15/03/2010

1

genové čipy

co to je genový čip (DNA microarray)? DNA šikování

• nová technologie zavedená koncem devadesátých let

• geny nebo fragmenty genů (cDNA, EST) jsou roboticky v přesně daných souřadnicích umístěny na mikroskopické sklo (plast)

• takto vytvořený genový čip se hybridizuje s RNA nebo cDNA určitého vzorku a následně počítačově srovná se standardem

Northern BlotNorthern Blotimobilizována mRNA se hybridizuje se značenou probou reprezentující jeden gen

DNA MicroarrayDNA Microarrayimobilizované proby hybridizují se značenou mRNA reprezentující všechny exprimované geny

15/03/2010

2

• do jednoho čipu lze uložit informaci celého genomu (až 50.000)• komerčně připravované čipy se prodávají pro celé organismy, které

mají odsekvencovaný genom• u vlastních microarray se používají jen krátké oligonukleotidy

reprezentující jednotlivé geny o známe funkci a všechny další EST

princip genových čipů

p j j g y y získané z daného organismu

• velice náročná příprava (imobilizace desetitisíců prób na velmi malé ploše

Human ~ 30,000 genes Mouse ~ 30,000 genesHuman ~ 30,000 genes Mouse ~ 30,000 genes• následuje označení

srovnávaných populací mRNA většinou fluorescenčně

• promytí takto označené mRNA Yeast ~ 6200 genes E. coli ~ 4200 genes

Phage T4 ~ 200 genesInfluenza ~ 12 genes

Yeast ~ 6200 genes E. coli ~ 4200 genes

Phage T4 ~ 200 genesInfluenza ~ 12 genes

p yčipem

• vyhodnocení rozdílů – je není exprimovaný

• u nejmodernějších i jak moc

• vše je řízeno počítačově

Macroarray & Microarray& DNA Chips

Micro a macroarray: lepené DNA čipy: syntetizované umělé(Affymetrix(Affymetrix technologie)technologie)

Próby [0.6 kb - 2.4 kb] jsouPCR amplifikované celé cDNAnebo EST [expressed sequencetags] sekvence.Jsou roztříděny a přilepenyroboticky na nepórozní pevnýnosič (plast).macroarray 1000 skvrn

(Affymetrix(Affymetrix technologie)technologie)

Próby jsou 20-25 deoxyoligonucleo-tidy syntetizované na sklo speciálnítechnikou (fotolitografie) Komerčníčipy mají 300.000 prób na 3 cm2

Experimentální čipy i s miliónemprób na array.

microarray 10000 skvrn.

15/03/2010

3

práce s genovým čipem

Affymetrix technologieAffymetrix technologie

1.28cm

50um

15/03/2010

4

fotolitografie fotolitografie metoda pro syntézu Affymetrix čipů

• wafer (křemíková destička se předem promyje a aktivuje (reakčníhydroxylové skupiny)

• ponoří se do silanu který zajistí jednolitou rovnoměrnou vrstvu• ta se překryje maskou která je řízená počítačem a na přesně danýchmístech se pak světlem aktivuje hydroxy skupina na kterou sep j y y psyntetizuje přesně určený nukleotid (podle databáze)

• opět se překryje vrstvou silanu a maskou• maska se přesune a opět aktivuje světlem• a opakuje se 25x• syntéza 25-oligonukleotidu• na jeden gen několik prób

Affymetrix technologieAffymetrix technologie• každé místo próby je obsazeno 22 oligonukleotidy reprezentující

jeden gen• 11 z nich je tzv.perfect match (PM) přesně kopírují sekvenci genu• 11 z nich je mismatch (MM) liší se jedním nukleotidem v centrální

pozici (12-1-12)• např. U133A human array, obsahuje přes 22.000 různých sekvencí

(genů) které jsou reprezentovány zhruba v 500.000 oligonukleotidech

15/03/2010

5

Affymetrix GeneChips

vymezení DNA próbypairs

vzorek mRNA

5’ 3’

referenční sekvence genu

…TGTGATGGTGGGAATGGGTCAGAAGGGACTCCTATGTGGGTGACGAGGCC…

TTACCCAGTCTTCCCTGAGGATACAC Perfect match oligo

TTACCCAGTCTTGCCTGAGGATACAC Mismatch oligo

PM

MM

Probe Set

PM - 25 bazí komplementárních k referenční sekvenciMM – prostřední báze je odlišná

