Volné radikály a antioxidanty
• Jak poznáme volný radikál?
• Reaktivní formy kyslíku a dusíku
• Jsou volné radikály vždy pohromou?
• Co je to oxidační stres?
• Co je to antioxidant? Které známe?
• Jak umíme oxidační stres kvantifikovat?
• Onemocnění spojená s oxidačním stresem
Volný radikál
Atom: proton, neutron, elektronový obal (orbital)
Radikál: obsahuje volný nepárový elektron v zevním orbitalu (může to být atom i molekula, neutrál či ion) homolytické štěpení kovalentní vazby
• většina biomolekul nejsou radikály
Jak se vyvíjel zájem o radikály ?
• chemik30. léta - předpověď existence superoxidu
• biochemik60. léta - superoxiddismutasa (SOD)
• lékařradikálové metabolity poškozují biomolekuly
Radikálová reakce
Radikál: snaha o spárování elektronů, většinou značná reaktivita
Obecně tři stadia
• iniciace
• propagace
• terminace
ROS (reactive oxygen species)
volné radikály
superoxid, O2 · -
hydroxylový radikál, OH ·
peroxyl, ROO ·
alkoxyl, RO ·
hydroperoxyl, HO2 ·
nejsou volnými radikály
peroxid vodíku, H2O2
(Fentonova reakce)
kyselina chlorná, HClO
ozon, O3
singletový kyslík, 1O2
RNS (reactive nitrogen species)
volné radikály
oxid dusnatý, NO .
oxid dusičitý, NO2 .
nejsou volnými radikály
nitrosyl, NO+
kyselina dusitá, HONO
oxid dusitý, N2O3
oxid dusičitý, N2O4
peroxynitrit, ONOO -
alkylperoxinitrit, ROONO
Odkud se volné radikály berou?
hlavní producenti ROS : membránově vázané enzymy popř. koenzymy flavinové struktury, hemové koenzymy, enzymy s Cu v aktivním centru
1. respirační řetězec mitochondrií : především superoxid a následně H2O2
• cca 1- 4% O2 vstupujícího do resp. řetězce (hlavně komplexy I a III)
Odkud se volné radikály berou? II
2. endoplazmatické retikulum
vznik superoxidu (cytochrom P- 450)
3. specializované buňky (leukocyty, makrofágy)
produkce superoxidu NADP-oxidasou
4. oxidace hemoglobinu na methemoglobin
(erytrocyt je „nabit“ antioxidanty)
Funkce volných radikálů ve zdravém organismu
Nástroj oxidas a oxygenas
• cytochromoxidasa (toxické meziprodukty, H2O2 a superoxid, vázány na enzymu)
• monoxygenasy (oxygenasy se smíšenou funkcí) - aktivují O2 v ER jater nebo v mitochondriích nadlevin; hydroxylace
Funkce volných radikálů ve zdravém organismu II
ROS a RNS proti bakteriím
• enzymový komplex NADPH-oxidasa leukocytů a makrofágů
• myeloperoxidasa - katalýza reakce
H2O2 + Cl- + H+ = HClO + H2O
Funkce volných radikálů ve zdravém organismu III
• signální molekulyprimární posel sekundární posel info síť
• redoxní stav buňky ovlivňuje funkci této sítě
• redoxní stav: kapacita antioxidačního systému, dostupnost redukčních ekvivalentů, intenzita oxidační zátěže (RONS)
ROS: sekundární poslové
Imunitní ochrana vs.regulace
masivní produkce ROS jako nástroj imunitní ochrany
x
indukce změn nízkých koncentrací ROS, jež jsou pravděpodobně regulačním
mechanismem
Antioxidační ochranný systémTři typy ochrany
zábrana tvorby nadměrného množství RONS
• záchyt a odstranění radikálů (lapače, vychytávače, zhášeče)
• reparační mechanismy poškozených biomolekul
Přehled antioxidantů a vychytávačů VR
1. Endogenní antioxidancia
• enzymová (cytochrom c, SOD, GSHPx, katalasa)
• neenzymová - membránová ( -tokoferol, -karoten,
koenzym Q 10)- nemembránová (askorbát, uráty,
transferin, bilirubin)
Přehled antioxidantů a vychytávačů VR II
2. Exogenní antioxidancia
• inhibitory vzniku VR (regulace aktivit enzymů)
• scavengery vzniklých VR (enzymy, neenzymy)
• stopové prvky (Se, Zn)
Enzymové antioxidační systémy
Superoxiddismutasa (EC 1.15.1.1, SOD)
2O2. - + 2H+ H2O2 + O2
SOD - téměř ve všech aerobních organismech
tři druhy - různé kofaktory (vždy metal atom)
indukce při vyšší tvorbě superoxidu
Superoxiddismutasa
Mn 2+ SOD (SOD1)
tetramer
matrix mitochondrie
menší stabilita než Cu, Zn - SOD
fylogeneticky mladší
Superoxiddismutasa
Cu 2+/Zn 2+ SOD (SOD 2)
dimer, Cu = redoxní centrum
cytosol, intermitochondriální prostor
hepatocyt, mozek, erytrocyt
