Editor: Št tina J., urda L.

Vydavatel: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická 5; 166 28 Praha 6

Rok vydání: 2008

ISBN 978-80-7080-695-1

3

OBSAHVýsledky 12. ro níku Celostátních p ehlídek sýr

urda Ladislav, Št tina Ji í................................................................................................................ 13 Optimalizace designu sýra s využitím conjoint analýzy Grosová Stanislava, Kutnohorská Olga ............................................................................................. 21 Ov iarstvo na Slovensku Keresteš Ján........................................................................................................................................ 27 Variabilita sy itelnosti v bazénových vzorcích kravského mléka P ibyla Lubomír, ejna Vladimír, Chládek Gustav........................................................................... 33 Rýchla identifikácia patogénov mastitíd, záruka výroby kvalitného surového mlieka ako suroviny pre výrobu syrov Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína ............................................................................................. 39 Skúsenosti s aplikáciou požiadaviek NK (ES) . 1664/2006 na hodnotenie mikrobio-logickej kvality surového ov ieho mlieka použitím alternatívnej skúšobnej metódy Tomáška Martin, Hofericová Margita, Kološta Miroslav.................................................................. 43 Možnosti zdokonalení postupu vysokodoh ívaných sýr s využitím biochemických charakteristik používaných MK.

erný Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasni ková Eva, Pufrová Eva, Švandrlík Zden k .................. 49 Metody pro stanovení bun né lýze bakterií mlé ného kvašení Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Šviráková Eva ................................................................... 53 Výb r vhodných hydrokoloid pro stabilizaci jakosti termizovaných smetanových sýrTykvartová Dagmar, Hrab Jan, Patrovský Ji í ................................................................................. 58 Vliv rozdílného sterila ního záh evu s konstantním smrtícím ú inkem na jakost tavených sýrBu ka František, Lazárková Zuzana, Bu ková Leona, Holá Felix, Krá mar Stanislav, Hrab Jan............................................................................................................................................ 64 Porovnání organoleptických a fyzikáln -chemických vlastností nápoj na bázi syrovátky Kou imská Lenka, Legarová Veronika, Dvo áková Blanka.............................................................. 71 HPLC stanovenie antimikrobiálnych látok produkovaných baktériami mlie nehokysnutiaGreif Gabriel, Kraj ová Eva, Greifová Mária, Karovi ová Jolana.................................................... 75 Antimikrobiálny ú inok kyseliny fenyl mlie nej Kraj ová Eva, Greifová Mária, Greif Gabriel, Schmidt Štefan ........................................................ 81 Minoritní složky mlé ného tuku, kyselina 11-cyklohexylundekanová zvláštŠmidrkal Jan, Karlová Tereza, Filip Vladimír, Zárubová Markéta ................................................... 85 Možnosti konzervace mlé ných výrobk nativními mastnými kyselinami a jejich derivátyKarlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír ....................................................... 89 Vplyv teploty a aktívnej kyslosti na rast Geotrichum candidum v mlieku a v mlie nom agare Hudecová Anna, Liptáková Denisa, Valík ubomír, Medve ová Alžbeta....................................... 94 Výskyt bifidobakterií v mate ském mléce Rada Vojt ch, Nevoral Ji í, Flajšmanová Kate ina, Ro ková Šárka, Šmehilová Martina, Tománková Eva ............................................................................................................................... 100 Inhibi ní ú inek lysozymu na bifidobakterie používané p i výrob mlé ných kysaných výrobkŠmehilová Martina, Ro ková Šárka, Rada Vojt ch, Tománková Eva ............................................ 103 P ežívání bifidobakterií v kravském mléceTománková Eva, Homutová Iva, Šmehilová Martina, Dubná So a, Rada Vojt ch ....................... 107

4

Plakátová sd lení:

Sledování výskytu psychrotrofních mikroorganism v syrovém mléce Hoferková Petra, Košinová Marcela, Burdychová Radka ............................................................... 115

Stanovenie mezofilných a psychrotrofných aeróbnych sporulujúcich mikroorganizmov v surovom kravskom mliekuKirchnerová Katarína, Foltys Vladimír ........................................................................................... 119

Sledování mikrobiologické kvality kozích sýr z tržní sít jihomoravského kraje Cupáková Šárka, Necidová Lenka, Dušková Marta, Belušíková Zora, Janštová Bohumíra, Pospíšilová Markéta, Karpíšková Renáta ........................................................................................ 123

Sledování r stu a produkce enterotoxin Staphylococcus aureus b hem technologie výroby erstvých sýrKarpíšková Renata, Necidová Lenka, Pospíšilová Markéta, Š ástková-Belušíková Zora,Dušková Marta................................................................................................................................. 127

Rast mikroorganizmov po as modelových výrob hrudkových syrov zo surového ov iehoa kozieho mlieka Medve ová Alžbeta, Liptáková Denisa, Valík ubomír, Janov íková Lenka, Hudecová Anna.... 131

Antimikrobiální aktivita laktobacil a laktokokN me ková Irena, Dráb Vladimír, Kle acká Jana, Vilímková Miroslava, Roubal Petr, Rohacká Hana ................................................................................................................................. 137

Antibakteriální ú inky fosfátových tavicích solí na vybrané mikroorganizmy kontaminující tavené sýry Bu ková Leona, Pleva Pavel, Bu ka František ............................................................................... 142

Antifungální aktivita kyseliny octové a mlé né na plíse rodu FusariumŠantinová Eva, Chumchalová Jana, Ondrá ková Iva, Plocková Milada ......................................... 148

Využitie metódy ramp (randomly-amplified microsatellite polymorphism) na typizáciu baktérií mlie neho kysnutia zo slovenskej bryndze Chebe ová Viera, Bertaová Gabriela, Kuchta Tomáš, Pangallo Domenico ................................... 152

PCR-typizácia pseudomonád izolovaných z ov iarskych prevádzok Kostolníková Mária, Bertaová Gabriela, Pangallo Domenico, Kore ová Janka ............................ 156

Výskyt bakterií mlé ného kvašení v pasterovaných vaje ných hmotách Miller Petr, Ku erová Kate ina, Chumchalová Jana, Míková Kamila ............................................ 160

Sledování procesu fermentace sladké syrovátky a sm si sladké syrovátky a mléka Legarová Veronika, Kou imská Lenka............................................................................................ 163

Sledování po tu probiotických mikroorganism ve fermentovaných mlé ných výrobcíchBurdychová Radka .......................................................................................................................... 168

Charakteristika rastu a produktov metabolizmu Lactobacillus reuteri po as fermentácie glycerolu Greifová Mária, Kraj ová Eva, Greif Gabriel, Pagurko Anton, Schmidt Štefan, Staruch Ladislav .............................................................................................................................. 171

Detekce bun né lyze u laktokokŠviráková Eva, Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Plocková Milada .................................... 177

Autolýza Lactobacillus helveticus 121 Ondrá ková Iva, Ku erová Kate ina, Šantinová Eva, Plocková Milada ......................................... 183

5

Vliv po tu somatických bun k na vybrané parametry mléka dojnic eského strakatého plemeneSkýpala Martin, Falta Daniel, Chládek Gustav................................................................................ 187

Vliv polymorfismu genu CSN2 na po et somatických bun k u eského strakatého a holštýnského mlé ného skotu. Sojková K., íha J., Manga I., Dvo ák J.......................................................................................... 193

Vliv sy idla na výt žnost sýr eidamského typu Ros lek Martin, Kou imská Lenka, Legarová Veronika, T ma Št pán.......................................... 200

Vyhodnocení výt žnosti eidamských sýrŠustová Kv toslava ......................................................................................................................... 203

Kontinuální, enzymová p íprava galaktooligosacharid s áste nou optimalizací doby zdržení v membránovém reaktoru Hellerová Klára, urda Ladislav ..................................................................................................... 207

Využití blízké infra ervené reflektan ní spektroskopie v analýze kozích sýrDra ková Michaela, Janštová Bohumíra, P idalová Hana, Vozková Lenka, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka.................................................................................................................................. 212

Stanovení vitamínu B2 v mléce Nohálová Zuzana, Kramá ová Daniela, Lazárková Zuzana, Hoza Ignác........................................ 217

Separace laktoferinu za využití monolitické kolony s následnou spektrofotometrickou detekcíHorna Aleš, Zítka Ond ej, Adam Vojt ch, Zeman Ladislav, Doležal Petr, Kizek René................. 221

T kavé látky houbových smetanových omá ekPudil František, Jenknerová Jana, Janda Václav.............................................................................. 227

Stupe poznania trhových druhov mlieka frekventantami špecializovaného senzorického laboratória Ma a Pavel, Baranová Mária, Sabolová Gabriela, Ma ová Jana..................................................... 233

Senzorické hodnocení jogurt a jogurtových drink s jahodovou p íchutíŠedivá Alena, Panovská Zde ka, Lukešová Dobromila .................................................................. 236

Senzorické hodnocení sýr a sýrových analogPanovská Zde ka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila ................................................................. 242

Využití spektrometrie pro hodnocení barvy mlé ných výrobkB enek Petr, J zl Miroslav, Šustová Kv toslava ............................................................................. 248

Hodnocení reologických vlastností eidamských sýrLužová Tá a, Šustová Kv toslava, Povolná Šárka, Nedomová Šárka, Blašková Veronika ........... 251

Možnosti využití nízkoesterifikovaného pektinu jako substituentu fosfátových tavicích solí ve výrob tavených sýr

erníková Michaela, Bu ka František, Pospiech Matej, Tremlová Bohuslava, Pavlínek Vladimír, B ezina Pavel ................................................................................................................................... 256

Vliv p ídavku pektinu a vybraných cukr na viskoelastické a senzorické vlastnosti tavených sýrMack Ivana, Bu ka František, Pavlínek Vladimír, Hrab Jan....................................................... 262

Vliv karagenan na fyzikální vlastnosti mléka a smetany Ková ová Renáta, Št tina Ji í, Loužecký Tomáš ........................................................................... 268

Rejst ík autor .................................................................................................................................. 275

6

7

CONTENS

Results of 12th National Quality Competition for Cheese. urda Ladislav, Št tina Ji í................................................................................................................ 13

Cheese design optimisation with use of conjoint analysis Grosová Stanislava, Kutnohorská Olga ............................................................................................. 21 The sheep farming in Slovakia Keresteš Ján........................................................................................................................................ 27 Variability of rennet coagulation time in bulk tank milk samples in cattle P ibyla Lubomír, ejna Vladimír, Chládek Gustav........................................................................... 33 Rapid identification of mastitis pathogens – guarantee of good quality raw milk production as raw material for chees production Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína ............................................................................................. 39 Experiences with application of requirements of CR (EC) 1664/2006 for assessment of microbiological quality of raw sheep milk by using routine testing method Tomáška Martin, Hofericová Margita, Kološta Miroslav.................................................................. 43 Application of biochemical characteristic pure lactic acid cultures for innovation high scalded cheese process.

erný Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasni ková Eva, Pufrová Eva, Švandrlík Zden k .................. 49 Methods for determination of cell lysis of lactic acid bacteria Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Šviráková Eva ................................................................... 53 The selection of suitable hydrocolloids for the quality stabilisation of thermized cream cheeseTykvartová Dagmar, Hrab Jan, Patrovský Ji í ................................................................................. 58 Influence of different sterilation mode with the same lethal effect on processed cheese qualityBu ka František, Lazárková Zuzana, Bu ková Leona, Holá Felix, Krá mar Stanislav, Hrab Jan............................................................................................................................................ 64 Comparison of organoleptic and physiochemical properties of whey based drinks Kou imská Lenka, Legarová Veronika, Dvo áková Blanka.............................................................. 71 HPLC determination of antimicrobial substances produced by lactis acid bacteriaGreif Gabriel, Kraj ová Eva, Greifová Mária, Karovi ová Jolana.................................................... 75 Antimicrobial effect of phenyllactic acid Kraj ová Eva, Greifová Mária, Greif Gabriel, Schmidt Štefan ........................................................ 81 Minor Components of Milk Fat, particularly 11-Cyclohexylundecanoic Acid Šmidrkal Jan, Karlová Tereza, Filip Vladimír, Zárubová Markéta ................................................... 85 Preservation possibilities of native fatty acids and their derivatives in dairy products Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír ....................................................... 89 The Effect of Temperature and pH on the Growth of Geotrichum candidum in Milk and on the Skim Milk AgarHudecová Anna, Liptáková Denisa, Valík ubomír, Medve ová Alžbeta....................................... 94 Occurence of bifidobacteria in human milk Rada Vojt ch, Nevoral Ji í, Flajšmanová Kate ina, Ro ková Šárka, Šmehilová Martina, Tománková Eva ............................................................................................................................... 100 Inhibition effect of lysozyme on bifidobacteria isolated from fermented milk products Šmehilová Martina, Ro ková Šárka, Rada Vojt ch, Tománková Eva ............................................ 103 Survival of bifidobacteria in cow milk Tománková Eva, Homutová Iva, Šmehilová Martina, Dubná So a, Rada Vojt ch ....................... 107

8

Posters:

Monitoring occurence of psychrotrophic microorganisms in raw milk Hoferková Petra, Košinová Marcela, Burdychová Radka ............................................................... 115

Estimation of mesophylic and psychrotrophic aerobe sporulating microorganisms in raw cow's milk Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír ........................................................................................... 119

Monitoring of microbial quality of goat’s cheese from the retail market in the South MoraviaCupáková Šárka, Necidová Lenka, Dušková Marta, Belušíková Zora, Janštová Bohumíra, Pospíšilová Markéta, Karpíšková Renáta ........................................................................................ 123

Tracing of Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in soft cheeses during their technological processing Karpíšková Renata, Necidová Lenka, Pospíšilová Markéta, Š ástková-Belušíková Zora,Dušková Marta................................................................................................................................. 127

Growth of microorganisms during the modelled manufacture of lump cheese produced from ewe's and goat raw milk Medve ová Alžbeta, Liptáková Denisa, Valík ubomír, Janov íková Lenka, Hudecová Anna.... 131

Antimicrobial activity of lactobacilli and lactococci N me ková Irena, Dráb Vladimír, Kle acká Jana, Vilímková Miroslava, Roubal Petr, Rohacká Hana ................................................................................................................................. 137

Antibacterial effect of phosphate-type emulsifying agents against selected microorganisms in processed cheeses Bu ková Leona, Pleva Pavel, Bu ka František ............................................................................... 142

Antifungal activity of acetic and lactic acid against Fusarium strains Šantinová Eva, Chumchalová Jana, Ondrá ková Iva, Plocková Milada ......................................... 148

Application of ramp (randomly-amplified microsatellite polymorphism) method for typing of lactic acid bacteria from slovakian bryndza cheese Chebe ová Viera, Bertaová Gabriela, Kuchta Tomáš, Pangallo Domenico ................................... 152

PCR – Typing of Pseudomonas isolates obtained from sheep plants Kostolníková Mária, Bertaová Gabriela, Pangallo Domenico, Kore ová Janka ............................ 156

Occurrence of lactis acid bacteria in pasteurized liquid whole eggs Miller Petr, Ku erová Kate ina, Chumchalová Jana, Míková Kamila ............................................ 160

Monitoring of fermentation process of cheese whey and mixtures of cheese whey and milk Legarová Veronika, Kou imská Lenka............................................................................................ 163

Selective enumeration and monitoring of probiotic counts in fermented milks Burdychová Radka .......................................................................................................................... 168

Characterization of growth and metabolite production of Lactobacillus reuteri during glycerol fermentation Greifová Mária, Kraj ová Eva, Greif Gabriel, Pagurko Anton, Schmidt Štefan, Staruch Ladislav .............................................................................................................................. 171

Cell lysis detection in lactococci Šviráková Eva, Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Plocková Milada .................................... 177

Autolysis of Lactobacillus helveticus 121 Ondrá ková Iva, Ku erová Kate ina, Šantinová Eva, Plocková Milada ......................................... 183

9

The influence of somatic cell count on chosen parameters of Czech Pied Cattle Skýpala Martin, Falta Daniel, Chládek Gustav................................................................................ 187

Effects of CSN2 gene on somatic cells count in Czech Spotted and Holstein dairy cows Sojková K., íha J., Manga I., Dvo ák J.......................................................................................... 193

The effect of rennet on the yield of Edam cheese production Ros lek Martin, Kou imská Lenka, Legarová Veronika, T ma Št pán.......................................... 200

Evaluation of yield of Edam cheese Šustová Kv toslava ......................................................................................................................... 203

Continual enzymatic preparation of galactooligosaccharides with partial optimalisation of residence time in membrane reactor Hellerová Klára, urda Ladislav ..................................................................................................... 207

Use of near-infrared reflectance spectroscopy for goat’s cheese analysis Dra ková Michaela, Janštová Bohumíra, P idalová Hana, Vozková Lenka, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka.................................................................................................................................. 212

Determination of vitamin B2 in milk Nohálová Zuzana, Kramá ová Daniela, Lazárková Zuzana, Hoza Ignác........................................ 217

Separation of lactoferrin by using of monolithic column coupled with spectrometric detectionHorna Aleš, Zítka Ond ej, Adam Vojt ch, Zeman Ladislav, Doležal Petr, Kizek René................. 221

Volatile components of mushroom cream sauces Pudil František, Jenknerová Jana, Janda Václav.............................................................................. 227

Level of knowladge of market types of milk by certificated participants of special sensorial laboratory Ma a Pavel, Baranová Mária, Sabolová Gabriela, Ma ová Jana..................................................... 233

Sensory evaluation of strawberry yogurts and yogurt drinks Šedivá Alena, Panovská Zde ka, Lukešová Dobromila .................................................................. 236

Sensory evaluation of cheeses and cheese analogues Panovská Zde ka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila ................................................................. 242

Spectrometric analysing of colour of some dairy products B enek Petr, J zl Miroslav, Šustová Kv toslava ............................................................................. 248

The evaluation of rheological qualities of Edam cheeses Lužová Tá a, Šustová Kv toslava, Povolná Šárka, Nedomová Šárka, Blašková Veronika ........... 251

Possibilities usage low-esterify pectin as a substituent phosphates emulsifying salts in production processed

erníková Michaela, Bu ka František, Pospiech Matej, Tremlová Bohuslava, Pavlínek Vladimír, B ezina Pavel ................................................................................................................................... 256

The effect of pectin and selected low molecular saccharides on viscoelastic and sensory properties of model processed cheeseMack Ivana, Bu ka František, Pavlínek Vladimír, Hrab Jan....................................................... 262

The influence of carrageenans on physical properties of milk and cream Ková ová Renáta, Št tina Ji í, Loužecký Tomáš ........................................................................... 268

Author index .................................................................................................................................... 275

10

Celostátní p ehl ídky sýr

13

VÝSLEDKY 12. RO NÍKU CELOSTÁTNÍCH P EHLÍDEK SÝRurda Ladislav, Št tina Ji í

Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

Results of 12th National Cheese Competition

Summary:The 12th National Cheese Competition was organized traditionally by Department of Dairy and Fat Technology (ICT Prague), Czech-Moravian Dairy Association and Czech Chemical Society on the 17 and 23 of January 2008 in Prague. 56 hard, semi-hard, mould, white, fresh and processed cheeses of 16 producers competed in this year. Competitive samples of cheeses were divided into 8 categories and evaluated by a commission of experts and also by a public commission. Two commissions of experts formed from three or four members assessed each cheese. More than 175 evaluators worked in public commissions. The cheeses were evaluated according to their taste and aroma and their consistence and appearance. Cheeses from abroad (11 samples) were evaluated separately. The results are summarized in tables. Extraordinary cheeses were presented on an exhibition within the competition. The National Cheese Competition was accompanied by a conference called „Milk and Cheeses“ with a scientific programme involving 18 lectures and 34 poster presentations.

Ve dnech 17. a 23. ledna se v Praze uskute nil 12. ro ník Celostátních p ehlídek sýr ,organizovaný Ústavem technologie mléka a tuk Vysoké školy chemicko-technologické v Praze ve spolupráci s eskomoravským svazem mlékárenským a Odbornou skupinou pro potraviná skou a agrikulturní chemii eské spole nosti chemické.

P ejímka vzork a odborné hodnocení se konalo 17. ledna. Do hodnocení bylo za azeno56 vzork od 16 tuzemských výrobc ; mezi zastoupenými výrobci sýr letos bohužel chyb la Madeta, která pat ila k nejúsp šn jším ú astník m všech p edchozích 11 ro ník . Kromtuzemských sýr bylo hodnoceno 11 vzork zahrani ních, které poskytlo 5 dovozc sýr . Sýry byly rozd leny do 8 kategorií. Nov vyhlášenou kategorií byly tavené sýry ochucené. Vzhledem nedostate nému po tu vzork bylo nutné n které vyhlášené kategorie slou it – k sýr m s tvorbou ok a typu moravský bochník byly p ipojeny ochucené polotvrdé sýry z p vodn vyhlášené kategorie specialit. Do slou ené kategorie ostatních m kkých sýr byly za azeny všechny plís ové sýry, ochucené m kké sýry a sýry s mazem na povrchu. Po této úprav byly kategorie rovnom rnobsazeny 6 až 8 vzorky. Ozna ení kategorií a po ty sýr v jednotlivých kategoriích jsou uvedeny v tab. I, zú astn né sýrárny a p ihlašovatelé sýr jsou pak v tab. II.

P i odborném hodnocení posuzují každý sýr 2 paralelní komise, každá má nezávislého p edsedu a t i zástupce výrobc . V p ípad kategorií hodnocených neanonymn (nap . u erstvých a termizovaných sýr ) je komise posílena o jednoho nezávislého odborníka. Sýry se posuzují ve dvou znacích: vzhled a konzistence (ve výsledném hodnocení tvo í 40 %) a chu a v n (60 %). Tuzemským sýr m bylo na základ tohoto hodnocení ud leno celkem 20 diplom . Po et diplomv jednotlivých kategoriích závisí na po tu p ihlášených vzork – na jeden diplom musí být v kategorii alespo 3 sýry, diplomy získávají první t i sýry v po adí. V kategoriích, které zahrnují sýry r zných typ , není ur ováno po adí, ale diplomy byly ud leny vzork m s hodnocením vyšším než 85 bod . V kategorii ochucených tavených sýr byla ud lena dv druhá místa kv li rovnosti bod .

14

Tabulka I Rozd lení sýr do kategorií. Kategorie Po et vzork Eidamské sýry 30 % t.v s. 7 Eidamské sýry 40-50 % t.v s. 8 Ostatní polotvrdé a tvrdé sýry 6 Uzené sýry 7

erstvé a termizované sýry neochucené 6 Ostatní m kké sýry 8 Tavené sýry neochucené 8 Tavené sýry ochucené (uzené maso, šunka) 6

Celkem 56

Tabulka II P ehled p ihlašovatel sýr a jejich zastoupení v jednotlivých kategoriích.

Kategorie1 2 3 4 5 6 7 8

eská republikaA.W. s.r.o., Pravé olomoucké tvar žky, Lošti 1 1Agricol s.r.o., Poli ka 2 1 1BEL Sýry esko a.s., Želetava 5 1 2 2Jarom ická mlékárna a.s. 4 1 2 1KROMILK s.r.o., Krom íž 3 2 1MILTRA B s.r.o., M ste ko Trnávka 4 1 1 2Mlékárna Klatovy a.s. 5 1 1 1 1 1Mlékárna Otínoves s.r.o. 1 1Mlékárna Polná s.r.o. 4 1 1 1 1Moravia Lacto a.s., Jihlava 3 1 1 1PLASTCOM, a.s., mlékárna P íšovice 7 2 1 3 1Polabské mlékárny a.s., Pod brady 4 1 1 2Povltavské mlékárny, a.s., Sedl any 3 1 2Pribina, s.r.o., P ibyslav 2 2TANY, s.r.o., Nýrsko 3 2 1TPK, s.r.o., Hodonín 5 3 2Vzorky z R celkem 56 7 8 6 7 6 8 8 6Dovozce zahrani ních sýrNIKA s.r.o. 4BEL Sýry esko a.s., Praha 1Bongrain Czech Management Services 2Lactalis CZ, s.r.o. 2SEAFOOD s.r.o. 2Sýry z dovozu celkem 11

Po et sýr

P ihlašovatel

Ve ejné hodnocení se konalo 23. ledna v kongresovém sále Masarykovy koleje. P ehlídky osobn zahájil rektor VŠCHT Doc. Ing. Josef Koubek, CSc., pod jehož záštitou se p ehlídky konají. Shoda mezi odborným a ve ejným hodnocením je pom rn dobrá. Nejv tší rozdíly byly zaznamenány v kategorii erstvých sýr , áste n i u tavených sýr . Rozd lení sýrdo kvalitativních kategorií v odborném i ve ejném hodnocení je uvedeno v tab. III, ze které je vid t,že 59 % vzork bylo hodnoceno odbornými komisemi jako výborné nebo velmi dobré, ve ve ejném

15

hodnocení to bylo 64 %. Na rozdíl od lo ského ro níku, kdy nebyl žádný sýr hodnocen jako výborný (t. j. v rozmezí 90 až 100 bod ), letos odborné komise za adily do této kvalitativní kategorie 4 vzorky. Pouze jeden sýr byl podpr m rný v odborném hodnocení. Porovnání etností hodnocení je uvedeno na obr. 1, v obou komisích se nej ast ji objevilo hodnocení mezi 75 a 80 body. Pr m rné hodnocení se lišilo nepatrn (76,95 a 75,45 bodu). Medián je pro odborné hodnocení je 80 bod , pro ve ejné se rozdíl v distribuci odpov dí projevil snížením mediánu na 78 bod .

Celkové výsledky p ehlídek jsou shrnuty v tab. IV, hodnocení vzork z dovozu je uvedeno v tab. V. Tu n jsou vyzna ené vzorky, které obdržely diplom.

Tabulka III Rozd lení sýr do kvalitativních kategorií

0

0

36

64

0

Ve ejnéhodnocení

[% vzork ]

< 30

30 - 49

50 - 74

75 - 89

90 - 100

Bodovéhodnocení

0

2

39

52

7

Odbornéhodnocení[% vzork ]

Kvalitativní kategorie

Nevyhovující

Podpr m rný (min. 30 bod od každé komise)

Pr m rný (standardní kvalita)

Velmi dobrý

Výborný (ideální typ)

0

0

36

64

0

Ve ejnéhodnocení

[% vzork ]

< 30

30 - 49

50 - 74

75 - 89

90 - 100

Bodovéhodnocení

0

2

39

52

7

Odbornéhodnocení[% vzork ]

Kvalitativní kategorie

Nevyhovující

Podpr m rný (min. 30 bod od každé komise)

Pr m rný (standardní kvalita)

Velmi dobrý

Výborný (ideální typ)

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Bodové hodnocení

Rel

ativ

ní

etno

st [%

]

Hodnocení expert

Ve ejné hodnocení

Obr. 1. Porovnání relativních etností hodnocení expert a p i ve ejném hodnocení.

16

Tabulka IV Výsledky Celostátních p ehlídek sýr

tvs suš

[%] [%]

1 1 2 Eidam 30% PLASTCOM a.s., mlékárna P íšovice 30 50 80,7 6,0 24,1 78,6

2 1 Eidam 30% Agricol s.r.o. 30 50 72,7 6,4 32,4 87,3

3 4 Eidam 20% PLASTCOM a.s., mlékárna P íšovice 20 50 66,7 3,3 21,5 75,9

4 5 Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B s.r.o. 30 51 65,0 4,7 16,2 71,3

5 6 Sýr Eidam 30% Mlékárna Klatovy a.s. 30 50 59,3 1,3 13,7 67,8

6 7 Eidamský sýr 30% Jarom ická mlékárna a.s., st . M. Bud jovice 30 50 55,3 6,1 9,0 62,6

7 3 Eidamský sýr 30% Mlékárna Polná s.r.o. 30 52 53,7 6,5 23,6 78,4

2 1 1 Eidamský sýr 45% Mlékárna Polná s.r.o. 45 56 79,0 2,0 30,5 86,0

2 3 Eidamský blok 45% Jarom ická mlékárna a.s. 45 55 78,0 3,0 23,8 79,7

3 7 Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B s.r.o. 40 53 72,0 * 14,3 69,4

4 6 Eidamský sýr 45% Jarom ická mlékárna a.s., st . M. Bud jovice 45 55 71,7 7,2 14,9 69,9

5 2 Eidamský sýr Moravia Lacto a.s. 45 55 71,0 4,3 28,0 83,3

6 5 Sýr Eidam 45% Mlékárna Klatovy a.s. 45 56 60,0 7,2 17,2 71,3

7 4 Mandava bio sýr 40 % tvs Polabské mlékárny a.s. 40 54 54,0 * 19,3 74,0

8 8 Eidam 45% PLASTCOM a.s., mlékárna P íšovice 45 56 44,7 6,2 12,5 67,1

3 edar Agricol s.r.o. 45 57 85,3 3,6 14,6 81,4

Gaston oregano PLASTCOM a.s., mlékárna P íšovice 45 56 63,0 4,7 12,8 78,6

Gaston paprika a chilli PLASTCOM a.s., mlékárna P íšovice 45 56 71,3 1,7 13,1 78,8

Gaston pep a chilli PLASTCOM a.s., mlékárna P íšovice 45 56 56,7 5,1 10,9 75,3

Moravský blok Moravia Lacto a.s. 45 60 88,0 5,5 14,8 81,9

Moravský blok 45% Mlékárna Klatovy a.s. 45 62 91,0 2,0 15,3 82,2

4 1 1 Eidamský sýr uzený 45% Mlékárna Polná s.r.o. 45 56 84,7 2,6 17,3 81,9

2 3 Šuhaj MILTRA B s.r.o. 45 50 79,7 1,9 15,4 78,7

3 4 Uzený eidamský sýr Moravia Lacto a.s. 45 55 78,0 3,0 13,1 75,0

4 2 Uzený sýr Gouda 48 % Jarom ická mlékárna a.s., st . Želetava 48 55 77,0 4,5 16,7 80,3

5 7 Uzený sýr Eidam 40% Mlékárna Klatovy a.s. 40 55 70,7 2,8 9,0 68,4

6 5 Eidam uzený PLASTCOM a.s., mlékárna P íšovice 45 56 70,7 6,3 12,2 73,0

7 6 Eidamský salámový polotvrdý sýr uzený MILTRA B s.r.o. 40 53 69,3 2,6 11,3 71,3

5 1 4 erstvý sýr p írodní KROMILK s.r.o. 60 36 97,8 1,7 12,7 78,8

2 3 Lu ina Jogurtina Povltavské mlékárny a.s. 60 32 89,0 3,9 14,4 83,0

3 2 Maskar z Polné Mlékárna Polná s.r.o. 75 48 81,5 2,2 14,8 83,4

4 1 Gervais BEL Sýry esko a.s. 63 32 74,8 3,9 17,7 86,8

5 5 Krajanka KROMILK s.r.o. 70 37 72,5 3,3 12,4 80,1

6 6 Monticremo smetanové Polabské mlékárny a.s. 66 38 67,8 2,0 9,5 75,3

Odbornéhodnocení

Prm

rné

hodn

ocen

íIn

terv

al

spol

ehliv

osti

Nep

aram

etric

ké

hodn

ocen

íPr

mrn

ého

dnoc

ení

Ve ejné hodnocení

Výrobce (p ihlašovatel)

Kate

gorie

Poad

í ve

ejné

ho

hodn

ocen

í

Poad

í odb

orné

ho

hodn

ocen

í

Sýr

17

Tabulka IV Výsledky Celostátních p ehlídek sýr - pokra ování

tvs suš

[%] [%]

6 Král sýr Hermelín Maxi Pribina s.r.o. 50 46 89,8 5,0 16,6 85,4

Král sýr sametový Pribina s.r.o. 56 50 91,8 1,7 19,8 89,0

Monticremo a la Budapeš Polabské mlékárny a.s. 65 34 85,8 4,7 8,1 72,3

Monticremo se žampiony Polabské mlékárny a.s. 66 35 81,3 4,0 7,9 72,9

NIVA extra Mlékárna Otinoves s.r.o. 52 53 81,8 2,4 13,8 81,6

Pravé olomoucké tvar žky A.W. s.r.o., Pravé olomoucké tvar žky 2 33 83,0 3,1 13,2 80,6

Sedl anský Mod enín Povltavské mlékárny a.s. 56 53 82,5 1,9 16,1 84,7

Sedl anský Pepin Povltavské mlékárny a.s. 53 45 88,0 3,0 13,0 79,3

7 1 4 Matador smetanový BEL Sýry esko a.s. 50 38 84,5 4,4 20,7 77,3

2 1 Pribina 70% TPK s.r.o., mlékárna Hodonín 70 44 83,8 3,1 22,9 79,2

3 5 Maratonec TPK s.r.o., mlékárna Hodonín 55 43 82,8 5,1 19,4 75,2

4 6 TANY smetanový TANY s.r.o., Nýrsko 65 45 82,5 4,3 19,0 73,1

5 2 Smetanito smetanové BEL Sýry esko a.s. 67 47 82,5 4,6 22,4 79,2

6 3 TANY DELICATO TANY s.r.o., Nýrsko 70 48 77,0 2,7 22,2 78,0

7 7 Apetito Supercremo TPK s.r.o., mlékárna Hodonín 60 41 70,3 9,9 16,5 72,1

8 8 Tavený sýr lahodný 70g KROMILK s.r.o. 45 33 56,8 8,6 9,3 59,8

8 1 2 Uzený salámový tavený sýr se šunkou Mlékárna Klatovy a.s. 45 50 91,5 2,4 21,5 78,2

2 3 Smetanito se šunkou BEL Sýry esko a.s. 51 40 81,8 4,9 20,4 76,2

2 6 TANY šunkový TANY s.r.o., Nýrsko 50 38 81,8 5,5 13,0 67,3

4 5 Apetito šunka TPK s.r.o., mlékárna Hodonín 55 43 81,3 2,8 17,2 73,0

5 1 Pribina se šunkou TPK s.r.o., mlékárna Hodonín 55 40 81,0 3,8 23,0 79,3

6 4 Matador s klobásou BEL Sýry esko a.s. 40 33 78,0 6,5 19,3 74,7

Prm

rné

hodn

ocen

íIn

terv

al

spol

ehliv

osti

Odbornéhodnocení

Ve ejné hodnocení

Nep

aram

etric

ké

hodn

ocen

íPr

mrn

ého

dnoc

ení

Sýr Výrobce (p ihlašovatel)

Kate

gorie

Poad

í odb

orné

ho

hodn

ocen

í

Poad

í ve

ejné

ho

hodn

ocen

í

18

Tabulka V Výsledky Celostátních p ehlídek sýr – zahrani ní vzorky

Mod

us

Med

ián

Bryndza NIKA spol. s r.o. 48 44 2 2 6Ramzes NIKA spol. s r.o. 45 56 3 3 0NIKA blue Gold NIKA spol. s r.o. 50 50 2 2 5Urda NIKA spol. s r.o. 28 72 3 3 6Port Salut Le Fondant BEL Sýry esko a.s. 50 52 1 1 24Camembert de Campagne Lactalis CZ, s.r.o. 45 3 3 0Président la Bûche fondante Lactalis CZ, s.r.o. 45 1 1 21Chaumes Bongrain Czech Management Services 50 1 1 18Fol Epi Bongrain Czech Management Services 50 2 2 9Epoisses SEAFOOD s.r.o. 50 2 2 7Tomme Savoie SEAFOOD s.r.o. 50 2 2 6

Kvalitativní kategorie:1. Vynikající2. Výborný3. Velmi dobrý4. Pr m rný5. Podpr m rný

Návrhy na diplomy

Kvalitativní kategorie

Sýr Dovozce tvs suš.

