Date post: | 03-Jul-2015 |
Category: |
Technology |
Upload: | maelstroem |
View: | 496 times |
Download: | 1 times |
Genové inženýrství
Genové inženýrství
● Genové inženýrství je soubor technik určených k cílené manipulaci genetické informace
● Cílené manipulaci?– alternativně: aplikace
genetických poznatků na křížení zvířat a rostlin
Centrální „dogma“ molekulární biologie
ÚvodStruktura DNA
● Určena 1953● Primární sekvence: pořadí bazí● Dvoušroubovice tvořená dvěma
antiparalelními vlákny● Hlavní nositel genetické informace
(spolu s RNA a epigenetickou informací)
ÚvodCo je gen
● Definováno každým oborem jinak● Pro genové inženýrství – úsek DNA kódující
protein+příslušné regulační oblasti● Pro klasického genetika - „vloha“● Identifikace genu:
– Genetické metody (mutace+mapování)
– Biochemické metody – nalezení proteinu => zpětné určení zodpovědného genu
Univerzální genetický kód
● Všechny organismy používají stejný genetický kód (několik výjimek, hlavně obsazení nekódujících pozic)
● DNA z různých organismů je vzájemně kompatibilní
Základyvztah genotypu a fenotypu
● Gen kóduje protein, který má nějakou funkci● Monogenní znaky● Polygenní znaky
– Výška, inteligence, hmotnost, krevní tlak
– Většina chorob
– Neléčitelné genovou terapií
Inspirace přírodouMobilní elementy
● Transpozomy a retroelementy● Úseky DNA, které jsou schopné se množit v
rámci genomu– Nosí informaci pro svou replikaci a často selekční
výhodu – resistenci nebo vyvolávají patogenitu
– Často se nesprávně vloží● Inaktivace rozrušeného místa => rakovina● Při vyštěpení mohou vzít část hostitelské DNA
– Genová duplikace
● Bakteriální integrativní plasmidy
Restrikčně modifikační systém
Inspirace přírodouSelekční znaky
● Využívání resistence na antibiotika● Obnova poškozených biosyntetických drah● Umožňují vybrat jednotlivé buňky, které si
osvojily vnesenou DNA
● Poznámka – existující resistence
bakterií proti těžkým kovům (stříbro)
Nová metodaSekvenace
Nová metodaPCR
● Vyžaduje znalost sekvence
Izolace „speciální“ DNA
● Forenzní analýza
– Mitochondriální DNA, DNA pro určení identity
– aDNA maximálně sto (stovky?) tisíc let (izolace DNA z dinosaurů nepotvrzena)
● DNA musí být rychle zmražena nebo vysušena (mumie)
● Izolace DNA pro potřeby genového inženýrství
● Praktická ukázka izolace DNA z rostlinného vzorku dnes večer!
Bezpečnost
● Biohazard I – běžná laboratoř, bakterie a viry neinfekční pro člověka
● Biohazard II – málo infekční (obtížně šiřitelné)● Biohazard III – nebezpečné a exotické
choroby● Biohazard IV – choroby
smrtelné, neléčitelné
a bez známé prevence
Otázka – zařaďte: ebola chřipka (běžná), SARS, salmonela, tuberkulóza, HIV, GMO
Hlavní využitíprimární výzkum
● Knock-out● Knock-down● Knock-in● Zkoumání lokalizace a exprese● Úpravy pro usnadnění biochemických analýz
Bakteriální beta-svorka+GFP
Zeleně:Tubulin+GFP
Otázka:Jak se liší uspořádání tubulinu v buňkách s průduchy a bez nic?
