Úvod do tkáňového inženýrství

Jana Horáková

Definice

Interdisciplinární obor využívající znalostí inženýrství a přírodních věd k vývoji biologických náhrad sloužících k obnově, zachování nebo zlepšení funkcí tkání nebo orgánů (Langer et Vacanti, 1993)

Využití poznatků biologie, chemie, fyziky, inženýrství biomateriálů, počítačové technologie, medicíny.

Cíle (4R)

Vysvětlení pojmů • In vitro – ve zkumavce

• In vivo – v živém organismu

• Scaffold – nosič, podpůrná struktura pro růst buněk, popř. tkání

• Adheze – přilnutí buněk, podmíněno přítomností specifických receptorů na povrchu buněk (adhezní proteiny)

• Proliferace – buněčné dělení

• Diferenciace – vývoj nespecializované buňky (kmenové) v buňku strukturně i funkčně specializovanou

• Kmenové buňky – nediferencované buňky se schopností přeměny v jakýkoliv jiný buněčný typ

1. Izolace buněk

2. Kultivace buněk (2D)

3. Výroba scaffoldu

4. Osazení scaffoldu a následná kultivace (3D)

5. Implantace

Proces tkáňového inženýrství

1. Buňky

• Autologní – zdrojem je sám pacient, imunotolerance

• Alogenní – lidské buňky, nebezpečí rejekce implantované tkáně, přenosu infekce

• Xenogenní – buňky jiného druhu (např. prasete) Primární Sekundární (buněčné kultury) Kmenové – možnost diferenciace za využití

růstových faktorů Tkáňově diferencované

Kmenové buňky (stem cells)

• Totipotentní – schopnost vývoje ve všechny buněčné typy, např. embryonální kmenové buňky (ESC)

• Pluripotentní – schopnost vývoje v několik buněčných typů (částečně diferencované), např. hematopoetické (HSC)→kostní dřeň, krevní buňky; neuronální (NSC)→neurony, gliové buňky; mesenchymální kmenové buňky (MSC)→svaly, kosti, chrupavčitá tkáň, šlachy

Výskyt dospělých KB

1. Kostní dřeň

2. Amniový vak

3. Pupečníková krev

4. Tuková tkáň

5. Bazální vrstva pokožky

Kultivace buněk in vitro

• Sterilní podmínky (jednorázový spotřební materiál, speciální chemikálie)

• Snaha o napodobení přirozených podmínek v organismu

• Proliferace a růst buněk, příp. diferenciace do určitých typů buněčných linií (např. mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně→kostní/nervová/chrupavčitá tkáň)

Podmínky kultivace

• Přísun cukrů, solí, aminokyselin, vitaminů, mastných kyselin, proteinů

• bikarbonátový pufrovací systém udržující pH v rozmezí 7,2-7,4

• 5% CO2, 37°C

• pH indikátor: fenolová červeň růžová barva při optimálním pH žlutá-kyselé pH, filaová- zásadité pH

• Médium s obsahem 10-15% FBS (proteiny, růstové faktory)

• Přídavek směsi antibiotik/antimykotik

CO2 inkubátor

Pasážování buněk

• Při dosažení 70-80% konfluence (souvislé vrstvy buněk) → „naředění buněk“

• Uvolnění adherentních buněk od kultivačního povrchu i od sebe navzájem, přenesení do nové kultivační nádoby s čerstvým médiem

• Způsob: působení proteáz (trypsin), odstranění dvojmocných iontů (EDTA-chelatačně váže Ca2+, Mg2+)

80% konfluence → vhodné k pasážování

Buňky v suspenzi po trypsinizaci

Růst buněk

Růstová křivka:

• A - statická (lag) fáze: příprava na buněčné dělení

• B - exponenciální (log) fáze: intenzivní množení buněk do vyčerpání živin

• C - stacionární (plató) fáze: počet buněk se nemění, počátek akumulace toxických produktů

• D - fáze odumírání

Růstová křivka

T (osa x)=čas

L (osa y)=počet buněk

A-statická fáze B-exponenciální fáze C-stacionární fáze D-fáze odumírání

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/53/Bacterial_growth.png

Růst buněk při kultivaci in vitro • Snaha o udržení log fáze (exponenciální nárůst

počtu buněk)

