Úvod do

MIKROBIOLOGIE

Filip Růžička

Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně

Přednáška pro II. r. ZL 2012

Lékařská mikrobiologie

soubor věd o mikroorganismech čili mikrobech, které mají význam v medicíně humánní, případně i veterinární

• patogenní mikroby, které vyvolávají onemocnění lidí nebo zvířat

• mikroby, které se u nich nalézají jen jako tzv. normální mikroflóra

• vzájemné vztahy mezi mikroby a jejich hostitelem

• vztahy mezi mikroby a prostředím

Klinická mikrobiologie

část lékařské mikrobiologie, zabývající se etiologií, patogenezí a diagnostikou onemocnění vyvolaných mikroby

Orální mikrobiologie – úzce změřená část lékařské mikrobiologie na mikroorganizmy dutiny ústní

Další mikrobiologie

• sanitární

• prostředí (půdní, vody apod.)

• rostlinolékařská

• potravinářská

• průmyslové mikrobiologie

bakterie bakteriologie

mikromycety (plísně a kvasinky) mykologie

(řasy) (algologie)

parazité parazitologie prvoci protozoologie

helminti helmintologie

členovci entomologie

viry virologie

mikrobiologie obecná × mikrobiologie speciální

Co nutno znát o agens

„Představení“ mikroba: jak vypadá, co způsobuje a proč, jak se infekce diagnostikuje, jak se léčí

1. Klasifikace a charakteristika Zařazení + typ buňky (eukaryotická/prokaryotická), příp. nebuněčný organizmus či protein) Je to bakterie, kvasinka, plíseň, či prvok? Morfologie + barvení Je bakterie kok, tyčinka, vlákno, spirála? G+, G-, nebo se barví jinak? Jak jsou buňky

navzájem uspořádány? Tvoří spory, pouzdra, granula? Je virus obalený? Jakou má kapsidu? Aj.

2. Fyziologie, biochemie, genetika, odolnost Typ metabolismu Je to aerob/anaerob aj.? Odolnost Je odolný, či choulostivý? Růstová náročnost jak se kultivuje - je-li specifická, významná (např. T.pallidum/ nekultivovatelná, H.

influenzae růstové faktory atd.), viry – jen na živých buňkách, S. aureus 10% NaCl…) Biochemie

je-li specifická, významná pro diagnostiku (př. Enterobacteriaceae) Antigeny Je jediný antigenní typ, či je typů několik? Je to významné pro diagnostiku (př. Enterobacteriaceae, streptokoky atd.)

Genetika je-li významná pro rezistenci na ATB, faktory patogenity a virulence apod.

4. Patogenita

Které choroby či syndromy vyvolává?

česká a latinská (!) jména chorob, nejvýznamnější příznaky(př. varicella-zoster virus – plané neštovice – vyrážka/puchýřky, reaktivace jako herpes zoster u oslabených...)

5. Patogeneze

Brána vstupu, šíření tělem, vylučování?

Jak vznikají příznaky?

Které jsou faktory patogenity?

6. Imunita

Vzniká vůbec?

Krátkodobá, nebo doživotní, humorální, či celulární?

7. Epidemiologie

Zdroj infekce: člověk, zvíře, nebo prostředí?

Jak se přenáší?

9. Prevence, případně profylaxe

Očkuje se, nebo se imunizuje pasivně?

O jaký typ očkovací látky jde?

10. Terapie

Co je lékem volby? (klíčové příklady – S.pyogenes - PNC apod.)

Pokud antibiotikum, tak které?

8. Laboratorní diagnostika

Průkaz přímý - průkaz příslušného agens

(mikroskopie, kultivace, antigeny, NK) – viz praktika

nepřímý - průkaz protilátek – viz praktika

Co se nemocnému odebírá?

Jak se to vyšetřuje?

Když kultivací, nechce to zvláštní půdu?

Jak se izolát blíže určí?

