocyty jsou přeneseny do jamek mikroplotny, ve které jsou kultivovány při teplotě

38,5°C, v atmosfeře vzduchu s 5 % CO2 po dobu 24 hodin.

Vývojově více kompetentní oocyty zrají za standardních podmínek. U vývojově méně

kompetentních oocytů je zrací médium nejdříve ekvilibrováno po dobu 1 hodiny, kdy je

5

přidáno mitochondriální stimulans a pH média je upraveno na hodnotu 7,1. Následně je

médium ekvilibrováno po dobu 2 hodin.

1.5 Optimalizace oplození oocytů

Před oplozením je nezbytné testovat fertilizační schopnost spermií potenciálních otců

embryí a optimalizovat podmínky oplození pomocí oocytů běžné populace jatečných krav

(Machatková et al 2009).

Po rozmrazení inseminačních dávek ve vodní lázni o teplotě 37 °C po dobu 60 sekund

je sperma podvrstveno v množství 25 μl pod 1000 μl modifikovaného Tyrodova média (SP-

TALP). Motilní spermie jsou ze spermatu izolovány metodou swim up probíhající při teplotě

38,5°C po dobu 1 hodiny. Pro oplození oocytů je použito modifikované Tyrodovo médium

(IVF-TALP) obsahující 1x106 spermií/ml a 10 μg/ml heparinu jako kapacitační agens.

1.6 Kultivace raných embryí

Za 20 -24 hodin po oplození jsou oocyty zbaveny kumulárních buněk a potencionální

zygoty jsou přeneseny na buněčný monolayer stabilní linie BRL (Buffalo rat liver cells ATCC

USA) Pro kultivaci je používáno kultivační medium B2 Menezo s 10% estrálního bovinního

séra, ve kterém se embrya vyvíjejí do přenosuschopných stádií při teplotě 39°C, v atmosféře

vzduchu s 5% CO2.po dobu 7 -8 dnů.

IV) Srovnání novosti postupů

V současné době jsou ooocyty skotu izolovány a během zrání jsou kultivovány za

standardních podmínek nezávisle na jejich meiotické a vývojové kompetenci. Z tohoto

důvodu je účinnost oplození a embryonálního vývoje vysoce variabilní v závislosti na použité

populaci oocytů, což vede k nestandardní kvalitě zralých oocytů a nízkému podílu

vyvíjejících se embryí.

Navržená metodika řeší problém nedostatečných energetických zásob u zralých

bovinních oocytů používaných pro reprodukční biotechnologie. Její podstatou je

dvoustupňová izolace oocytů a diferenciace podmínek jejich zrání na základě meiotické a

vývojové kompetence. Vývojově méně kompetentních oocyty zrají za podmínek, kdy dochází

k aktivaci mitochondrií a následně ke zvýšené mitochondriální reorganizaci a produkci ATP.

Specifická stimulace mitochondriálních funkcí pozitivně ovlivňuje energetické zásoby zralých

oocytů, a tím zlepšuje kvalitu jejich cytoplazmy.

6

Nový způsob zrání umožňuje zlepšit energetický stav vývojově nízce kompetetních

oocytů oocytů, zvýšit efektivnost jejich fertilizace i embryonálního vývoje. Výsledkem zrání

podle navržené metodiky jsou nejen z hlediska cytoplazmy kvalitnější oocyty ale i účinnější

penetrace spermií do oocytů, rychlejší syngamie obou prvojader a nástup dělení. Podíl zralých

a normálně oplozených oocytů se zvyšuje průměrně o 10 %, podíl raných embryí stoupá o

více než 20 % a podíl embryí využitelných k embryotransferu se zvyšuje průměrně o 30 %.

Navržená metodika přispívá k efektivnějšímu využití vývojově méně kompetentních

oocytů, které v populaci oocytů získaných od nesuperovulovaných donorek převažují.

Zvyšuje se účinnost normálního oplození těchto oocytů, a tím i pravděpodobnost získání

požadovaného počtu embryí využitelných jak ke kryokonzervaci tak i přímému

embryotransferu.

V) Ekonomické přínosy

Finanční náklady na zavedení metody diferencovaného zrání bovinních oocytů nejsou

vysoké. Pokud pracoviště již disponuje laboratorním vybavením zaměřeným na přípravu IVP

embryí, zvyšují se náklady na produkci těchto embryí maximálně o 5 %. V této částce jsou

zahrnuty především náklady na jednorázové sety používané při dvoustupňové izolaci oocytů a

náklady na přípravu specifických aditiv do zracích médií.

Výsledný ekonomický přínos metodiky přípravy embryí skotu z oocytů zrajících za

diferencovaných podmínek bude záviset na intenzitě produkce embryí v laboratoři a

dosahované úrovni embryonálního vývoje.

Pokud vycházíme z předpokladu, že pomocí metodiky lze průměrně zvýšit podíl

přenosuschopných embryí až o 30 %, potom náklady na přípravu jednoho embrya se

adekvátně sníží. Celkový ekonomický přínos bude závislý na genetické hodnotě a tržní ceně

vyprodukovaných embryí.

V) Popis uplatnění metodiky

V navržené metodice je popsán efektivnější způsob zrání vývojově méně

kompetentních oocytů skotu v podmínkách in vitro pomocí aktivace jejich mitochondrií

specifickým stimulans. Zvýšení energetických zásob u zralých oocytů zvyšuje účinnost

oplození i embryonálního vývoje.