K nejúsp šn jším sýrárnám na letošních p ehlídkách pat í Agricol s. r. o., Poli ka a Pribina s. r. o., P ibyslav, které m ly p ihlášeny po 2 vzorcích a oba získaly diplom. Po dvou diplomech obdržely také BEL Sýry esko, Mlékárna Klatovy, Mlékárna Polná a Povltavské mlékárny. Na rozdíl od lo ského ro níku, kdy nebyl žádný sýr hodnocen jako výborný (t. j. v rozmezí 90 až 100 bod ), letos odborné komise za adily do této kvalitativní kategorie 4 vzorky. Nejvyšší bodové ohodnocení (97,75 bodu) pat í erstvému sýru p írodnímu (KROMILK s. r. o., Krom íž).

Ve skupin zahrani ních sýr bylo hodnoceno sedm francouzských sýr , které byly získány díky úsilí pana Ladislava Liklera. Další vzorky ze Slovenska poskytla spole nost NIKA. Tyto sýry jsou posuzovány odd len , hodnotí je všichni lenové odborných komisí i departážní komise. Každý hodnotitel sýr za azuje do kvalitativních kategorií a navíc má právo 3 vzorky, které považuje za nejlepší, navrhnout na diplom. Nejvíce návrh na diplom získal sýr zrající pod mazem Port Salut Le Fondant (BEL Sýry esko a.s), který získal 24 návrh na diplom ze 34 možných). Diplomem byl dále ocen n kozí sýr Président la Bûche fondante (Lactalis CZ s. r. o.) a sýr Chaumes (Bongrain Czech Management Services). Ze slovenských sýr nejvíce zaujal nezrající ov í sýr Urda, vyráb ný tepelným srážením žin ice. Výsledky hodnocení zahrani ních sýr jsou uvedeny v tab. V.

Hlavním bodem odborného programu p ehlídek byla p ednáška Ing. J. Kopá ka, CSc. ( eskomoravský svaz mlékárenský), který ú astníky seznámil se situací v evropském a sv tovémmlékárenství, která v uplynulém roce prošla bou livým vývojem. Další p ednáška se zabývala využitím conjoint analýzy ve výrobkovém výzkumu (doc. Ing. S. Grosová, VŠCHT Praha). P ednáška ing. J. Keresteše (NIKA, s.r.o) byla v nována chovu ovcí na Slovensku z hlediska historie, zpracování ov ího mléka a jeho významu. Na navazující konferenci Mléko a sýry 24. ledna bylo prezentováno 18 p ednášek a tém dvojnásobný po et poster . Obou akcí se dále ú astnilo 13 firem, jejichž innost se dotýká laboratorního vybavení a pot eb pro zpracování mléka. Tradi nbyla vedle sout žních sýr prezentována ada dalších výrobk na doprovodné výstavce. jejich seznam uvádí tab. VI.

19

Tabulka VI Seznam sýr vystavených v pr b hu Celostátních p ehlídek sýr a konference Mléko a sýry Spole nost, mlékárna, sýrárna Sýr Sušina tvs A.W. spol. s r.o., Loštice Kousky se zeleným pep em 33% 1% Kúsky s rest. cibulkou 33% 1% Loštické kvarteto 34% 1% Pravé olomoucké tvar žky 33% 1% Pusinky z Loštic 33% 1% Sváte ní ty inky 33% 1% Agricol s.r.o., Poli ka edar 57% 45% Eidam 50% 30% BEL Sýry esko, Želetava Gervais 32% 63% Matador s klobásou 33% 40% Matador s nivou 38% 45% Matador smetanový 38% 50% Matador tavený sýr s esnekem 33% 40% Matador s romadúrem 33% 40% Kromilk s.r.o. Krom íž erstvý sýr nezrající 36% 60% Krajanka, terminovaný smetanový sýr 37% 70% Mlékárna Klatovy Eidam 30% 50% 30% Eidam 45% 56% 45% Moravský blok 61% 45% Uzený salámový tavený sýr se šunkou 50% 45% Uzený sýr Eidam 40% 54% 40% Mlékárna Otinoves s.r.o. NIVA extra 53% 52% Mlékárna Polná s. r.o. Balkánský sýr 42% 50% Maskar z Polné 48% 75% Zlatá Praha 58% 50% Zlatá Praha porce 58% 50% Moravia Lacto a.s., Jihlava Eidam sýr 45% polotvrdý plátkovaný 55% 45% Eidam sýr 45% uzený 55% 45% Eidamský sýr 30% plátkovaný 50% 30% Eidamský sýr 45% plátkovaný 55% 45% Eidamský sýr uzený 45% blo ek 55% 45% Eidamský sýr uzený 45% plátkovaný 55% 45% Excelent pažitka plátkovaný 55% 45% Excelent polotvrdý sýr se zeleným

pep em a chilli plátkovaný 55% 45%

Excelent uzený s esnekem plátkovaný 55% 45%

Montana 45% blo ek 60% 45% Montana 45% plátkovaný tvrdý sýr 60% 45% Moravský blok 60% 45% NIKA s.r.o., Povážská Bystrica, NIKA Blue Gold 50% 50% Slovensko Ov í syr Urda 72% 28% Slovenská bryndza 44% 48% Plastcom a.s., Mlékárna P íšovice Eidamská cihla 50% 30% Eidamská cihla 56% 45% Eidamský uzený sýr 56% 45% Gaston oregano 56% 45% Gaston paprika a chilli 56% 45% Gaston pep a chilli 56% 45%

20

Tabulka VI pokra ováníSeznam sýr vystavených v pr b hu Celostátních p ehlídek sýr a konference Mléko a sýrySpole nost, mlékárna, sýrárna Sýr Sušina Tvs Polabské mlékárny a.s., Pod brady Monticremo a´ a Budapeš 34% 65% Monticremo s žampiony 35% 66% Monticremo smetanové 38% 66% Povltavské mlékárny , a.s., Sedl any Sedl anský mod enín 53% 56% Sedl anský pepin 45% 53% TANY, spol. s r.o. TANY Delicato 48% 70% TANY kapie 38% 50% TANY klobása 33% 50% TANY mix 38% 50% TANY plís ový 100g 38% 50% TANY plís ový 140g 38% 50% TANY smetanový 45% 65% TANY šunkový 38% 50% TANY žampiony 38% 50% TPK, spol. s r.o., Hodonín Apetito Supercremo 41% 60% Apetito šunka 43% 55% Maratonec 43% 55%

21

OPTIMALIZACE DESIGNU SÝRA S VYUŽITÍM CONJOINT ANALÝZY Grosová Stanislava, Kutnohorská Olga

Ústav ekonomiky a ízení chemického a potraviná ského pr myslu VŠCHT v Praze

Cheese design optimisation with use of conjoint analysis

Summary:Udržení dynamiky r stu prodeje p edpokládá sledovat nákupní jednání zákazník a jeho prom ny. P edpokladem formulace dobré výrobkové strategie každého výrobce musí být znalost toho, co zákazník považuje za kvalitu a poskytnout mu to v žádoucí podob . Vhodným nástrojem pro tyto ú ely je software SPSS, modul Conjoint analysis. Realizovali jsme výzkum, jehož cílem bylo kvantifikovat vliv vybraných výrobkových atribut sýra s oky, identifikovat p ípadné rozdíly mezi segmenty spot ebitel a nalézt optimální variantu sýra, která bude p edstavovat ideální mix vybraných výrobkových atribut . Výsledky realizované na vzorku 118 respondent ukázaly, že na výb ru sýra se z 30,32% podílel vzhled (oka), zna ka z 35,49%, p vod sýra z 12,85% a obsah tuk z 21,34 %.

ÚvodOptimalizace designu výrobku vzhledem k spot ebitelským preferencím pat í ke klí ovým

cíl m každého výrobce (16). Schopnost podniku vytvá et a nabízet produkty, které uspokojí požadavky zákazníka, pot ší ho a u iní jej loajálním, je klí em k úsp chu a r stu zisku (13). Úsp šnost p ijetí produktu spot ebitelem závisí na ad faktor , které se vztahují k produktu, spot ebiteli a vn jšímu prost edí (2,5). Mezi významné faktory vztahující se k potraviná skému produktu lze za adit nap . vzhled produktu, jeho zna ku, obal, cenu, umíst ní v regálu, zp sobkomunikace, proces vzniku (11,20,21). Výrobci by proto m li poznat, jak tyto atributy ovliv ují preference (vybraného segmentu) zákazník a využívat je v procesech vývoje a zavád ní nových výrobk na trh. Conjoint analýza poskytuje kvantitativní m ení relativní d ležitosti jedné vlastnosti oproti druhé (1). Slovo „conjoint“ vzniklo z úvahy, že relativní význam posuzovaných v cí (consider) lze m it spole n (jointly) i tehdy, když lze jen t žko m it jejich význam odd len(4). Vliv hedonických, zdravotních, convenience faktor a vliv procesu vzniku na preference spot ebitel sýr byly studovány adou výzkum (6,10,17,18,22). P írodní polotvrdé sýry s oky nás zajímaly i proto, že p edstavují vzhledem k r stu prodeje zajímavý výrobkový segment (12).

Cíl studieNaším cílem bylo studovat vliv vybraných výrobkových atribut p írodního polotvrdého

sýra s oky na nákupní rozhodování vybraného vzorku spot ebitel , nalézt p ípadné rozdíly mezi vybranými segmenty spot ebitel a nalézt optimální variantu sýra, která bude p edstavovat ideální mix vybraných výrobkových atribut . Sledovali jsme n které vybrané faktory, u kterých jsme cht liov it, jakým zp sobem ovliv ují názor spot ebitel na výrobek. Vybranými vlastnostmi byly vzhled sýra, zna ka sýra, p vod sýra a obsah tuku.

Použité metody

Ucelený pohled na conjoint analýzu jako vícerozm rnou statistickou metodu vyvinutou pro ú ely výzkumu v 70. letech 20. století lze najít v zahrani ní literatu e (7). Z nejnov jší literatury zpracované v poslední dob lze získat podrobný p ehled jejího vývoje, velkého po tu typ aplikací a názory na budoucí vývoj (8). Conjoint analýza je „praktický soubor metod, které lze použít pro p edvídání spot ebitelských preferencí pro produkty (nabídky) charakterizované mnoha atributy (vlastnostmi) a kterou lze aplikovat u širokého spektra výrobk “ (4,7). Hlavní p ínos lze spat ovat v získání informací o tom, jak lidé vybírají, hodnotí r zné výrobkové faktory (atributy) a rozhodují tak o výb ru produktu (3). P i hodnocení produkt spot ebitelé tak asto dochází ke kompromis m. Conjoint analýza umož uje výzkumník m zkoumat tyto kompromisy, zjiš ovat relativní význam každého atributu, každé jednotlivé úrovn atributu a kombinace atribut . To lze využít p i navrhování produkt , které jsou nejvíce p itažlivé pro ur itý trh (segment).

22

P i aplikaci je t eba nejd ív vytvo it soubor reálných i hypotetických produkt pomocí kombinace vybraných úrovní každého atributu. Tyto kombinace jsou p edkládány respondent m,kte í je hodnotí jako celek. Tento postup velmi realisticky p edstavuje proces, kdy spot ebitel hodnotí soubor nabídek produkt . Vzhledem k tomu, že jednotlivé hypotetické produkty jsou vytvá eny specifickým zp sobem, lze stanovit vliv každého atributu a každé úrovn atributu z celkového hodnocení respondenta (7,8).

Prvním krokem je tedy vymezení produktu pomocí atribut , které budou zkoumány a jednotlivých úrovní t chto atribut . P i výb ru atribut a jejich úrovní je t eba dbát, abychom postihli pokud možno všechny atributy ovliv ující výb r spot ebitele a formulovali jednotlivé úrovn tak, aby „dob e“ diferencovali mezi jednotlivými úrovn mi. Je t eba rozhodnout o po tuzkoumaných atribut a jejich úrovní, protože tento po et má bezprost ední vliv na statistickou spolehlivost a p esnost získaných výsledk .

Dalším krokem je rozhodnutí o typu conjoint analýzy. V typu, který byl použit v této studii, šlo o metodu plného profilu, kdy je všem respondent m p edkládán soubor produkt ,které jsou popsány pomocí všech sledovaných atribut a u každého atributu je zvolena konkrétní úrove . Naproti tomu metoda neúplného profilu umož uje p edkládat respondent m varianty produkt , které nejsou popsány pomocí všech atribut . Metoda plného profilu byla použita proto, že umož uje stanovit utilitu (užitnost) každé úrovn atributu a ideální kombinaci atribut . Utilita (užitnost) indikuje, jak každý faktor ovliv uje preference. Kladné hodnoty signalizují, že úroveatributu pozitivn p ispívá k preferenci, zatímco záporná hodnota úrovn indikuje, že tato úrovefaktoru není preferovaná. Hodnota d ležitosti m í význam atributu v preferen ním hodnocení (7,8). Pro realizaci conjoint analýzy jsme použili statistický software SPSS (verze 12.0), který má pro conjoint analýzu speciáln implementovaný modul.

Výb r atribut pro studiiPro vymezení atribut (výrobkových vlastností) a jejich úrovní byla využita metoda

skupinových rozhovor (Focus group) (1). Je to metoda kvalitativního výzkumu trhu, jejímž ú elemje zjistit názory p ímo cílové skupiny spot ebitel . Soub žn probíhající studium literatury, vztahující se k nákupnímu chování na trzích s potraviná skými výrobky potvrdilo, že atributy uvád né spot ebiteli jsou významné a zajímavé i z pohledu výzkumného. Skupinový rozhovor prob hl v prosinci 2007 v Praze, zú astnilo se ho celkem 9 ú astník (7 žen , 2 muži), scénározhovoru navazoval na p edchozí realizované výzkumy (14).

Vybranými atributy byly vzhled sýra, zna ka sýra, p vod sýra a obsah tuku. Vzhled sýra byl vybrán proto, že „zákazník kupuje o ima“ a spot ebitelky a spot ebitelé v rámci skupinových rozhovor formulovali sv j požadavek takto: „Když oka, ta a jsou po ádná“ (14). Vliv zna ky sýra byl zkoumán vzhledem k rostoucím výdaj m na budování zna ek v potraviná ském pr myslu (9). Aktivity výrobc i obchodu a v neposlední ad r st zájm spot ebitel v Evrop i R o bio produkty (24) nás vedl k za azení atributu p vod výrobku. Kone n obsah tuku byl zvažován vzhledem k rostoucímu zájmu spot ebitel o zdravý životní styl (15,23). Jednotlivé výrobkové vlastnosti (atributy a jejich úrovn ) jsou uvedeny na Obr. 1.

Realizace výzkumuUvedený po et atribut a jejich úrovní vedl k celkovému po tu 3x3x2x2=36 výrobkových

variant. Vzhledem ke zkušenostem z už realizovaných výzkum jsme omezili po et generovaných variant, což vedlo software Conjoint modulu k vytvo ení 9 výrobkových kombinací uvedených v tab.I. Ty byly následn upraveny do podoby karet p edkládaných respondent m, na kterých byl vzhled sýra ilustrován pomocí obrázku, viz Obr.II.A,B. Uvedený p ístup získávání informací je charakterizován jako „simulace podmínek v supermarketu“ (6).

23

Vlastnosti Vzhled Zna ka P vod Obsah tuku v sušin

Madeta bio 45%

Tesco tradi ní 30%

ajejich

úrovn

bez zna ky

Obr. I. Atributy sýra a jejich úrovn

Respondenti, spot ebitelé nakupující p írodních polotvrdých sýr s oky, adili karty p edstavující výrobkové varianty podle svých preferencí od nejvíce po nejmén preferovanou variantu a výsledky byly zapisovány do p edem p ipraveného dotazníku. Celkem bylo osloveno 122 respondent s ukon eným st edoškolským vzd láním s bydlišt m v Praze, z toho bylo 81 žen, 41 muž . 70 respondent bylo mladších 30 let a 52 nad 30 let. Vlastní šet ení probíhalo v období 10.- 17.ledna 2008. P i zpracování údaj bylo nutné vy adit 4 dotazníky vzhledem k nevhodnému zp sobu jejich vypln ní, takže celkové výsledky reprezentují preference celkem 118 respondent .

Tabulka I Soubor výrobkových variant

Card 1Oka velká Zna ka Tesco P vod Bio Tuk 45%

Card 2Oka velká Zna ka Bez zna kyP vod Bio Tuk 30%

Card 3Oka st edníZna ka Madeta P vod Bio Tuk 30%

Card 4Oka st edníZna ka Bez zna kyP vod tradice Tuk 45%

Card 5Oka st edníZna ka Tesco P vod Bio Tuk 45%

Card 6Oka malá Zna ka Bez zna kyP vod Bio Tuk 45%

Card 7Oka malá Zna ka Madeta P vod Bio Tuk 45%

Card 8Oka velká Zna ka Madeta P vod tradice Tuk 45%

Card 9Oka malá Zna ka Tesco P vod tradice Tuk 30%

Výsledky a diskuseVýstupem software CONJOINT SPSS 12.0 je soubor, ve kterém jsou vypo tené d ležitost a

váhy atribut (výrobkových vlastností) a jejich úrovní pro všech 118 respondent . Získané výsledky byly zpracovány do tabulky, ve které první sloupec uvádí výsledky „pr m rná d ležitost“ udávající pom r, v jakém se sledované atributy podílely na rozhodování respondenta. Pom r je uvád nv procentech. Sloupec „Utilita“ uvádí „užitnosti“, jaké mají pro soubor respondent konkrétní úrovn atribut . Pod grafem jsou uvedeny hodnoty Kendallova tau a Pearsonova koeficientu, což jsou charakteristiky t snosti mezi vytvo eným modelovým chováním a skute ným jednáním zákazník , tudíž indikují rozdíl mezi empirickými a teoretickými hodnotami. ím více se tyto hodnoty blíží jedné, tím je t sn jší shoda mezi modelem preferencí a skute nými preferencemi spot ebitele (4,7).

Celkový model preferencí pro všech 118 respondent poskytl výsledky uvedené v Tab.II.

24

Tabulka II Výsledky celkového modelu preferencí (n= 118)

Význam atributu (Averaged Importance) Atribut Úrove atributu Utilita

(Utility) Malá - 1,0678*

st ední 0,7147** 30,32 vzhled (oka) velká, nepravidelná 0,35531

Madeta 1,2740** Tesco - 0,3701 35,49 zna ka

bez zna ky - 0,9040* Bio 0,1208** 12,85 P vod klasický - 0,1208* 45% - 0,2521* 21,34 obsah tuku 30% 0,2521**

Pearson's R = ,993 Significance = ,0000Kendall's tau = ,944 Significance = ,0002

* nižší hodnoty utility p edstavují nižší hodnotu z pohledu zákazníka **vyšší hodnoty utility p edstavují vyšší (lepší) hodnotu z pohledu zákazníka

Z výstupu je patrné, že p i koupi výrobku se na preferencích respondent podílel vzhled sýra (oka, jejich tvar, velikost i po et) z 30,32%, zna ka z 35,49%, p vod sýra z 12,85% a obsah tuk z 21,34 %. Získané údaje byly dále zpracovány také pro díl í segmenty respondent , ženy celkem a muže celkem, do 30 let celkem a nad 30 let celkem a pro ženy do 30 let a ženy nad 30 let. Získané výsledky jsou uvedeny souhrnn v Tab.III. V t chto skupinách se názory respondent na význam jednotlivých atribut lišily.

Tabulka III Výsledky v len ní podle segmentSegment 1

n = 79 Segment 2

n = 48 Segment 3

n = 31 Segment 4

n = 39 Segment 5

n = 69 Segment 6

n = 49 Atribut Úrove

atributu Význam atributu

Utilita úrovn

Význam atributu

Utilita úrovn

Význam atributu

Utilita úrovn

Význam atributu

Utilita úrovn

Význam atributu

Utilita úrovn

Význam atributu

Utilita úrovn

malé -1,0256* -0,8865* -1,2667* -1,1500* -0,9227* -1,2933* st ední 0,6923** 0,5816** 0,8889** 0,7583** 0,7246** 0,7267**

vzhled (oka)

velké,nepr29,67

0,3333 28,12

0,3050 32,84

0,3778 31,57

0,3917 29,17

0,1981 32,08

0,5667 Madeta 1,4188** 1,4681** 1,2889** 0,9917** 1,3382** 1,1667** Tesco -0,4573 -0,4184 -0,4333 -0,2000 -0,3913 -0,3533

zna ka

bez zna ky

38,20 -0,9615*

41,49 -1,0496*

32,00-0,8556*

30,22-0,7917*

39,14-0,9469*

30,06 -0,8133*

bio 0,2212** 0,2447** 0,2000** -0,0750* 0,1667** 0,0250** p vodklasický

12,16 -0,2212*

12,04 -0,2447*

12,57-0,2000*

14,180,0750**

12,59-0,1667*

13,49 -0,0250*

45% -0,5160* -0,3457* -0,7750* 0,2625** -0,0978* -0,4800* obsah tuku 30%

19,97 0,5160**

18,35 0,3457**

22,590,7750**

24,03-0,2625*

19,110,0978**

24,37 0,4800**

Pearson´s R 0,994 0,996 0,989 0,990 0,990 0,995 Kendall´s 1,000 1,000 1,000 0,889 0,944 1,000 Popis segmentu ženy celkem ženy do 30 let ženy nad 30 let muži celkem do 30 let celkem nad 30 celkem

* nižší hodnoty utility p edstavují nižší hodnotu z pohledu zákazníka **vyšší hodnoty utility p edstavují vyšší (lepší) hodnotu z pohledu zákazníka

ada výstup potvrdila naše p edstavy a o ekávání. Je z ejmé, že vzhled sýra hraje p ivýb ru a hodnocení významnou roli. V p ípad , že spot ebitel o ekává u sýra oka, pak vedle toho, že preferuje pravidelná, st edn velká oka, akceptuje spíše velká, nepravidelná oka než nízký po etmalých ok. Ale i zna ka je pro spot ebitele nakupujícího sýry d ležitá. P i sb ru dat s respondenty jsem zjistili, že mnoho z nich doslova irituje, že neznají toho, kdo výrobek vyrobil. Obchodní zna ky, mnohdy tak nepopulární u výrobc pro dopady své politiky v oblasti obchodních zna ek,jsou však preferovány víc než no-name výrobky. Z Tab.II,III je také z ejmé, že respondenti v našem výzkumu sice oce ovali bio p vod, nicmén význam tohoto faktoru diferencoval mezi jednotlivými nabídkami mén než faktory zna ka i obsah tuku.

Získané výsledky rovn ž umožnily získat p edstavu o „ideální“ koncepci spot ebitel .Zajímavé, i když o ekávané rozdíly byly nalezeny mezi ženami a muži, viz Obr.II. A,B.

25

Muži Ženy

Obr. II A,B: Nejvíce preferovaná varianta sýra pro segment „muži“ a „ženy“

Pro segment muž p edstavuje ideální výrobek kombinaci atribut : zna ka Madeta, klasický p vod, obsah tuku 45% („tu n jší je lepší“) a rovnom rná, p im en velká oka. O ekávání vzhledu a zna ky spojuje ve svém hodnocení muže a ženy, ovšem ženy preferovaly spíše nižší (30%) obsah tuku a bio p vod sýra. Srovnání námi dosažených výsledk s výsledky publikovanými v studiích ( 6,10,17,18, 23) je obtížné vzhledem k existenci silných interkulturálních rozdíl v potravních zvyklostech (20) a v rozdílech mezi volbou model zkoumaných výrobkových atribut . R st preferencí u variant s nižším obsahem tuku a zájem o proces vzniku (p vod) výrobku je v souladu se zjišt ními ve výše uvedených výzkumech.

Záv ry:Náš p ísp vek ilustruje výhody Conjoint analýzy p i zjišt ní spot ebitelských preferencí

p írodního polotvrdého sýra s oky. V studii jsme pracovali zatím jenom s n kterými, vybranými faktory (atributy) výrobku. Podle zkušeností uvedených v bohaté literatu e k problematice conjoint analýzy i podle našich realizovaných výzkum lze v navazujících šet eních zkoumat nap . vliv informací o sledovatelnosti p vodu (traceability) na preference spot ebitel , vliv specifického zp sobu komunikace o výhodách sýra (nap . obsah Ca, posílení kostí i celkov lepšího pocitu pohody) na preference zákazník , vliv r zných cenových úrovní na kupní zám ry i podrobn jiidentifikovat segmenty preferující navržené koncepce nových výrobk (19).

Pod kování:Auto i d kují MŠMT R za prost edky uvoln né v rámci financování výzkumného zám ru

FCHI VŠCHT fakulty MSM 6046137306, které umožnily realizaci této stati.

Použitá literatura:1. AAKER, D.A., KUMAR,V., DAY,G.S.:Marketing Research . 8th Ed. John Wiley&Sons, Inc., 605-606

(2004)2. ASSAEL H.: Consumer Behaviour and Marketing Action. 6th Ed. South-Western College Publishing

(1998)3. CATTIN P., WITTINK D.R.: Commercial use of conjoint analysis: A survey. Journal of Marketing. 4,

169-184 (1982).

KKaarrttaa HH

Produkt: sýr ementálského typu

Zna ka: Madeta

P vod: klasický

Obsah tuku: S obsahem tuku 45 %

Oka:

KKaarrttaa CC

Produkt: sýr ementálského typu

Zna ka: Madeta

P vod: BIO

Obsah tuku: S obsahem tuku 30 %

Oka:

26

4. ERMÁKOVÁ, A.: Possibility of Conjoint Analysis in Course of Modeling Consumer Preference. ActaUniversitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis, IL, 89-94 (2001)

5. ENGEL J.F., BLACKWELL, R.D. AND MINARD, P.W.,. Consumer behaviour. (8th Ed.), The Dryden Press, New York (1995)

6. FREWER L., HOWARD C., HEDDERLY D., SHEPHERD R.: Consumer attitudes towards different food-processing technologies used in cheese production—The influence of consumer benefit. FoodQuality and Preference, 8, Iss.4,271-280 ( (1997)

7. GREEN, P.E., SRINIVASAN, V.: Conjoint analysis in consumer research. Issues and outlook. Journalof Consumer Research 5 (9), 103–123. (1978)

8. GREEN, P.E., KRIEGER, A. AND WIND, Y., "Thirty years of conjoint analysis: Reflections and prospects". Interfaces, 31,S56-S73. (2001)

9. GROSOVÁ S.: Specifika marketingu potraviná ských výrobk . In: Praktické marketingové aplikace.Oeconomica, Praha 2007.

10. GRUNERT, K.G., BECH-LARSEN,T.,BREDAHL, L.: Three issues in consumer quality perception and acceptance of dairy products. Int.Dairy J., 10 ,575–584 (2000)

11. GRUNERT, K.G..: Current issues at understanding food choice. Trends in Food Science &Technology.Vol.13, Iss.8, 275-285 (2002)

12. KOPÁ EK J.: Situace v evropském a sv tovém mlékárenství v roce 2007. P ednáška na konferenci: Celostátní p ehlídky sýr 2007, Praha.

13. Kotler P., Keller K.L.: Marketing Management. 12th Ed. Grada Publishing, str. 193,(2007) 14. KUTNOHORSKÁ O.: Zavád ní nového výrobku na trh. Diplomová práce VŠCHT, (1996) 15. Lifestyle Study 2005.TNS AISA,2005 16. McEWAN, J.A.: Preference mapping for product optimisation. In: Naes, T. and Risvik, E., Editors,

1996. Multivariate analysis of data in sensory science, Elsevier science, London, 17. 71–102 (1996) 18. MURPHY M. ET AL.: A conjoint analysis of Irish consumers preference of farmhouse cheese. British

Food Journal, 2004,106,4 19. MURRAY,J.M., DELAHUNTY C. M.:Mapping consumer preference for the sensory and packaging

attributes of Cheddar cheese. Food Quality and Preference 5(11),.419-435 (2000) 20. NAES T.,KUBBEROD E., SIVERTSEN H.: Identifying and interpreting market segments using

conjoint analysis. Food Quality and Preference, 2(12),133-143 (2001) 21. OLSON P., GRUNERT,J.: Consumer Behaviour and Marketing Strategy. European Edition McGraw

Hill(1999).22. SHEPHERD R.: Factors influencing food preferences and choices. In: R. Shepherd, Editor, Handbook of

the psychology of human eating, John Wiley and Sons, Chichester, 3–24,(1989). 23. TENDERO A., BERNABÉU R.: Preference for cheese consumers: A Spanish case study. British Food

Journal, 107, 60-74 (2005) 24. Unilever: Opinion Window Research International. Unilever (2005) 25. Václavík T.: eský trh s biopotravinami 2005. Green marketing, Praha (2006)

Kontaktní adresa:Stanislava Grosová, Ústav ekonomiky a ízení chemického a potraviná ského pr myslu, VŠCHT v Praze.e-mail: stanislava.grosova@vscht.cz Olga Kutnohorská, Ústav ekonomiky a ízení chemického a potraviná ského pr myslu, VŠCHT v Praze.e-mail: olga.kutnohorska@vscht.cz

27

OV IARSTVO NA SLOVENSKU Keresteš Ján

NIKA , spol. s r.o., Považská Bystrica

The sheep farming in Slovakia

Summary:The sheep farms, sheep milk treatment and most importantly the sheep cheese products have a long tradition in Slovakia. Nowadays, it is necessary to come back to our traditional dairy products, which can draw attention to our regional specials. The most famous Slovak sheep cheese specials are lumpy sheep cheese a, steamed/smoked, žin ica (a sheep\'s whey), and bryndza (sheep cottage cheese). In addition to the Slovak sheep specials, new dairy products are currently being developed. This contribution describes a history of sheep farms, dairy-farming in the Slovak region, a composition of sheep milk, its importance in the nourishment, and current normative principles of processing in EU setting. The operative part this contribution is concerned with is sheep dairy products made in the Slovak sheep farms, and dairy factories. The main focus of this contribution is the “bryndza” process i.e. its technology and nutritional value, in addition, its various up-to-date modifications. Nowadays, the sheep farms in Slovakia have progressively developed, particularly in agro tourism, which can help with the preservation of its present traditions, but with higher level of quality.

Ov iarstvo na Slovensku, spracovanie ov ích produktov a zvláš mlieka majú na Slovensku dlhú tradíciu. V knižnom spracovaní predstavuje as Slovenskej histórie a jej miesto v kontexte historického postavenia ov iarstva v rozli ných stup och vývoja v rôznych formách geografického a politicko – spolo enského usporiadania.

Rozsah problematiky o ov iarstve na Slovensku, jeho histórii a technológiách môže byažko vy erpávajúci, ak zah a ve ké obdobie mnohokrát s protichodnými tendenciami. Vo svojej

histórii ov iarstvo na Slovensku zasahuje do vedeckých odborov biológie, fyziky, chémie, biotechnologických vied, archeológie, histórie, po nohospodárstva, potravinárstva, takže svojou podstatou sa ov iarstvo podie alo na akceleráciách života celej našej spolo nosti. Možno tvrdi ,že ov iarstvo a jeho využitie vo forme výživy je materializovanou filozofiou života.

Ov iarstvo, rôzne spôsoby chovu oviec a zvláš chov valašským spôsobom je unikátom a špecifikom tradi nej udovej kultúry Slovenska. Jeho jedine nos je v tom, že sa tu spájajú ekonomické, hospodárske, právne a kultúrne aspekty.