Interpretace (Co se považuje za pozitivní nález, význam)

Jak tedy na zkoušku…

Trojotázky – příklad:

• Biofilm a jeho medicínský význam

• Streptococcus pyogenes

• Rod Hepatovirus

Obecná mikrobiologie

Etiologické otázky – strukturovat odpověď, vybrat vhodné

příklady

Orální otázky – viz letní semestr, etiologie parodontitid,

zubního kazu atd., správné názvy mikrobů

Speciální mikrobiologie – viz výše

Doporučená literatura

Biofilm a jeho význam

Filip Růžička

Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně

Přednáška pro II. r. ZL 2012

HISTORIE

• 1676 Antony van Leeuwehoek sledoval bakterie v zubním povlaku

• Od dob Pasteura a Kocha 100 let nikoho nenapadlo, že mikrobi v přírodě rostou jinak, než jako volně se vznášející plankton v tekutinách nebo jako kolonie na pevných půdách

• 1935 C. E. Zobel první popis biofilmu u mořských bakterií

• 1950 – 1960 první zprávy o problémech s biofilmem

• 1978 J. W. Costerton upozornění na všudypřítomnost biofilmu a jeho možná účast na perzistentních infekcích

Biofilm

Planktonická forma

Biofilm – adheze, kooperace, gradient

Mechanická ochrana

Vliv na účinek ATB

Ochrana před chem. látkami

Šíření mikroorganizmů

Způsob života mimo

rozhraní fází

Výměna genetické informace

Homeostáza - mikroprostředí

Kooperace a specializace buněk

Ochrana před imunitním systémem

BIOFILM

Mikrobiální biofilm je společenství mikroorganizmů,

které se tvoří na rozhraní fází.

Pevně lne k inertním i živým povrchům.

Vedle mikrobiálních buněk bývá důležitou

stavební složkou biofilmu i mezibuněčná

hmota.

V biofilmu probíhá komunikace a kooperace mezi jednotlivými buňkami i celými

populacemi

TVORBA BIOFILMU

ČASNÁ FÁZE - atraktace a

adheze buněk k povrchu

STŘEDNÍ FÁZE - tvorba

mikrokoloní (akumulace

buněk), příp. tvorba

pseudo/hyf, produkce

extracellulární matrix

MATURACE - vytvoření silné

vrstvy biofilmu s

etracellulární matrix

DISPERSE - odlučování buněk

Regulace tvorby biofilmu hustota populace, složení společenstva, koncentraci živin aj.

Systém quorum-sensing – malé extracelulární signální molekuly

→ akumulace → transkripce cílových genů.

Jeden druh může mít více QS systémů a více signálních molekul

FARNESOL – vliv na expresi min. 274 genů inhibice biofilmu

tvorba klíčků, časná fáze tvorby biofimu - TYROSOL

G- bakterie - N-acyl-L-homoserin laktony

G+ bakterie - signální peptidy

(s cyklickou thionolaktonovou strukturou)

Kandidy -

X

Biofilm – významný faktor virulence

mechanická ochrana buněk (adheze k povrchům a matrix)

Vrstva biofilmu tvoří vhodné mikroprostředí v okolí mikrobů

Kooperace a specializace buněk, přenos genů

Ochrana před účinky imunitního systému

Vliv na účinek antimikrobiálních látek

− Snížená difúze do biofilmové vrstvy, vazba na struktury biofilmu,

− Zvýšená degradace ATB účinkem enzymů

− Změny vlastností mikroba, exprese odlišných genů (multidrug efflux pumps CDR, MDR)

− Heterogenita populace (genetická variabilita), perzistoři

−Změny mikroprostředí

− Změny rychlosti růstu

BIOFILMOVÁ ONEMOCNĚNÍ

pomalý, chronický průběh

často bez výraznějších příznaků

občas akutně exacerbují

antibiotická terapie mívá omezený efekt

po vysazení antibiotik infekce rekurují

izolovaná agens se mohou jevit dle MIC jako citlivá

Biofilmové infekce spojené s přítomností implantátů

biofilmové infekce krevního řečiště (katétrové

sepse, infekce chlopenních náhrad, aj. ….),

endotracheální kanyly, chirurgické stehy,

infekce močových katetrů,

inf. kloubních náhrad,

kontaktní čočky

aj…

aj...

kolpitidy,

zubní kaz, rány

otitis, osteomyelitidy,

pneumonie u cystické fibrózy

subakutní endokarditidy, cholecystitidy

Biofimové infekce nativních povrchů

BIOFILM V MAKROORGANISMU

HRAJE I PROSPĚŠNOU ROLI

normální mikroflóra tvoří vrstvu biofilmu na

sliznicích

Problémy s biofilmem jsou i mimo medicínu

Znečištění povrchů

Zvýšení turbulence protékající tekutiny

Zúžení průsvitu až ucpání potrubí

Koroze ropovodů, nádrží paliva v letadlech

Černání tekutin redukovanými kovy

Tvorba izolační vrstvy v tepelných výměnících

Zvýšení odporu lodního trupu při plavbě

aj.