Modifikovaný způsob zrání lze využít především u oocytů získaných od geneticky

cenných donorek, které jsou oplozovány spermiemi špičkových býků, kdy podíl zralých a

7

normálně oplozených oocytů je rozhodující pro zisk embryí požadovaného genetického

původu.

Významný přínos může mít metodika také při produkci embryí uchovávaných jako

genové zdroje a ohrožených živočišných druhů, kdy zdroje oocytů jsou značně limitovány.

Efektivnější metoda zrání je aplikovatelná i v rámci vývoje technologicky

náročnějších reprodukčních metod, jako jsou klonování a transgeneze, které vyžadují kvalitní

zralé oocyty a progresivně se vyvíjející raná embrya.

Metodika je určena jak výzkumným pracovištím produkujícím experimentální embrya

skotu pro řešení svých experimentálních záměrů tak i specializovaným laboratořím, které se

zabývají produkcí embryí požadovaného genetického původu v rámci služeb chovatelům

v oblasti reprodukce a šlechtění skotu včetně embryotransferu.

VI) Seznam použité literatury

Heyman Y. Nuclear transfer: a new tool for reproductive biotechnology in cattle.

Reprod Nutr Dev, 2005, 45: 353–361.

Knijn, H. National statistical data of embryo transfer activity in Europa (2011). In:

Proceeding of the 28th A.E.T.E. Annual Meeting – Saint Malo, France, 7th-8th

September 2012; 43-53.

Machatkova, M., Hanzalova, K., Horakova, J., Reckova, Z., Hulinska, P. Collection of

oocytes from donors in the growth phase of follicular development can enhance the

production of bovine embryos for cryopreservation. Vet Med-Czech 2006, 51, 232-

238.

Machatkova M., Hulinska P., Reckova Z., Hanzalova K., Spanihelova J. Pospisil R. In

vitro production of embryos from high performance cows and the development of

frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Vet Med Czech, 2008, 53, 358-

364.

Machatkova M, Jokesova E, Horky F, Krepelova A. Utilization of the growth phase of

the first follicular wave for bovine oocyte collection improves blastocyst production.

Theriogenology. 2000; 54:543-550

Merton J.S., de Roos A.P.W., Mulaart E., de Ruigh L., Kaal L., Vos P.L.A.M.,

Dieleman S.J. Factors affecting oocyte quality and quantity in commercial application

of embryo technologies in the cattle breeding industry. Theriogenology. 2003, 59:

651-674

8

Smidt D., Niemann H. Biotechnology in genetics and reproduction. Lives Prod Sci.

1999, 59: 207-221

VII) Seznam publikací autorů, které předcházely metodice

Machatkova M., Ješeta M., Hulinska P., Knitlova D., Nemcova L., Kanka J.

Characteristics of bovine oocytes with different meiotic competence in terms of their

mitochondrial status and expression of nuclear-encoded factors. Reprod Dom Anim,

2012, 47:806 – 814.

Kanka, J., Nemcova, L., Toralova, T., Vodickova-Kepkova, K., Vodicka, P., Jeseta

M., Machatkova, M. Association of the transcription profile of bovine oocytes and

embryos with developmental potential Anim Reprod Sci 2012, 134(1-2): 29-35.

Machatková M., Ješeta M., Hulínská P., Rečková Z., Hanzalová K. (2009): Predikce

fertility býků in vitro pomocí penetračního testu, metodika certifikována MZe dne

24.8.2009

Machatkova M., Hulinska P., Reckova Z., Hanzalova K., Spanihelova J. Pospisil R. In

vitro production of embryos from high performance cows and the development of

frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Vet Med Czech, 2008, 53, 358-

364.

Machatkova, M., Hanzalova, K., Horakova, J., Reckova, Z., Hulinska, P. Collection of

oocytes from donors in the growth phase of follicular development can enhance the

production of bovine embryos for cryopreservation. Vet Med-Czech 2006, 51, 232-

238.

Machatkova M, Krausova K, Jokesova E, Tomanek M. Developmental competence of

bovine oocytes: effects of follicle size and the phase of follicular wave on in vitro

embryo production. Theriogenology. 2004; 61, 329-335.

Machatkova M, Jokesova E, Horky F, Krepelova A. Utilization of the growth phase of

the first follicular wave for bovine oocyte collection improves blastocyst production.

Theriogenology. 2000; 54:543-550

9

VIII) Dedikace

Metodika vznikla na základě metodických poznatků získaných v průběhu řešení

projektu NAZV QI91A018(50 %) a výzkumného záměru MZE 0002716202 MZe ČR (50%).

Podíl práce autorů: Ing. Marie Machatková, CSc (30%), Ing. Michal Ješeta, Ph.D. (30%),

MVDr. Drahomíra Čtvrtlíková Knitlová (20%), Mgr.Kateřina Hanzalová (20%).

IX) Návrh oponentů

MVDr. Jan Bažant

SVS ČR

Slezská 7

120 56 Praha 2

Doc. MVDr. Radko Rajmon Ph.D.

Katedra veterinárních disciplin

FAPPZ, ČZU

Kamýcká 129

Praha 6 - Suchdol