Pastierska kultúra a chov oviec predstavovali na Slovensku od najstarších ias prínos nielen v ekonomickej oblasti ale našli odraz vo výtvarnom umení, hudobnom a tane nom folklóre. Všetky sú asti sú v aka rôznym okolnostiam dodnes živé, predstavujú živú kultúrnu tradíciu. Svojou odlišnos ou od kultúr iných národov predstavujú významný vklad Slovenska do Európskych kultúrnych tradícií.

Najstaršie kontakty loveka s ovcami nám dokumentujú archeologické vykopávky na území Slovenska hlavne z doby bronzovej ( r. 1800- 1000 p. n. l. ). Chov oviec je úzko spojený s vývojovými formami po nohospodárstva s väzbou na spôsoby obhospodarovania pôdy, pestovania rôznych druhov plodín a kategórií hospodárskych zvierat. Medzníkom po nohospodárskej výroby bolo 8. storo ie n. l. ke došlo na našom území k postupnému prechodu od žiarového po nohospodárstva k efektívnejšiemu orebnému hospodáreniu.

Archeologické nálezy potvrdzujú že nízke stavy oviec boli v 11. – 14. storo í.Po osíd ovaní oblastí Slovenska v 12. storo í na princípe Šoltýsovej kolonizácie najvä ší vplyv na rozvoj ov iarstva v 15. – 16. storo í mala kolonizácia na princípe valašského práva.

Rýchla dynamika rozvoja ov iarstva bola v období 16. – 18. storo ia hlavne vplyvom priemyslovej revolúcie a osvieteneckého obdobia Rakúsko – Uhorskej panovní ky Márie Terézie a Jozefa II. Toto obdobie možno charakterizova ako ve kovýrobné technológie chovu oviec na feudálnom princípe, oproti malochovom charakterizovaným nízkou po etnos ou oviec a postupným zvyšovaním stavov hovädzieho dobytka a ošípaných.

28

Ovce sa stali jedným z akcelerátorov priemyselnej revolúcie, majúce zna nýnárodohospodársky význam rozšírením chovov do horských oblastí, zabezpe ením výživy obyvate stva a opa ne, znižovaním stavov zna nú emigráciu, ktorá sa prejavila koncom 19. storo ia a za iatkom 20. storo ia.

Spomínaná knižná publikácia hovorí o využívaní všetkých ov ích produktov, ale aj o prvých vedecky zdôvodnených a ú elovo prispôsobených cielených plemenárskych zásahov ako formy umelého výberu.

Rozvojom stavov oviec a ich plemennej príslušnosti došlo k nebývalému rozvoju plemenárskej práce, vytvoreniu systémov chovov a distribúciu najvýkonnejších plemenných zvierat do rozmnožovacích chovov. To potvrdzujú aj výsledky vedeckých zistení, archívnych dokumentov v známych feudálnych chovate ských rodinách.

Chov plemenných zvierat na Slovensku mal významný vplyv na úrove plemenárskej práce v celom Rakúsko – Uhorsku. K výraznému zníženiu stavov oviec dochádza v období tesne pred I. svetovou vojnou a rozli ným stabilizáciám v období 20. storo ia a vä ším i menším úspechom prispievali štátne formy intervencií.

Skuto ne vedecký základ chovu oviec na Slovensku dalo zriadenie Štátneho ov iarsko – vlnárskeho ústavu v Tur ianskom Svätom Martine v roku 1935, ktorý založil známy eskýodborník Dr. Ing. Vilém Kurz.

Po 2. svetovej vojne a po rozli ných zmenách v organiza nom lenení výrazne prispieval ov iarskej vede a výskumu Výskumný ústav ov iarsky v Tren íne a Vysoká škola po nohospodárska v Nitre. Zásluhou Prof. Dr. Ing. J. Lauren íka, Vysokej školy po nohospodárskejv Nitre, plemenárskych a chovate ských organizácií bolo na Slovensku vyš achtené nové plemeno- zuš achtená valaška. Osobitným podielom je zvýraznená práca vo vede a výskume po roku 1950, kedy Slovenská veda a výskum dosiahli najvä šieho uznania.

Intenzifikácia po nohospodárstva práve tohto obdobia s jej koopera nými a integra nými prvkami prispela ku vzniku špecializovaných po nohospodárskych podnikov na chov oviec, hlavne v horských oblastiach. Opä sa historicky potvrdilo opodstatnenie chovov oviec s vysokou koncentráciou v krátkom historickom období viackrát.

Rozširovaním vedeckej základne chovu oviec a prílevom po nohospodárskych odborníkov do prvovýroby sa dlhodobá skúsenos chovu oviec dostala na úrove vedeckého riadenia výroby. Na tomto stave má nespochybnite nú zásluhu Vysoká škola po nohospodárska v Nitre a Výskumný ústav ov iarsky v Tren íne.

Celú históriu ov iarstva a jeho vedecký výskum je potrebné chápa v kontinuite doby a danej úrovni vedeckých poznatkov, avšak najvä ší vplyv na kultúrno – historické regióny, pastiersku kultúru v ítane organizovania kolektívnych salašov, stavebných objektov na salašoch, práce ov iarov, ich stravovanie, odev ov iarov a spôsoby zužitkovania ov ích produktov mali tradi né formy pastierskeho hospodárenia.

Doteraz zachované tradície výroby pastierskeho náradia, ná inia, výrobkov udovej stravy hlavne ov ieho syra a ov ieho mäsa hovorí o našich filogenetických základoch výživy a ich vplyvu na zdravotný stav obyvate stva. Filogenetické základy v rozsahu výživnej hodnoty a biodiverzity používanej výživy, hlavne ov ích syrov nám dali základ genetickej variability spätným dosahom najmenej 5 predchádzajúcich generácií. Pastierska kultúra nám zanechala zna né množstvo aj živých umeleckých predmetov, špecifického odievania a všeobecnej kultúry, ktorá presahuje rámec Slovenska. Spracovanie ov ích výrobkov výrazne prispelo aj k vypracovaniu odbornej legislatívy v jednotlivých fázach vývoja, hlavne vo výžive ustanovením Uhorského potravinového kódexu.

Ov iarska história je cestou od opakovanej biedy k dostatku potravy a v dnešnom ponímaní posledných 50 rokov od kontingentov dodávok, lístkového systému po spotrebu 243 litrov mlieka na obyvate a a rok. V kontexte životného štýlu od drevených chalúpok, otepom pokrytých a zemou nabíjaných múrov, po moderné mestské sídelné agromelácie. Opätovne sa potvrdilo, že v štruktúre výroby a výživy treba chápa ov iarstvo ako synergický faktor mnohých vedných a výrobných odvetví.

29

Chov oviec vo svojej histórii na Slovensku stál pri základoch nových vedných po nohospodárskych, potravinárskych a iných odvetviach. Ale v pragmatickej innosti spracovanie ov ích výrobkov, hlavne mlieka dalo základ výroby Slovenských syrov, ktoré sa stali unikátnymi nielen s charakterom biodiverzity ale aj technickej vynaliezavosti .

O tom už v roku 1921 napísal eský laktológ profesor Laxa: „Slovenské parenice sú unikum syrá ských technologií v bec“, alebo že Slovenská bryndza obsahuje Coccus carpaticcus ako nový mikroorganizmus vyrovnávajúci sa mnohým mliekárenským mikroflóram.

Vz ah ov ieho hospodárstva a dnešných 800 000 hektárov trávnych porastov na Slovensku svojej histórie determinoval životnú úrove Slovákov a národností žijúcich na tomto území, stal sa bytostne spätý s demografickým rozvojom Slovenska.

Vedecké poznatky získané v druhej polovici 20. storo ia ur ili pre prax základy vedeckej výživy chovu oviec, ustajneniu, organizácie práce, sociálno – ekonomických aspektov chovu oviec, š achtite skej a plemenárskej práce a podiel ov iarstva na ekológii krajiny.

K biotechnologizácii chovu oviec a jej vplyvom na biodiverzifikáciu životného prostredia výrazne prispievali vedecké objavy vo výžive, anatómii a fyziológii oviec, vplyvy frekven né,sekven né, stimula né a akcelera né podmienky rozvoja chovov oviec.

Uvedená kniha o ov iarstve na Slovensku obsahuje aj historický vývoj technológií, spracovania mlieka, mäsa, vlny, rievok, koží, rohov a paznechtov. Pre novodobé biotechnologické h adiská a ich využitie v eliminácii novodobých ochorení je potrebné pripomenú ich nezastupite né miesto, hlavne v produkcii mäsa a mlieka s vyšším obsahom selénproteínov oproti iným výrobkom. Ove a vážnejším a menej doceneným významom je rozsiahly mikrobiálny vplyv na zdravotný stav obyvate stva, z dôvodov zachovania biodiverzity. Nevyužitý je potenciál vysokého obsahu nenasýtených konjugovaných mastných kyselín a štruktúra možností ich biotechnologického použitia, hlavne v stimula ných faktoroch.

V poslednom období bol venovaný vedecký výskum zna nej asti symbiotických a antagonistických vz ahov mikroflóry, hlavne Slovenskej bryndze, jej vplyvu na zdravotný stav obyvate stva a dlhovekos . Bolo potvrdené a klinicky dokázané že Slovenská bryndza je unikátny, mikrobiálne širokospektrálny a inde neopakovate ný prírodný mäkký zrejúci syr a v tomto ponímaní ako mikrobiálny fenomén!!!

Najnovšie objavy boli zamerané na možnosti využitia polyformizmu bielkovín ov iehomlieka, laktoproteínov a ich hlavných vlastností, súvislosti medzi genetickými variantami mlie nych proteínov, zložením mlieka, jeho spracovaním, vplyvu na výživu a zdravotný stav obyvate stva .

K výživnej hodnote mlieka výrazne prispela modifikácia zloženia mastných kyselín, minerálnych živín, vitamínov a iných protektívnych látok. Klinicky boli overené funkcie revnej mikroflóry v udskom organizme, ich probiotické ú inky i spojitos s pôsobením prebiotík a imunomodula nými ú inkami.

Práve Slovenská bryndza a jej výskum môže pre prax vytvori vedecké predpoklady pre priemyselnú výrobu probiotických potravín. V tej súvislosti je treba uvies , že v menšom rozsahu boli publikované získané probiotické ú inky ov ieho mäsa a niektorých jeho benefitov.

História ov iarstva na Slovensku nám potvrdzuje, že v rozli ných spolo enskýchformáciách a v sú asnom období zvláš , je možné výrazne uplatni komplexné prvky efektívnej akcelerácie chovov a probiotického využívania ov ích produktov.

Pre samotnú výrobu k efektívnym prvkom chovu patrí predovšetkým manažment, evidencia zvierat, selekcia, plemeníci, prevencia a výživa. Z biotechnologických metód akcelerácie, usmernenie reproduk ného cyklu, prvky organiza né, ekonomické a legislatívne.

Pre ov iarstvo budúcnosti je potrebné vymedzenie výroby naturálnych probiotických syrov, aktívny manažment predaja jato ných zvierat. Sezónny predaj a to spravidla na poslednú chví u je po komer nej stránke kontraproduktívny.

Jeden z problémov ov iarstva je aj vytipova spracovate ov vlny do efektívnych výrobkov, hlavne do tradície výroby slovenských kobercov. Dnes nie je organizácia, ktorá by vlnu do týchto výrobkov spracovávala.

30

Z legislatívnych akcelera ných vplyvov treba upravi kontraproduktívnos 51 % - ného podielu ov ieho syra v bryndzi, ke pri dnešných kontrolných mechanizmoch je falšovanie u ve kých výrobcov bryndze od 5 do 29 % v takom istom stave ako v roku 1921, kedy Teodor Vallo navrhol pre neobvyklé rozmery falšovania bryndze zoštátnenie bryndziarní.

Akcelera né prvky rozvoja ov iarstva na Slovensku však vychádzajú z poznania, že nesprávnymi politickými rozhodnutiami dochádzalo k zhoršeniu úrovne kvality a množstva potravín.

Probiotiká a prebiotiká sa vyzna ujú významnými funk nými a zdravotne prospešnými ú inkami. Ich využitie vo forme funk ných potravín a liekových foriem má ve kú budúcnos . S ur itos ou možno potvrdi z doterajších klinických výskumov, že zaujmú významné postavenie v prevencii a terapii naj astejších ochorení, ktoré udstvo postihujú: kardiovaskulárne choroby, rakovina, hypercholesterolémia, osteoporóza, diabetes mellitus, atopické, imunodeficiencie a iné. To v pragmatickej innosti znamená prechod od konzerv pre dlhodobé použitie, k živej, biologicky sofistikovanej širokospektrálnej výrobe potravín.

V sú asných podmienkach je problematika dodržiavania kvality mlie nych výrobkov, ale aj potravín vôbec, priamo úmerná úrovni štátnych dotácií do po nohospodárstva.

Ov iarstvo, napriek všetkým problémom na Slovensku sa v sú asnosti dynamicky rozvíja a má na to ve ké možnosti a predpoklady. Zvláš aktuálny je intenzívny rozvoj salašníckeho i mliekarenského spracovania ov ieho mlieka a ostatných ov ích produktov a problematika rozvoja agroturistiky, v rámci ktorej by sa mali zachova doterajšie tradície, avšak na vyššom kvalitatívnom stupni.

Záverom nedá mi, aby som nespomenul že historický rozvoj ov iarstva a jeho základu mlie neho hospodárstva výrazne ovplyvnili mnohí vynikajúci eskí odborníci. Preto Slovenská história nikdy nemôže zabudnú na odborníkov Laxu, Rosana, Prokeša, Šebelu, Kn za, Olšanského, Formana, Kurza, Hr zu, Horáka a alších, ktorí sa zapísali do Slovenského ov iarstva a vz ahov, ktoré prežili politiku..... .

Po akovanie : Týmto akujem celému autorskému kolektívu a svojím spolupracovníkom pri zostavovaní knižnej publikácie Ov iarstvo na Slovensku.

Kontaktná adresa : Ing. Ján Keresteš, NIKA , spol.s r.o. , Nová ul. .135, 01701 Považská Bystrica, Slovensko.

MLÉKO a SÝRY

P ednášky

33

VARIABILITA SY ITELNOSTI V BAZÉNOVÝCH VZORCÍCH KRAVSKÉHO MLÉKA P ibyla Lubomír1, ejna Vladimír2, Chládek Gustav3

1 Institut analytické chemie AV R, Brno 2 Odd lení vývoje a výzkumu, PRIBINA, spol. s r. o.,

3 Ústav chovu a šlecht ní zví at, Agronomická fakulta MZLU, Brno

Variability of rennet coagulation time in bulk tank milk samples in cattle

Summary:Rennet coagulation time is an elementary processing characteristic which greatly affects quality and quantity of cheese production in cheese-making plants. This experiment was designed to monitor changes in coagulation time over a certain observation period and find differences in rennet coagulation time of milk of different milk producers. We analysed bulk tank samples of milk of 13 producers in weekly intervals (from week 30 to 46). We found a statistically significant effect (P<0.001) of a test week on rennet coagulation time. The best rennet coagulation time (in all producers) was found in week 32 (212 s) and the worst in week 40 (304 s). The effect of producer on rennet coagulation time was also statistically significant (P<0.001). The best rennet coagulation time was found in milk coming from farms 2 and 3 (231 s) and the worst from farm 8 (343 s). Our experiment revealed a major impact of season and milk producer on milk coagulation time. It is obvious that regular milk tests for coagulation time are vital for a successful control of milk-processing in a cheese-making line

Úvod Rozši ující se sortiment mlékárenských výrobk a zvýšení tlaku na ekonomiku jejich výroby vyvolává zvýšené nároky na kvalitu mléka. Navíc vzhledem k celosv tov nar stajícímcenám mléka je t eba maximální znalost zpracovávané suroviny za ú elem nastavení optimálních parametr výrobních linek a tím docílení maximální ekonomiky výroby. Tyto faktory vyvolávají pot ebu poznat dokonale parametry zpracovávané suroviny. Vedle standartn zjiš ovanýchukazatel (fyzikáln -chemicko-mikrobiologických) tudíž nabývají na významu i ty, které se b žnnestanovují. Jedná se p edevším o technologické vlastnosti mléka, které se významnou m roupodílejí na jakosti a rentabilit výroby. Jejich variabilita v pr b hu ro ního období a také mezi jednotlivými dodavateli pak m že výrazn ovlivnit tyto výrobní faktory.

Sy itelnost p edstavuje základní technologickou vlastnost mléka, která se významnou m rou podílí na kvantitativní a kvalitativní produkci sýrárny. Vhodnost mléka k dalšímu zpracování na sýry je dána p edevším odpovídající výt žností (množství vyrobeného sýra ze 100 kg mléka), která tvo í základ ekonomické produkce sýra ze strany výrobce. Tuto vhodnost ovliv ují faktory jako: doba srážení (sy itelnost), kvalita sý eniny, obsah bílkovin, kaseinu, –kaseinu B, kaseinové íslo, obsah tuku, laktózy, vápníku a hodnota pH [1]. Také Ostersen et al. (1997) [2] uvád jí tyto

hlavní sýra ské vlastnosti: obsah kaseinu a vápníku, pH, sy itelnost a kvalita sý eniny. Mlé né koagula ní vlastnosti velmi ovliv ují výslednou kvalitu a kvantitu sýr [3]. Mléko, které koaguluje a tvo í pevnou sý eninu brzy po p idání sy idla, je schopno vyprodukovat více sýr než mléko se špatnými koagula ními vlastnostmi [4]. Také Ikonen et al. (2004) [5], poznamenávají že, pro produkci sýr je žádoucí mléko, které rychle koaguluje (krátký as sy itelnosti) a rychle formuje pevnou sý eninu (vysoká kvalita sý eniny). U erstv nadojeného mléka jsou již technologické vlastnosti dány a závisejí na celé ad faktor , související s individualitou dojnice, plemenem, d di ným založením, po adím a stadiem laktace, ro ní dobou a v nejv tší mí es podmínkami výživy a krmení a zdravotním stavem dojnice. U skladovaného mléka mohou p sobitješt další faktory, které mohou technologické vlastnosti zlepšit nebo zhoršit. Tyto faktory souvisejí jednak se zm nami ve složení mléka v d sledku rozvoje a biochemické innosti kontaminující mikroflóry a jednak s fyzikáln –chemickými zm nami zp sobenými skladováním mléka p i nízké teplot [6]. Shodn Riddell–Lawrence a Hicks (1989) [4] uvád jí, že následné zacházení s mlékem (doba a teplota skladování, tepelné ošet ení, homogenizace a standartizace, typ a koncentrace srážecího enzymu, p ídavek vápenatých solí a srážecí teplota) ovliv uje sy itelnost. Také další

34

environmentální faktory, jako je sezónnost, stadium laktace a výživa ovliv ují sy itelnost mléka [7], p i emž tyto rozdíly jsou zp sobeny p edevším vlivem zm n chemického složení mléka [8].

Velmi významný je také vliv plemene. U kritérií jako je sy itelnost a kvalita sý eninyje z ejmá p evaha plemen strakatého skotu nad plemenem holštýnským. D vodem je výhodn jší obsah bílkovin, p edevším pak zastoupení kaseinu a jeho frakcí [9]. Studie zjiš ující rozdíly v koagula ních vlastnostech mléka mezi r znými plemeny byly zpracovány ve Velké Británii [10], Francii [11], Itálii [12; 13], Irsku [14] a na Novém Zéland [15]. V eské republice byly v posledních letech vypracovány tyto studie zabývající se vlivem plemenné p íslušnosti dojnic na technologické vlastnosti mléka: [16; 17; 18; 19]. V sý enin vzniklé z mléka s dobrou sy itelností je zachyceno více kaseinu a tuku p i následném krájení. Vzhledem k tomu, že kasein a tuk p edstavují kolem 90 % sušiny sýr ,ze ztráty t chto komponent do syrovátky projeví v úrovni dosahované výt žnosti sýr [20]. Obdobn Aleandri et al. (1989) [21] a Riddell–Lawrence a Hicks (1989) [4] zjistili, že od mléka s dobrou sy itelností a tvorbou kvalitní sý eniny lze o ekávat produkci sýr s vyšší sušinou než u mléka se špatnými koagula ními vlastnostmi. To potvrzují i Ikonen et al. (1999) [22], kte í z mléka s dobrou sy itelností vyrobili sýry ementálského typu s vyšší sušinou, s nižším obsahem tuku a kaseinu v syrovátce oproti mléku se špatnou sy itelností. P edpokládají,že zlepšování sy itelnosti v bazénových vzorcích zlepší kvalitu sýra ských proces . V d sledkusou asných zm n v oblasti chovu skotu (technika ustájení, výživa, plemenná skladba) je nutné v novat pozornost vlivu t chto faktor na zm ny v sy itelnosti mléka. Sledování sy itelnosti by m lo probíhat nejen na úrovni pr myslového zpracování (mléko na výrobníku), ale také na úrovni prvovýroby mléka (bazénové vzorky) a šlecht ní skotu (individuální vzorky) [23].

Cílem tohoto projektu je posouzení variability sy itelnosti u jednotlivých dodavatela také zjišt ní vlivu sezóny na zm ny tohoto parametru. Znalost této problematiky je zejména d ležitá pro sýra ské provozy, které na tyto zm ny mohou reagovat v asnými zásahy do technologie výroby.

Materiál a metodikaData pro tuto studii byla získána z bazénových vzork kravského mléka. Vzorky byly

odebírány 1x týdn v rámci jednoho dne. Odb r vzork probíhal od 30. do 46. týdne. Vzorky p edstavují sm s ranního a ve erního nádoje. Analýza vzork probíhala okamžit po p íjezdu svozné cisterny do mlékárny. Sledované farmy byly dodavatelé s r znou dodávkou mléka (80 – 20 000 litr /denn ) se zastoupením jak kombinovaných tak mlé ný plemen, pop . s jejich r zným podílem ve stád . Sledované farmy se nacházely v severní ásti kraje Vyso ina. Celkem bylo analyzováno 212 bazénových vzork mléka. Sy itelnost byla m ena pomocí turbidimetrického sníma e koagulace mléka (obr. 1). Tento p ístroj se vyzna uje svojí jednoduchostí a odolností. Jako kyveta m eného vzorku mléka je použita sterilní 2 ml injek ní st íka ka. Optický detektor p ístroje p evádí intenzitu procházejícího sv tla na elektrický signál a velikost nap tí na výstupu optického detektoru je funkcí intenzity sv tla, které na optický detektor dopadá. B hem koagulace dochází k úbytku optického signálu, což se projeví úbytkem m eného nap tí. Tento pr b h je okamžit derivován a výsledné vysrážení para–kaseinu odpovídá minimální hodnot deriva ní k ivky. Vzorek mléka (25 ml) byl vytemperován na 35 °C s následným p ídavkem 200 l sy idla (mikrobiální sy idlo, 220 IMCU, ed ní 1:9) a promíchán. Poté se odebralo m ící sondou (injek ní st íka ka) 2 ml mléka a sonda

byla míst na do m ící cely sníma e. Po 30 s od p ídavku sy idla do mléka byl zapnut start s následným záznamem analýzy. K výslednému asu zm eného sníma em bylo poté p i teno 30 s. Aktivní kyselost byla m ena pH-metrem WTW pH 197. Titra ní kyselost byla provád nadle SN 57 0530 l. 58.

35

Výsledky a diskuze Pr m rná sy itelnost a její variabilita sledovaného souboru farem v jednotlivých kalendá ních týdnech uvádí tab I. Grafické znázorn ní zm n pr m rné sy itelnosti sledovaného souboru farem je patrné z grafu 1. Pr m rná sy itelnost se ve sledovaném období pohybovala v intervalu 212 (32. týden) až 304 s. (40. týden). Rozdíl mezi nejlepší a nejhorší sy itelností tedy inil 92 s; ili prodloužení sy itelnosti o 43 %. Nejvíce m ení se pohybovalo v intervalu 245 až

290 s. (31; 36 – 39; 41 – 46 týden). Pr m rná hodnota sy itelnosti za celé sledované období byla 267 s. Nejlepší sy itelnost mléka byla zjišt na ve 30. a 32. týdnu (238; 212 s). Naopak nejhorší sy itelnost byla zaznamenána ve 40. a 46. týdnu (304; 286 s). Obecn lze íci, že ve druhé polovinsledovaného období byla tato vlastnost mírn horší než v první polovin období. Nejlepší sy itelnost z 32. týdne nelze p ímo vysv tlit p sobením kyselosti mléka, i když aktivní kyselost byla pon kud nižší (6,66) v rámci hodnot celého sledovaného období (tab. II), nicmén hodnota titra ní kyselosti (6,33) je pon kud nep íznivá pro dosažení velmi dobré sy itelnosti. Z tohoto lze usoudit na p sobení n kterého dalšího vlivu, pop . vliv , které v této práci nebyly sledovány. Zjistili jsme vysoce statisticky pr kazný vliv (P<0,001) sledovaného období na sy itelnost mléka. Obdobný výsledek uvád jí i Summer et al. (2000) [24]. Pon kud menší vliv sezóny na sy itelnost mléka (P<0,01) publikovali Mariani et al, (1999) [25]. V rámci jednotlivých m síc roku zjistili Marchi et al. (2006) [26] nejlepší sy itelnost v m sících zá í a íjen a nejhorší v m sících leden a únor. Mariani et al. (1999) [25] zjistili nejlepší sy itelnost v m sících duben a ervenec (17,7; 18,8 min) a nejhorší v m sících srpen a zá í (20,5; 20,7 min). Variabilita sy itelnosti se ve sledovaném období pohybovala v intervalu od 7,0 (36. týden) do 21,0 % (30. týden). Nejvíce se variabilita pohybovala v intervalu od 13 do 19 % (33. – 35; 38. – 42.; 45. a 46. týden). Pr m rnávariabilita za celé sledované období byla 15,9 %. Nezaznamenali jsme výrazný trend zm nyvariability v sy itelnosti v pr b hu sledovaného období. Zjišt ná variabilita sy itelnosti bazénových vzork je nižší než variabilita sy itelnosti v individuálních vzorcích, nebo v bazénových vzorcích jsou více eliminovány rozdíly v individualit dojnice. Nap . ejna (2006) [27] uvádí variabilitu sy itelnosti v individuálních vzorcích kravského mléka 35,4 a 26,1 %. Obdobn Hanuš et al. (1995) [28] uvád jí u individuálních vzork variabilitu sy itelnosti 36,0 %.

Pr m rná sy itelnost jednotlivých farem za celé období uvádí tab. III. Grafické znázorn nípr m rné sy itelnosti jednotlivých farem je patrné z grafu 2. Nejlepší sy itelnost byla zaznamenána u farem 2, 3, 11 a 12 (231; 231; 236 ; 237 s) a nejhorší sy itelnost u farem 6, 7, 8 a 10 (304; 302; 343 a 297 s). Rozdíl mezi nejlepší sy itelností u farem 2 a 3 (231 s) a nejhorší u farmy 8 (343 s) byl 113 s; tedy zhoršení sy itelnosti o 49 %. Jak je patrné z grafu 2, jsou farmy, které dosahují velmi dobré sy itelnosti a druhou stranu jsou farmy s pon kud horší sy itelností. Mezi hlavní faktory, které mohly zp sobit tyto rozdíly, pat í zejména zootechnické a veterinární podmínky na jednotlivých farmách (plemeno, výživa, zdravotní stav). Zjistili jsme vysoce statisticky pr kaznývliv (P<0,001) farmy na sy itelnost mléka. Nejmenší variabilita sy itelnosti byla zaznamenána u farmy 9 (8,3 %), nejv tší u farmy 10 (20,3 %). Hanuš et al. (2007) [29] udávají variabilitu sy itelnosti u bazénových vzork ze 13 ekologických farem 17,3 % s intervalem asu sy itelnostiod 94 – 184 s.

36

Tab. I.: Pr m rná sy itelnost sledovaného souboru farem v jednotlivých kalendá ních týdnech

Tab. II.: Pr m rná titra ní a aktivní kyselost sledovaného souboru farem v jednotlivých kalendá ních týdnech

týden pr m r

(s) min max Sx v% týden SH pH

30 238 190 359 50,0 21,0 30 6,88 6,69 31 272 204 408 56,8 20,9 31 6,59 6,70 32 212 179 221 23,5 11,1 32 6,33 6,66 33 278 236 366 42,2 15,2 33 6,38 6,70 34 248 209 389 45,7 18,4 34 6,45 6,73 35 273 217 377 38,1 14,0 35 6,38 6,66 36 261 222 287 18,3 7,0 36 6,65 6,65 37 257 185 362 49,4 19,2 37 6,61 6,69 38 252 195 320 35,4 14,1 38 6,50 6,68 39 277 218 370 49,4 17,9 39 6,41 6,75 40 304 245 413 51,4 16,9 40 6,42 6,65 41 281 232 366 38,4 13,7 41 6,43 6,71 42 273 220 330 37,7 13,8 42 6,39 6,71 43 275 203 411 54,0 19,7 43 6,54 6,72 44 279 231 390 43,8 15,7 44 6,51 6,74 45 275 237 341 33,6 12,3 45 6,54 6,72 46 286 220 392 53,4 18,7 46 6,55 6,72

Tab. III.: Pr m rná sy itelnost jednotlivých farem za sledované období

Obr. 1: Turbidimetrický sníma koagulace mléka

farma pr m r(s) min max Sx v%

1 242 185 319 31,6 13,1 2 231 192 294 24,0 10,4 3 231 179 255 20,6 8,9 4 246 193 283 22,8 9,3 5 270 193 348 32,4 12,0 6 304 230 408 43,1 14,2 7 302 248 351 27,7 9,2 8 343 251 411 43,7 12,7 9 246 212 268 20,4 8,3

10 297 207 413 60,5 20,3 11 236 195 278 21,9 9,3 12 237 195 268 20,0 8,4 13 270 207 319 30,4 11,2

37

200

220

240

260

280

300

320

340

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

farma

[s]

sy itelnost

150

170

190

210

230

250

270

290

310

330

350

30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

týden (2007)

[s]

sy itelnost

Záv r Sy itelnost mléka významn ovliv uje kvantitativní i kvalitativní produkci sýrárny. Zjistili jsme vysoce statisticky pr kazný vliv (P<0,001) sledovaného období na sy itelnost mléka. Tyto zm ny v pr b hu sezóny pak mohou negativn ovlivnit produkci sýrárny a znalost p ípadných sezónních výkyv m že tyto dopady ú eln eliminovat. Dále jsme zjistili vysoce statistickypr kazný vliv (P<0,001) farmy na sy itelnost mléka. Tato skute nost ukazuje na významný vliv dodavatele mléka na jeho sy itelnost. Tento experiment ukázal na d ležitost sledování sy itelnosti mléka jak z pohledu sezónních zm n tak z pohledu dodavatele mléka.

Pod kování:P ísp vek byl vypracován s podporou projektu NAZV QF4082, MZe.

Použitá literatura:1. BUCHBERGER, J. – BIECHL, CH. – MILLER, M. – UTH, M. – WILLEKE, H. Vliv plemene na vhodnost mléka ke zpracování na sýry. Zpravodaj svazu chovatel a plemenné knihy eského strakatého skotu, 2005, . 1, s. 15. ISSN: 1214-8016. 2. OSTERSEN, S. – FOLDAGER, J. – HERMANSEN, J. E. Effects of stage of lactation, milk protein genotype and body condition at calving on protein composition and renneting properties of bovine milk. J. Dairy Res., 1997, vol. 64, no. 2, s. 207–219. ISSN: 0022-0299. 3. WEDHOLM, A. – LARSEN, L. B. – LINDMARK-MÅNSSON, H. – KARLSSON, A. H. – ANDRÉN, A. Effect of protein composition on the cheese–making properties of milk from individual dairy cows. J. Dairy Sci., 2006, vol. 89, no. 9, s. 3296–3305. ISSN: 0022-0302. 4. RIDDELL-LAWRENCE, S. – HICKS, C. L. Effect of curd firmness on stirred curd cheese yield. J. Dairy Sci., 1989, vol. 72, no. 2, s. 313–321. ISSN: 0022-0302. 5. IKONEN, T. – MORRI, S. – TYRISEVÄ, A.-M. – ROUTTINEN, O. – OJALA, M. Genetic and phenotypic correlations between milk coagulation properties, milk production traits, somatic cell count, casein kontent and pH of milk. J. Dairy Sci., 2004, vol 87, s. 458–467. ISSN: 0022-0302. 6. GAJD ŠEK, S. Laktologie. Brno: MZLU, 2003, 84 s. ISBN: 80-7157-657-3. 7. DAVOLI, R. – DALLOLIO, S. – RUSSO, V. Effect of –casein genotype on the coagulation properties of milk. J.Anim. Breed. Genet., 1990, vol. 107, no. 6, s. 458–464, ISSN: 0931-2668. 8.TYRISEVÄ, A.-M. – VAHLSTEN, T. – RUOTTINEN, O. – OJALA, M. Noncoagulation of milk in finnish Ayshire and Holstein-Friesian cows and effect of herds on milk coagulation ability. J. Dairy Sci., 2004, vol. 87, no. 11, s. 3958–3966. ISSN: 0022-0302. 9. KU ERA, J. – KRÁL, P. eský strakatý skot – výsledky a budoucnost. In Den mléka 2005, ZU Praha, 2005, s. 7–9. ISBN: 80-213-1327-7. 10. VERDIER-METZ, I. – COULON, J. B. – PRADEL, P. – VIALLON, C. – BERDAGUE, J. L. Effect of forage conservation (hay or silage) and cow breed on the coagulation properties of milks and on the characteristics of ripened cheeses. J. Dairy Res.,1998, vol. 65, no. 1, s. 9–21. ISSN: 0022-0299. 11. MACHEBOEUF, D. – COULON, J. B –DHOUR, P. Effect of breed, protein genetic–variants and feeding on cows milk coagulation properties. J. Dairy Res., 1993, vol. 60, no. 1, s. 43–45. ISSN: 0022-0299.