Jak diagnostikovat infekce s přítomností biofilmu?

Jak interpretovat schopnost agens tvořit biofilm?

Jak léčit infekce spojené s přítomností biofilmu?

Laboratorní diagnostika biofilmových infekcí

Pevné přilnutí k povrchu - záchytu mikroba.

Je přítomen biofilm? Jakou hraje roli v patogenezi?

Jak ovlivní biofilm terapii?

Průkaz infekce implantátu

A) Nevyžadující vyjmutí implantátu

B) Průkaz kolonizace implantátu po jeho vyjmutí

Průkaz schopnosti tvořit biofilm

Účinnost antimikrobiální terapie na biofilm

Fenotypové metody průkazu tvorby biofilmu

Vizualizace

Kultivační průkaz

Průkaz klíčových složek biofilmu

Povrchové vlastnosti mikroba

Adheze

Biofilmová

vrstva

Kultivační průkaz tvorby biofilmu

Modifikace Christensenovy metody (Christensen et al., 1982,1985)

1) Kultivace mikroba v přítomnosti vhodného kutivačního povrchu Zkumavková metoda Mikrodestičková metoda Disková metoda

2 ) Promytí - odstranění planktonických buněk

3) Průkaz vytvořené

biofilmové vrstvy

Zjištění počtu CFU

Barvení + spektrofotometrické měření

Sušina

Kolorimetrická média (redukce tetrazoliových

solí, resazurin aj.)

a další

++ + 0

-

Průkaz stavebních složek biofilmu (extracelulární matrix)

Charakteristický růst na agaru s Kongo červení (Freeman 1985)

Povrchové vlastnosti – zodpovědné za adhezi

Hydrofobita

Adheze buněk na rozhraní uhlovodík/voda (Rosenberg et al., 1980)

Suspenze testovaného + Uhlovodík (xylen, oktan aj.)

Vortexování → OD vodní fáze

Hydrofobicita redukci OD původní susp.

Měření kontaktního úhlu

Povrchový náboj a izoelektrický bod (pI)

kapilární izoelektrická fokusace (Růžička et al., 2009; 2010)

Genotypové metody průkazu schopnosti

tvořit biofilm

detekce genů kódujících tvorbu biofilmu

Průkaz ica operonu u stafylokoků pomocí PCR

124 bp – S. epidermidis

546 bp - ica operon

ica R ica A ica D ica B ica C

Primer-F Primer-R

Klinický význam průkazu tvorby biofilmu

Marker klinické významnosti kmene

Je kmen izolovaný z hemokultur klinicky relevantní?

Nejde o kontaminaci?

Průkaz tvorby biofilmu může přinést cenné klinické informace

Prognóza. Jak postupovat v další léčbě?

Citlivost biofilmu k antimikrobiálním látkám

Jaké antimikrobiální látky použít na katétrovou infekci?

MIKROBY V BIOFILMU JSOU

VŽDY ODOLNĚJŠÍ NEŽ FORMY PLANKTONICKÉ

MIC neodpovídá koncentracím antimikrobiálních látek schopných zasáhnout biofilm (MBIC a MBEC)

Zvýšená odolnost se týká dezinfekčních látek i antibiotik/antimykotik

Rozdíly v citlivost činí až několik řádů

Předpokládá se více mechanizmů, které se na rezistenci BF podílí

MIC nemá přímý vztah k MBIC a MBEC

MBIC - minimální biofilm inhibující koncentrace

MBEC - minimální biofilm eradikující koncentrace

ZHORŠENÝ PRŮNIK

EXTRACELULÁRNÍ MATRIX - PENETRAČNÍ BARIÉRA

SNÍŽENÍ DIFÚZE ANTIMIKROBIÁLNÍ LÁTKY

nelze však vždy prokázat

VLIV POVRCHOVÉHO NÁBOJE zdá se důležitější např. aminoglykosidy (+)

se vážou na alginát (-) P. aeruginosa SNÍŽENÁ DIFÚZE ENZYMŮ jako jsou ß-laktamázy Snazší degradace antibiotik