PM

MMProbe Pair

PMProbe Cell

Affymetrix technologieAffymetrix technologieznačení mRNA populace

Cy3-dCTPCy5-dCTP

15/03/2010

6

Affymetrix technologieAffymetrix technologieznačení mRNA populace

cy5

cy3 and cy5: běžně používané fluorescenční značky

cy3 cy5

664 nm

emission

cy3 www.amersham.com

510 nm

emission

yellow cy3=cy5

red cy5>cy3green cy3>cy5

15/03/2010

7

Affymetrix technologieAffymetrix technologie

Affymetrix technologieAffymetrix technologie

Agilent bioanalyzer

15/03/2010

8

Affymetrix technologieAffymetrix technologiepo promytí dvěma různýma populacemi mRNA se zeleným a červeným značením je celá array skenována a vyhodnocena ve speciálních programech

nejdřív se vyhodnotí rozdíl mezi PM a MM (tím se velmi redukuje chyba)MM próby vychytávají nespecifický signál

následně se srovnají vzájemně i t it

PMMM

intenzity

v ideálním případě by dvě naprosto totožné populace mRNA dávali celou žlutou array

Affymetrix technologieAffymetrix technologie

15/03/2010

9

Affymetrix technologieAffymetrix technologie

• tento komerční genový čip obsahuje 5 arrayi• Array B,C,D,E obsahují 4x cca 12.000 prób pro klustry komprimované z lidských EST klonů

A b h j 12 000 ób lid ké• array A obsahuje cca 12.000 prób pro lidské geny o známé funkci

• tento čip obsahuje genetickou informaci ze dvou organismůSaccharomyces cerevisiae a Schizosaccharomyces pombe

• čip obsahuje próby pro 5 841 z 5 845 všech genů přítomných včip obsahuje próby pro 5,841 z 5,845 všech genů přítomných v S.cerevisiae a 5,021 z 5,031 genů přítomných v S. pombe.

• divergence mezi oběma kvasinkami proběhla zhruba před 500 milióny lety a proto je mezi nimi taková odlišnost, která vyžaduje samostatné próby.

• informace z obou genomů je ale uložena pouze v jednom arrayi.• Sekvence pro navržení prób byly vygenerovány z veřejných databázi GenBank® (květen 2004) a Sanger Center (červen 2004)

PG2

Snímek 18

PG2 S. cerevisiae has approximately 5600 open reading frames; S. pombe has approximately 4970 open reading frames. S. cerevisiae has 16 chromosomes, S. pombe has 3. S. cerevisiae is often diploid while S. pombe is usually haploid. Both species share genes with higher eukaryotes that they do not share with each other. S. pombe has heterochromatin and RNAi machinery genes like those in vertebrates, while these are missing from S. cerevisiae. Conversely, S. cerevisiae has well developed peroxisomes, while Sch. pombe doesnot. galuszka; 19/03/2009

15/03/2010

10

další typ genového čipujednotlivé array jsou rozděleny podle orgánu ze kterého byl získán

daný EST

Brain Brain 67,67967,679

Heart Heart 9,4009,400Liver Liver

37,80737,807 Colon Colon 4,8324,832

P t tP t t

Lung Lung 20,22420,224

BrainBrain LungLung

Prostate Prostate 7,9717,971

Skin Skin 3,0433,043

Bone Bone 4,8324,832

LiverLiver Liver TumorLiver Tumor

• vznikají i čipy pro organismy, které nemají odsekvenovaný genom

• např. Affymetrix čip pro ječmen (srpen 2004)• přes 22.500 prób• z toho 1.145 známých genů (včetně alel)• z databázi bylo extrahováno zhruba 400.000 ječmenných EST klonů, ty byly počítačově zpracovány a bylo vytvořeno 26 634 kontigů azpracovány a bylo vytvořeno 26.634 kontigů a 24.396 singletonů

• všechny tři zdroje byly znova zpracovány a bylo vybráno 22.500 jedinečných genů či jejich fragmentů s kompaktním 3´koncem pro vytvoření prób

Potencionální využití t di k lit l dstudium kvality sladu, kontrola proti škůdcům a nemocem, abiotický stres, nutriční charakteristika

15/03/2010

11

cenacenanejvětší problémnejvětší problém

(2OO2)(2OO2)

vyuvyužžití genových ití genových ččipipůů• Studium exprese genů (regulace genů)• Funkce nových genů (neobjevené metabolické pochody)