• Kontaktní inhibice při dosažení konfluence

• Před dosažením plató fáze pasážování (naředění na takové množství, aby kultura opět rostla exponenciálně)

Uchovávání buněk (kryoprezervace) • Možnost dlouhodobého uchovávání v

hlubokomrazícím boxu (-80°C) nebo v parách kapalného dusíku (-196°C)

• Přidání kryoprotektiv (DMSO, glycerol) – zabrání poškození krystaly vody při zmražování buněk

• Záloha při kontaminaci, načasování pokusů

Sterilizace

• Odstranění mikroorganismů z prostředí, ve kterém se pracuje s buněčnými kulturami

• Zásadní krok – při kontaminaci buněčných kultur: destrukce buněk, pomalý růst, změna chování, přenos kontaminace na další buněčné kultury,…

• Dodržování GLP-přesné a opakovatelné výsledky

Metody sterilizace

• Autoklávování

• UV záření

• 70% EtOH

• Ethylenoxid

• Plazma

• V praxi často kombinace metod

• Používání jednorázových sterilních prostředků

Kontaminace buněčných kultur

• Bakterie (přidávání antibiotik do kultivačních médií) – viditelné v mikroskopu

• Mykoplasmata – intracelulární parazité (nezjistitelné při mikroskopické kontrole), testování na přítomnost mykoplasmat

• Plísně, kvasinky (přídavek antimykotik) – mikroskopie

• Viry – vzácně, obtížná detekce

Opatření při kontaminaci

• Zpomalení proliferace, změna vlastností buněk

• Likvidace kultury

• Asanace laboratoře a inkubátoru

• Příprava nových kultivačních médií

• Obnovení kultury ze zmražené zálohy

2. Scaffoldy

Požadavky:

• Biokompatibilita

• Biodegradabilita (rychlost degradace úměrná rychlosti formování tkáně)

• Mechanická podpora

• Porézní struktura umožňující usazení buněk, jejich růst a migraci

• 3D struktura

Scaffoldy

• Důležitý výběr vhodného materiálu (syntetický/přírodní), způsob výroby

• Snaha o napodobení přirozeného prostředí buněk v organismu

Materiály Syntetické:

kyselina polyglykolová (PGA),kyselina polymléčná (PLA), a jejich kopolymery (PLGA), polykaprolakton (PCL)

Biologické:

• Přírodní polymery: kolagen, fibrin, chitosan, alginát, glykosaminoglykany (GAGs), kyselina hyaluronová (HA)

• Acelulární tkáňové scaffoldy: ECM

A) Syntetické materiály

• Mechanická pevnost, odolnost

• Možnost modifikace tvaru a stupně degradace

• Hydrofobní povrch→špatná adheze buněk

Polyestery

• Esterové vazby odbourávány hydrolýzou→ finální produkty mohou vyvolat zánětlivou reakci (vznikají kyselé produkty)

PGA

• Hydrofilní struktura → hydrolýza ve vodném prostředí za vzniku kyseliny glykolové

• Rychlá degradace → možnost vzniku zánětu (kyselé produkty rozpadu)

PLA

• Hydrofobnější struktura → pomalejší degradace

• Při rozpadu vzniká kyselina mléčná

PCL

• Nejpomalejší degradace, použití na dlouhodobější implantáty

• Degradací vzniká kyselina kapronová

PCL microfibers (drawing) PCL micro/nanofibers (electrospinning)

B) Přírodní materiály

• Snadná buněčná adheze

• Přirozené pro lidský organismus – nevyvolávají imunitní odpověď

• Rozpad na netoxické produkty, které jsou z těla přirozenou cestou vyloučeny

• Nedostatečná mechanická pevnost

Kolagen typ I

• Hlavní složka pojivové tkáně člověka zajišťující mechanickou podporu a flexibilitu tkáně (kůže, kosti)

• Fylogeneticky stálá sekvence aminokyselin a helikální struktura→nevyvolává imunologickou odezvu organismu

GAGs • Lineární polysacharidy • Při vazbě na bílkoviny tvoří

proteoglykany – základní součást ECM

• Př.: kyselina hyaluronová (HA), chondroitin sulfát, dermatan sulfát, keratan sulfát, heparan sulfát, heparin