ZMĚNA PROSTŘEDÍ

vyčerpání O2 v určitých oblastech

zvýšení osmotického tlaku

nahromadění kyselých zplodin metabolismu

přímý účinek - potlačení účinku antibiotika

chinolony, aminoglykosidy

nepřímý účinek - snížení růstové rychlosti

beta-laktamy, glykopeptidy

ZMĚNA MIKROBIÁLNÍ POPULACE

toxická látka

zabije většinu mikrobů v biofilmu

zůstane subpopulace buněk

k dané látce vysoce rezistentních „Biofilmový fenotyp“ - exprese genů zodpovědných za rezistenci

tato subpopulace odpovídá za zvýšenou rezistenci biofilmu

PREVENCE BIOFILMOVÝCH INFEKCÍ

JE VÝHODNĚJŠÍ NEŽ LÉČBA

Společný zájem pacienta, lékaře i ekonomů

Typ implantátu (mechanické, konstrukční a fyzikálně-chem.

vlastnosti, zvl. charakter povrchu aj.)

Stav pacienta (imunosuprese, věk, další onemocnění)

Agens a jeho faktory virulence (adheze aj.)

Způsob zavedení a péče o implantát

Prevence biofilmových infekcí

Vhodná volba implantátu a způsob zavedení (asepticky!)

Zkušený personál + kvalitní následná péče

Preventivní/preemptivní podání ATB u rizikových

pacientů ???

Vhodný materiál (charakter povrchu: druh materiálu,

povrchová energie, povrchový náboj, hrubost aj.)

Impregnace implantátů - antimikrobiální látky a

antiseptika (chlorhexidin, Ag)

www.rajsmichu.cz

Terapie infekcí spojených

s tvorbou biofilmu

Terapie infekcí spojených s tvorbou biofilmu

Ponechání infikovaného implantátu

Méně závažné infekce

patogenními mikroby (např. CoNS),

riziko disseminace

Stabilizovaný pacient, benigní průběh,

bez komplikací

Reaguje na ATB terapii

Pokus o likvidaci ložiska biofilmu

(Vysoká pravděpodobnost selhání)

(Doporučení IDSA - Mermel et al, 2009)

Likvidace

ložiska

odstranění

implantátu

+

následná

ATM terapie

Budoucnost

Prevence katétrových infekcí

Interference se signály typu quorum sensing (furanony, RNAIII-IP,

AIP)

Ovlivnění povrchových vlastností katétru

Inhibice vzniku vysoce odolných perzistorů

Vakcinace

?

Terapie katétrových infekcí

Rozvolnění mezibuněčné hmoty

enzymaticky (lyasy polysacharidů)

fyzikálně (ultrazvukem, elektromagnetickým polem)

Molekuly vyvolávajících autodestrukci biofilmu

regulátory tvorby biofilmu (quorum sensing - furanony, RNAIII-IP, AIP)

?

Úvod do orální mikrobiologie

Filip Růžička

Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně

Přednáška pro II. r. ZL 2012

Mikroflóra dutiny ústní

Vše začalo Leeuwenhoekem…

(a) Původní kresba A.L., (b) Campylobacter rectus, (c) Selenomonas sputigena , (d) ústní koky (e) Treponema denticola, (f) Leptotrichia buccalis

Mikroflóra dutiny ústní Jedno z nejrozsáhlejších mikrobiálních

společenství, přes 700 rodů, některé dosud nepopsané

Stálá – komenzálové, nebo přechodná

Ekologický systém

Tvorba biofilmu

Významný vliv na zdraví lokálně i celkově

Vztah k etiologii zubního kazu a parodontitidy

Prostředí dutiny ústní

• Vícevrstevný dlaždicový epitel

– Rty

– Bukální sliznice

– Sliznice patra

– Hřbet jazyka

– Dásňové sulky

• Dále

– Povrch zubů

– Protetické náhrady a ortodontické aparáty

Rty

Mikroflóra přechodem mezi mikroflórou kůže a ústní sliznice.

Na retní sliznici převážně streptokoky , např. Str. vestibularis.

Bukální sliznice

Sliznice dutiny ústní je osídlena relativně řídce – na jednu epitelii připadá jen 5 – 25 bakterií.

Na bukální sliznici nalézáme hlavně Str. sanguinis a Str. mitis, H. parainfluenzae a částečně i ústní neisserie.

Sliznice patra

Hlavními zástupci streptokoky a aktinomycety, méně hemofily a gramnegativní anaeroby.