vysoká stabilita, katalýza při pH 4,5-9,5
Glutathionperoxidasy
odstraňují intracelulární hydroperoxidy a H2O2
2 GSH + ROOH GSSH + H2O + ROH
• cytosolová GSH - glutathionperoxidasa (EC 1.11.1.9, cGPx)
• extracelulární GSH - glutathionperoxidasa (eGSHPx)
• fosfolipidhydroperoxid GSH - peroxidasa (EC 1.11.1.12, PHGPx)
Katalasa
(EC 1.11.1.6, KAT)
2 H2O2 2 H2O + O2
inaktivace H2O2 : peroxisomy a mitochondrie hepatocytu, cytoplasma erytrocytu
tetramer obsahující Fe, přítomnost NADPH
Vysokomolekulární endogenní antioxidanty
• transferin
• feritin
• haptoglobin
• hemopexin
• albumin
Nízkomolekulůrní endogenní antioxidanty IAskorbát (vitamin C)
syntéza kolagenu
přeměna dopaminu na noradrenalin
redukční činidlo
vstřebávání železa
antioxidační účinek = redukce O2
· - , OH ·, ROO·, HO2 ·
regenerace tokoferylového radikálu
prooxidant
Alfa-tokoferol a vitamin E
antioxidant membrán
produkuje hydroperoxidy, které zneškodňuje GSHPx
Ascorbic acid a její metabolity
Nízkomolekulární endogenní antioxidanty II
• ubichinon (koenzym Q)
přenašeč elektronů v dýchacím řetězci
tlumí radikálové rekce ve spolupráci s tokoferolem
• karotenoidy, -karoten, vitamin A
odstranění radikálů v lipidech
Nízkomolekulůrní endogenní antioxidanty III
• glutathion (GSH, GSSG)
ve všech savčích buňkách (1-10 mmol/l)
významný redox pufr
2 GSH GSSG + 2e- + 2H+
likviduje ROS, stabilizuje v redukované SH- sk., regeneruje tokoferyl a askorbát
substrát glutathionperoxidas
Nízkomolekulůrní endogenní antioxidanty IV
• kyselina lipoová (lipoát)
kofaktor PDH
regenerace tokoferylu, askorbátu
• melatonin
hormon hypofýzy (regulace spánkového cyklu)
lipofilní; vychytávač hydroxylových radikálů
Nízkomolekulůrní endogenní antioxidanty V
• kyselina močová (urát) - odpadní látka? nejhojnější antioxidant plasmy, významná reabsorpce, vychytávání RO. , HClO, vazba Fe, Cu
• bilirubin - inhibice lipoperoxidace
• flavonoidy - chelatace Fe, antikarcinogenní a protizánětlivé účinky
Stopové prvky ovlivňující VR
Selenovlivňuje resorpci vit. E, součást selenoproteinů Se = nedostat. imunitní odp.., hemolýza erytrocytů, syntéza methemoglobinu
Zinekstabilizace buněčných membránzvýšení imunitní odpovědi, antagonista Fe
Oxidační stres
Při porušení rovnováhy mezi vznikem a odstraňováním RONS nastává tzv.
oxidační stres
Rovnováha může být porušena na obou stranách!!
Poškození lipidů - atak na nenasycené MK
Poškození
• ztráta násobných vazeb
• vznik reaktivních metabolitů (aldehydy)
Důsledek
• změna fluidity propustnosti membrán
• vliv na membránově vázané enzymy
Peroxidace kyseliny linolenové
Poškození proteinů
Poškození
• agregace a síťování,• fragmentace a štěpení• reakce s hemovým
železem• modifikace funkčních
skupin
Důsledek
• změny transportu iontů
• změny aktivity enzymů
• proteolýza
Poškození DNA
Poškození
• štěpení cukerného kruhu
• modifikace bází• zlomy řetězce
Důsledek
• mutace• translační chyby• inhibice proteosyntézy
Jak umíme oxidační stres kvantifikovat ?
Detekce volných radikálů
• poměrně náročné vzhledem vzhledem k fyz. chem. vlastnostem
Měření produktů oxidačního stresu
• jednodušší, široká paleta markerů oxidačního stresu
Markery oxidačního stresu
Posouzení lipoperoxidace:
malondialdehyd (MDA), konjugované dieny, izoprostany
Posouzení poškození proteinů :
proteinové hydroperoxidy
Posouzení poškození DNA :
stanovení modifikovaných nukleosidů
Stanovení antioxidantů
askorbát
tokoferol
SOD
GSHPx
glutathion
Onemocnění spojená s oxidačním stresem
Neurologická
Alzheimerova choroba
Parkinsonova choroba
Endokrinní
Diabetes
Gastrointestinální
Akutní pankreatitida
Onemocnění spojená s oxidačním stresem
Vaskulární
Ateroskleroza
Ostatní
Obezita
Transplantace orgánů
Literatura
Štípek Stanislav a kol.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci, Grada, 2000
Free radicals and antioxidant protocols edited by Armstrong D., Methods in Molecular biology, volume 108, HUMANA PRESS, Toronto, New Yersey, 1998