• Nejčastěji využívána HA – snadná chemická modifikace, náhrada chrupavky

Chitosan

• Deacetylovaný derivát chitinu

Celulóza

• Polysacharid tvořený glukózovými jednotkami

• Využití derivátů: acetylcelulóza, karboxymethylcelulóza

Decelularizace

• Způsob výroby scaffoldu

• Odstranění buněk z tkání→zisk ECM

• Několik možných mechanismů:

Fyzikální metody (zamražení, sonikace, tlak)

Chemické metody (zásadité/kyselé prostředí, detergenty: Triton X-100, SDS, hypertonické/hypotonické prostředí)

Enzymatické metody (trypsin, endo-, exonukleasy)

Extracelulární matrix (ECM)

• Mezibuněčná hmota

• Složena z proteinů (kolagen, elastin) a glykosaminglykanů (heparan sulfát, chondroitin sulfát, kyselina hyaluronová) a glykoproteinů (laminin, fibronektin)

• Fce: uchycení buněk, zajištění mezibuněčné komunikace, pružnost tkáně, podíl na diferenciaci buněk a vývoji embrya

• Zdroj: decelularizované tkáně

Osazení scaffoldu a následná kultivace

• Napodobování přirozených podmínek v organismu

• Přísun kyslíku a živin, vhodné pH, teplota a vlhkost, osmotický tlak

• Možnost přidání růstových faktorů, hormonů, specifických živin

• Využití bioreaktorů

Bioreaktory

• Udržování konstantních podmínek – přísun živin, odvod zplodin metabolismu, kyslík, pH

• Fyzikální stilmulace tkáně – diferenciace

• Dlouhodobá kultivace 3-4 měsíce

• Různé uspořádání dle požadovaného typu kultivace: spinner flask, rotating vessels

Implantace

• Vnesení scaffoldu osázeného buňkami do těla pacienta

• !Zánětlivá reakce,imunologická reakce hostitele!

• Postupná degradace scaffoldu a obnovení nebo nahrazení ztracené funkce tkáně (biodegradabilní materiál nahrazen ECM produkovanou buňkami)

Regenerativní medicína

• Využití kmenových buněk pro léčbu onemocnění kardiovaskulárního a nervového systému, léčbu diabetu, jaterních onemocnění, nemocí kostí, kloubů,…

• Zdroje kmenových buněk: kostní dřeň, embrya

• Postup: izolace kmenových buněk, vývoj ve specializované buněčné typy, implantace do poškozených orgánů

• Využití: Alzheimerova nemoc, Parkinsonova choroba, mrtvice, roztroušení skleróza,…

Aplikace

• Alternativa k transplantacím

1. Vytvoření funkční tkáně mimo tělo pro pozdější implantaci-náhrada poraněné tkáně, např. kožní kryty pro léčbu popálenin

2. Implantace buněčného substrátu, který vyvolá regeneraci tkáně v organismu (využití růstových faktorů), např. podpora regenerace kostní tkáně

3. Vytvoření funkční tkáně za využití kmenových buněk, např. kosti, svalstvo, chrupavka, játra

Tkáňové inženýrství vybraných tkání

1. Chrupavka

2. Kost

3. Cévy

4. Srdeční chlopně

5. Kryty ran

1. Chrupavka

1. Chrupavka

• Omezená regenerační kapacita (nízká dostupnost chondrocytů-ukotveny v ECM kloubního povrchu, absence progenitorových buněk, avaskulární tkáň)

• Izolace autologních chondrocytů/BMSC (bone marrow stromal cells=buňky kostní dřeně) + polymerní 3D scaffold (PLA, PGA, PCL, kolagen) – kultivace v bioreaktoru → implantace

Chung C., Burdick J.A. Engineering cartilage tissue. Advanced Drug delivery Reviews, 2008.