Graf 1 Pr m rná sy itelnost sledovaného souboru farem v jednotlivých kalendá níchtýdnech

Graf 2 Pr m rná sy itelnost jednotlivých farem za sledované období

38

12. CHIOFALO, V. – MALDONATO, R. – MARTIN, B. – DUPONT, D. – COULON, J. B. Chemical composition and coagulation properties of Modicana and Holstein cows´ milk. Ann. Zootech., 2000, vol. 49, no. 6, s. 497–503. ISSN: 0003-424X. 13. MALACARNE, M. – SUMMER. A. – FOSSA, E. – FORMAGGIONI, P. – FRANCESCHI, P. – PECORARI, M. – MARIANI, P. Composition, coagulation and Parmigiano-Reggiano cheese yield of Italian brown and Italian friesian herd milks. J. Dairy Res., 2006, vol. 73, no. 2, s. 171–177. ISSN: 0022-0299. 14. AULDIST, M. J. – MULLINS, C. – O´BRIEN, B. – O´KENNEDY, B. T. – GUINEE. T. Effect of cow breed on milk coagulation properties. Milchwissenschaft, 2002, vol. 57, no. 3, s. 140 – 143. ISSN: 0026-3788. 15.AULDIST, M. J. – JOHNSTON, K. A. – WHITE, N. J. – FITZSIMONS, W. P. –BOLAND, M. J. A comparison of the composition, coagulation characteristics and cheese making capacity of milk form Friesian and Jersey dairy cows. J. Dairy Res., 2004, vol. 71, no. 1, s. 51–57. ISSN: 0022-0299. 16. KOŠ, J.: Porovnání mlé né užitkovosti dojnic holštýnského a montbeliardského plemene skotu na farm Pap vka. Diplomová práce. AF MZLU Brno, 2006, 59 s 17. EJNA, V. – CHLÁDEK, G. Zhodnocení rozdíl v sýra ských vlastnostech mléka mezi dojnicemi holštýnského a montbeliardského plemene. In: Mléko a sýry 2006, Praha: eská spole nost chemická, 2006, s. 53 – 58, ISBN: 80-7080-620-6. 18. EJNA, V. – ML EK, J. – CHLÁDEK, G. Vliv plemene a po adí laktace na obsah kaseinu v kravském mléce. In Den mléka 2006, Praha: ZU, 2006, s. 98–99. ISBN: 80-213-1498-2. 19. HANUŠ, O.- FRELICH, J.- ROUBAL, P.- VORLÍ EK, Z.- ÍHA, J- POZDÍŠEK, J.- BJELKA, M. Vlivy plemenné p íslušnosti dojnic na n které chemicko-složkové, fyzikální, zdravotní a technologické mlé né ukazatele. Výzkum v chovu skotu, 2003, ro . 45, . 4, s. 1-10. ISSN: 0139-7265. 20. POLITIS, I. – NG-KWAI-HANG, K. F. Effects of somatic cell and milk composition on cheese composition and cheese making efficiency. J. Dairy Sci., 1988, vol. 71, no. 7, s. 1711-1719. ISSN: 0022-0302. 21. ALEANDRI, R. – SCHNEIDER, J. C. – BUTTAZZONI, L. G. Evaluation of milk for cheese production based on milk characteristics and Formograph measures. J. Dairy Sci., 1989, vol. 72, no. 8, s. 1967–1975. ISSN: 0022-0302. 22. IKONEN, T. – RUOTTINEN, O. – SYVAOJA, E. L. – SAARINEN, K. – PAHKALA, E. – OJALA, M. Effect of milk coagulation properties of herd bulk milks on yield and composition of Emmental cheese. Agricultural and food science in Finland., 1999, vol. 8, no. 4–5, s. 411–422. ISSN: 1239-0992. 23. EJNA, V. – P IBYLA, L. Význam sledování sy itelnosti mléka. Potraviná ská revue, 2007, ro . 4, . 3, s. 91–93. ISBN neuvedeno. 24. SUMMER, A. – FORMAGGIONI, P. – TOSI, F. – FOSSA, E. – MARIANI, P. Effects of the hot-humid climate on rennet coagulation properties of milk produced during summer months of 1998 and relationships with the housing systéme in the rearing of Italian friesian cos. Annali della Facolta di Medicina Veterinaria, Universita di Parma, no. 19, vol. XX, 2000, s. 167 – 179, ISSN: 0393-4802. 25. MARIANI, P. – SUMMER, A. – FORMAGGIONI, P. – BELTRAMI, A. – SANDIR, S. Andamento mensile delle principali caratteristiche di coagulazione del latte di singoli allevamenti di vacche di razza frisona con particolare riguardo alla velocità di formazione del coagulo. Annali della Facolta di Medicina Veterinaria, Universita di Parma, no. 18, vol. XIX, 1999, s. 65 – 83, ISSN: 0393-4802. 26. MARCHI, de M. – ZOTTO, D. R. – CASSANDRO, M. – BITTANTE, G. Milk coagulation ability of five dairy cattle breeds. J. Dairy Sci., 2007, vol. 90, no. 8, s. 3986-3992. ISSN: 0022-0302. 27. EJNA, V.: Vliv laktace krav na vybrané technologické vlastnosti mléka. Diserta ní práce. AF MZLU Brno, 2006, 120 s 28. HANUŠ, O. – GAJD ŠEK, S. – BEBER, K. – FICNAR, J. – JEDELSKÁ, R. Složení a technologické vlastnosti mléka od dojnic ve st ední ásti laktace a jejich vzájemné vztahy. Živo išná výroba, 1995, ro . 40, . 12, s. 555–561. ISSN: 0044-4847. 29. HANUŠ, O. – GEN UROVÁ, V. – ROUBAL, P. – JAN , L. – ROZSYPAL, R. – VYLET LOVÁ, M. – MACEK, A. Vybrané aspekty zdraví dojnic, kvality vody a mléka ekologicky mléka ících farem v eské republice.Výzkum v chovu skotu, 2007, ro . 49, . 3, s. 1-13. ISSN: 0139-7265.

Kontaktní adresa:Ing. Lubomír P ibyla, email: LPRIBYLA@SEZNAM.CZ; tel: 723 120 569

39

RÝCHLA IDENTIFIKÁCIA PATOGÉNOV MASTITÍD, ZÁRUKA VÝROBY KVALITNÉHO SUROVÉHO MLIEKA AKO SUROVINY PRE VÝROBU SYROV

Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína Slovenské centrum po nohospodárskeho výskumu, Výskumný ústav živo íšnej výroby, Nitra

Rapid identification of mastitis pathogens – guarantee of good quality raw milk production as raw material for chees production

Summary:Sales for milk depend on observance of specified characteristics of quality. Good state of health in mammary gland of dairy cows is the basis for production of good quality milk. Particularly the disorder of mammary gland is the greatest health problem in breeding of dairy cows nowadays. Milk from healthy herds is the guarantee of good quality cheese production. The breeder must gain milk from healthy individuals to produce milk of high quality. Identification of risk dairy cows is possible in different ways: partly visually, by stable tests, on the basis of SCC in individual dairy cows, and partly in the bulk sample. Another way are the laboratory tests of milk to detect pathogens of mastitis. It is possible to obtain information which pathogen is present in the herds in various ways, which have their advantages and disadvantages, as well as typical spheres of utilization. They are: bacteriological examination of individual cows in the herd, tests of milk bulk sample for presence of pathogens, and a new method, which we test – tests of filter on presence of pathogens. We try to base the new method also on quantitative evaluation of pathogens occurrence. Results from first experiments will be presented. They were obtained during the departmental research. The benefit consists in the possibility to estimate the prevalence of the given pathogen in stable on the basis of results from basin or filter sample analyses.

Základom výroby kvalitného mlieka je dobrý zdravotný stav mlie nej ž azy dojníc. Ochorenie mlie nej ž azy – mastitída – je v dnešnej dobe, ved a porúch plodnosti, najvä ším zdravotným problémom v chovoch dojníc. Z poh adu prvovýrobcu mlieka je odhad strát len zo zníženej produkcie 10 – 30 %. alšie straty však vznikajú prvovýrobcom z :

- nespracovate ného mlieka pri ošetrení vemena, - zrážok z platieb za mlieko, - nákladov na obnovu stáda, - nákladov na veterinárne ošetrenie.

Mastitída – téma na odborný seminár na celý de – je zápalové ochorenie mlie nej ž azy,spôsobené patogénnymi mikroorganizmami.

Je to polyfaktoriálne ochorenie, kde riziko vzniku ovplyv uje dojnica, prostredie a infek né mikroorganizmy.

Najspo ahlivejším indikátorom zdravotného stavu mlie nej ž azy je po et somatických buniek (PSB) v mlieku. Zvýšený PSB je známkou ochorenia, je ukazovate om zdravotného stavu. Jednozna ná hranica medzi hodnotami „zdravými“ a „dobrými“ neexistuje, prechod medzi nimi je plynulý. Bunky však v mlieku nie sú schopné sa množi , preto sa ich po et nezvyšuje.

Stanovenie po tu somatických buniek1. V rámci stáda – bazénová vzorka udáva obraz o zdravotnom stave dojníc celého stáda. Neodhalí

však dojnice so zvýšeným PSB, ktoré sú hlavne zdrojom infekcie pre alšie dojnice. 2. Individuálne vyšetrenia – vysoká presnos a možnos cieleného postupu opatrení v stáde.

PSB je možné stanovi : - presne – prístrojové stanovenie v laboratóriu (CSL, kontrola úžitkovosti dojníc), - odhadom – tzv. mašta ný NK-test.

- pomocou merania elektr. vodivosti Pod a výsledkov poradenského servisu odporú ame kontrolu zdravotné stavu vemien

v stáde robi v dvojtýžd ových intervaloch, striedaním zis ovania PSB v rámci kontroly úžitkovosti a vyšetrenia NK-testom. Odporú ame zavies individuálnu evidenciu o zdravotnom stave, i už formou eviden ných kariet alebo elektronickou formou.

40

Aké sú prí iny zvýšeného PSBIch obsah je ovplyvnený rôznymi faktormi. Každý chovate vie, že aj pri zdravých

dojniciach môže PSB kolísa bez toho, aby nastala porucha zdravotného stavu mlie nej ž azy.S d žkou laktácie PSB stúpa, hlavne pri dojniciach krátko pred zasušením. PSB súvisí aj s plemenom a v podstate kopíruje úžitkovos . So zvyšovaním úžitkovosti PSB stúpa. PSB zvyšuje nadmerne mechanické za aženie, ale hlavne poruchy zdravotného stavu mlie nej ž azy. Škodlivé vplyvy pôsobiace na dojnicu alebo priamo na tkanivo mlie nej ž azy vyvolávajú obrannú reakciu organizmu. Špeciálne obranné bunky (hlavne leukocyty) vystupujú z cievneho rie iš a do tkaniva mlie nej ž azy a z neho do mlieka.

Negatívne faktory môžeme rozdeli do dvoch skupín : podráždenie mlie nej ž azy,infekcie a zápaly mlie nej ž azy, spôsobené mikroorganizmami.

Neinfek né prí inyExistuje ve a faktorov, ktoré môžu zvýši PSB bez infekcie. Tieto faktory pôsobia

z prostredia, ale aj v samotnej dojnici. Faktory individuálne :

vrodené dispozície – plemeno – chovate ský ukazovate zdravotného stavu mlie nej ž azy má len stredný alebo nízky stupe dedi nosti, ale genetická základ a je široká a dá sa selekciou dosiahnu pozitívny výsledok, štádium laktácie – v prvých a posledných týžd och laktácie, ako aj v posledných týžd ochbrezivosti je zvýšená náchylnos k poruchám zdravotného stavu, tvar vemena – nízko zavesené vemeno zvyšuje nebezpe enstvo poranenia a infekcie, úrove metabolizmu - ovplyv uje stav imunity, metabolické zá aže zvyšujú PSB.

Faktory vonkajšieho prostredia: ro né obdobie – v letných mesiacoch PSB stúpa (tepelný stres, pastva), chyby pri dojení – nedostato ná hygiena mlie nej ž azy, dlhé dojenie, chyby v technike dojenia – vysoký podtlak, zlé ukon enie dojenia, opotrebované ceckové gumy, nedostato ná hygiena – mašta , vemeno, dojacie zariadenie, chyby v ustajnení – rošty, klzký povrch, chyby v k mení – nedostatok energie, vlákniny, ketózy.

Infek né prí inyMedzi naj astejších pôvodcov mastitíd patria streptokoky, stafylokoky, koliformné kmene,

baktérie spôsobujúce hnisanie a hnilobné baktérie. V poslednom období dochádza naj astejšiek infekciám, ktoré sú spôsobené poslednými tromi typmi mikroorganizmov. Hlavne pri streptokokoch a stafylokokoch sa vyskytujú kmene, ktoré sú typickým pôvodcom mastitíd. Sú ve mi dobre prispôsobené vnútornému prostrediu mlie nej ž azy a prenášajú sa vä šinouz jedného vemena na druhé (rukami doji ov, ceckovými nástr kami, utierkami). alšími a v poslednom období ve mi rozšírenými pôvodcami sú mikroorganizmy z vonkajšieho prostredia (enviromentálne). Pochádzajú z okolia dojnice a prenášajú sa kontaktom (hnoj, podstielka, muchy a pod.).

Enviromentálne mastitídy: v poslednom období obrovský nárast – sú zaznamenávané zmeny v zastúpení patogénov - zdroje vonkajšieho prostredia - extrémne rýchlo sa množia - enviromentálne streptokoky (Enterococcus, Str. uberis, coli baktérie) naj astejšia nákaza - v dobe zasušenia, - v období pôrodu.

41

Nie je však možné vies boj proti nepriate ovi, ktorého nepoznáme. Je teda potrebné zamera sa na :

Kontrolu mlie nej ž azy - pod kontrolou sa rozumie pozorovanie vemena, posúdenie mlieka a urobenie NK-testu.

Laboratórne vyšetrenie mlieka – detekcia pôvodcov mastitídPresné stanovenie pôvodcov ochorení mlie nej ž azy je možné len mikrobiologickým

vyšetrením mlieka v laboratóriu. Informácie o tom, ktorý mikroorganizmus je v stáde prítomný, možno získa v zásade

tromi spôsobmi, ktoré majú svoje výhody aj nevýhody a aj typické oblasti využitia.

1. Bakteriologické vyšetrenie jednotlivých dojníc v stádeVýhody : - detailný preh ad o infekciách jednotlivých dojníc,

- možnos detekcie širokého spektra patogénov v mlie nej ž aze,- možnos stanovenia citlivosti k antibiotikám.

Nevýhody : – ve mi nákladné a prácne, ve mi drahé. Použitie : – cielené ozdravenie dojníc v stáde aj v priebehu laktácie

2. Vyšetrenie bazénovej vzorky mlieka na prítomnos patogénovVýhody : – ve mi lacné vyšetrenie, minimálne náklady pre prvovýrobcu. Nevýhody : – praktická možnos detekcie len nieko kých patogénov (ve ké rozptýlenie patogénov

vo ve kom množstve mlieka), ale dáva preh ad o celkovej situácii v stáde. Použitie : – plošný screening, kontrola postupov pri mastitídnych programoch,

- periodická kontrola.

3. Vyšetrenie filtra na prítomnos patogénovVýhody : – lacné vyšetrenie, záchyt patogénov je vyšší nako ko všetko mlieko preteká filtrom Nevýhody : – zložitejšia metóda pre stanovenie patogénov v laboratóriu

- ochrana pred sekundárnou kontamináciou filtra po as dopravy do laboratória Použitie : – zistenie zastúpení hlavných patogénov v stáde,

- periodická kontrola, - kontrola ú innosti mastitídneho programu. Získavanie výsledkov bazénových vzoriek mlieka a vyšetrenie filtra je pre rýchlu a prvú

informáciu ve mi dôležité pre chovate a.

Interpretácia výsledkov bazénových vzoriek na prítomnos patogénov nie je založená len na kvalitatívnom hodnotení. Snažili sme sa metodiku založi aj na kvantitatívnom hodnotení výskytov patogénov. Prínos tohto prístupu spo íva v možnosti odhadu prevalencie (% po tu dojníc, pri ktorých je patogén rozšírený) daného mikroorganizmu v maštali, na základe výsledkov z bazénových vzoriek. Tak ako bazénový PSB s ur itými výhradami odráža celkový zdravotný stav mlie nych žliaz dojníc, po ty patogénov umož ujú relatívne presný odhad prevalencie. Na základe rozsiahlych súborov výsledkov individuálnych aj bazénových vzoriek, sme sa snažili ur iprevalencie jednotlivých patogénov.

Výsledky je možné uvies aj formou tabu ky. Pre jednotlivé patogény sú v nej uvedené, proti hodnotám koncentrácie patogénov v bazéne (KTJ/ml), najpravdepodobnejšie prevalencie v stáde. Tabu ka obsahuje maximálne a minimálne hranice prevalencie, ktoré je možné pre dané hodnoty o akáva . Ke máme napríklad výsledok pre Staphylococcus aureus v bazéne 200 KTJ/ml (hodnota x v tabu ke), najpravdepodobnejšia je cca 20 % prevalencia St. aureus v stáde.

42

Tabu ka I Odhad prevalencie patogénov v stáde na základe ich po tu v bazénovej vzorke.

Hodnota x Staphylococcus aureusodhad

Streptococcus agulactiaeodhad

0 0 0 10 2,0 1,0 50 7,0 4,5 100 12,5 7,0 200 20,5 13,5 300 26,5 17,5 500 36,0 24,5 700 43,5 30,0

1000 52,0 36,5 1500 63,0 44,5

Aké nové poznatky odporu i pre výrobcov mlieka. Ve mi dôležitá je prevencia vzniku ochorenia. V chovoch sa lie ba infikovaných dojníc presúva do kategórie dojníc, ktoré sú podozrivé

z infekcie (nerentabilná je lie ba „milionárok“), to sú dojnice, kde vidíme 50 % zvýšenie PSB oproti poslednému odberu. Dôležité je vykonáva kontrolu PSB v 4. de po pôrode – tzn. vychytáva dojnice „otelené s infekciou“.

Pozitívne pre chovate a je sledovanie ukazovate a PSB pri kontrole úžitkovosti – pre odhad plemennej hodnoty býkov pre PSB. Genetická korelácia PSB a výskytu mastitíd je 0,65. Preto zahrnutie údajov o výskyte mastitíd do š achtite ského cie a môže prispie k zlepšeniu zdravia dojníc.

Záverom treba poveda , že uvedené výsledky sú sú as ou rezortnej výskumnej úlohy MP SR a bude tvori sú as komplexného ozdravovacieho programu proti mastitídam.

Kontaktná adresa:Ing. Vladimír Foltys, PhD., Slovenské centrum po nohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, foltys@scpv.sk

43

SKÚSENOSTI S APLIKÁCIOU POŽIADAVIEK NK (ES) . 1664/2006NA HODNOTENIE MIKROBIOLOGICKEJ KVALITY SUROVÉHO OV IEHO MLIEKA

POUŽITÍM ALTERNATÍVNEJ SKÚŠOBNEJ METÓDY Tomáška Martin, Hofericová Margita, Kološta Miroslav

Výskumný ústav mliekárenský, a.s.; SL EXAMINALA

Experiences with application of requirements of CR (EC) 1664/2006 for assessment of microbiological quality of raw sheep milk by using routine testing method

Summary:Sheep milk is mainly utilized for production of cheese specialties in Slovakia. Laser flow cytometry (Bactoscan FC 50 H, Foss Electric, Denmark) is used for determination of bacteriological quality of the milk in laboratory EXAMINALA. As the results are used for the purpose of milk quality assessment (Regulation (EC) 853/2004), the method has to fulfill criteria required by CR (EC) 1664/2006. Establishment of the suitable conversion of the primary measured results into the scale of the anchor method (EN ISO 4833) – CFU/ml and its permanent verification is the most crucial for the laboratory, as a validation procedure of the routine method has already been performed by producer of the equipment. The representative conversion equation (model of linear regression of log transformed data) was firstly created in 2004 according recommendation of ISO 21187. Since 2005 validity of the regression has been regularly verified, using statistical tools described in ISO 8196-2. During last two years the equation was twice slightly amended, as differences between directly measured results by the anchor method and converted results from the routine method were statistically significant. However the changes were almost imperceptible. Despite of the applied testing method, the quality of raw sheep milk rises up. Presented study can be also employed on other routine microbiological methods and matrixes. The plan is to perform similar work on a new biosensor (EU project PATHOMILK) which should be able to detect (and hopefully also quantify) of S. aureus in milk.

ÚvodNa Slovensku vzrastá popularita ov iarstva vo viacerých smeroch. Chov oviec prináša

úžitok po stránke produkcie mlieka, mäsa, kožušín a koží, ale aj ako krajinotvorný prvok (starostlivos o pasienky, salašníctvo) a ako sú as rozvíjajúceho sa ekoturizmu. Samozrejme, mliekárov zaujímajú ovce predovšetkým pre potenciál produkcie mlieka, ktoré má výrazne odlišné vlastnosti, ako mlieko kravské. Tieto rozdiely sú všeobecne známe. Ov ie mlieko sa spracováva predovšetkým na syry a rôzne syrárske špeciality, v menšej miere na tekutý program – typický kyslomlie ny nápoj žin icu a jeho rôzne odvodeniny. Najznámejším ov ím syrom je tradi násalašnícka hrudka a z nej vyrábaná bryndza.

Spôsob spracovania ov ieho mlieka sa zna ne vyvíja, diverzifikuje a mení. Okrem malovýroby (systém salaš – bryndziare ), ktorá pretrváva aj na alej, rastie výroba mlie nychšpecialít aj v tzv. priemyselných mliekár ách. Aplikované technológie sú rôzne a samozrejme podmienené dostupným technologickým vybavením. A tak sa na Slovensku môžete stretnú s bryndzou, ktorá bola napríklad vyrobená s pasterizovaného i nepasterizovaného ov ieho mlieka.

alšou zmenou v spracovaní je práve kladenie dôrazu na bezpe nos ov ích výrobkov. Všetky prevádzky, bez oh adu na kapacitu, vyrábaný sortiment, musia plni základné požiadavky tzv. „hygienického balí ka“. Jeho sú as ou sú aj kritéria na mikrobiologickú kvalitu mlieka a spôsob jej hodnotenia.

Najbežnejším, ale aj najorienta nejším znakom, ktorý vyjadruje celkovú mikrobiologickú kvalitu mlieka je celkový po et mikroorganizmov. Ur enou metódou na jeho meranie je kultiva ná metóda pri 30°C pod a EN ISO 48331, ktorou je možné mera KTJ v jednom mililitri mlieka. V týchto jednotkách sú stanovené aj limity pre prijate nos surového mlieka a to v nariadení (ES) . 853/20042. Pre surové ov ie mlieko, ktoré bude predmetom tepelného ošetrenia je hrani ná

hodnota (stanovená ako k zavý geometrický priemer hodnôt za obdobie dvoch mesiacov pri najmenej dvoch vzorkách za mesiac) 1 500 000 KTJ/ml a pokia nebude tepelne ošetrené je to 500 000 KTJ/ml.

Ur ená metóda je pomerne obtiažne aplikovaná v laboratóriách, ktoré vykonávajú skúšanie surového mlieka pre ú ely hodnotenia jeho kvality – pre svoju prácnos a d žku získania výsledku

44

(až 72 h). Ove a astejšie sa používajú rôzne rutinné metódy – v tejto oblasti predovšetkým laserová prietoková cytometria. Jej princíp možno zjednodušene popísa , ako selektívne po ítanie zafarbených mikrobiálnych buniek. Výhodou metódy je hlavne rýchlos merania a možnosautomatizácie výkonu skúšky. Predsa však, je to metóda založená na úplne inom princípe, ako ur ená metóda a preto je zrejmé, že namerané výsledky môžu by rozdielne a je potrebné interpretova ich za podmienok použitej metódy3. Ako každú rutinnú metódu, aj laserovú prietokovú cytometriu je potrebné prvotne validova , napríklad pomocou normy EN ISO 161404.Pre rutinné laboratória je výhodou, že dostupné meracie zariadenia, na ktorých sa daná metóda vykonáva, sú už validované výrobcom. Úlohou laboratória je preto iba preukáza , že je schopné dosiahnu požadované valida né kritéria, ako napr. parametre reprodukovate nosti, chyby z prenosu a pod. Samozrejme danú metódu musí zavies a vykonáva presne pod a odporú anívýrobcu, bez akýchko vek modifikácií. Pomocou laserovej prietokovej cytometrie sa však primárne merajú výsledky v iných jednotkách, ako v KTJ – v impulzoch (presný názov závisí od výrobcu zariadenia). Na to, aby takéto výsledky boli použite né, to znamená aby ich bolo možné porovnas kritériami uvedenými v legislatíve, je potrebné namerané výsledky transformova do stupnice v KTJ. Postup na vytvorenie príslušného prepo ítavacieho vz ahu je uvedený v ISO 211875.Základným princípom je, že prepo ítavací vz ah má plne reprezentova podmienky, kde sa bude používa a že jeho platnos sa musí pravidelne verifikova . Vhodnou metódou na verifikáciu je aplikácia štatistických nástrojov uvedených v norme ISO 8196-26. Z uvedeného je zrejmé, že sa neodporú a vytvori jeden všeobecný prepo ítavací vz ah, ale naopak, každé laboratórium, resp. skupina laboratórií by si mala vytvori vlastný prepo et a tento aj verifikova na meniace sa miestne podmienky (druh mlieka, plemeno, výživa, sezónnos , spôsob dojenia a pod.). Všetky vyššie uvedené požiadavky po núc validáciou rutinnej metódy až po verifikáciu vytvoreného prepo tu boli donedávna iba v rovine ur itej dobrovo nosti – boli popísané iba v daných normách. Až prijatím NK (ES) . 1664/20067 sa tieto postupy stali záväznými v tom prípade, pokia sa výsledky danej alternatívnej skúšobnej metódy využívajú pri kontrole dodržania kritérií stanovených v asti III kapitoly I oddielu IX prílohy III k nariadeniu (ES) . 853/20042.

V príspevku sú popísané skúsenosti akreditovaného skúšobného laboratória EXAMINALA s aplikáciou týchto požiadaviek, pri meraní mikrobiologickej kvality surového ov ieho mlieka metódou laserovej prietokovej cytometrie.

Materiál a metódy Na meranie boli použité bazénové vzorky surového ov ieho mlieka, odoberané

vyškolenými pracovníkmi mliekárni, ktoré takéto mlieko spracovávajú. Vzorky boli odoberané ru ne a ihne po odbere konzervované Acidiolom (Merck, SRN)8 a uchovávané pri teplote 1°C až 10 °C až do vykonania skúšok. Skúšky boli vykonané do 48 hodín po odbere v SL EXAMINALA.

Mikrobiologická kvalita bola meraná ur enou metódou pod a EN ISO 48331 a rutinnou metódou na zariadení Bactoscan FC 50H (FOSS Electric, Dánsko) pod a odporú aní výrobcu zriadenia a STN 57 05399. Výsledky merania z rutinnej metódy boli primárne vyjadrené v „individuálnych bakteriálnych bunkách“ IBC.

Kontrola kvality merania bola preverovaná štandardnými nástrojmi, ktoré sa uplat ujú pri plnení akredita ných kritérií skúšobných laboratórií. Iba tie výsledky meraní, ktoré plnili kritéria kvality, boli brané do úvahy.

Prepo ítavací vz ah na jednotky ur enej metódy bol vypo ítaný metódou lineárnej regresie z logaritmicky transformovaných dát.

Výsledky a diskusia V SL EXAMINALA sa zariadenie Bactoscan používa na meranie mikrobiologickej kvality

od obdobia rokov 2002 až 200310. Najprv v surovom kravskom mlieku, ktoré pochopite nedominuje. Predsa však, zákazníci laboratória uvítali rýchlos získavania výsledkov a spo ahlivosmetódy a dožadovali sa výkonu danej skúšky aj pre iné matrice na tomto zariadení. Kým surové kozie mlieko sa v SL skúša iba ojedinele, po et vzoriek surového ov ieho mlieka mierne vzrastá.

45

Z toho dôvodu sa SL rozhodlo zavies metódu laserovej prietokovej cytometrie aj na túto matricu. Ako už bolo spomenuté v úvode, surové ov ie mlieko sa od kravského odlišuje. Z poh adu aplikovanej skúšobnej metódy môžu by významné predovšetkým tieto rozdiely:

1. Prirodzene vyšší po et mikroorganizmov a možne aj odlišné druhové zastúpenie. 2. Prirodzene vyšší po et somatických buniek. 3. Odlišné chemické zloženie, ktoré sa výraznejšie mení v priebehu sezóny a s tým

súvisiace fyzikálne vlastnosti – napr. viskozita mlieka. Okrem rozdielov v zložení sú vzorky surového ov ieho mlieka odoberané takmer výlu ne ru ne(odber autosamplermi nie je možné aplikova ) a mlieko je dostupné iba obmedzene – zvä ša od apríla do októbra, s výnimkou synchronizovaných chovov. Významnos uvedených rozdielov na valida né charakteristiky bola posúdená a rovnako bol vytvorený aj prepo ítavací vz ah11. Ten bol získaný paralelným meraním (oboma metódami) bazénových vzoriek, ktoré boli v roku 2004 odoberané od apríla do októbra. 913 párov výsledkov vyhovelo kritériám kvality. Po ponížení súboru o 1% najvyšších a 1% najnižších výsledkov z oboch metód (aby sa eliminovali extrémne hodnoty12) bol vytvorený kone ný súbor vzoriek n = 877. Kvôli spomínanej obmedzenej dostupnosti vzoriek surového ov ieho mlieka bol tento menší, ako pri surovom kravskom mlieku, predsa však reprezentoval podmienky jeho budúceho použitia. Následne vypo ítaný prepo etvo forme lineárnej regresie mal tvar: log10 KTJ/ml = 1,088 log10 IBC/ l + 2,292; so smerodajnou odchýlkou z regresie sy,x = 0,305 log10 KTJ/ml.

Z poh adu skúšobníctva má pri každej kvantitatívnej metóde zmysel odhadnú neistotu merania s ktorou laboratórium meria. Je to diskutabilná záležitos , ako z poh adu samotného kvalifikovaného odhadu, niekedy aj vlastného využitia zákazníkmi laboratória (Ako narábas neistotou, pri geometrických priemeroch?). Pri klasických kultiva ných mikrobiologických metódach sa vä šinou neistota odhaduje z opakovate nosti merania, plus niektoré laboratória berú do úvahy aj príspevok „vychýlenia“ laboratória od „správnej“ hodnoty – napr. z analýzy medzilaboratórnych skúšok spôsobilosti. Pri laserovej prietokovej cytometrií by bol odhad neistoty merania po ítaný iba z opakovate nosti pravdepodobne nesprávny – jedná sa o automatizovanú metódu, ktorej alšou prednos ou je ve mi dobrá reprodukovate nos merania – iže takto po ítaná neistota merania by bola malá. Preto, ako neistota merania bol zvolený 1,96 násobok sy,x, ižepresnos metódy6. Primárne je teda aj neistota vyjadrená v logaritmickej stupnici, o však nebráni tento spôsob vyjadrenia transformova pri konkrétnom výsledku na hodnotu v KTJ/ml, resp. vyjadri ju percentuálne. Pri diskusiách o tomto prístupe po ítania neistoty boli vznesené námietky, že takto odhadnutá neistota je príliš „ve ká“. Je potrebné si však uvedomi , že laserová prietoková cytometria je metóda na úplne inom princípe ako kultiva ná metóda a že takto odhadnutá neistota „nadväzuje“ na ur enú metódu, na ktorú bola „kalibrovaná“. Predsa však odhad neistoty môže by vykonaný aj iným spôsobom a prezentovaný postup nemusí by jediný správny, i komplexný. Tak i tak, takto odhadnutá neistota, bola základným údajom, na základe ktorého

bola vykonaná prvotná verifikácia prepo tu v roku 2005. Pod a odporú aní ISO 211875 verifikácia spo íva v porovnaní novo získaných výsledkov,

ktoré boli namerané ako ur enou metódou, tak aj rutinnou metódou a prepo ítané pod a aktuálneho prepo ítavacieho vz ahu. V roku 2005 bolo preto po as sezónnej dostupnosti surového ov iehomlieka zmeraných paralelne 86 vzoriek. Platnos prepo tu sa „potvrdzovala“ tak, že sa absolútne rozdiely logaritmicky transformovaných priamo nameraných1 a prepo ítaných výsledkov (z rutinnej metódy na KTJ/ml) porovnali s limitnou hodnotou 1,96 x sy,x = 0,598 log KTJ/ml. Pokia by boli rozdiely po etne vä šie, znamenalo by to, že prepo et nie je platný a je potrebné ho modifikova .Pod a nameraných údajov, ani jeden rozdiel výsledkov z 86 vzoriek nebol vä ší, ako zvolená limitná hodnota13. Samozrejme tento prístup bol iba orienta ný. Komplexnejšiu analýza bola vykonaná v roku 2006 pod a požiadaviek ISO 8196-26. Uvedená norma sa týka vo všeobecnosti všetkých nepriamych skúšobných metód na mlieko, predovšetkým však fyzikálno-chemických (meranie množstva tuku je zvolené ako príklad). V prípade verifikácie prepo tu, boli ako hodnoty „y“ zvolené logaritmicky transformované priamo namerané výsledky ur enou metódou1 a ako hodnoty „x“ logaritmicky transformované výsledky namerané rutinnou metódou, ktoré boli

46

prepo ítané aktuálnym prepo tom na KTJ/ml. Získané priemerné rozdiely a smerodajná odchýlka rozdielov sú uvedené v tabu ke I. Testovala sa štatistická významnos :

i sa hodnota smernice líši od hodnoty „1“. i sa hodnota posunutia líši od hodnoty „0“. i sa hodnota vychýlenia d = y - x líši od hodnoty „0“. i je nastavenie strednej hodnoty správne.