Kandidy - snímací totální a parciální náhrady.

Hřbet jazyka

V prostorách mezi papilami mohou zůstávat odloupané epitelie; mikrobů proto daleko více.

Nízký redox potenciál - růst anaerobů.

Kromě Str. sanguinis nalézáme na jazyku i Str. salivarius, Stomatococcus mucilaginosus, neisserie (zejména u malých dětí) a hemofily, ale i veillonely, aktinomycety a prevotely.

Sulci gingivales

Hlavně anaeroby a fakultativně anaerobní bakterie

Z prvoků se v sulci gingivales vyskytují Entamoeba gingivalis a Trichomonas tenax.

ANAEROBY

Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans Actinomyces – A. gerencseriae, A. georgiae Fusobacterium – F. nucleatum, F. alocis, F. sulci Prevotella nigrescens Porphyromonas gingivalis, P. endodontalis Treponema denticola, T. vincentii, pectinovarum, socranskii Tannerella forsythia Wolinella succinogenes Selenomonas sputigena

fakultativní AEROBY

Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus subsp. constellatus, Streptococcus constellatus subsp. pharyngis, Streptococcus intermedius

Subgingivální plak

převládají anaeroby, např. Peptococcus anaerobius,

Peptococcus magnus a Peptococcus micros, různé

druhy eubakterií, Propionibacterium propionicum,

Bifidobacterium dentium, veillonely, Porphyromonas

gingivalis a Porphyromonas endodontalis, Prevotella

nigrescens a Leptotrichia buccalis.

Povrch zubů

Zubní plak - liší se dle lokalizace.

Hladké supragingivální povrchy jsou osídleny

menším počtem mikrobů, a to vesměs aerobních, než

rozmanité štěrbiny a mezizubní prostory,

Subgingivální plak poskytuje výhodnější podmínky

mikrobům anaerobním.

Supragingivální plak - na povrchu zubů zejména

Streptococcus mutans a Streptococcus sobrinus.

Ve vyvinutém plaku pak též Streptococcus sanguinis,

Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis,

Streptococcus oralis a Streptococcus peroris,

většinou ale ne S. salivarius.

Dále mohou být různé druhy laktobacilů a hemofilů,

Rothia dentocariosa, Eikenella corrodens,

Capnocytophaga haemolytica a Capnocytophaga

granulosa.

Protetické náhrady a ortodontické aparáty

Na dentálních pomůckách velmi snadno vzniká

biofilm – plak, na jehož vzniku se kromě

vyjmenovaných spíše aerobních mikrobů podílejí

ještě stafylokoky, a to i Staphylococcus aureus, a

především kvasinky, zvláště Candida albicans.

V případě špatně udržovaných protetických náhrad

mohou tyto kvasinky vyvolat stomatitidu.

Mikroflóra dutiny ústní má významnou úlohu při vzniku a

vývoji onemocnění dásní a parodontu i při patogenezi

celkových onemocnění

Rod Streptococcus

• α-hemolytické druhy streptokoků, rozděleny na skupiny

• Skupina S. mutans:

Nejčastěji se izoluje S. mutans, méně často S. sobrinus, vzácně S. cricetus a S. rattus. Ze sacharózy tvoří lepkavé glukany a fruktany, rychle tvoří kyseliny ze sacharidů

• Skupina S. salivarius: S. salivarius, S. vestibularis - ve slinách a na povrchu jazyka. Sacharózu metabolizuje na fruktan levan, na půdách s tímto cukrem roste v mukózních koloniích, může vyvolat endokarditidu.

• Skupina S. mitis: S. mitis , S. oralis a S. peroris - na sliznici i v zubním plaku a s výjimkou S. mitis vyvolávají loudavou sepsi…+

S. sanguinis a S. gordonii - na jazyku, na bukální sliznici a v zubním plaku. S. sanguinis dovede štěpit sekreční IgA.

Oba druhy jsou významnými původci subakutní bakteriální endokarditidy (sepsis lenta) !!

• Skupina S. anginosus rostoucí v drobných koloniích - S. anginosus (v brit. literatuře S. milleri), S. constellatus se dvěma poddruhy, constellatus a pharyngis, a S. intermedius.

Kromě nosohltanu se nalézají zejména v gingiválních sulcích. Působí dentoalveolární a endodontické infekce.