2. Kost

• Využití: osteogenesis imprerfecta (mutace v genu pro kolagen typu I), osteoporoza (řídnutí kostí)

• Scaffold: mechanická pevnost, ideální velikost pórů, tvrdost, 3D struktura, PCL/HA+β-TCP (kyselina hyaluronová+β-trikalcium fosfát)

• Izolace mesenchymálních progenitorových buněk z kostní dřeně (BMSCs)-diferenciace→osteoblasty/osteocyty-produkce mineralizované ECM (hydroxyapatit) a kolagenu

Criteria Function

Biocompatibility Ability to perform its function in the host tissue without eliciting any immune response

Biodegradability Tunable rate of degradation to match growth of new bone tissue as scaffold gets replaced by new bone

Mechanical properties

Sufficient mechanical strength to provide temporary support to the defect region and withstand in vivo loading forces

Microarchitecture Interconnected scaffold structures to uniformly distribute stresses throughout scaffold

Osteoinductivity Osteoinductive properties to recruit and differentiate osteoprogenitors to the defect region

Porosity Large surface area: volume and pore size to allow for tissue in-growth, neovascularisation, mass transport and osteogenesis

Surface properties Appropriate chemical and topographical properties for influencing cellular adhesion, proliferation and differentiation

Liu Y. et al. Review: Development of clinically relevant scaffolds for vascularised bone tissue engineering. Biotechnology Advances, 2012.

http://www.osteopore.com.sg

http://www.osteopore.com.sg/http://www.osteopore.com.sg/

3. Cévy

• Limitováno možný vznikem trombů, chronického zánětu, rejekcí nebo špatnými mechanickými vlastnostmi

• Endotelové buňky, buňky hladkého svalstva (zajišťují vasoaktivitu cév a mechanickou pevnost při působení tlaku v oběhovém systému), cytokiny a růstové faktory, biodegradabilní polymery

1. Tunica intima • Vnitřní vrstva tvořená endotelovými buňkami

(EC=endothelial cells)

• Bazální membrána (kolagenní vlákna)

• Vnitřní elastická lamina

2. Tunica media • Tvořena pojivovou a svalovou tkání

• Hladkosvalové buňky (SMC=smooth muscle cells) – vazokonstrikce x dilatace

• Elastin, Kolagen

• Ohraničena vnitřní a vnější elastickou laminou

3. Tunica adventitia • Kolagen, elastin; fibroblasty

• Obsahuje nervy, cévy (vasa vasorum)

Heparin-bonded ePTFE graft www.goremedical.com

Knitted polyester collagen-coated graft www.medicalexpo.com

http://www.goremedical.com/http://www.goremedical.com/http://www.goremedical.com/http://www.medicalexpo.com/http://www.medicalexpo.com/

• U cév s malým průměrem (

4. Srdeční chlopně • Umělé srdeční chlopně-nebezpečí

trombembolismu (celoživotně podávání antikoagulancií)

• Bioprotézy (např. transplantace prasečí chlopně):

nevýhody-kalcifikace, změny struktury

výhody-netrombogenní, neinfekční, delší životnost, přežívání buněk→možnost růstu, regenerace, remodelace (využití především u dětských pacientů)

Přirozená struktura srdeční chlopně

Proces tkáňového inženýrství srdeční chlopně

Weber B., Hoerstrup S.P. Tissue Engineering of Heart Valves. Comprehensive Biomaterials, 2011.

5. Kůže

• Proces hojení ran: 1.reepitelizace 2.remodelace granulační tkáně 3.tvorba jizvy

• Epidermis – schopna regenerace

• Dermis – regenerace pouze v malé míře – náhrada tkáně jizvou, která postrádá elasticitu a pevnost škáry

• Kožní náhrady – zakrytí rány, stimulace regenerace dermis

Apligraf (Graftskin)

• Spodní vrstva tvořena kolagenem a lidskými fibroblasty (kožní buňky), které produkují ECM

• Horní vrstva tvořena lidskými keratinocyty, které dávají vzniknout epidermis

• Neobsahuje cévy, vlasové folikuly, melanocyty, potní žlázy

• Léčba diabetických vředů

www.apligraf.com

http://www.apligraf.com/http://www.apligraf.com/

Etické problémy

• Transplantace – autologní štěpy, allogenní, xenogenní

• Umělé implantáty

• Tkáňové inženýrství

• Rozhodnutí o nejlepší možné léčbě

• Rozhodující faktory: stav pacienta, věk→zvážení přínosu/risku

Morální principy

1. Nezávislost – možnost svobodné volby

2. Prospěšnost

3. Spravedlnost a rovnoprávnost

Legislativa v ČR

• Transaplantační zákon č.285/2002 Sb.

• Zákon o lidských tkáních a buňkách č.296/2008 Sb.

• Kontrola: SÚKL

• Předpokládaný souhlas

• Národní registr osob odmítající dárcovství orgánů