Tabu ka I Sumarizácia rozdielov výsledkov merania mikrobiologickej kvality surového ov ieho mlieka metódou pod a EN ISO 4833 (y) a na zariadení Bactoscan FC H, po ich prepo te na KTJ/ml (x) (po logaritmickej transformácii).

d = y – x sdRok n (log10 KTJ/ml) 2005-2006 153 -0,022 0,116

2007 100 -0,025 0,089

Pri analýze dát bolo zistené nasledovné: Dáta z roku 2005 (n = 86) ani jeden ukazovate nebol štatisticky významný, prepo ítavací vz ahzostal v platnosti v roku 2006. Dáta z roku 2006 (n = 67) ani jeden ukazovate nebol štatisticky významný. Ke sa však analyzovali dáta z 2005 a 2006 spolu, štatisticky významným bolo vychýlenie a bolo potrebné zamietnu hypotézu správnosti nastavenia strednej hodnoty. Preto bol prepo ítavací vz ah pre rok 2007 aktualizovaný. Dáta z roku 2007 (n = 100) boli analyzované s obdobným výsledkom, ako dáta z rokov 2005 a 2006, preto bol prepo ítavací vz ah pre rok 2008 aktualizovaný.

Spôsob vytvorenia aktualizovaného prepo ítavacieho vz ahu môže by rôzny5. Nové dáta sa môžu prida k pôvodnému súboru, ktorý sa poníži o rovnaký po et najskorších výsledkov. Druhou možnos ou je iba doplnenie nových dát. Výber závisí od viacerých faktorov, najmä však od toho, i pôvodné dáta možno stále považova za reprezentatívne. Nako ko pôvodný dátový súbor bol menej po etný, podobne ako aj jednotlivé novozískané súbory a podmienky získavania surového ov ieho mlieka sa výrazne na Slovensku nemenili, bol zvolený spôsob pridávania dát. Aktualizácia prepo tu je zdokumentovaná v tabu ke II. Z tabu ky III, kde sú modelové primárne dáta prepo ítané pod a meniacich sa prepo ítavacích vz ahov, vidno, že výsledné dáta sa výrazne nemenia. Z praktického h adiska možno teda hovori o ur itej „stabilite“ vytvoreného prepo ítavacieho vz ahu.

Tabu ka II Aktualizácia prepo tu výsledkov merania mikrobiologickej kvality surového ov ieho mlieka metódou laserovej prietokovej cytometrie, na zariadení Bactoscan FC 50H, na jednotky KTJ/ml, v SL EXAMINALA.

Rok n Prepo ítavací vz ah sy,x (log10 KTJ/ml) Rx,y

2005-2006 877 log10 KTJ/ml = 1,09 log10 IBC/ l + 2,29 0,31 0,87 2007 1024 log10 KTJ/ml = 1,08 log10 IBC/ l + 2,31 0,28 0,88 2008 1120 log10 KTJ/ml = 1,08 log10 IBC/ l + 2,33 0,27 0,88

47

Tabu ka III Prepo et vybraných výsledkov merania mikrobiologickej kvality surového ov ieho mlieka na zariadení Bactoscan FC 50H pod a platných prepo ítavacích vz ahov, uvedených v tabu ke II

2005-2006 2007 2008 IBC/ l (103 KTJ/ml) 100 29 30 30 500 169 170 173

1000 360 361 364 5000 2072 2069 2060 10000 4406 4385 4345 16000 7347 7299 7208

Niekedy je nastolená otázka, ako sa zmenila mikrobiologická kvalita po zavedení laserovej prietokovej cytometrie do rutinného merania na Slovensku. Hoci sa táto otázka môže zda na prvý poh ad absurdná (ako môže ma metóda, pokia je objektívna, vplyv na výsledok?), ke si uvedomíme odlišnos princípov merania, ako aj to, že sa jedná o kvantitatívnu mikrobiológiu, má daná otázka ur ité opodstatnenie. V tabu ke IV sú prezentované sumárne výsledky vzoriek surového ov ieho mlieka merané na celkový po et mikroorganizmov v rokoch 2004 – 2007 v SL EXAMINALA. Z tabu ky je zrejmé, že mikrobiologická kvalita sa zlepšuje a že tento trend nezaznamenal žiadnu skokovú zmenu pri zmene používanej skúšobnej metódy. Kým v roku 2004 vyhovovalo kritériu 1 500 000 KTJ/ml (skúšané boli predovšetkým vzorky mlieka, ktoré sú predmetom tepelného ošetrenia) 76 % vzoriek, v roku 2006 až 91 % vzoriek, pri om nárast bolo pomerne plynulý (76% - 84% - 87% - 91%). Vidno tu skôr tlak požiadaviek potravinovej legislatívy, nákupcov a spracovate ov, ako aj snahu prvovýrobcov kvalitu surového ov ieho mlieka na Slovensku zlepšova .

Tabu ka IV Mikrobiologická kvalita surového ov ieho mlieka v SL EXAMINALA.

Rok Aritmetický

priemer(103 KTJ/ml)

% výsledkov 500

(103 KTJ/ml)

% výsledkov > 500 - 1500(103 KTJ/ml)

Po etvzoriek Metóda

2004 909 57 19 1289 EN ISO 4833 2005 1002 69 15 1201 LPC* 2006 800 75 12 1329 LPC 2007 606 80 11 1377 LPC

*LPC – Laserová prietoková cytometria – Bactoscan FC 50H

Záver Viacro né praktické skúsenosti SL EXAMINALA v oblasti skúšania surového ov ieho

mlieka ukazujú, že: 1. Jeho mikrobiologickú kvalitu možno mera spo ahlivo modernou metódou laserovej prietokovej

cytometrie na zariadení Bactoscan FC 50H. 2. Prepo et výsledkov merania na jednotky KTJ/ml je žiadúce vykona pomocou osobitného

prepo ítavacieho vz ahu.3. Prepo ítavací vz ah je možné pravidelne verifikova a túto verifikáciu vyhodnocova pod a

ISO 8196-26.Ke že výsledky SL EXAMINALA využívajú jeho zákazníci na hodnotenie kvality pod a

požiadaviek nariadeniu (ES) . 853/20042, sú výsledky získané v súlade s požiadavkami NK (ES) . 1664/20067. Tento prístup SL EXAMINALA je alším príspevkom v budovaní dôvery v tradi né

slovenské syrárske špeciality, ktoré sa vyrábajú zo surového ov ieho mlieka so zlepšujúcou sa

48

mikrobiologickou kvalitou. Navyše Výskumný ústav mliekárenský, a.s., ako materská organizácia sa podie a na riešení medzinárodného projektu „PATHOMILK“, ktorého cie om je pripravimultiparametrický biosenzor na detekciu vybraných patogénov v mlieku. Jedným z nich je aj S. aureus – mikroorganizmus, ktorý sa môže bežne vyskytova v surovom ov om mlieku a ktorý môže prežíva aj vo výrobkoch z nepasterizovaného mlieka, pokia nebol dodržaný optimálny technologický postup (zrenie hrudkového syra). Pokia by vyvinutá metóda bola schopná aj kvantifikova po et a nie len prítomnos stafylokokov, potom by sa mohol odskúša podobný spôsob prepo tu primárnych výsledkov merania a jeho verifikácia aj na tomto modeli.

Pod kování:Príspevok bol finan ne podporený riešením projektu EÚ „PATHOMILK“ COLL-CT-2006-30392.

Použitá literatura:1. European Committee for Standardization, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal

method for the enumeration of microorganisms – Colony-count technique at 30 °C, EN ISO 4833, Brussels, Belgium, 2003.

2. Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 laying down specific hygiene rules for on the hygiene of foodstuffs, Official Journal of the European Union L 139/55, 30.4.2004.

3. Suhren G., Reichmuth J., Interpretation of quantitative microbiological results, Milchwissenschaft 55 (2000) 18–22.

4. European Committee for Standardization, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods, EN ISO 16140, Brussels, Belgium, 2003.

5. International Standard Organization, Milk – Quantitative determination of bacteriological quality – Guidance for establishing and verifying a conversion relationship between routine method results and anchor method results, ISO 21187, Geneva, Switzerland, 2004.

6. International Standard Organization, Milk – Definition and evaluation of the overall accuracy of indirect methods of milk analysis – Part 2: Calibration and quality control in the dairy laboratory, ISO 8196-2, Geneva, Switzerland, 2000.

7. Commission Regulation (EC) No 1664/2006 of 6 November 2006 amending Regulation (EC) No 2074/2005 as regards implementing measures for certain products of animal origin intended for human consumption and repealing certain implementing measures, Official Journal of the European Union L 320/13, 18.11.2006.

8. Rapp M., Münch S., Neuentwicklung von flüssigen Konservierungsmitteln für Milchproben, Dtsch. Molk. Zeit. 105 (1984) 1264–1272.

9. Slovak Institute for Standardization, Automatic determination of microorganisms in raw milk by direct enumeration of bacterial cells, STN 57 0539, Bratislava, Slovakia, 2003.

10. Tomáška M., Suhren G., Experiences with introduction of the Bactoscan FC in Slovakia, Bull. Int. Dairy Fed. 383 (2003) 58–60.

11. Tomáška M., Suhren G., Hanuš O., Walte H.-G., Slottová A., Hofericová M., The application of flow cytometry in determining the bacteriological quality of raw sheep’s milk in Slovakia, Lait 86 (2006) 127–140.

12. Suhren G., Reichmuth J., Walte H.-G., Bacteriological quality of raw milk: Conversion of Bactoscan-FC counts onto the scale of the official method, Milchwissenschaft 56 (2001) 380–384.

13. Tomáška M., Hofericová M., Slottová A., Praktické skúsenosti s meraním mikrobiologickej kvality surového ov ieho mlieka prietokovou cytometriou, v: Zborník prác medzinárodnej vedeckej konferencie Bezpe nos a kontrola potravín (Angelovi ová, M. et al; ed.), 273 – 276, 5. – 6. apríl 2006, Nitra, Slovenská po nohospodárska univerzita, Nitra.

Kontaktní adresa:Výskumný ústav mliekárenský, a.s.; Dlhá 95, 010 01 Žilina, Slovensko; tomaska@vumza.sk

49

MOŽNOSTI ZDOKONALENÍ POSTUPU VYSOKODOH ÍVANÝCH SÝR S VYUŽITÍM BIOCHEMICKÝCH CHARAKTERISTIK POUŽÍVANÝCH MK.

erný Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasni ková Eva, Pufrová Eva, Švandrlík Zden kMILCOM a.s., Výzkumný ústav mlékárenský Praha, pracovišt Tábor

Application of biochemical characteristic pure lactic acid cultures for innovation high scalded cheese process.

Summary:Behavior of single strains and mixed strains Lactobacillus ssp. and Streptococcus spp. was tested on the laboratory models during the cultivation in thermic (temperature) cycle, corresponding to emmental type cheese production. Knowledge received were generalized and summarized to the „Recommendation for production praxis“ for making high scalded emmental type cheese. On cut of ripe experimental cheeses during checking results of solution in praxis were pure eyes. Nut eyes were predominant on the cut of control cheeses.

Úvod : P írodní sýry, a zejména sýry doh ívanou sý eninou, p edstavují v rámci mlékárenského

pr myslu jednu z nejvýznamn jších komodit. U zralých sýr se pom rn asto vyskytují problémy spojené s výskytem senzorických vad které nejsou tak výrazné, že by bylo nutno vy adit sýry z konzumu, ale snižují konkurenceschopnost t chto sýr na spot ebitelském trhu. Tyto vady je možno v mnoha p ípadech spojovat s p sobením p ítomné ušlechtilé i kontaminující mikroflóry a s dynamikou probíhajících proces (nap . tvorba ho kých peptid , špatná tvorba ok i výskyt prasklin v sýrech typu ementál i maasdamer). Výroba sýrového zrna a formování mladých sýr jsou základní operace, ve kterých probíhá hlavní ást mlé ného kysání. Bakterie mlé ného kysání (LAB) p em ují laktózu na laktát. Rostoucí

koncentrace kyseliny mlé né vznikající glykolytickými pochody zp sobuje pokles hodnoty pH mladého sýra a jsou tak vytvá eny optimální podmínky pro r st žádoucích skupin mikroorganismi pro další zrání sýr . Podle složení použitých kultur se m že m nit nejen množství vytvo ené kyseliny mlé né, ale také pom r mezi její D- a L- formou. P ípadný zbytkový obsah galaktosy má být kmeny LAB nejpozd ji b hem pobytu sýr ve studeném sklep zcela fermentován. Jinak hrozí nebezpe í, že bude využíván nejen p ítomnými hofermentativními LAB, ale i nap . propionovou kulturou, heterofermentativními laktobacily (NSLAB) a další nežádoucí kontaminující mikroflórou. Problematice chování istých mléka ských kultur v podmínkách výroby sýrového zrna a formování mladých sýr v pr b hu prvních 24 hodin je proto pot eba v novat stálou pozornost.

Materiál a metody :P i studiu biochemických charakteristik mikroorganism d ležitých p i výrob vysokodoh ívanýchsýr bylo testováno jednotliv nebo ve sm sích 12 izolát Latobacillus helveticus, 5 izolátLactobacillus delbrueckii subsp. lactis a 10 isolát Streptococcus salivarius subsp. thermophilus.Kultivace ve sterilovaném obnoveném mléce p i konstantní teplot ,Kultivace ve sterilovaném obnoveném mléce v teplotním cyklu. Jejím základním rysem je dlouhodobé p sobení vyšších teplot kultivace modelujících teplotní k ivku na výrobníku sýrového zrna a pomalé chladnutí sýr b hem jejich lisování.

Výsledky a diskuse .P i formulování návrhu modelového testu kultivace v teplotním cyklu byly využity zkušenosti

z p edcházejících výzkumných prací a byly navrženy 2 teplotní k ivky. Ob varianty mají stejnou první fázi p estavující periodu p edkysání mléka, sý ení, krájení a míchání sýrového zrna na výrobníku až do za átku doh ívání sýrového zrna. Rychlost doh ívání sýrového zrna byla volena cca 2-3°C za 5 minut. Rozdíl mezi teplotními k ivkami byl v použité teplot dosoušení sýrového zrna ( v pr m ru 52,5°C pro variantu „A“ a 50,5°C pro variantu „B“) a navazujícím modelu

50

poklesu teploty kultivace, který modeluje chladnutí sýrového zrna b hem vypoušt ní na lisovací vanu a chladnutí sýr b hem jejich lisování.

30

35

40

45

50

55

0 5 10 15 20 25

time (hour)

tem

pera

ture

(°C

) "A" "B"

Obr. . 1 : Teplotní k ivky pro modelové kultivace

Výhody využití tohoto modelu kultivace v teplotním cyklu proti kultivaci p i konstantní teplot lze dokumentovat porovnáním výsledk kultivací t í isolát Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ( . 22, 24 a 27). Pro porovnávací testy bylo vždy mléko nao kováno p íslušným isolátem a rozd leno na dv ásti. Jedna ást mléka byla kultivována p i konstantní teplot 37°C (Obr. .2), druhá ást byla kultivována v teplotním cyklu „A“ (Obr. .3).

0500

1000150020002500300035004000

0 5 10 15 20 25

time (hours)

Impe

danc

e (u

S)

ST Nr. 24 ST Nr. 22ST Nr. 27

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

0 500 1000 1500

time (min)

pH (-

)

S22S24S27

Obr. 2 : kultivace 37 °C Obr. 3 : kultivace tepl. cyklus „A“

P i standardní metod kultivace p i 37°C mají všechny 3 isoláty prakticky stejnou kysací k ivku (m enou jako zm na impedance). P i použití navržené metody kultivace v teplotním cyklu jsou z etelné rozdíly v pr b hu kysacích k ivek t chto isolát ( m ených jako zm na pH).

Pro pot eby ešení byly p i modelových kultivacích v teplotním cyklu využívány obnavržené teplotní k ivky (Obr. .1). Ob varianty teplotních k ivek mají stejnou první fázi až do za átku dosoušení sýrového zrna. V dalším pr b hu je rozdíl mezi teplotními k ivkami 2 °C.

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

0 5 10 15 20 25time (hours)

pH (-

)

"B" TE2217

"A" TE2217

Obr. . 4 : Kultivace sm si LAB v teplotním cyklu „A“ a „B“.

51

Rozdíl v teplotách použitých p i kultivaci v teplotním cyklu na pr b h kysací k ivky sm si isolátu Streptococcus salivarius subsp. thermophilus . 22 a Lactobacillus helveticus . 17. je zachycen na Obr. . 4.. Zvýšení teploty o 2°C zp sobilo, že se as do dosažení hodnoty pH = 5,5 prodloužil o n kolik hodin.

Vybrané kombinace kmen LAB pro kultivace v teplotním cyklu.Pro tyto testy byly použity 3 isoláty streptokok ( . 22, 24 a 27) a 3 isoláty laktobacil ( .3, 9

a 17). Testování bylo provedeno v modelu matice 3x3 a pro kultivace t chto kombinací laktobacila streptokok byly použity oba modely teplotního cyklu zna ené jako „A“ nebo „B“.

Testy prokázaly, že se v závislosti na podmínkách kultivace i v závislosti na použité kombinaci kmen streptokok a laktobacil se m ní pH na konci kultivace, produkce kys. mlé né,pom r mezi po ty laktobacil a streptokok .

Jako p íklad jsou v následující tabulce uvedeny rozdíly v kone ných hodnotách pH p i kultivaci v teplotním cyklu a p i kultivaci p i 37°C. P i kultivaci v termickém cyklu „A“ byla pr m rná hodnota pH 3,70, p i kultivaci v teplotním cyklu „B“ byla pr m rná hodnota pH o 0,09 vyšší a p i kultivaci p i 37°C byla kyselost v pr m ru vyšší o 0,31 jednotky pH.

Tab. . 1 : Rozdíly v dosažených hodnotách pHStr. + Lb. kultivace "A" kult. 37°C rozdíl pH kultivace "B" kult. 37°C rozdíl pH pr m r 3,70 4,01 0,31 3,79 4,04 0,24

Str. .24+Lb. 3,72 3,94 0,22 3,81 4,03 0,22 Str. .27+Lb. 3,69 4,02 0,33 3,82 4,09 0,27 Str. .22+Lb. 3,71 4,08 0,37 3,75 3,99 0,24

D ležité jsou výsledky získané p i porovnání pr b hu kysacích k ivek testovaných kombinací kmen laktobacil a streptokok . Dále uvedený Obr. .5 shrnuje výsledky p timodelových kultivací mléka zao kovaného vždy kombinací 1 kmene laktobacil a jednoho kmene streptokok p i kultivaci v teplotním cyklu za použití teplotní k ivky „A“ nebo „B.

33,5

44,5

5

5,56

6,57

0 5 10 15 20 25time (hour)

pH (-

)

A TE2717A TE2409B TE2717B TE2409B TE2403

Obr. . 5 : Kultivace kombinace kmen Str. a Lb. v teplotním cyklu „A“ a „B“.

Výsledky ukazují, že vhodnou volbou kombinace kmen Lacobacillus sp. a Streptococcus sp.spolu s volbou teplotní k ivky použité p i kultivaci je možno výrazn ovlivnit pr b h kysací k ivky.Požadovaného pr b hu kysací k ivky lze dosáhnout bu použitím stejné teplotní k ivky kultivace a vhodn zvolenou kombinací kultur nebo použitím stejné kombinace kultur a úpravou teplotní k ivky kultivace.

Ov ení výsledk v praxi :Výsledky laboratorních modelových kultivací na chování kmen MK byly ov eny

na provozních výrobách kontrolních (n=3) a pokusných (n=3) sýr ementálského typu. Pro tyto výroby bylo použito mléko z jednoho zásobního sila, byly použity stejné MK a byly zachovány stejné podmínky výroby až do fáze doh ívání sýrového zrna. V další fázi technologického postupu

52

výroby byly na pokusných výrobách využity výše uvedené výsledky ešení zam ených na chování a vlastnosti MK získané na laboratorních modelových pokusech a v souladu s nimi byl mírnmodifikován postup dosoušení a formování mladých sýr .

Pokusné sýry m ly v pr m ru o 1,42% vyšší sušinu, vyšší aktivní kyselost ve st edové ásti, stupe proteolýzy byl mírn nižší jak do hloubky tak i ší ky zrání a i množství vytvo ené kyseliny propionové bylo nižší ( o 99 mg/100g sýra). Obsah kyseliny máselné byl u obou skupin sýrprakticky stejný ( 40 mg/100g u kontrolních sýr proti 37 mg/100g u pokusných sýr ).

Podle výsledk mikrobiologických rozbor pokusných a kontrolních sýr ve stá í 91 nebyl shledán žádný výrazný rozdíl v zastoupení mesofilních a termofilních laktokok , termofilních a fakultativn heterofermentativních laktobacil , Propionobacterium ssp. ani halotolerantních mikroorganism . U pokusných sýr byl mírn vyšší po et termoresistentních anaerobních mikroorganism a Clostridium ssp.

P i senzorickém hodnocení zralých pokusných a kontrolních sýr nebyl shledán žádný výrazn jší rozdíl mezi sýry z obou skupin a sýry nevykazovaly žádné senzorické vady. Pokusné sýry m ly na skus mírn pevn jší a pružn jší konzistenci.

Výrazný rozdíl byl zjišt n ve vzhledu zralých sýr , p edevším v množství a kvalitvytvo ených ok. Rozdíl v otev ení sýr je patrný z níže uvedených fotografií kontrolního (obr.7) a pokusného (obr.6) sýra.

Obr. 6 : pokusný sýr Obr. 7 : kontrolní sýr

Shrnutí a záv r :Studium vlastností MK p i kultivaci v teplotním cyklu poskytuje, ve srovnání s kultivací p i konstantní teplot , podrobn jší informace o jejich chování v podmínkách konkrétního technologického postupu výroby.Umož uje zvolit vhodnou kombinaci kultur nebo upravit teplotní k ivku výroby sýrového zrna chladnutí sýr b hem lisování tak, aby bylo dosaženo požadovaného pr b hu prokysávání sýr .Výsledky provozního ov ování signalizují, že lze o ekávat i na vliv výslednou jakost zralých sýr .Hlavní zásady jsou shrnuty do „Souboru doporu ení pro výrobní praxi“, Jejich cílem je doplnit odborné informace a napomoci p i zdokonalování a modifikaci stávajících postup výroby sýr a zvyšování konkurenceschopnosti zralých sýr na spot ebitelském trhu. Na požádání bude obratem zaslán i elektronickou poštou.

Pod kování:

Práce byla vykonána s podporou grantu MZe NAZV QF4082.

Kontakt :v.cerny@vum-tabor.cz

53

METODY PRO STANOVENÍ BUN NÉ LÝZE BAKTERIÍ MLÉ NÉHO KVAŠENÍ Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Šviráková Eva

Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha

Methods for determination of cell lysis of lactic acid bacteria

Summary:Cell lysis is a phenomenon of large importance in semi-hard and hard cheese ripening. Cell lysis of lactic bacteria has a strong impact on cheese aroma production and fastens cheese ripening. For the purpose of this study, five Lactococcus lactis (NIZO R5, LCC 416, HMM 81, NIZO B643 and AM2) strains were chosen. Cell lysis was detected by different methods (e.g. in GM17 agar with Micrococcus lysodekticuscommercial lysate, in citrate buffer and by estimation of released extracellular lactate-dehydrogenase). All used Lc. lactis (NIZO R5, LCC 416, HMM 81, NIZO B643 and AM2) strains were evaluated as lytic strains by used of all methods. The most lytic strain was assessed the Lc. lactis HMM 81 (30 % cell lysis) and the least lytic strain was assessed the Lc. lactis NIZO B643 (9 % cell lysis) during cultivation in the citrate buffer at 13°C after 12 days. Other used methods confirmed previous results. The influence of added nisin (0, 100, 250, 500, 1000, 5000 IU ml-1) to the citrate buffer on lactococci lysis was estimated. Significant increase in cell lysis in all five Lc. lactis strains was confirmed. The highest cell lysis was achieved in all tested lactococci in the citrate buffer with nisin concentrations 1000 and 5000 IU ml-1.

ÚvodVýroba sýra m že být z hlediska technologie rozd lena na dv etapy: na vlastní výrobu,

která zahrnuje zpracování mléka na erstvý sýr a jeho následné zrání ve zracím sklep , kde dochází k ad zm n ve složení sýra a vzniká jeho typické aroma. Na zrání sýra je t eba nahlížet jako na komplexní biochemický proces, p i kterém se uplat uje celá ada enzym [1]. Jedním z d j ,ke kterým dochází ve zrajícím sýru, je proteolýza. Probíhající proteolýza je ovlivn na plasminem, zbytky sy idla a enzymy zákysových a nezákysových bakterií mlé ného kvašení. Pro zrání sýr je d ležitý vliv intracelulárních laktokokových proteinas a peptidas, jejichž množství v sýru je ovlivn no bun nou lýzí. P i lýzi se intracelulární enzymy bakterií dostávají ven z bun k a svým p sobením ovliv ují kvalitu vyrobeného sýra [2].

K detekci bun né lýze je možno p istupovat r znými zp soby. Mohou být p ímo sledovány bakteriální bu ky, stanovovány intracelulární enzymy nebo d sledky bun né lýze v sýru. P i pozorování laktokok lze využívat elektronového nebo fluorescen ního mikroskopu [3, 4], stanovovat po ty laktokok na agarových plotnách nebo m it absorbanci vodných suspenzí bakterií [5]. Stanovení bun né lýze pomocí celkových po t nebo absorbance m že být zatíženo chybou, protože lyzovaná bakteriální bu ka není totéž jako mrtvá bu ka. P i bun né lýzi m žedojít pouze k narušení bun né st ny, p i kterém z bu ky uniká cytoplazma, ale bu ka má zachovanou schopnost regenerace po p enesení do výživného média (nap . agaru). áste nlyzované bu ky se proto p i stanovení lýze pomocí absorbance a celkových po t jeví jako nelyzující. Proto je procento bun né lýze vypo ítané z celkových po t nebo z absorbance podhodnocené [3, 4]. Pro p esn jší stanovení bun né lýze se využívá m ení aktivit n kterých intracelulárních enzym . Podmínkou je, aby enzymy, jejichž aktivita je m ena, byly v médiu stabilní. Nej ast ji jsou pro stanovení bun né lýze používány laktát-dehydrogenasa (LDH), glukosa-6-fosfát dehydrogenasa (G6PDH) a intracelulání peptidasy [3, 6, 7]. Vlivem uvoln níintracelulárních enzym do sýra dochází k intenzivn jšímu zrání a ve v tší mí e vznikají t kavé produkty. Tyto t kavé produkty (nap . butanal, propanal) mohou sloužit ke stanovení d sledkbun né lýze [8].

Pro stanovení bun né lýze mohou být použita r zná kultiva ní média. Nejjednodušším systémem je pufr nebo bujón, ve kterých lze stanovit bun nou lýzi pomocí m ení absorbance suspenze bun k. Jejich nevýhodou je jiné chování než v sýru, které se u n kterých kmen projevuje a vyplývá z rozdílného složení. Dalším možným médiem pro kultivaci bakterií p i stanovení bun né lýze jsou modelové systémy sýra (nap . výluh sýra - cheese slurry). Lýzi bakterií lze pozorovat i p ímo v sýru [9]. Ke stanovení lýze v sýru se používají m ení aktivit intracelulárních enzym . V sýru je možné stanovit i t kavé produkty, které tvo í aroma sýra [8].

54

Cíl práceCílem této práce bylo porovnání bun né lýze kmen laktokok za použití r zných

detek ních metod.

Materiál a metody

Použité kmeny Pro sledování bun né lýze bylo použito 5 kmen Lc. lactis: Lc. lactis subsp. cremoris

AM2 (p vod: Moorepark Research Centre, Teagasc, Moorepark, Fermoy, Co Cork, Irsko), Lc. lactis subsp. lactis NIZO B643 (p vod: National Collection of Dairy Organisms, Reading, Velká Británie), Lc. lactis subsp. lactis HMM 81 (p vod: VŠCHT Praha, eská republika), Lc. lactis subsp. lactis NIZO R5 (p vod: Netherlands Institute for Dairy Research, Department of Biophysical Chemistry, Molecular Genetics Group, Ede, Nizozemí) a Lc. lactis subsp. lactisLCC 416 (p vod: Laktoflora® Milcom a.s., Praha, eská Republika).

Stanovení lýze laktokok na agaru GM17 s lyzátem Micrococus lysodeikticusD kazem bun né lýze, zp sobené laktokoky, bylo vytvo ených lytických zón na agaru

GM17 s p ídavkem komer ního lyzátu M. lysodeikticus. (0,2 % obj.) (Sigma-Aldrich, SRN). Testované laktokoky byly o kovány metodou rozt ru (inokulum 0,1 ml) na povrch agaru GM17 a kultivovány p i teplot 30 °C po dobu 2 až 6 dn [10].

Stanovení lýze laktokok v citrátovém pufru s nisinem Bun ná lýze p edkultivovaných a promytých bun k laktokok byla m ena v citrátovém

pufru s p ídavkem r zných koncentrací nisinu (0, 100, 250, 500, 1000, 5000 IU.ml-1). Laktokoky byly nejprve p edkultivovány v bujónu LM17, a poté kultivovány v citrátovém pufru o pH 5 p i teplot 13 °C po dobu 12 dní. Pro stanovení bun né lýze byly m eny absorbance suspenzí laktokok (A650). Bun né lýze byla vypo ítáno podle rovnice 1: bun ná lýze = [(A0 – At)/A0]× 100 [%], kde A0 byla po áte ní absorbance a At byla absorbance m ená v ase t [5].

Stanovení lýze laktokok v citrátovém pufru detekované na mikrotitra ních desti káchRychlometoda pro stanovení bun né lýze u laktokok , stanovovaná na mikrotitra ních

desti kách, které umož ují automatické m ení v pr b hu kultivace, je podobná m ení lýze laktokok v citrátovém pufru. Laktokoky byly p edkultivovány, promyty a p eneseny do citrátového pufru a kultivovány p i teplot 40 °C b hem 6 h, kdy byla m ena absorbance bun ných suspenzí laktokok [11].

Stanovení lýze laktokok detekované uvoln ním laktátdehydrogenasy (LDH) Pro stanovení lýze laktokok , pomocí uvoln né LDH, byly laktokoky kultivovány stejným

zp sobem jako v p edchozích stanoveních, tedy po p edkultivaci byly promyty, a poté kultivovány v citrátovém pufru p i teplot 13 °C po dobu 12 dní. M ení aktivity LDH spo ívalo v oxidaci laktátu na pyruvát. Z rychlosti oxidace m ené spektrofotometricky se vypo ítala aktivita LDH v jednotkách. Jedna jednotka byla definována jako množství enzymu LDH pot ebné k oxidaci 1 M NADH.min-1.ml-1 pufru [6, 7].

Výsledky

Lýze laktokok na agaru GM17 s lyzátem Micrococus lysodeikticusJako d kaz bun né lýze, zp sobené laktokoky, byly kolem kolonií všech testovaných

kmen laktokok pozorovány na agaru GM17 s komer ním lyzátem M. lysodeikticus vyjasn né,lytické zóny, které m ily v pr m ru od 2 do 6 mm.

55

Lýze laktokok v citrátovém pufru Procento bun né lýze u testovaných laktokok uvádí tabulka I. V pufru bez p ídavku

nisinu byl nejmén lytický kmen Lc. lactis NIZO B643 (lyze 9 %) a nejvíce lytický kmen Lc. lactisHMM 81 (30 %).

Bylo potvrzeno zvýšení bun né lýze vlivem p ídavku nisinu, známé z literatury [12]. P ídavek nisinu do citrátového pufru zvyšoval bun nou lýzi u všech p ti kmen laktokok .Nejv tší zvýšení lýze bylo pozorováno u nízkých koncentrací nisinu. P i vyšších koncentracích nisinu byly rozdíly v bun né lýzi nízké. P i koncentracích nisinu 1000 a 5000 IU.ml-1 byl rozdíl lýzí zanedbatelný (obr. 1). Nejvíce se bun ná lýze zvýšila p ídavkem nisinu u kmene Lc. lactisAM2 (lýze v citrátovém pufru bez nisinu byla 28 %, a p i p ídavku nisinu o koncentraci 5000 IU.ml-1 byla 52 %). Tabulka I uvádí hodnoty bun né lýze dosažené po 12 dnech v citrátovém pufru a v citrátovém pufru s p ídavkem nisinu 5000 IU.ml-1.

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

cnis (IU/ml)

Bun

ná ly

ze

LCC416R5HMM81R5II den10AM2B643

Obr. 1. Závislost bun né lýze laktokokových kmen na koncentraci p idaného nisinu (0, 100, 250, 500, 1000, 5000 IU.ml-1); kultivace laktokok v citrátovém pufru (pH 5) p i teplot 13 °C za 12 dní.