Zeleně:
14-3-3-φ/GFP transgene
Červeně:
Autofluorescence chlorofylu
Využití:produkce proteinů ve velkém
● První – inzulin v bakteriích (1977)● Rostlinné očkování● Produkce enzymů
– Vylepšení produkce „přírodních“ enzymů
● Hypoteticky možnost libovolný protein produkovat ve velkém množství– Protein pavoučího vlákna => lepší, než kevlar
GMO Plodiny
● Cílené úpravy, technicky stejné, jako ty probíhající přirozeně, které jsou ale velmi nepravděpodobné
● Plodiny nesoucí Bt toxin – v „běžných podmínkách“ (využívání pesticidů) srovnatelný výnos, bez použití pesticidů výnos +80 %
– Budoucí uplatnění GMO hlavně v rozvojových zemích
● Možný přenos DNA na člověka?
– „Rostliny mají geny ?!?“
● Pokud je GMO riziko, pak hlavně pro životní prostředí (ryby)
● 25 let zkoumání, 130 nezávislých týmů, konsenzus – bezpečné při dodržení předběžné opatrnosti
Únik resistence na antibiotika
● Horizontální genový transfer– Běžný jev, hlavně prokatyota a nižší eukaryota
– Genom bakterie Wolbachia (endosymbiont) se v evoluci přenesl do některých druhů hmyzu
– Separovaná germinální linie u zvířat
● Používané selekční znaky se běžně vyskytují– Resistence na ampicilin nese 10 % půdních
bakterií
– Přenos resistence
Výhody
● Omezení využití pesticidů a zvýšení resistence– Využitelné pro rozvojové země
– „Obsahuje GMO x 12x povrchově ošetřeno pesticidy“
● Úprava obsahu živin– Zlatá rýže, sója s upraveným obsahem
aminokyselin
Nevýhody
● Mezinárodní korporace● Závislost zemědělce na výrobci (i u konvenčních –
heterózní efekt)● Možnost vzniku resistence u příbuzných plevelů (x
DNA jako DNA – stejně dobře se může přenést i „přirozená“ resistence)
● Možnost úniku GMO do prostředí => ekologická katastrofa?
● Bt toxin a ničení včelstev? Úhyn motýla monarch?● Setkání s látkami, se kterými se člověk v evoluci
nesetkal? (x kiwi, mechanismus trávení)
Nechvalně známýPusztai affair
● Jedna z prvních velkých nezávislých studií o bezpečnosti GMO (1998)
● Lektin ze sněženky do brambor
=> imunodeficience u potkanů a pomalejší růst
● Špatný pokus
– Kontrolní brambory obsahovaly +20 % proteinů a potkanům byly podávány především brambory
– Dalším skupinám se výsledky nepodařilo zopakovat
– Peer Review: „experiments were poorly designed, contained uncertainties in the composition of diets, did not have a large enough number of rats, used incorrect statistical methods and lacked consistency within experiments“
● Hysterie ze strany tisku, předtím snad snaha umlčet Puszataiho
Nová plodina musí být testována
● Výzkum vložené DNA a syntetizovaných proteinů● Analýza chemického složení plodiny, měření
obsahu živin (ptáci preferují GMO před BIO), přítomnost známých toxinů a alergenů (vnesení genu může změnit jejich regulaci)
● Určení, jestli nevznikají nové alergeny– Odhad průměrné spotřeby
– Test na zvířatech: krátkodobý (několik dní), dlouhodobý (několik málo generací)
● Lepší kontrola, než u konvenčních metod
„přírodní experimenty“
● Experimenty s blokací myostatinu● Vychází z přirozeně vzniklých mutantů
– Stovky let testování konzumenty
Využití:Genová terapie
● Úprava genetické informace za účelem opravit existující chybu
● Odpůrci: velmi emocionální apokalyptické vize, „pokoušení osudu a hraní na boha“
● Zastánci: zázračná léčba umožňující vymýcení nemocí
● Reálně: poměrně omezená metoda na pouze některé cíle, v současnosti stále experimentální procedura
Nosiče DNA
● Stabilní/dočasná● Vnesení nahé DNA● Lipozomy● Virové
– Odvozené od (vykuchaných) virů
– Integrativní – nebezpečí vzniku rakoviny (x chemoterapie, imunosuprese, rengen/CT)
– Stabilně přítomné
Čas na diskuzi
● Aplikované flebotonium