• Detekce mutantů• Diagnóza nemocí(analýza polymorfismu)• Hl dání n ý h léč bný h p tupů (j li či ý d h• Hledání nových léčebných postupů (jestli určitý druh

rakoviny zvyšuje expresi daných genů, můžeme zjistit které další podmínky způsobují expresi těchto genů a případně zjistit, která látka ji zpětně snižuje - potenciální lék)

• Farmakogenomika (testování nových léčiv před uvedením na trh)• Toxikogenomika (hledání korelace mezi odpovědi na toxickou

látku a změny jí vyvolané v genetickém profilu)

15/03/2010

12

studium estudium expresxprese gene genůů

ZMĚNY V EXPRESI GENů VYVOLANÉ KOUŘENÍMtranscriptony z buňek plicního epitelu nekuřáků, kuřáků, bývalých kuřáků a kuřáku různých

ras a věku byly izolovány a podstoupeny hybridizaci z GeneChip® U133A

NEKUŘÁCI .• Bylo zjištěno že v jejich buňkách se exprimuje cca 2,000 genů• Exprese těchto genů není ovlivněna věkem, rasou ani pohlavím• Většina genů tvoří geny spojené z oxidativním stresem, ion/elektronové přenašeče,

chaperony, vezikulární transportery atd.

KUŘÁCI .• Zvýšená exprese 97 genů – spojené s buněčnou adhezí, oxidativním stresem,

metabolismem gluthationu, transportem elektronů, metabolismem a sekrecí xenobiotik a několik onkogenů

• Downregulovány byly supresory tumorů a zánětové regulátory.• Profil tři dlouhodobých kuřáků stejný jako u nekuřáku !!!• Profil daleko výraznější u starších kuřáků• Pohlaví nemá vliv, rasa ano• Kavkazská rasa daleko slabší profil než negroidní

BÝVALI KUŘÁCI .• Návrat k normální expresi do dvou let• Stále vysoká hladina supresorů tumorů a některých onkogenů

VÝZNAM .• Objeveno spousta genů které nebyly s kouřením spojovány (metabolismus gluthationu)• Dají se identifikovat kuřáci s vysokým rizikem ke vzniku rakoviny plic

15/03/2010

13

• pro diagnostické účely se budou používat čipy s limitovaným počtem prób (metoda bude daleko levnější)- prediktivní medicína

• Affymetrix technologie je značně spolehlivá (při testování 34 stejných vzorků byla 94-97% shoda).

DNA bi či j ž á j bj ější ti ký á t j• DNA biočipy jsou považovány za nejobjevnější genetický nástroj poslední dekády

PROBLÉMY GENOVÝCH PROBLÉMY GENOVÝCH ČČIPIPůů::

• znalost sekvence genu a míry její exprese mnohdy nestačí k předpovězeni povahy a množství proteinu jí kódovaného (mnomnožžství ství mRNA není vmRNA není vžždy úměrné mnody úměrné množžství proteinuství proteinu)

• alternativní splicing – jeden gen produkuje více proteinů

• syntéza proteinů je ovlivněna i vnějšími vlivy a může se lišit i v čase

• význam proteomiky

15/03/2010

14

obrana proti bioterorismuobrana proti bioterorismu

biologická válečná agens jsou bez barvy a bez zápachu a většinou trvá dny až týdny než vyvolají symptomy

obrana proti bioterorismuobrana proti bioterorismu• nejnovější detektory biologických zbraní dokážou odlišit patogeny od

neškodných organismů tím,že srovnávají jejich genetickou výbavu• systém GeneXpert nebo(americká firma Cepheid)

• obsahuje koncentrátor vzduchu a filtr zachycující patogeny

• dezintegrátor buněk

• DNA patogenů pak jde do speciálního čipu obsahující ssDNA ze všech možných pathogenů, který má po stranách elektrody

• čip se pak hybridizuje s krátkými komplementárními próbami značenými zlatými částečkami

• pokud dojde k hybridizaci sepne se

pomocí zlatých částeček obvod • jiný typ detektoru je založen na

l ti PCRreal-time PCR

• databáze TIGER triangulační genetická evaluace biologických rizik

• amplifikace úseku genomu odpovědného za

proteosyntesu, nelze zneužít mutací patogena

15/03/2010

15

• Swiss Federal Institute for Technology

• sledování exprese 23,750 genů u modelové rostliny Arabidopsis thaliana v jednotlivých orgánech a v závislosti na ontogenezi, a biotických a abiotických faktorech

• proč Arabidopsis?

• 25 498 genů zhruba u 60% je předpovězena nebo objasněná funkce

• databáze zpracovává data z 2317 arrayí (listopad 2005)

15/03/2010

16