Tabulka I Bun ná lýze laktokok kultivovaných v citrátovém pufru a v citrátovém pufru s p ídavkem nisinu (5000 IU.l-1) p i teplot 13 oC po 12 dnech

KmenLc. lactis

Lyze v citrátovém pufru [%]

Lyze v citrátovém pufru s nisinem

(5 000IU.ml-1) [%] NIZO R5 24 65

LCC 416 20 31

HMM 81 30 38

NIZO B 643 9 33

AM2 28 52

56

Lýze laktokok v citrátovém pufru detekovaná na mikrotitra ních desti káchZa podmínek této metody se kmeny Lc. lactis (NIZO R5 a AM2) jevily jako vysoce lytické

kmeny. Ostatní testované kmeny Lc. lactis (NIZO B643, HMM 81 a LCC 416) se jevily jako nelytické kmeny. Lýze n kterých laktokok p i zvýšené teplot m že být zp sobena p ítomností termoindukovatelného pro-fága, kterého je možno aktivovat již teplotou kolem 40 °C. U kmene Lc. lactis AM2 byla p ítomnost termoindukovatelného profága publikována v literatu e [9]. Lýze laktokok detekovaná uvoln ním laktátdehydrogenasy

Ze stanovení lýze laktokok , detekované m ením aktivity uvoln né LDH vyplynulo, že k nejvyšší lýzi došlo u kmene Lc. latis HMM 81, což odpovídalo nejvyšší hodnot aktivity uvoln né LDH (5,4 jednotky). Také ostatní testované kmeny laktokok se jevily jako lytické kmeny. Nejmén lytický byl kmen Lc. lactis NIZO B643 (aktivita LDH 0,98 jednotky).

Záv rPro detekci bun né lýze u testovaných laktokokových kmen byly použity r zné detek ní

metody. Všechny testované kmeny se chovaly jako lytické kmeny, což bylo potvrzeno tvorbou lytických zón na agaru GM17 s p ídavkem komer ního lyzátu M. lysodeikticus. Ostatní metody (s výjimkou rychlometody na mikrotitra ních desti kách) poskytovaly s drobnými rozdíly podobné výsledky: nejvíce lytický byl kmen Lc. lactis HMM 81 a nejmén lytický byl kmen Lc. lactis NIZO B643. Odlišné výsledky (získané p i použití rychlometody a metody v citrátovém pufru) i n kteréodchylky (zjišt né u ostatních metod) jsou dokladem toho, že získané výsledky závisí na použité metod . Je proto d ležité využít i dalších možností pro stanovení bun né lýze u laktokok ,nap . stanovení dalších významných intracelulárních enzym (nap . peptidas pepN & C, pep X).

V sýra ské praxi je možno získaných výsledk - tj. poznatk o schopnosti laktokokových kmen intenzivn lyzovat - použít k urychlení zrání polotvrdých a tvrdých sýr a ke zlepšení jejich kvality, p edevším aroma.

Pod kováníTato práce byla podpo ena Ministerstvem školství, mládeže a t lovýchovy, eská

republika (MSM 6046137305).

Použitá literatura1. Law B. A.: Flavour development in cheese. Advances in Microbiology and Biochemistry of Cheese

and Fermented Milk, eds. L. Davies, B.A. Law. Elsevier Applied Science Publishers, London, pp. 187-208 (1984).

2. Sheenan A., O‘Cuin G., Fitzgerald R.J., Wilkinson M.G.: Proteolytic enzyme activities in Cheddar cheese juice made using lactococcal starters of differing autolytic properties. J. Appl. Microbiol. 100,893-901 (2006).

3. Sheenan A., O’Loughlin C., O’Cuinn G., Fitzgerald R.F., Wilkinson M.W.: Cheddar cheese cooking temperature induces differential lactococcal cell permeabilization and autolytic responses as detected by flow cytometry: implications for intracellular enzyme accessibility. J. Appl. Microbiol. 99, 1007-1018 (2005).

4. Chapot-Chartier M.-P., Deniel C., Rousseau M., Vassal L., Gripon J.C.: Autolysis of two strains of Lactococcus lactis during cheese ripening. Int. Dairy J. 4, 251-269 (1994).

5. Boutrou R., Sepulchre A., Gripon J.C., Monnet V.: Simple tests for predicting the lytic behavior and proteolytic activity of lactococcal strains in cheese. J. Dairy Sci. 81, 2321-2328 (1998).

6. O’Donovan C.M., Wilkinson M.G., Guinee T.P., Fox P.F.: An investigation of the autolytic properties of three lactococcal strains during cheese ripening. Int. Dairy J. 6, 1149-1165 (1996).

7. Wilkinson M.G., Guinee T.P., Fox P.: Factors which may influence the determination of autolysis of starter bacteria during Cheddar cheese ripening. Int. Dairy J. 4, 141-160 (1994).

8. Hannon J.A., Kilcawley K.N., Wilkinson M.G., Delahunty C.M., Beresford T.P.: Flavour precursor development in Cheddar cheese due to lactococcal starters and the presence and lysis of Lactobacillus helveticus. Int. Dairy J. 17, 316-327 (2007).

57

9. O’Sullivan D., Ross P.R., Fitzgerald G.F., Coffey A.: Investigation of the relationship between lysogeny and lysis of Lactococcus lactis in cheese using prophage-targeted PCR. Appl. Env. Microbiol. 5, 2192-2198 (2000).

10. Garde S., Gaya P., Medina M., Nunez M.: Autolytic behaviour of Lactococcus lactis subsp. cremorisand Lc. lactis subsp. lactis wild isolates from ewes‘ raw milk cheeses. Milchwissenschaft 57, 143-147 (2002).

11. Kenny O.M., Fitzgerald R.J., O’Cuinn G., Beresford T.P., Jordan K.N.: Comparative analysis of the autolytic potential of Lactobacillus helveticus strains during Cheddar cheese ripening. Int. J. Dairy Tech. 4, 207-213 (2005).

12. Martínez-Cuesta M.C., Kok J., Herranz E., Pelález C., Requena T., Buist G.: Requirement of autolytic activity for bacteriocin-induced lysis. Appl. Environ. Microbiol. 8, 3174-3179 (2000).

Kontaktní adresaMagdaléna Abrlová, magdalena.abrlova@vscht.cz

58

VÝB R VHODNÝCH HYDROKOLOID PRO STABILIZACI JAKOSTI TERMIZOVANÝCH SMETANOVÝCH SÝR

Tykvartová Dagmar 1), Hrab Jan 2), Patrovský Ji í 3)

1) VOŠ potraviná ská a SPŠ mlékárenská v Krom íži 2) Ústav potraviná ského inženýrství, FT UTB ve Zlín

3) NATURA, a.s., Praha

The selection of suitable hydrocolloids for the quality stabilisation of thermized cream cheese

Summary:Consistency and texture are very important organoleptic properties of thermized cheese due to the expected smooth appearance of that spreadable foodstuffs. In our lab and pilot trials, we analyzed and compared the samples of thermized cream cheese prepared with addition of different hydrocolloids. The choice of suitable hydrocolloids has been made on the basic tests with the application of a generally available assortment of commercial hydrocolloids. Our cheese samples were analyzed after production and after 40 days of storage at 6 2 C, i.e. at the end of their shelf life. After introductory trials, we have chosen two types of hydrocolloids: the mixture of modified starch, xanthan gum and guar gum (sample E) and individual high-methoxyl pectin HM (sample I), and they were subsequently used for experiments. Then, several physically-chemical and sensory analyses were applied for evaluation of finished samples of thermized cheese. Viscoelastic properties were determined by dynamic oscillatory rheometry. On the basis of comparative analysis, we have found the blended stabilizer (sample E) as the best hydrocolloids premix for our purpose its influence on viscoelastic and organoleptic properties was positive and the best applicable.

ÚvodHydrokoloidy–biopolymery p evážn rostlinného, ale i živo išného a mikrobiálního

p vodu, jsou látky dodávající potravinám funk ní vlastnosti. Jsou p idávány k n kterým mlékárenským produkt m s cílem stabilizovat strukturu finálního výrobku, resp. optimalizovat konzistenci a sou asn i celkový senzorický profil termizovaných výrobk .1,2 Bylo zjišt no, že na reologické vlastnosti výrobk nemá vliv pouze množství hydrokoloidu, ale p edevším jeho molekulová hmotnost, struktura, náboj a typy vazeb v daném biopolymeru.3 Vliv molekulové hmotnosti biopolymeru na viskozitu jogurt zkoumal Tuinier a kol.4 Petry a kol5. sledovali vliv monosacharidového složení na výslednou viskozitu produktu u kmen Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a konstatovali, že ím více glukózy je v et zci biopolymeru, tím je viskozita produktu vyšší. Dalším faktorem ovliv ujícím viskozitu je náboj biopolymeru. Bylo zjišt no, že záporn nabité biopolymery zvyšují elasticitu tím, že elektrostatickými silami interagují s kladnnabitým kaseinem a tím posilují proteinovou sí .6 Dalším faktorem, ovliv ujícím viskozitu, je druh vazeb v základním et zci biopolymeru. P edpokládá se, že vazba (1 4) d lá polysacharid ménohebný a tím p ispívá ke zvýšení viskozity produktu ve srovnání s vazbami (1 3), (1 2),

(1 4), které poskytují pružn jší konzistenci a p ispívají tak ke zvýšení elasticity.7V technologii výroby smetanových termizovaných sýr našly uplatn ní hlavn

hydrokoloidy rostlinného p vodu–karagenany, modifikované škroby a pektiny, dále guar a biotechnologickým postupem získávaný xanthan. V našich pokusech, z osmi druh hydrokoloid a jejich sm sí, obsahujících modifikované škroby (bramborový, tapiokový a kuku i ný) v kombinaci s pektiny nízko- i vysokoesterifikovanými, guarovou gumou, xanthanovou gumou a karagenany, byly po senzorickém a fyzikáln -chemickém hodnocení vybrány dva druhy, které nejlépe vyhovovaly jakostním požadavk m. Jednalo se o biopolymer typu vysokoesterifikovaný pektin a sm s modifikovaných škrob s xanthanovou a guarovou gumou.

Pektiny jsou hydrokoloidy výlu n rostlinného p vodu. Základní struktura pektinu je tvo ena lineárním et zcem 25-100 jednotek -D-galakturonové kyseliny spojených vazbou (1 4).Jsou áste n esterifikovány methanolem. Základní et zec je v menší mí e p erušován p ítomností L-rhamnózy a jiných neutrálních jednotek (D-galaktóza, L-arabinóza, D-xylóza aj.). Pro pektiny je

59

charakteristický stupe esterifikace (DE–degree of esterification), který vyjad uje procentické zastoupení methylace galakturonových kyselin v methyl-esterové form . Vysokoesterifikované pektiny (HM) jsou definovány jako ty, které mají hodnotu DE nad 70 %, nízkoesterifikované pektiny (LM) mají DE mén než 50 %. Mohou být navíc ješt amidované (LMA) nebo neamidované (LMNA). Stupe amidace (DA) vyjad uje procentické zastoupení karboxylové skupiny v amidové form .8,9

Mechanismus tvorby gelu závisí na stupni esterifikace pektinu. Vysokoesterifikované pektiny tvo í gely s cukrem v kyselém prost edí. Cukr váže vodu a snižuje tak stupe hydratace pektinu. Molekuly pektinu s nízkým po tem methoxylových skupin se vzájemn odpuzují, což brání asociaci molekul a tvorb gel . Gely proto vznikají jen za p ítomnosti vápenatých kationt . Pektinové molekuly mají v prost edí neutrálním záporný elektrický náboj, a proto reagují s polymery nesoucími kladné náboje, nap . s proteiny. Známé jsou interakce mezi kaseinem a vysokoesterifikovaným pektinem. Ob tyto makromolekulární složky se obvykle setkají v pr myslov vyráb ných potravních koloidech a pektin zejména je doporu ován jako stabilizátor kysaných mlé ných nápoj . V kyselém prost edí pektin stabilizuje kasein.9 Ambjerg, Pedersen a Jorgensen popsali, že vazby vysokoesterifikovaného pektinu na kaseinové micely jsou elektrostatické povahy a závisejí na pH prost edí.10 Adsorpce pektinu na kaseinové ástice a stabilizace komplexu byly popsány Glahnem.11 Dalgleish a Hollocou udávají, že velmi nízké koncentrace pektin mohou ochránit komplex kaseinátu sodného p ed agregací p i pH 5 a že pektin se váže na povrch emulze dokonce p i pH blízkém isoelektrickému bodu kaseinu.12

Modifikované škroby jsou škroby upravené tak, aby se omezily nežádoucí vlastnosti nativního škrobu-nerozpustnost ve vod , vysoká viskozita škrobových maz , vznik gumovité kohézní textury a tvorba kalných a retrogradujících gel .13

Xanthanová guma je hydrokoloid mikrobiálního p vodu. Producentem extracelulárního xanthanu jsou bakterie rodu Xanthomonas (nej ast ji Xanthomonas campestris). Jde o heteropolysacharid velké molární hmotnosti (M=2,5.106). Úplnou hydrolýzou získáme monomerní jednotky D-glukózy, D-mannózy a D-glukuronové kyseliny. Základní skelet xanthanu se podobá celulóze. Struktura je komplikovaná p ítomností pyruvátu vázaného na koncovou jednotku -D-mannózy. P ítomnost aniontu zvyšuje hydrataci a zajiš uje rozpustnost xanthanu ve studené vod . Samotný xanthan netvo í gely, ale termoreverzibilní gel vzniká ve sm sis polysacharidy, nap . s galaktomannany (gumou rohovníku-mou kou svatojánského chleba), glukomannany (konjakovou gumou) a -karagenanem. Vznik gelu vyžaduje interakci molekul xanthanu (dihelixu) s nev tvenou strukturou molekuly polysacharidu (s jeho vazebnou zónou). Kvalitn jší, elastické, soudržné gely vznikají z deacetylovaného xanthanu.14,15

Guarová guma je polysacharid–galaktomannan, získává se jako mouka z endospermu semen lušt niny Cyamopsis tetragonoloba. Polysacharidový et zec je tvo en -D-mannózovými jednotkami spojenými (1 4) vazbami a z vedlejšího et zce -D-galaktózy spojenými vazbami (1 6). Celkové zastoupení t chto dvou monomerních jednotek je v pom ru asi 2:1. Galaktózové substituenty jsou pravideln rozd leny podél mannózového et zce. asto se využívají v kombinaci s jinými koloidy, nap . s karagenany.16

Karagenany jsou polysacharidy, extrakty ervených mo ských as typu Chondrus, Gigartina a Euchema. Existuje osm druh frakcí, nejznám jší jsou t i (kappa, iota a lambda). Liší se po tem a polohou sulfátových skupin na 3,6-anhydro- -D-galaktopyranóze. Sulfátové skupiny mají nejv tší vliv na vlastnosti t chto hydrokoloid . Snadno tvo í gely i s jinými hydrokoloidy, nap . s mou kou svatojánského chleba.16

Cílem této práce bylo vybrat vhodné druhy hydrokoloid a jejich sm sí pro výrobu smetanových termizovaných sýr s obsahem 60 % tuku v sušin (w/w) a studovat rozdíly v základních vlastnostech fyzikáln -chemických, organoleptických a v záv ru i viskoelastických. Použité koncentrace hydrokoloid byly zvoleny tak, aby byla spln na podmínka tvorby žádané konzistence a schopnost výrobku vázat syrovátku po celou dobu trvanlivosti výrobku.17

60

Materiál a metodyVyrobeny a analyzovány byly smetanové termizované sýry s obsahem sušiny min. 25 %

(w/w) a tuku min. 15 % (w/w). Termizované sýry byly vyráb ny na za ízení Stephan UMM/SK 80 p i termiza ním záh evu 76 C. Po termizaci byla hmota homogenizována na homogenizátoru Sigma, zchlazena na teplotu 6 2 C a p i této teplot byly výrobky skladovány. K výrob byly použity suroviny: tvaroh tu ný, máslo a vybrané druhy a sm si dále uvedených hydrokoloid .

vzorek B,C a D: nízkoesterifikované pektiny E 440 v množství 0,2 % w/w. Vzorky se lišily procentickým obsahem jednotlivých složek.

vzorek E: sm s modifikovaného tapiokového škrobu E 1442, modifikovaného bramborového škrobu E 1414, xanthanové gumy E 415 a guarové gumy E 412 v celkovém množství sm si 0,5 % w/w

vzorek F: sm s kappa-karagenanu E 407 a modifikovaného kuku i ného škrobu E 1442 v množství 0,4 % w/w

vzorek G: sm s xanthanové gumy E 415 a mlé ných bílkovin v množství 0,5 % w/w vzorek H: modifikovaný bramborový škrob E 1442 v množství 0,5 % w/w vzorek I: vysokoesterifikovaný pektin. E 440 v množství 0,2 % w/w

Organoleptické i fyzikáln -chemické hodnocení bylo provedeno po výrob a na konci doby minimální trvanlivosti, to je po 40 dnech. Na základ výsledk senzorické analýzy byly pro další blok zkoušek vybrány ty i a následn pouze dva druhy hydrokoloid . I tyto výrobky byly hodnoceny organolepticky, fyzikáln chemicky a navíc byly zjiš ovány i reologické vlastnosti.

Senzorické hodnocení bylo provád no skupinou 12 vybraných posuzovatel , vyškolených podle SN ISO 8586-1.17 Vzorky byly p edkládány anonymn p i skladovací teplot . Senzorické hodnocení bylo provedeno pomocí po adového preferen ního testu a statistické vyhodnocení provedeno oboustranným zjednodušeným testem.18 Ve výsledkové ásti uvádíme pouze výsledky po adového preferen ního testu, kdy byl hodnocen celkový senzorický profil a statistické hodnocení bylo provedeno Friedmanovým testem.19

Pro fyzikáln -chemickou analýzu byla použita ke stanovení obsahu tuku technická acidobutyrometrická metoda van Gulikova, ke stanovení sušiny metoda p esná vážková, obsah tuku v sušin byl stanoven metodou technickou výpo tovou, aktivní kyselost metodou potenciometrickou a titra ní kyselost alkalimetrickou titrací.20

Reologické vlastnosti vyrobených sýr byly charakterizovány pomocí rota níhoviskozimetru Bohlin Gemini (Bohlin instruments, UK) v geometrii deska-deska (pr m r 40 mm, št rbina 1 mm) p i teplot 20 C. M ení bylo provád no v oscila ním režimu s amplitudou smykového nap tí 20 Pa v oblasti lineární viskoelasticity. Elastický modul pružnosti G a ztrátový modul pružnosti G byly vyhodnocovány v rozsahu frekvencí 0,1-50 Hz.21,22

Výsledky a diskuzeV první fázi bylo pro výrobní experimenty použito osm výše uvedených hydrokoloid .

Analýzy byly provedeny po výrob a na konci doby minimální trvanlivosti. Z výsledk chemické analýzy jsou uvedeny pouze závažn jší odchylky od standardních hodnot (komplexní výsledky jsou k dispozici u autor p ísp vku). U vzork B a C bylo chemickou analýzou zjišt no zvýšení obsahu sušiny v pr b hu skladování asi o 2-3 % (z hodnoty 37,55 % na 40,14 % u vzorku B a z 37,22 % na 39,89 % u vzorku C). P í inou zvýšené sušiny bylo nedostate né vázání syrovátky a její následné uvol ování z výrobku. Výsledky senzorického hodnocení jsou uvedeny v tabulce I.

Vzorky G a H byly p i senzorické analýze nejmén preferovány, k emuž p isp la i vysoká hodnota sušiny (38-39 %). Ta mohla mít souvislost se vznikem krátké, drobivé až rozpadavé konzistence, což negativn ovlivnilo celkový senzorický profil výrobku. Na základ výsledksenzorického hodnocení byly z dalších pokus vy azeny vzorky pod ozna ením B, C, G a H.

S vybranými 4 druhy biopolymer byly provedeny opakované výroby a zp sob hodnocení byl totožný. Výsledky chemických analýz a senzorického hodnocení jsou uvedeny v tabulce II a III.

61

Tabulka I Výsledky po adového preferen ního testu (celkový senzorický profil výrobku) po 40 dnech skladování (konec DMT*)

vzorek B C D E F G H Isou et po adí

všech hodnotitel 74 91 56 29 55 93 99 24

po adí 5 6 4 2 3 7 8 1*DMT datum minimální trvanlivosti

B,C,D: nízkoesterifikované pektiny E 440E: sm s modifikovaného tapiokového škrobu E 1442, modifikovaného bramborového škrobu

E 1414, xanthanové gumy E 415 a guarové gumy E 412F: sm s kappa-karagenanu E 407 a modifikovaného kuku i ného škrobu E 1442G sm s xanthanové gumy E 415 a mlé ných bílkovinH: modifikovaný bramborový škrob E 1442I: vysokoesterifikovaný pektin. E 440

Tabulka II Fyzikáln -chemické hodnoty zjišt né u skupiny smetanových termizovaných sýr vyrobených za použití ty vzork hydrokoloid po 40 dnech skladování

vzorek tuk %w/w

sušina %w/w

tuk v sušin% , w/w

titra ní kyselost SH

aktivní kyselost pH

D 20,5 37,75 54,3 66 4,4 E 20,5 35,91 57,1 67 4,5 F 20,5 37,27 55,0 66 4,4 I 20,5 35,96 57,0 66 4,4

Tabulka III Výsledky senzorické analýzy po adovým preferen ním testem (hodnocen celkový senzorický profil sýr ) po 40 dnech skladování

vzorek D E F Isou et po adí

všech hodnotitel 50 18 56 31

po adí 3 1 4 2vysv tlení symbol viz. legenda u tabulky I

Tabulka IV Fyzikáln -chemické hodnoty zjišt né u skupiny smetanových termizovaných sýr vyrobených za použití dvou vzork hydrokoloid po 40 dnech skladování

vzorek tuk %w/w

sušina %w/w

tuk v sušin% , w/w

titra ní kyselost SH

aktivní kyselost pH

E 16,1 34,58 46,6 70 4,3 I 16,2 33,78 48,0 68 4,4 A 16,1 34,65 46,5 70 4,3

E: sm s modifikovaného tapiokového škrobu E 1442, modifikovaného bramborového škrobu E 1414, xanthanové gumy E 415 a guarové gumy E 412I: vysokoesterifikovaný pektin E 440

A: standard-sm s karobové gumy E 410, guarové gumy E 412 a xanthanové gumy E 415

62

Vzorky D a F vykazovaly zvýšený obsah sušiny. Bylo zjišt no zvýšené uvol ování syrovátky, které se projevilo tužší konzistencí a zhoršenou roztíratelností, což se negativn odrazilo ve výsledcích senzorického hodnocení. Na základ senzorického vyhodnocení byly vy azeny vzorky D a F a p ikro ilo se k výrob s použitím hydrokoloid ozna ených kódy E a I (jejich charakteristika je uvedena u tabulky IV). Výsledky analýz byly opakovan porovnány s tzv. standardem, to je výrobkem v sou asné dob vyráb ným.

Tabulka V Výsledky senzorického hodnocení smetanových termizovaných sýr po adovým preferen ním testem po 40 dnech skladování (konec DMT*)

vzorek E I A sou et po adí všech

hodnotitel 19 33 20

po adí 1 3 2 *DMT datum minimální trvanlivosti

U vyrobených vzork byly dále sledovány zm ny reologických vlastností, konkrétnelastického modulu pružnosti G a ztrátového modulu pružnosti G , které byly vyhodnocovány v rozsahu frekvencí 0,1-50 Hz. Z nam ených hodnot vyplývá, že sýry s hodnocenými hydrokoloidy mají na konci doby skladovatelnosti hodnoty elastického i ztrátového modulu pružnosti nižší než standard. Tyto sýry mají, podle výsledk reologických m ení, slabší gel a jsou mén tuhé než standard.

P i senzorickém hodnocení byl nejvíce preferován vzorek ozna ený kódem E (sýr vyrobený za použití sm si modifikovaných škrob , xanthanové a guarové gumy), dále vzorek pod ozna ením standard (sýr b žn vyráb ný za použití sm sného stabilizátoru) a nejménpreferovaný byl vzorek ozna ený kódem I (sýr vyrobený za použití vysokoesterifikovaného pektinu).

Záv rV práci byly charakterizovány b žné hydrokoloidy používané k úprav textury

termizovaných smetanových sýr a byl kvantifikován jejich vliv na mechanické vlastnosti vyrobených smetanových termizovaných sýr . Byla srovnávána jakost smetanových termizovaných sýr s p ídavkem vybraných druh hydrokoloid a jejich sm sí. Vyhodnocení bylo provád nofyzikáln -chemickou a senzorickou analýzou, posléze i reologickými metodami.

Bylo zjišt no, že ze skupiny osmi navržených druh a kombinací hydrokoloid lze pro zajišt ní požadované jakosti doporu it dva druhy: sm sný stabilizátor, obsahující modifikovaný tapiokový škrob E 1442, modifikovaný bramborový škrob E 1414, xanthanovou gumu E 415 a guarovou gumu E 412 a jako druhý vzorek vysokoesterifikovaný pektin E 440. Tyto druhy vyhovují po stránce fyzikáln -chemické, senzorické i reologické. Jako mén vhodné se jevily pektiny nízkoesterifikované, které vytvá ely konzistenci drobivou, p íliš tuhou, h e roztiratelnou.

Výsledky všech rozbor potvrdily, že dva vybrané vzorky hydrokoloid lze doporu itk použití p i výrob smetanových termizovaných sýr , protože nebyly zjišt ny významn jší rozdíly v jejich jakosti p i porovnání se stávajícím, v sou asnosti používaným stabilizátorem. P i senzorické analýze byl výrobek se sm sným stabilizátorem-vzorkem E hodnocen navíc jako kvalitn jší (viz tab. V). Získané výsledky mohou být využity pro návrh sm sí hydrokoloidpro konkrétní aplikace do termizovaných smetanových sýr .

Pod kování:Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM 7088352101.

63

Použitá literatura:1. SIMEONE, M., ALFANI, A., GUIDO, S. Phase diagram, rheology and interfacial tension of aqueous

mixtures of Na-caseinate and Na-alginate. Food Hydrocolloids, 18, 2004, 463 – 470. 2. THAIUDOM, S., GOFF, H.D. Effect of -carrageenan on milk protein polysaccharide mixtures.

International Dairy Journal, 13, 2003, 763 – 771. 3. MARSHALL, V.M., DUNN, H., ELVIN, M., MELAY, N., LAWS, A.P. Structural characterisation of

the exopolysaccharide produced by Streptococcus thermophilus EU20. Carbohydrate Research, 2001, 413-422.

4. TUINIER, R., YOON, P., STUART, M.A.C., FLEER, G.J., de KRUIF, C.G. Concentration and shear-rate dependence of the viscosity of an exocellular polysaccharide. Biopolymers, 1999, 50, 641-646.

5. PETRY, S., FURLAN, S., WAGHORNE, E., SAULNIER, L., CERNING, J., MAGUIN, E. Comparison of the thickening properties of four Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus strains and physicochemical characterization of their exopolysaccharides. FEMS Microbiology Letters, 2003, 221, 285-291.

6. DUBOC, P., MOLLET, B. Applications of exopolysaccharides in the dairy industry. International Dairy Journal, 11, 2001, 759-768

7. RAUS-MADIEDO, P., HUGENHOLTZ, J., ZOON, P. An overview of exopolysaccharide produced by lactic acid bacteria. International Dairy Journal, 12, 2002, 163-171.

8. Propaga ní materiál firmy Degussa. Texturant Systems, N mecko9. VELÍŠEK, J. Chemie potravin I. 1. vyd. Tábor : OSSIS, 1999. 352 s. ISBN 80-902391-3-7 10. AMBJERG, PEDERSEN, H.C., JORGENSEN,B.B (1991) Influence on the stability of casein solutions

studied in dependence of varying pH and salt concentration. Food Hydrocolloids, 4, 323-328 11. GLAHN, P. Hydrocolloid stabilization of protein suspensions at low pH. Food Nutr., Sci. 1982, 6. 171-

17712. DALGLEISH, D.G., HOLLOCOU, A.L. (1997) Stabilization of protein-based emulsions by means of

interacting polysaccharides. In E. Dickinson, B. Bergenst hl (Eds.), Food colloids: proteins, lipids and polysaccharides (pp. 236-244). Cambridge, UK. Royal Society of Chemistry

13. ZADRAŽIL, K., GAJD ŠEK, S. Mléka ství. 1. vyd. Praha : ISV, 2002. 125 s. ISBN 80-86642-15-1 14. www.cargilltexturizing.com15. www.cpkelco.com16. IMESON, A.P. Carrageenan. In Handbook of hydrocolloids. Eds. Phillips, G.O. & Williams, P.A.

Woodhead Publishing Limited and CRC Press: Boca Raton, 2000, 87 – 102. 17. ISO Standard No. 8586-1:1993 Sensory analysis – General guidance for the selection, training and

monitoring of assessors – Part 1: Selected assessors. International Organization for Standardization, Geneva, 1993.

18. JAROŠOVÁ, A. Senzorické hodnocení potravin. 1. vyd. Brno : MZLU, 2001. 84 s. ISBN 80-7157-539-9 19. K ÍŽ, O., BU KA, F., HRAB , J. Senzorická analýza potravin II. Statistické metody. 1. vyd. UTB Zlín.

2007. 127 s. ISBN 978-80-7318-494-0 20. INDRA, Z., MIZERA, J. Chemické kontrolní metody pro obor zpracování mléka. 1. vyd. Praha. 1992.

273 s. 21. GUNASEKARAN, S. Cheese reology and texture. Boca Raben press LLC. 2003. ISBN 1-58716-021-8 22. KRÁ ALÍK, M. Reology of dispersive polymeric systems. UTB Zlín. 2006. 46 s. ISBN 80-7318-493-1

Kontaktní adresa:Ing. Dagmar Tykvartová, VOŠ potraviná ská a SPŠ mlékárenská v Krom íži, Št chovice 1358, 767 54 Krom íž, tel. 774 144 913, e-mail: dagmar.tykvartova @email.cz

64

VLIV ROZDÍLNÉHO STERILA NÍHO ZÁH EVU S KONSTANTNÍM SMRTÍCÍM Ú INKEM NA JAKOST TAVENÝCH SÝR

Bu ka František 1), Lazárková Zuzana 1), Bu ková Leona 1), Holá Felix 2),Krá mar Stanislav 1), Hrab Jan 1)

1) Ústav potraviná ského inženýrství FT UTB ve Zlín , 2) Pragolab s.r.o.

Influence of different sterilation mode with the same lethal effect on processed cheese quality

Summary:The article aims to evaluate the impact of 4 different modes of sterilization (110°C for 100min, 115°C for 32min, 120°C for 10min and 125°C for 3.17min) with the same lethal effect (F-value 7.78) on the properties of processed cheeses (38% w/w dry matter, 50% w/w fat in dry matter) depending on the addition of lactose (0; 0.5; 1.0; 1.5 and 2.0% w/w). The microbiological quality of the processed cheeses as well as their protein profile (SDS-PAGE method), colour (spectrophotometrically analyzed) and sensory properties (flavour) were evaluated. The sterilization modes tested ensured inactivation of the microflora observed (the total number of microorganisms, coliforms, aerobic and anaerobic spore-forming bacteria and colony forming units of yeasts and/or moulds). With the falling sterilization temperature and adequately prolonged period of the exposure time (in order to maintain a constant lethal effect) the processed cheeses became darker and less acceptable from the sensory point of view and more significant hydrolytic changes of proteins occurred. In comparison with the non-sterilized processed cheeses, the smallest changes were noted in products treated with a temperature of 125°C for 3.17min. The heat at a temperature of 120°C for 10min was still acceptable from sensory points of view. A decline in quality was even more significant with the increasing amount of lactose added (in the area of concentration tested, i.e. 0.5–2.0% w/w). The additions of lactose higher than 1.0 % w/w were found unsuitable for the production of sterilized processed cheeses.

ÚvodTavené sýry jsou vyráb ny zah íváním sm si r zných druh p írodních sýr (v r zném

stadiu zralosti) s tavicími solemi (obvykle sodné soli fosfát a polyfosfát , pop . citrát )za áste ného podtlaku a stálého míchání, až se dosáhne homogenní hmoty. Krom tradi níchsurovin (nap . p írodní sýry, tavicí soli, máslo, tvaroh, voda) se v poslední dob rovn ž využívá ada sušených mlé ných koncentrát , z nichž n které mají významný obsah laktózy (nap íklad

sušené odst ed né mléko a sušená syrovátka), která však m že podstatn ovlivnit jakost tavených sýr 1–3. Tyto suroviny jsou využívány p edevším z ekonomických d vod (snížení nákladna surovinu).

Tavené sýry pat í mezi typické nekyselé potraviny (pH>4) a p edstavují prost edí, které vyhovuje mnohým mikroorganizm m v etn sporulujících bakterií. B žné tavené sýry mají trvanlivost ádov n kolik m síc v závislosti na ad faktor , nap . na použité surovin , tavicí teplot a dob jejího p sobení, technologii balení, obalovém materiálu a teplot skladování 4.Pro zabezpe ení delší trvanlivosti tavených sýr je možné použít sterila ní záh ev hermeticky zabalených výrobk . Sterilované produkty je možné využít nap . do bojových dávek potravin (nap íklad armády USA, N mecka, eské republiky), pro zabezpe ení stravování lenIntegrovaného záchranného systému p i jejich opera ním nasazení, ale i v b žném životv p ípadech, kdy není k dispozici chladírenská technika 5.

P i sterilaci je smrtící ú inek na mikroorganizmy dán p edevším výší teploty a dobou jejího p sobení. Pro numerické vyjád ení smrtícího ú inku daného sterila ního režimu (kombinace teploty a doby jejího p sobení) lze využít tzv. F–hodnotu 6. Úrove 1 F odpovídá smrtícímu ú inkuteploty 121,1oC p sobící práv 1 minutu (nebo ekvivalentnímu sterila nímu záh evu, který zabezpe í stejný destruk ní ú inek na testovací mikroorganizmus). Hodnota veli iny F se vypo te podle vztahu:

zT

tF1,121

10 (1) kde: t je as p sobení sterila ní teploty (min); T je sterila ní teplota (°C) a z je hodnota vyjad ující pot ebný nár st v teplot , aby byl získán stejný letální ú inek p i 1/10 doby p sobení (°C). Hodnota

65

z se pro obvyklé testovací mikroorganizmy (nap . Bacillus stearothermophilus, Clostridium botulinum aj.) pohybuje kolem 10°C 7.

Termosterilací však nejsou dot eny pouze mikroorganizmy, ale také p ítomné chemické látky, jejichž reakce mohou zp sobit snížení nutri ní hodnoty vysterilovaných výrobk 8.Bezesporu nejvýznamn jší reakcí probíhající v d sledku termosterilace je Maillardova reakce, jako reakce karbonylových slou enin (zejména redukujících sacharid ) s aminoslou eninami (nej ast jiaminokyselinami) 9. Proto p i použití surovin obsahujících vyšší množství laktózy (nap . sušené mléko nebo sušená syrovátka) lze p edpokládat zvýšení intenzity Maillardovy reakce 2,10. ada produkt i meziprodukt t chto reakcí jsou senzoricky aktivními látkami ovliv ujícími aroma, konzistenci i barvu výrobku, nap . uhlovodíky, aldehydy, ketony, kyseliny. Komplex Maillardových reakcí m že rovn ž zp sobit ztráty nutri n významných látek 9–11.

Rovnice (1) m že být použita také pro vyjád ení ztrát nutri n významných látek, ke kterým m že dojít v rámci sterila ního režimu definovaného kombinací teploty a doby jejího p sobení. Hodnoty z pro tyto ztráty se pohybují p ibližn na úrovni 5ti až 10ti násobku ve srovnání se z-hodnotami pot ebnými pro usmrcení daných mikroorganizm 12. Pro zachování vysoké nutri níhodnoty sterilovaných potravin p i konstantním smrtícím ú inku na mikroorganizmy je t eba využít spíše vyšších sterila ních teplot p sobících adekvátn kratší dobu.

Cílem této práce bylo vyhodnotit vliv 4 r zných sterila ních režim daných kombinací teploty a asu (p i konstantním smrtícím ú inku vyjád eném F-hodnotou) na vybrané chemické, mikrobiologické a senzorické vlastnosti tavených sýr v závislosti na jejich obsahu laktózy.

Materiál a metody

Pro ú ely experimentu byly vyrobeny tavené sýry (obsah sušiny 38 % w/w, obsah tuku v sušin 50 % w/w) s p ídavkem laktózy (0,5; 1,0; 1,5 a 2,0 % w/w ve finálním produktu). Získán byl rovn ž tavený sýr bez p ídavku laktózy. Surovinová sm s zahrnovala: Eidamskou cihlu, máslo, vodu a komer ní tavicí soli. Tavené sýry byly vyrobeny na laboratorním za ízení Vorwerk Thermomix TM 21 13. Obsah laktózy byl korigován p ídavky vody a másla pro zachování konstantního obsahu sušiny a tuku v sušin . Tavicí teplota byla 90°C a celkový as p ípravy vzorku byl 10 minut. Vyrobená tavenina byla pln na do 75g obal z taženého hliníku uzav enýchp iva itelným hliníkovým ví kem. Malá ást vani ek z každé výroby byla zchlazena b hem 3 – 4 hodin na 6 2°C (tzv. „nesterilované tavené sýry“), zatímco zbytek byl rozd len na 4 ásti,které byly následn podrobeny ty em r zným sterila ním záh ev m (tzv. „sterilované tavené sýry“). Pro sterilaci byl použit diskontinuální pr myslový autokláv SVV2AKV (Pacovské strojírny, Slovenská republika). Aplikovány byly následující sterila ní režimy: 100°C 100 minut (A), 115°C 32 minut (B), 120°C 10 minut (C) a 125°C 3,17 minut (D). Všechny kombinace byly vybrány tak, aby bylo dosaženo konstantní F-hodnoty (F=7,78). Doba do dosažení sterila ní teploty a doba chlazení byly prakticky stejné u všech 4 sterila ních režim . Celkov bylo vyrobeno 25 variant vzork : 4 skupiny lišící se kombinací sterila ní teploty a doby jejího p sobení (A – D) a 1 skupina nesterilovaných tavených sýr . Každá skupina obsahovala výrobek bez obsahu laktózy a dále 4 výrobky s obsahem laktózy (0,5; 1,0; 1,5 a 2,0 % w/w). Každá varianta byla vyrobena t ikrát.

Modelové tavené sýry byly charakterizovány pomocí pH, obsahu sušiny, tuku a dusíkatých látek. M ení byla provedena nejmén dvakrát (u každého vzorku). Mikrobiologická jakost nesterilovaných i sterilovaných tavených sýr byla posouzena pomocí stanovení celkového obsahu mikroorganizm , obsahu koliformních mikroorganizm a plísní a kvasinek. Dále byly zjiš oványpo ty aerobních a anaerobních sporulujících mikroorganizm . Sterilované tavené sýry byly podrobeny termostatové zkoušce (10 dn p i teplot 37 1°C).

Barva tavených sýr byla zjiš ována pomocí spektrofotometru CM-2600d (Konica Minolta, Tokio, Japonsko). Výsledky byly získány pro osv tlení D65 (denní sv tlo s teplotou barvy 6500 K) a CIE 1964 10o standardního pozorovatele a vyjád eny ve stupnici CIE L*a*b*. Z nam ených hodnot sou adnic L*, a*, b* byl vypo ítán tzv. index žlutosti (YI), jehož nár stindikuje zvýšenou intenzitu degrada ních reakcí v m eném systému.

66

U vzork byl zjiš ován proteinový profil pomocí denatura ní polyakrylamidové elektroforézy (SDS-PAGE). Vzorky byly p ipraveny podle metody popsané v Bütikofer et al. 14.Polyakrylamidový gel (17 %) a systém pufr byl p ipraven podle metodiky Laemmli 15 s použitím vertikálního elektroforetického systému P9DS Emperor Penguin (Owl, Portsmouth, USA). Elektroforéza probíhala 4 hodiny p i 15°C a 70 mA. Jako standardy pro ur ení molekulové hmotnosti separovaných protein byl použit Protein Test Mixture 5 (Serva, Heidelberg, N mecko) s proteiny s následujícími molekulovými hmotnostmi (kDa): 29,0; 21,0; 12,5; 6,5. Separované proteiny byly barveny dusi nanem st íbrným podle Kirkeby et al. 16. Program Ultra QuantTM 6.0 (Ultra-Lum. Inc., Claremont, USA) byl použit pro analýzu separovaných protein .

Se vzorky nesterilovaných a sterilovaných tavených sýr byla provedena senzorická analýza prost ednictvím 16 vybraných posuzovatel (podle ISO 8586-1:1993). Pro sledování chuti a v n byla použita sedmibodová hedonická stupnice s charakteristikou každého bodu.

Výsledky základních chemických analýz, spektrofotometrického hodnocení barvy a senzorického posouzení chuti a v n byly statisticky analyzovány pomocí Kruskal-Wallisova a Wilcoxonova testu s 5% rizikem omylu. Výsledky elektroforézy byly podrobeny shlukové analýze. Pro vyhodnocení byl využit program Unistat 5.5 (Unistat Ltd., Londýn, UK).

Výsledky a diskuze

P i mikrobiologickém vyšet ení byly u nesterilovaných tavených sýr (po 1 m síci skladování p i teplot 6 2°C) zjišt ny následující výsledky: celkový po et mikroorganizm3,7 104 KTJ·g-1, aerobní sporulující mikroorganizmy 2,3 104 KTJ·g-1, anaerobní sporulující mikroorganizmy 1,9 104 KTJ·g-1 plísn a kvasinky 8,7 103 KTJ·g-1. Koliformní mikroorganizmy nebyly u nesterilovaných tavených sýr zjišt ny. U sterilovaných tavených sýr nebyly detekovány žádné mikroorganizmy, a to ani p i termostatové zkoušce. Všechny aplikované sterila ní režimy s hodnotou F=7,78 (A – D) byly tedy dosta ující pro inaktivaci p ítomných mikroorganizm(detekovatelných použitými metodami), což koresponduje s publikovanými údaji 12.

Ze základní analýzy vyplynulo, že se sledované tavené sýry signifikantn nelišily (P 0,05) v obsahu sušiny (37,11 – 38,46 % w/w) a obsahu tuku (18,5 – 19,0 % w/w), což je d ležité pro zabezpe ení srovnatelnosti testovaných vzork 17,18. Zatímco sterilace obsah dusíkatých látek neovlivnila (P 0,05), s nar stající koncentrací laktózy ve vzorcích se obsah dusíkatých látek snižoval (P < 0,05); celkov se pohyboval v intervalu 11,83 – 13,09 % w/w. Snižování obsahu dusíkatých látek p i zvyšujícím se p ídavku laktózy bylo nezbytné pro zachování konstantního obsahu sušiny a tuku. Tento stav odpovídá pr myslové praxi, nebo p ídavky relativn levn jších surovin s vyšším obsahem laktózy mají primárn za cíl nahradit ást relativn dražší základní suroviny (p írodních sýr – s vysokým obsahem bílkovin) p i nem nném obsahu sušiny a tuku.

U nesterilovaných tavených sýr se pH pohybovalo v intervalu 5,97 – 6,10. Výrobky, na n ž byly aplikovány sterila ní režimy A a B, respektive C a D, vykazovaly pH v intervalu 5,75 –5,93, respektive 5,83 – 5,95. Sterilované tavené sýry tedy vykazovaly signifikantn (P < 0,05) nižší pH než výrobky nesterilované, a to v pr m ru o cca 0,1 – 0,2. Jednu z p í in poklesu pH lze hledat v hydrolýze p ítomných polyfosfátových tavicích solí, ímž m že dojít ke zm n jejich pufrovací schopnosti 19,20. Vliv obsahu laktózy na úrove pH nebyl u nesterilovaných ani u sterilovaných tavených sýr pozorován (P 0,05).

Proteinové profily nesterilovaných a sterilovaných tavených sýr získané metodou SDS-PAGE byly statisticky analyzovány pomocí shlukové analýzy (dendrogram na obr. 1). Nesterilované tavené sýry vytvo ily samostatný shluk, výrazn odd lený od všech vzork ,které byly ošet eny sterilací. Proteinový profil sledovaných tavených sýr byl významn ovlivn njak použitým sterila ním režimem (A – D), tak i obsahem laktózy. Tavené sýry bez p ídavkulaktózy, na které byly aplikovány sterila ní režimy C a D, m ly ze všech sterilovaných produktproteinový profil nejbližší k proteinovým profil m nesterilovaných výrobk . Naopak pokud byla p idávána laktóza, pak se proteinové profily výrobk C a D blížily více k proteinovým profil mtavených sýr ošet eným režimy A a B než k proteinovým profil m nesterilovaných produkt .

67

Obecn je možné na základ získaných výsledk íci, že se snižující se sterila ní teplotou (a adekvátním prodlužováním jejího trvání pro zachování konstantního smrtícího ú inku) docházelo k rozsáhlejší hydrolýze p ítomných protein . V proteolytických procesech probíhajících p i sterilaci, prokázaných pomocí metody SDS-PAGE, lze hledat další p í inu poklesu pH. Vysv tlení m že spo ívat ve skute nosti, že u vytvo ených št pných produkt dojde k nár stu volných karboxylových skupin ve srovnání s nezhydrolyzovaným proteinem.

Obr. 1. Výsledky shlukové analýzy proteinového profilu sledovaných tavených sýr : A – 110°C 100 minut, B – 115°C 32 minut, C – 120°C 10 minut a D – 125°C 3,17 minut, None – nesterilované tavené sýry. Obsah laktózy je vyjád en v procentech (w/w).

Výsledky spektrofotometrické analýzy barvy sledovaných tavených sýr jsou uvedeny v tabulce I. V d sledku sterilace došlo u všech výrobk k signifikantnímu nár stu hodnot indexu žlutosti (P < 0,05). Výrobky, na n ž byl aplikován sterila ním režim A a B se v indexu žlutosti významn odlišovaly (P < 0,05) jak navzájem tak i od tavených sýr podrobených sterila nímzáh ev m C a D. Jedinou výjimkou byly vzorky bez p ídavku laktózy, kde se index žlutosti u varianty B významn neodlišoval (P 0,05) od sterila ních režim C a D. Tavené sýry ošet ené zp sobem C a D, do nichž byl aplikován p ídavek laktózy <2,0 % w/w (v etn vzork bez p ídavku laktózy), se vzájemn neodlišovaly (P 0,05) v indexu žlutosti. Z výsledk bylo možné vysledovat, že se snižující se teplotou sterilace docházelo k nár stu hodnot indexu žlutosti jako markeru intenzity degrada ních reakcí.

P ídavek laktózy zp sobil u nesterilovaných tavených sýr u všech realizovaných koncentrací (0,5 – 2,0 % w/w) signifikantní zvýšení hodnot indexu žlutosti (P < 0,05) ve srovnání s kontrolním vzorkem bez p ídavku laktózy. U aplikovaných sterila ních režim (A – D) byl s nár stem obsahu laktózy rovn ž pozorován signifikantní (P < 0,05) nár st hodnot indexu žlutosti. Tento trend byl patrn jší u sterila ních režim A a B ve srovnání s C a D, kde se ve v tšin p ípadodlišovaly (P < 0,05) až výrobky, kde rozdíl v obsahu laktózy inil alespo 1,0 % w/w.

68

Tabulka I Výsledky instrumentálního hodnocení barvy sterilovaných a nesterilovaných tavených sýrvyjád ené pomocí indexu žlutosti (pr m r S.D.) *

Sterila ní teplota a doba jejího p sobeníObsahlaktózy

(% w/w) Nesterilované

výrobky 110°C 100 min 115°C 32 min 120°C 10 min 125°C 3,17 min

0,0 21,5 ± 0,4 a A 32,6 ± 2,0 a B 25,6 ± 2,1 a C 24,0 ± 1,1 a C 23,3 ± 1,3 a C 0,5 23,4 ± 0,6 b A 50,7 ± 0,5 b B 33,9 ± 1,3 b C 27,9 ± 2,5 a,b D 26,7 ± 0,5 b D 1,0 24,2 ± 0,6 b A 63,5 ± 4,8 c B 42,0 ± 1,2 c C 30,8 ± 2,1 b,c D 28,2 ± 2,1 b,c D 1,5 23,2 ± 1,4 b A 75,1 ± 0,9 d B 47,8 ± 3,9 d C 31,8 ± 2,9 c D 28,4 ± 2,5 b,c D 2,0 23,6 ± 0,5 b A 78,9 ± 0,1 e B 55,1 ± 0,9 e C 38,7 ± 2,4 d D 30,8 ± 1,1 c E

* Nemají-li pr m ry ve sloupci (vliv obsahu laktózy) žádné spole né písmeno v horním indexu, pak se indexy žlutosti výrobk v daném sloupci signifikantn liší (P < 0,05). Nemají-li pr m ryv ádku (vliv r zné teploty sterilace a doby jejího p sobení) žádné spole né velké písmeno, pak se indexy žlutosti výrobk v daném ádku signifikantn liší (P < 0,05).

Hodnocena byla rovn ž chu a v n nesterilovaných a sterilovaných tavených sýr a výsledky jsou uvedeny v tabulce II. Všechny nesterilované tavené sýry byly v chuti a v nihodnoceny bez ohledu na obsah laktózy (0 – 2,0 % w/w) jako velmi dobré (P 0,05). Výrobky ošet ené režimem D vykazovaly chu a v ni dobrou až velmi dobrou, která se u v tšiny testovaných koncentrací laktózy nelišila od nesterilovaných vzork (P 0,05). U sterila ních režim A a B se chu a v n tavených sýr signifikantn zhoršovala (P < 0,05) s nar stající koncentrací laktózy, p i emž vzorky s nejvyššími koncentracemi byly hodnoceny jako špatné až nevyhovující. Výrobky ošet ené režimy A a B vykazovaly signifikantní zhoršení chuti a v n (P < 0,05) ve srovnání s produkty vysterilovanými zp sobem D a s nesterilovanými výrobky. V tšina tavených sýrošet ených režimem C s obsahem laktózy 1,0 % w/w se v chuti a v ni neodlišovala (P 0,05) od výrobk , na které byl aplikován režim D, ani od nesterilovaných produkt . V tšina z t chtovýrobk byla hodnocena jako dobrá. P i vyšším obsahu laktózy (>1,0 % w/w) se již chu a v nvýrobk ošet ených režimem C ve srovnání s nesterilovanými produkty významn zhoršila (P < 0,05).

Tabulka II Výsledky senzorické analýzy chuti a v n tavených sýr *

Sterila ní teplota a doba jejího p sobeníObsahlaktózy(% w/w)

Nesterilovanévýrobky

110°C100 min

115°C32 min

120°C10 min

125°C3,17 min

0,0 2 a A 5 a B 4 a B,C 3 a A,C 3 a A 0,5 2 a A 6 b B 5 a,b B,C 4 a A,C 3 a A 1,0 2 a A 6 b B 5 a,b B,C 4 a A,C 4 a A 1,5 2 a A 7 c B 6 b,c B 4 a,b C 4 a C 2,0 3 a A 7 c B 7 c B 5 b C 4 a A,C

* Chu a v n byla hodnocena sedmibodovou ordinální stupnicí (1 – vynikající, 4 – dobrý, 7 – nevyhovující), prezentovány jsou mediány. Nemají-li mediány ve sloupci (vliv obsahu laktózy) žádné spole né písmeno v horním indexu, pak se chu a v n výrobk v daném sloupci signifikantn liší (P < 0,05). Nemají-li mediány v ádku (vliv r zné teploty sterilace a doby jejího p sobení) žádné spole né velké písmeno, pak se chu a v n výrobk v daném ádkusignifikantn liší (P < 0,05).

69

Obecn nelze suroviny obsahující významn jší podíl redukujících sacharid z výše uvedených d vod doporu it pro výrobu sterilovaných tavených sýr . V p ípad , že takovéto látky producent p esto do surovinové skladby použije, pak by na základ výsledk této práce m l být obsah redukujících cukr ve finálním výrobku menší než 1,0 % w/w. V tomto p ípad je pak t ebazvolit co nejvyšší sterila ní teplotu p sobící adekvátn kratší dobu. Na druhou stranu ani nejvyšší testované sterila ní teploty nezabránily signifikantnímu zhoršení zejména organoleptických znaktavených sýr v situaci, kdy obsah p idaných redukujících sacharid (v našem p ípad laktózy) byl vyšší než 1,0 % w/w.

Záv r

V d sledku sterilace došlo k hydrolýze p ítomných protein , k tvorb tmavšího odstínu a ke zhoršení chuti a v n tavených sýr ve srovnání s nesterilovanými vzorky. Klesala-li sterila níteplota s adekvátním prodloužením doby jejího p sobení za ú elem zachování konstantního smrtícího ú inku, pak byly výše zmín né procesy intenzivn jší a došlo k rozsáhlejšímu zhoršení jakosti sterilovaných výrobk . P ídavky laktózy zp sobily další pokles jakosti sterilovaných tavených sýr , zvlášt pokud byly v tší než 1,0 % w/w. U nejvyšší použité sterila ní teploty a nejkratší doby jejího p sobení (125°C 3,17 min) se testované charakteristiky vysterilovaných tavených sýr zhoršily oproti nesterilovaným vzork m jen v malé mí e. Jakost sterilovaných tavených sýr ošet ených režimem 120°C 10 min byla p i p ídavcích laktózy pod 1,0 % w/w rovn ždobrá a akceptovatelná, a proto lze i tento režim doporu it pro praxi. Nižší sterila ní teploty zejména v kombinaci s vyšším testovaným obsahem laktózy však již neposkytovaly p ijatelné produkty.

Pod kováníPráce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM 7088352101.

Použitá literatura:1. Guinee, T. P., Cari , M., & Kaláb, M. (2004). Pasteureized processed cheese and substitute/imitation

cheese products. In Fox, P.F. et al., Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2: Major cheese groups. 3. ed. (pp. 349–394). London: Elsevier Applied Science.

2. Bley, M. E., Johnson, M. E., & Olson, N.F. (1984). Factors affecting nonenzymatic browning of process cheese. Journal of Dairy Science, 68, 555–561.

3. Savello, P. A., Ernstrom, C. A., & Kaláb, M. (1989). Microstructure and meltability of model processed cheese made with rennet and acid casein. Journal of Dairy Science, 72, 1–11.

4. Schär, W., & Bosset, J. O. (2002). Chemical and physico-chemical changes in processed cheese and ready-made fondue during storage. A review. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 35, 15–20.

5. Bu ka, F., Hrab , J., & Krá mar, S. (2004). The effect of sterilisation on amino acid contents in processed cheese. International Dairy Journal, 14, 829–831.

6. Gaillard, S., Leguérinel, I., Savy, N., & Mafart, P. (2005). Quantifying the combined effects of the heating time, the temperature and the recovery medium pH on the regrowth lag time of Bacillus cereus spores after a heat treatment. International Journal of Food Microbiology, 105, 53–58.

7. Zanoni, B., Pagliarini, E., Giovanelli, G., & Lavelli V. (2003). Modelling the effects of thermal sterilization on the quality of tomato puree. Journal of Food Engineering, 56, 203–206.

8. Efigênia, M., Povoa, B., & Moraes-Santos, T. (1997). Effect of heat treatment on the nutritional quality of milk proteins. International Dairy Journal, 7, 609–612.

9. Friedman, M. (1996). Food browning and its prevention. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 632–653.

10. Rufián-Henares, J. A., Guerra-Hernández, E., & García-Villanova, B. (2006). Available lysine and fluorescence in heated milk proteins/dextrinomaltose or lactose solutions. Food Chemistry, 98, 685–692.

11. Contarini, G., Povolo, M., Leardi, R., & Toppino, P. M. (1997). Influence of Heat Treatment on the Volatile Compounds of Milk. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 3171–3177.

70

12. Bylund, G. (1995). Dairy Processing Handbook. Lund (Sweden): Tetra Pak Processing Systems. 13. Bu ka, F., Pavlínek, V., Hrab , J., Rop, O., Janiš, R., & Krej í, J. (2007). Effect of 1-monoglycerides on

viscoelastic properties of processed cheeses. International Journal of Food Properties, 10, 819–828. 14. Bütikofer U., Rüegg M., & Ardö Y. (1993). Determination of nitrogen fractions in cheese: evaluation of

a collaborative study. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 26, 271–275. 15. Laemmli U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage

T4. Nature, 227, 680–685. 16. Kirkeby S., Moe D., & Bog-Hansen T. C. (1993). The silver staining procedure of sodium dodecyl

sulfate gels may be accelerated by shortening fixation time. Electrophoresis, 14, 51–55. 17. Lee, S. K., Anema, S., & Klostermeyer, H. (2004). The influence of moisture content on the rheological

properties of processed cheese spreads. International Journal of Food Science and Technology, 39, 763–771.

18. Dimitreli, G., & Thomareis, A. S. (2007). Texture evaluation of block-type processed cheese as a function of chemical composition and in relation to its apparent viscosity. Journal of Food Engineering, 79, 1364–1373.

19. Molins, R.A. (1991). Phosphates in food. Boca Raton: CRC Press. 20. Bu ka, F., Št tina, J., Hrab , J. Zm ny barvy sterilovaných tavených sýr b hem dvouletého skladování

In Sborník Celostátní p ehlídky sýr Mléko a sýry 2006. Praha: eská spole nost chemická, 2006, s. 192–198.

Kontaktní adresa:Ing. František Bu ka, Ph.D., Ústav potraviná ského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , nám. T. G. Masaryka 275, 762 72 Zlín, tel. +420 576 031 528, e-mail: bunka@ft.utb.cz

71

POROVNÁNÍ ORGANOLEPTICKÝCH A FYZIKÁLN -CHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ NÁPOJ NA BÁZI SYROVÁTKY

Kou imská Lenka, Legarová Veronika, Dvo áková Blanka Katedra kvality zem d lských produkt , FAPPZ, eská zem d lská univerzita v Praze

Comparison of organoleptic and physiochemical properties of whey based drinks

Summary:Recombined sweet whey and its mixture with semi-skimmed milk (25 and 50 % of milk) were used for whey drinks preparation. Drinks were fermented by liquid thermophilic yoghurt culture KAN IV (Milcom a. s., Laktoflora ®) for 3 and 4 hours. Sensory profile of non-fermented and fermented drinks was assessed using unstructured graphical scales. Organoleptic properties of drinks were correlated with titratable and active acidities. Non-fermented drinks were preferred to fermented drinks. Drinks fermented for 4 hours were more pleasant than drinks fermented for 3 hours. Correlations between sour and sweet tastes and acidity were found.

ÚvodSladká syrovátka, jako vedlejší produkt p i výrob sýr , p edstavuje velký zdroj bílkovin

a nutri n cenných látek využitelných ve výživ lov ka. Syrovátka zahrnuje 80 až 90 % zpracovávaného objemu mléka a obsahuje asi 50 % živin z mléka: rozpustné bílkoviny, laktosu, vitaminy a minerály1.

P i experimentech na krysách, kterým byla výživa obohacena o sušené syrovátkové proteiny2-4, byl zjišt n vliv t chto protein na redoxní parametry ve svalech (snížení oxida níhostresu), celkovou t lesnou hmotnost, r st svaloviny a s tím související stavbu t la. Krysy p ijímající syrovátkové bílkoviny m ly siln jší svaly a lépe zvládaly fyzickou zát ž. Syrovátkové proteiny jsou nutri n cenné také proto, že obsahují více aminokyselin s rozv tveným et zcem (BCAA) v porovnání s kaseinovými bílkovinami2. Obsahují také d ležité r stové faktory nap íklad IGF (insulin like growth factor) nebo TGF (transforming growth factor)5.

Pozitivní ú inek syrovátkových bílkovin byl zjišt n p i lé b rakoviny, hepatitidy, kardiovaskulárních onemocn ní, diabetu typu II, nefropatie, osteoporosy, hypercholesterolemie a žalude ních v ed 3.

P i št pení -kaseinu chymosinem p echází do syrovátky kaseinmakropeptid (CMP). Bylo zjišt no, že CMP p sobí jako bioaktivní peptid a mohl by být použit jako funk ní potravina6.

I když se ást syrovátky stále využívá jako krmivo, má v potraviná ském pr myslu jako aditivum široké uplatn ní syrovátka sušená, syrovátkové koncentráty nebo frakce. Syrovátka se také používá jako surovina pro výrobu laktosy1. erstvou syrovátku je možno použít pro výrobu nápoj ,které se i na našem domácím trhu objevují stále ast ji a získávají si své zákazníky.

Materiál a metodyV experimentu byly p ipraveny za laboratorních podmínek nefermentované a fermentované

syrovátkové nápoje, kde jako surovina byla použita rekombinovaná sušená syrovátka Lactosérum (Moravia Lacto a. s.) rozmíchaná v teplé pitné vod v pom ru 10 g syrovátky ve 100 ml teplé pitné vody. Tato syrovátka byla p ípadn obohacena o p ídavek erstvého polotu ného kravského mléka (Jiho eské lahodné mléko polotu né, vysokotepeln pasterované, Madeta a. s.), který p edstavoval25 % nebo 50 %. Nápoje byly ošet eny pasterací (78 °C, 30 sekund). Polovina nápoj byla fermentována p i 43 °C a pro fermentaci byla použita komer n dostupná tekutá termofilní jogurtová kultura KAN IV (Milcom a. s., Laktoflora®). Fermentace byla ukon enapo 3 a 4 hodinách. Grafickou nestrukturovanou orientovanou stupnicí byl 20ti školenými hodnotiteli posuzován senzorický profil jak fermentovaných, tak nefermentovaných nápoj .Organoleptické vlastnosti byly porovnány s vlastnostmi fyzikáln -chemickými, hlavn titra ní a aktivní kyselostí SN 57 05307. Korela ní koeficient byl vypo ítán za použití programu EXCEL (funkce CORREL).

72

Výsledky a diskuseP i porovnání fermentovaných a nefermentovaných nápoj byla barva, v n a konzistence

všech fermentovaných nápoj hedonicky hodnocena jako p íjemn jší (výjimka: 50 % mléka, fermentace 4 h). Celková p íjemnost chuti fermentovaných nápoj byla ale ve všech p ípadech hodnocena h e. To se promítlo i do celkového hodnocení nápoj (obrázky 1 a 2), kde byly jako p íjemn jší hodnoceny nápoje nefermentované (F0 = nefermentované nápoje, F3 = fermentace 3 h, F4 = fermentace 4 h). P ídavek mléka (SM0 = bez p ídavku, SM25 = p ídavek 25 %, SM50 = p ídavek 50 %) bez ohledu na fermentaci zvyšoval p íjemnost hedonického hodnocení nápoj . Mezi hodnotiteli bylo ale 66 % hodnotitel , kte í hodnotili syrovátkové nápoje bez ohledu na fermentaci a p ídavek mléka celkov nep ízniv (ozna ili celkové hodnocení nápoje v intervalu od 0 do 50 %). Bude proto t eba do budoucna výsledky posuzovat i podle toho, zdali hodnotitelé v bec konzumují mlé né, p ípadn fermentované výrobky.

Celkové hodnocení nápoje (0 % = odporný, 100 % = velmi p íjemný)

F0

F0

F0

F3

F3

F3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

SM0 SM25 SM50

[%]

Obr. 1. Celkové hodnocení syrovátkových nápoj nefermentovaných a fermentovaných 3 hodiny

Celkové hodnocení nápoje (0 % = odporný, 100 % = velmi p íjemný)

F0

F0

F0

F4

F4

F4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

SM0 SM25 SM50

[%]

Obr. 2. Celkové hodnocení syrovátkových nápoj nefermentovaných a fermentovaných 4 hodiny

P i intenzitním hodnocení byla u fermentovaných nápoj zjišt na vyšší intenzita syrovátkové v n , celkové chuti, syrovátkové, kyselé, trpké a svíravé chuti a celkové intenzity pachutí. U nefermentovaných nápoj byla zjišt na vyšší intenzita mlé né v n (výjimka: 50 % mléka, fermentace 4 h), mlé né a sladké chuti. P ídavek mléka bez ohledu na fermentaci zvyšoval intenzitu barvy, mlé né v n a chuti. Zárove snižoval intenzitu chuti syrovátkové, kyselé a svíravé, jakož i celkovou intenzitu pachutí.

73

Porovnáním nápoj fermentovaných 3 a 4 hodiny byla v n a konzistence nápojfermentovaných 3 hodiny hedonicky hodnocena jako p íjemn jší (výjimka: 50 % mléka, fermentace 4 h). Celková p íjemnost chuti byla lépe hodnocena u nápoj fermentovaných 4 hodiny. V celkovém hodnocení nápoj byly též jako p íjemn jší hodnoceny nápoje fermentované 4 hodiny (obrázek 3). P ídavek mléka bez ohledu na dobu fermentace zvyšoval p íjemnost celkového hedonického hodnocení nápoj .

Celkové hodnocení nápoje (0 % = odporný, 100 % = velmi p íjemný)

F3

F3

F3

F4

F4

F4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

SM0 SM25 SM50

[%]

Obr. 3. Celkové hodnocení syrovátkových nápoj a fermentovaných 3 a 4 hodiny

Rozdíly hodnot intenzit mezi vzorky fermentovanými 3 nebo 4 hodiny byly v mnoha p ípadech zanedbatelné (syrovátková v n a chu , mlé ná chu , celkové pachut ). U nápojfermentovaných 3 hodiny byla zjišt na vyšší intenzita mlé né v n a kyselé chuti, zárove s nižší intenzitou sladké chuti (výjimka: 50 % mléka, fermentace 4 h). P ídavek mléka bez ohledu na dobu fermentace zvyšoval intenzitu barvy, mlé né v n , mlé né a sladké chuti. Zárove snižoval intenzitu chuti kyselé a svíravé, jakož i celkovou intenzitu pachutí.

V tabulce I jsou uvedeny korela ní koeficienty mezi dv ma vybranými organoleptickými vlastnostmi (sladká a kyselá chu ) a titra ní a aktivní kyselostí. Nejužší korelace byla zjišt na mezi kyselou chutí a hodnotami pH.

Tabulka I Korela ní koeficienty závislosti sladké a kyselé chuti na titra ní a aktivní kyselosti syrovátkových nápoj

Korelace SH pH

Sladká -0,7656 0,9194

Kyselá 0,8000 -0,9225

Na obrázku 4 je vid t, že hodnotitelé z eteln odlišili nápoje nefermentované (pH 6,0 až 7,0) od nápoj fermentovaných (pH kolem 4,0 až 5,0). Mezi nápoji fermentovanými 3 nebo 4 hodiny již pr kazné rozdíly v intenzit chutí nejsou. D vodem m že být dosažení horního podn tového práhu, rozdíly v pH menší než rozdílový práh nebo ovlivn ní jinými díl ími chut mi.

74

010

2030

4050

6070

8090

3,00 4,00 5,00 6,00 7,00

Aktivní kyselost [pH]

Inte

nzita

chu

ti [%

]

KyseláSladká

Obr. 4. Závislost intenzity kyselé a sladké chuti na pH

Záv rV experimentu byly nefermentované syrovátkové nápoje v porovnání s nápoji

fermentovanými hodnoceny jako p íjemn jší. P ídavek mléka k syrovátce zlepšoval hedonické hodnocení organoleptických vlastností nápoj . Mezi fermentovanými nápoji byly senzoricky lépe hodnoceny nápoje fermentované 4 hodiny.

Použitá literatura:1. Bylund, G. Dairy Processing Handbook. Tetra Pak Processing Systems AB, Lund, 1995, 436 s. 2. Kerksick, C. M., Rasmussen, C. J., Lancaster, S. L., Magu, B., Smith, P., Melton, C.,

Greenwood, M., Almada A. L., Earnest, C. P., Kreider, R. B. The Effects of Protein and Amino Acid Supplementation on Performance and Training Adaptations During Ten Weeks of Resistance Training. Journal of strength and Conditioning Research, 2006, vol. 20, No. 3, s. 643-653.

3. Elia, D., Stadler, K., Horváth, V., Jakus. J. Effect of Soy- and Whey Protein-isolate Supplemented Diet on the Redox Parameters of Trained Mice. Eur. J. Nutr., 2006, vol. 45, No. 5, s. 259-266.

4. Morifuji, M., Sakai, K., Sanbongi, C., Sugiura, K., Dietary Whey Protein Downregulates Fatty Acid Synthesis in the Liver, but Upregulates it in Skeletal Muscle of Exercise-trained rats. Nutrition, 2005, vol. 21, s. 1052-1058.

5. Gauthier, S. F., Pouliot, Y., Maubois, J.-L. Growth Factors from Bovine Milk and Colostrum: Composition, Extraction and Biological Activities. Lait, 2006, vol. 86, s. 99-125.

6. Martín-Diana, A. B., Gomez-Guillén, M. C., Montero, P., Fontecha, J. Vicsoelastic Properties of Caseinmacropeptide Isolated from Cow, Ewe and Goat Cheese Whey. J. Sci. Food. Agric., 2006, vol. 86, s. 1340-1349.

7. SN 57 0530 Metody zkoušení mléka a tekutých mlé ných výrobk . eský normaliza ní institut Praha, 1972, 100 s.

Kontaktní adresa:Dr. Ing. Lenka Kou imská, Katedra kvality zem d lských produkt , FAPPZ, ZU v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, e-mail: kourimska@af.czu.cz.

75

HPLC STANOVENIE ANTIMIKROBIÁLNYCH LÁTOK PRODUKOVANÝCH BAKTÉRIAMI MLIE NEHO KYSNUTIA

Greif Gabriel, Kraj ová Eva, Greifová Mária, Karovi ová Jolana Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, STU v Bratislave, SR

HPLC determination of antimicrobial substances produced by lactis acid bacteria

Summary:We have developed an HPLC method for simultaneous determination of glucose and phenyllactic (PLA), lactic and acetic acids. The analytes were detected on serially connected UV and RI detectors after separation on catex column (Polymer IEX H+). This improved chromatographic method allow separation and qantification of PLA with a recovery of 98, 4%. The metod is highly reproducible with an intraday repeatability of the total peak area of 1,58%, while the intererday repeatability of 2,08%. The intraday repeatability of peak heghts was 1,1%, their intererday repeatability was 1,59%.

Organické kyseliny majú ve mi široké spektrum ú inku a potlá ajú rast grampozitívnych i gramnegatívnych baktérií, kvasiniek i plesní. Tieto látky vo všeobecnosti vytvárajú nevhodné prostredie pre rast patogénnych a kontaminujúcich mikroorganizmov. Množstvo a typ produkovanej kyseliny závisí od kme a, ktorý ju produkuje, od zloženia použitej zmesnej kultúry ako aj od podmienok kultivácie (1, 2, 3). Mechanizmom ich ú inku je znižovanie pH prostredia, ovplyvnenie protónového gradientu cytoplazmatickej membrány, okyslenie cytoplazmy a zásah do transportu cez cytoplazmatickú membránu. Okrem toho, že kyslé prostredie obmedzuje rast baktérií, podporuje aj pôsobenie ostatných antimikrobiálnych komponentov. Nižšie mastné kyseliny produkované BMK sú v kyslom prostredí málo disociované. Ich antimikrobiálny ú inok nie je nato ko závislý od nízkej hodnoty pH, ako od samotnej mikrobicídnosti málo disociovanej molekuly kyseliny. Táto difunduje cez bunkovú membránu do bunky, v ktorej zníži pH- hodnotu a významne naruší jej metabolizmus, prípadne spôsobí až jej devitalizáciu (1, 2, 3). Kyselina mlie na je hlavným produktom BMK, ktorý vzniká pri fermenta ných procesoch. Na za iatku fermentácie je disociovaná forma v rovnováhe s nedisociovanou formou. Rozsah disociácie závisí od pH prostredia. Pri nižšom pH je prítomné vä šie množstvo nedisociovanej formy, tým sa zvyšuje aj jej toxicita vo i prítomným mikroorganizmom. Rozdielnu ú innos majú aj jej stereoizoméry. L-forma je ú innejšia ako D-forma (2, 3). Ú inok kyseliny octovej spo íva v interakcii nedisociovaných molekúl s bunkovou membránou, neutralizácii elektrochemického protónového gradientu, nasleduje okyslenie cytoplazmy a porušenie transportu cez cytoplazmatickú membránu. Dochádza aj k zníženej absorpcii aminokyselín. Jej ú inok však závisí od nízkeho pH, spôsobeného prítomnos ou kyseliny mlie nej (3).

Kyselina fenyl mlie na je jedným z produktov BMK, ktoré sa tvoria po as fermentácie, ale produkuje ju aj Geotrichum candidum. Po as fermentácie sa tvorí D- a L-forma tejto kyseliny, pri om oba stereoizoméry pôsobia porovnate ne na nežiaduce mikroorganizmy. Kyselina pôsobí spolu s ostatnými fermenta nými produktmi, ktoré zvyšujú jej ú innos . Jej ú inok na mikrobiálnu bunku je podobný ako u predošlých kyselín. (4, 5, 6, 7).

Lavermicocca et al (2000) zistil tvorbu kyseliny fenylmlie nej a 4-hydroxy-fenylmlie nejpri kultivácii Lactobacillus plantarum 21B, ktorá prejavila antifungálnu aktivitu vo i niektorým vláknitým hubám. Kyselina fenylmlie na bola izolovaná aj zo supernatantov týchto kultúr: L.plantarum MiLAB 393, L coryniformis Si3 a u kme ov Pediococcus pentosaceus a L. sakei (3).

Produkcia aktívnych zložiek v procese fermentácie baktériami mlie neho kysnutia (BMK) s antagonistickým efektom vo i plesniam, kvasinkám a baktériám je v posledných rokoch cie omvedeckého výskumu (8-13). Kyseliny fenylmlie na (PLA) a hydroxyfenylmlie na (4-HPLA) boli zistené ako metabolity fenylalanínu a tyrozínu v procese zrenia syrov. Avšak, PLA je efektívnym markérom vo i listériám a plesniam.

76

Cie práce Využitie HPLC-UV/RID metódy pre stanovenie kyseliny fenylmlie nej, 4-hydroxy-

fenylmlie nej (4-HPLA), sacharidov a organických kyselín vybranými kme mi baktérií mlie nehokysnutia v MRS bujóne pri teplote 37 °C.

Materiál a metódy

Chemikálie: kyselina DL-3-fenylmlie na, DL-mlie nan lítny (Sigma-Oldrich, Nemecko), kyselina octová, glukóza monohydrát,

Kultiva né médium: MRS bujón,

Mikroorganizmy: Lactobacillus rhamnosus VT 1 (ÚTMT, VSCHT Praha, eská republika, Lactobacillus rhamnosus LC 705 Lactobacillus plantarum ALC 01 (Danisco, Nemecko), Lactobacillus plantarum CCM 7039, Lactobacillus amylophilus CCM 7001 (CCM-MU Brno,

eská republika), Lactobacillus reuteri Protectis (Bio Gaia, Švédsko), Lactobacillus plantarum L2-1 (Danisco, Nemecko), Lactobacillus sp. (izolovaný z uhoriek v slanom náleve), Lactobacillussanfrancisco (izolovaný z kvasníc).

Predanalytická úprava vzorky: MRS bujón s testovanými mikroorganizmami sa odstredil pri 9000 ot.min-1. Supernatant sa prefiltroval cez mikrofilter (0,2 m) a následne aplikoval na kolónu.

Podmienky analýzy: Pumpa: DeltaChrom™ SDS 030, manuálny dávkova Rheodyne 7725i, dávkovacia slu ka 20 l,kolóna: Polymer IEX H+ (250 x 8 mm), vyhrieva kolóny DeltaChrom™ Temperature Control Unit (50±0,1 °C), mobilná fáza: 1 mM H2SO4, prietok mobilnej fázy: 1 cm3.min-1, detekcia: UV detektor Applied Biosystems 759A (261 nm) a refraktometrický detektor RI K-2301, PC a zbera dát v programe Clarity.

Výsledky a diskusia Hlavným kritériom pri výbere BMK ako štartovacích kultúr je schopnos rastu v komplexnom médiu a rýchlos prekvášania substrátu s ím je spojená produkcia kyselín (predovšetkým kyseliny mlie nej) a pokles pH (aktívnej kyslosti). Antimikrobiálna aktivita laktobacilov je daná predovšetkým produkciou organických kyselín (mlie nej, octovej, propionovej, valérovej) a iných inhibi ných látok H2O2, CO2, diacetylu, bakteriocínov – nízkomolekulárnych látok na báze aminokyselín. V práci sme sa zamerali na využitie HPLC-UV/RID metódy pre sú asné stanovenie kyseliny fenylmlie nej, sacharidov a organických kyselín vybranými kme mi baktérií mlie nehokysnutia v MRS bujóne pri teplote 37 °C. Výsledky analýz sú uvedené na obr. 1 – 3. Jednotlivé analyty boli pri použití danej metódy z kolóny eluované nasledovne: glukóza (4,9 min), kyselina mlie na (6,8 min), kyselina octová (8,2 min) a kyselina DL-3-fenylmlie na (23 min).

77

Time [min]0 5 10 15 20 25 30

Volta

ge [m

V]

0

200

400

600

800

PLA

Time [min]0 5 10 15 20 25 30

Volta

ge [m

V]

0

200

400

600

800

PLA

Obr. 1. HPLC UV chromatogramy štandardu kyseliny DL-3-fenylmlie nej (PLA) (1,22 mM) vo vode (A) a kvapalnom MRS bujóne (B)

Vyššia citlivos UV detektora pri 210 nm ako RI detektora (obr. 1B a 2) dáva možnoskvantitatívneho stanovenia kyseliny DL-3-fenylmlie nej ale aj kyseliny mlie nej a octovej. Avšak, UV detektorom nie je možné stanovenie glukózy a iných sacharidov (laktóza, galaktóza) prítomných napr. v mlieku. Separácia vybraných sacharidov, organických kyselín a etanolu je dokumentovaná na obr. 4.

A

B

78

Time [min]0 5 10 15 20 25 30

Volta

ge [m

V]

0

200

400

600

800

PLA

Obr. 2. HPLC UV chromatogram MRS bujónu po 72 h kultivácie pri 37 °C s Lactobacillusplantarum L2 1

Time [min]0 5 10 15 20 25 30

Volta

ge [m

V]

0

50

100

150

200

250

300

KOGlu

KM

Obr. 3. HPLC - RI chromatogram MRS bujónu po 72 h kultivácii pri 37 °C s Lactobacillus plantarum L2 1; glukóza (Glu), kyselina mlie na (KM), kyselina octová (KO)

Produkcia kyseliny DL-3-fenylmlie nej, kyseliny mlie nej vybranými kme mi BMK a zostatková koncentrácia glukózy v MRS bujóne po 72 hodinách kultivácie sú uvedené v Tab. I. Vo vä šine prípadov zostatková koncentrácia glukózy bola nižšia ako detek ný limit danej metódy.

79

Time [min]0 5 10 15 20 25 30

Volta

ge [m

V]

0

20

40

60

12

34

5

67

Obr. 4. HPLC - RI chromatogram štandardov: laktóza (1), glukóza (2), galaktóza (3), k. mlie na (4), k. octová (5), etanol (6), k. DL-3-fenylmlie na (7)

Tab. I Obsah organických kyselín a glukózy v MRS bujóne pri 37 °C (72 h kultivácie)

K. DL-fenylmlie na Glukóza K. mlie naMikroorganizmus

mmol.dm-3

L. rhamnosus VT 1 0,275 ± 0,009 0,003 ± 0,001 0,165 ± 0,009

Lactobacillus sp. 0,330 ± 0,008 ND 0,169 ± 0,010

L. sanfrancisco 0,659 ± 0,008 0,007 ± 0,003 0,163 ± 0,008

L. reuteri 0,647 ± 0,009 ND 0,153 ± 0,007

L. rhamnosus LC 705 0,272 ± 0,008 0,015 ± 0,006 0,135 ± 0,011

L. plantarum L2-1 0,744 ± 0,006 ND 0,169 ± 0,009

L plantarum CCM 7039 0,489 ± 0,009 ND 0,168 ± 0,010

L. amylophilus CCM 7001 0,341 ± 0,009 ND 0,169 ± 0,011

L. plantarum ALC 01 0,246 ± 0,009 ND 0,161 ± 0,012

ND – nedetekovate né množstvo

Záver Bola vypracovaná selektívna a dostato ne citlivá metóda pre stanovenie kyseliny fenylmlie nej, glukózy a organických kyselín (kyselina mlie na a octová) vybranými kme mi baktérií mlie neho kysnutia v MRS bujóne. Pri on-line zapojení detektorov UV a RI je možná sú asná detekcia kyseliny fenylmlie nej,glukózy ale aj laktózy, galaktózy a organických kyselín (kyselina mlie na a octová) v kultiva nommédiu (napr. MRS). Produkcia PLA môže by selek ným kritériom pri výbere BMK v potravinárskom priemysle.

80

Použitá literatúra1. Kazatelová M.: Produkty metabolismu bakterií mlé ného kvašení s antimikrobiální aktivitou. Bulletin of

Food Research, 42(1-2), 2003, 67-73. 2. Görner, F.- Greifová, M.: Systémy a látky inhibujúce rast a metabolizmus mikroorganizmov

v požívatinách. Bulletin potravinárskeho výskumu, 33(1-2), 1994, 7-19. 3. Schnürer, J.- Magnusson, J.: Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives. Trends in Food Science

& Technology, 2005, 1-9. 4. Dieuleveux, V.- Lemarinier, S.- Guéguen, M.: Antimicrobial spectrum and target site of D-3-

phenyllactic acid. International Journal of Food Mikrobiology, 40, 1998, 177-183. 5. Lavermicocca, P.- Valerio, F.- Visconti, F.: Antifungal Activity of Phenyllactic acid against Molds

Isolated from Bakery Products. Applied And Environmental Mikrobiology, 2003, 634-640. 6. Dieuleveux, V.- Van der Pyl, D.- Chataud, J.- Gueguen, M.: Purification and charakterization of Anti-

Listeria compounds producted by Geotrichum candidum. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 800-803.

7. Ström, K.- Sjögren, J.- Broberg, A.- Schnürer, J.: Lactobacillus plantarum MiLAB 393 Produces the Antifungal Cyclic Dipeptides Cyclo(L-Phe-L-Pro) and Cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-Phenyllactic acid. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 4322-4327.

8. Martín, R.- Olivares, M.- Marín, M.L.- Xaus, J.- Fernández, J.- Rodríguez, J.M.: Characterization of reuterin- producing Lactobacillus coryniformis strain isolated from a goat`s milk cheese. International Journal of Food Mikrobiology, 104, 2005, 267-277.

9. Cleveland, J.- Montville, T.J.- Nes, I.F.- Chikindas, M.L.: Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. International Journal of Food Microbiology, 71, 2001, 1-20.

10. Rodríguez, E.- González, B.- Gaya, P.- Nu ez, M.- Medina, M.: Diversity of bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from raw milk. International Dairy Journal, 10, 2000, 7-15.

11. Plocková M., Chumchalová J., Stiles J.: Hodnocení antifungální aktivity bakterií mlé ného kvašení metodou mlé ných agarových ploten. Mléka ské listy, 62, 2000, 16-19.

12. Plocková M., Stiles J., Chumchalová J., Halfarová R.: Kontrola r stu plísní kmeny Lactobacillus rhamnosus VT1 a Lactobacillus reuteri CCM 3625 sledovaná metodou mlé ných agarových ploten. Czech J. Food Sci., 19, 2001, 46-50.

13. Hudá ek J., Zalán Z., Štetina J., Chumchalová J., Halász A.: Sledování produkce organických kyselin kmeny Lactobacillus v r zných médiích. In: „Výsledky p ehlídek a sborník p ednášek Mléko a sýry 2006“. VŠCHT Praha, s.234-238.

Po akovanie:Táto práca bola podporená grantom VEGA 1/3546/06

Kontaktná adresa:Ing. Gabriel Greif, PhD., FCHPT STU v Bratislave, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, SR. e-mail: gabriel.greif@stuba.sk

81

ANTIMIKROBIÁLNY Ú INOK KYSELINY FENYL MLIE NEJKraj ová Eva, Greifová Mária, Greif Gabriel, Schmidt Štefan

Slovenská technická univerzita, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie,Ústav biochemickej technológie a potravinárstva, Oddelenie potravinárskej technológie, Bratislava

Antimicrobial effect of phenyllactic acid

Summary:The main goal of this work was to observe antifungal and antimicrobial activity of phenyllactic acid against selected filamentous fungi and bacteria and influence of different pH value. Antifungal activity of the acid decreased with increasing pH value. The most sensitive against phenyllactic acid were Alternaria alternata(83% - inhibition), Fusarium nivale (70%) and Cladosporium herbarum (79%). The smallest effect of the acid was observed against Penicilium funiculosum (28%). The best antimicrobial effect of phenyllactic acid was against Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. The antimicrobial effect of tested acid increased with increased concentration.

ÚvodKyslomlie ne baktérie boli používané v procese fermentácie potravín a krmovín už dávno

predtým, kedy ešte neboli poznatky o týchto baktériach. Používanie fermenta ního procesu sa rozvíjalo v priebehu nieko ko storo í a zah a ve a rozdielnych druhov krmovín a potravín. V priebehu minulého storo ia bolo dokázané, že kyslomlie ne baktérie sú zodpovedné za fermentáciu a majú biokonzerva ný ú inok využívaný v po etných potravinových a krmovinových procesoch. Biokonzervácia slúži na pred ženie trvanlivosti a na zvýšenie bezpe nosti potravín použitím prirodzenej alebo pridanej mikroflóry a ich antimikrobiálnych produktov [1].

Konzerva ný ú inok je spôsobený redukciou pH v priebehu tvorby slabých organických kyselín. Antimikrobiálny ú inok KMB nie je nato ko závislý od nízkej pH-hodnoty prostredia, ako od samotnej mikrobicídnosti nedisociovaných kyselín. Nedisociované kyseliny prenikajú bune noumembránou a narúšajú trans-membránový potenciál [2].

Vlaknité huby a kvasinky sú hlavné organizmy, ktoré spósobujú kazenie potravín a to fermentovaných mlie nych výrobkov, syrov, chleba,skladovaných plodín a krmovín. Nežiadúce rody húb sú Aspergillus, Cladosporium, Endomyces, Fusarium, Monilia, Mucor, Penicilium aRhizopus. Hlavné fyzikálne metódy (zahrievanie, chladenie, sušenie, balenie, skladovanie vo vákuu, zmrazovanie) chránia výrobky pred ples ami, ale kysnutie ako prírodný spôsob ochrany sa zdá bynajlepšia ochrana pred nežiadúcimi pleskami [3].

Cie om našej práce bolo sledova antifungálny a antimikrobiálny ú inok kyseliny fenylmlie nej vo i vybraným druhom plesní a patogénom v závislosti od rôzneho pH.

Materiál a metódy

Indikátorové mikroorganizmy:Aspergillus flavus CCM F-108; Penicillium fumiculosum CCM F-161; Alternaria alternata KBM2/91; Rhizopus oryzae KBM1/90; Fusarium nivale KBM 1/89, Cladosporium herbarum KMB 2/90, Mucor racemosus KBM 1/90, Listeria monocytogenes NCTC 4886, Staphylococcus aureus CCM 3953.

Príprava spórovej suspénzie rôznych vláknitých húb:5 ml 0,1 %-ného vodného roztoku Tweenu 80 sa naleje na vyrastenú kolóniu vláknitej huby a bakteriologickým o kom sa uvolnia spóry z mycélia. Suspenzia sa prefiltruje do skúmaviek cez 3-krát preloženú gázu. Po et spór sa zisti priamym po ítaním v Bürkerovej komôrke [4].

Dilu ná metóda stanovenia antifungálnej aktivity kyseliny fenylmlie nej:Do Petriho misiek sa naleje 10 ml sterilného Sabouroado-glukozového agaru v ktorom je rôzna

82

koncentrácia kyseliny DL fenylmlie nej. Použité koncentrácie uvedenej kyseliny v médiu boli 10, 7, 5, 2,5 mg/ml. Tiež sa menilo pH živnej pôdy (4, 4,5 a 5,5). Po stuhnutí živnej pôdy sa do stredu Petriho misiek umiestnia sterilné papierové disky (Whatman 1) priemeru 5 mm, ktoré sa následne inokulujú 5 l spórovej suspenzie (cca 103 spór/disk). Huby sa kultivujú statický pri teplote 25 °C a kinetika ich rastu v prítomnosti testovaných zlú enín a bez nich sa sleduje meraním priemeru rastúcej kolónie v pravidelných asových intervaloch. Zo získaných hodnôt sa zostroja rastové krivky a antifungálna ú innos sa charakterizuje pomocou hodnôt IC50 a MIC [4].

Mikrotitra ná metóda stanovenia antimikrobiálnej aktivity kyseliny fenylmlie nej:Antimikrobiálny efekt testovanej kyseliny sa sledoval použitím mikrotitra nej metódy v 96 jamkových mikrotitra ných platni kách. Indikátorové mikroorganizmy sa kultivovali v BHI bujóne p i 37°C po as 12 hodín. Na testovanie sa použila vždy erstvá 12-16 hodinová no ná kultúra. Z nej sa p ed testovaním pripravovalo inokulum so vstupnou koncentriáciou buniek 108 KTJ/ml. 20 l tejto suspenzie sa pridalo k 180 l testovanej kyseliny, ktorej pH sa upravilo na sledovanú hodnotu a kultivovalo sa 12 hodín stacionárnou kultiváciou. Následne sa v zvolených asovýchintervaloch merala absrobancia pri 630nm v dvoch paralelkách. Z nametaných údajov sa vypo ítali charakteristiky rastu, ktoré reprezentujú antimikróbny efekt testovanej kyseliny [4].

Výsledky

Antifungálna aktivita kyseliny fenylmlie nej:Dilu nou metódou bola testovaná antifungálna aktivita kyseliny fenylmlie nej vo i

zvoleným vláknitým hubám: Aspergillus flavus, Penicillium fumiculosum, Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Fusarium nivale, Cladosporium herbarum, Mucor racemosus. Na testovanie sa použilo pä rôznych koncentrácií kyseliny (20; 10; 7; 5; 2,5 mg/ml). Ú innos kyseliny sa testovala pri pH 4, 4,5 a 5,5. Ako kontrola (K1) sa použila živná pôda bez prídavku kyseliny fenylmlie nej a bez úpravy pH a ako kontrola (K2) živná pôda bez prídavku kyseliny fenylmlie nej s úpravou pH, aké bolo testované. Výsledky sú názorne ukázané iba pre Cladosporium herbarum (obr.1, tab. I).

(A) (B) (C)

Obr. 1. Rastové krivky pre Cladosporium herbarum na Sabourodovom agare pri rôznej koncentrácii kyseliny fenylmlie nej a pH 4 (A), pH 4,5 (B) a pH 5,5 (C) média, t=25 °C

0 2 4 6 8 10 120

10

20

30

40

50 K1 K2 10 mg/ml 7 mg/ml 5 mg/ml 2,5 mg/ml

prie

mer

ple

sne

(mm

)

as (dni)0 2 4 6 8 10 12

0

10

20

30

40

50 K1 K2 10 mg/ml 7 mg/ml 5 mg/ml 2,5 mg/ml

prie

mer

ple

sne

(mm

)

as (dni)0 2 4 6 8 10 12

0

10

20

30

40

50 K1 K2 10 mg/ml 7 mg/ml 5 mg/ml 2,5 mg/ml

prie

mer

ple

sne

(mm

)

as (dni)

83

Tabulka I Percento inhibície plesne Cladosporium herbarum kyselinou fenylmlie nou.

Cladosporium herbarum inhibícia (%) koncentrácia kyseliny fenylmlie nej (mg/ml)

pH4 pH4,5 pH5,5

10 79,69 57,91 16,80 7 60,15 37,45 9,16 5 46,62 26,64 7,65

2,5 24,81 9,65 3,06 IC50(mg/ml) 5,8 8,6 >10

Antimikrobiálna aktivita kyseliny fenylmlie nej: Na zistenie antimikrobiálného ú inku testovanej kyseliny na Staphylococcus aureus sapoužila mikrotitra námetóda. Následne sa z rastovej krivky vypo ítali charakteristiky rastu pre jednotlivé pH. Ich provnaním sa zistilo, že testovaná kyselina mala najvyšší inhibi ný ú inokpri pH 4,5 a naopak najnižší pri pH 6,5. Z oho vyplýva, že zníženie pH výrazne zvýši jej inhibi nýú inok. Dochádza k výraznemu zníženiu rýchlosti rastu a k pred ženiu lag fázy. Pri vyššom pH sa zníži inhibi ný ú inok kyseliny fenylmlie nej aj pri použití vyšších koncentrácií. Pri nízkom pH boli ve mi ú inné aj nižšie koncentrácie kyseliny a výrazne inhibovali rast Staphylococcus aureus(obr.2).

(A) (B) (C)

Obr. 2. Rastové krivky pre Staphylococcus aureus pri rôznej koncentrácii kyseliny fenylmlie nej a pH 6,5 (A), pH 5,5 (B) a pH 4,5 (C) média

Záver Kyslomlie ne baktérie majú vo fermentovaných potravinách mnoho potenciálnych využití,

pretože zna ne ovplyv ujú nutri né a senzorické vlastnosti ako aj trvanlivos produktov. Sú známe tým, že produkujú bioaktívne molekuly, ktoré majú antimikrobiálny ú inok proti nežiadúcim a patogénnym mikroorganizmom. Ström a kol. [5] sa venovali antifungálnemu ú inku KMB a dokázali, že sledovaný mikroorganizmus pôsobil inhibi ne vo i niektorým kme om kvasiniek a plesní. Zistilo sa, že antmikrobiálny ú inok a antifungálny ú inok kyseliny fenylmlie nej sa zna ne menil v závislosti od meniaceho pH. Lavernicocca a kol. [6] sa venovali vplyvu pH na antimikrobiálnu aktivitu kyseliny fenylmlie nej o koncentrácií 20 mg/ml. Sledovali ú innoskyseliny v rozpätí pH 2,6-5,5. Dokázali, že kyselina bola najú inejšia pri pH 2,6 a jej ú innospostupne klesala so zvýšujúcim pH.

0 2 4 6 8 10 12

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

istý bujón pH7,4 20mg/ml, pH6,5 10mg/ml, pH6,5 7mg/ml, pH6,5 5mg/ml, pH6,5 2,5mg/ml,pH6,5

istý bujón pH6,5

A 630

as (h)0 2 4 6 8 10 12

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

istý bujón pH7,4 20mg/ml, pH5,5 10mg/ml, pH5,5 7mg/ml, pH5,5 5mg/ml, pH5,5 2,5mg/ml,pH5,5

istý bujón, pH5,5

A 630

as (h)0 2 4 6 8 10 12

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6istý bujón pH7,4

20mg/ml, pH4,5 10mg/ml, pH4,5 7mg/ml, pH4,5 5mg/ml, pH4,5 2,5mg/ml,pH4,5

istý bujón pH4,5

A 630

as (h)

84

Po akovanie:Táto práca bola podporená Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy . APVV-0310-06" a grantom VEGA . 1/0746/08.

Použitá literatúra:1. Carr, F. J. – Chill, D. - Maida, N.: The lactic acid bacteria: a literature survey. Critical reviews in

Microbiology, 28, 2002, s. 281- 370. 2. Görner. F. – Greifová, M.: Systémy a látky inhibujúce rast a metabolizmus mikroorganizmov

v poživatinách, Bulletin potravinárskeho výskumu, 33, 1994, s. 7-19. 3. Corsetti, A. – Gobebetti, M. – Rossi, J. – Damiani, P.: Antimould activity of sourdough lactic acid

bacteria: Identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1. Applied Microbiology and Biotechnology, 50, 1998, s. 253- 256.

4. Betina, V. : Mikrobiologické laboratórne metódy. Alfa Bratislava, 1987, s. 544. 5. Ström, K. – Sjögren, J. – Broberg, A. – Schnürer, J.: Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the

antifungal cyclic dipeptides cyclo (L-Phe-L-Pro) and cyclo (L-Phe-trans-4-OH-L- Pro) and 3-pnenyllactic acid. Applied and Enviromental Microbiology, september, 2002, s. 4322-4327.

6. Lavernicocca, P. –Valerio, F. – Visconti, F.: Antifungal activity of pheyllactic acid against molds isolated from bakery products. Applied and Enviromental Microbiology, january, 2003, s. 634-640.

Kontaktní adresa:Eva Kraj ová, Slovenská technická univerzita, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Radlinského 9, 831 02 Bratislava, eva.krajcova@ stuba.sk

85

MINORITNÍ SLOŽKY MLÉ NÉHO TUKU, KYSELINA 11-CYKLOHEXYLUNDEKANOVÁ ZVLÁŠT

Šmidrkal Jan, Karlová Tereza, Filip Vladimír, Zárubová Markéta Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

Minor Components of Milk Fat, particularly 11-Cyclohexylundecanoic Acid

Summary:In an ongoing discussion if it is butter (milk fat) or margarine (plant fat) that is optimal for our diet. The fact that the milk fat contains many minor fatty acids is mostly neglected. The 11- cyclohexaneundecanoic acid is contained in cow milk fat in amount 0.1-0.2%. It is also contained in human milk. This acid was synthesized and its antimicrobial properties was investigated.

1. ÚvodMlé ný tuk [1] obsahuje vysoký podíl nasycených mastných kyselin (70 - 75 %), mén

mononenasycených mastných kyselin (20 - 25 %) a malé množství polynenasycených mastných kyselin (0 - 5 %). Dále obsahuje vedle majoritních mastných kyselin, které jsou obsaženy i v rostlinných olejích, adu dalších minoritních mastných kyselin (po et cca 40, obsah celkem cca 10 %). Jednotlivé minoritní mastné kyseliny jsou obsaženy v množstvích od 0,01 % (což je spodní mez detekovatelnosti GLC) do cca 1 %. Tyto mén obvyklé mastné kyseliny mají 12 – 26 uhlíkových atom , jsou nasycené i nenasycené (obsahují až 6 dvojných vazeb) a jsou lineární i rozv tvené. Zcela výjime né jsou v této ad dv oxokyseliny (8-keto16:0 a 10-keto18:0) a jediná cyklická kyselina (11-cyklohexylundekanová, 11-cyklohexyl 11:0). Strukturní vzorce n kterých výše uvedených mén obvyklých minoritních karboxylových kyselin mlé ného tuku jsou uvedeny na následujícím obrázku 1.

COOH

COOH

O

COOH

COOH

10-keto18:0 0,09 kyselina 10-oxostearová)

11-cyklohexyl 11:0 0,18 kyselina 11-cyklohexylundekanová

18:1trans-11 1,04kyselina vakcenová

3,7,11,15-tetramethyl 16:0 0,05 kyselina phytanová

Zkratka kyseliny Obsah v mlé ném Strukturní vzorecNázev kyseliny tuku [%]

Obr.1 N které minoritní mastné kyseliny mlé ného tuku [1]

Uvedené minoritní mastné kyseliny, zjednodušen e eno, vlastn odlišují mlé ný tuk (máslo) od emulgovaných rostlinných tuk (margarín ) a mj. p edstavují jeho nefalšovatelné markery. O funkci t chto minoritních kyselin v mléce a jejich významu pro lidskou výživu je minimum informací.

Výrobci emulgovaných tuk zd raz ují, že tyto tuky jsou zdrojem omega 3 a omega 6 nenasycených mastných kyselin (ty jsou v ad nativních rostlinných olejích obsaženy ve zvýšené mí e) a deklarují obsažená aditiva, nap . vitaminy. Údaj o tom že výrobek je roztíratelný rostlinný tuk je uveden na spodní stran drobnými písmeny. Výrobci másla na obale pouze uvád jí, že je to máslo. O tom, že mlé ný tuk obsahuje mastné kyseliny (tedy jejich acyly), které mohou mít význam pro lidské zdraví není uvedeno nic. Publikované práce se zabývají hlavn nutri ním významem majoritních mastných kyselin [2-4].

86

Mezi minoritními mastnými kyselinami mlé ného tuku je unikátní kyselina 11-cyklohexylundekanová (obsah v mlé ném tuku 0,1 – 0,2 %), která je jedinou cyklickou mastnou kyselinou obsaženou v mlé ném tuku [1,5]. Poprvé byla izolována z mlé ného tuku roku 1965 holandskýcmi autory [5]. Kyselina 11-cyklohexylundekanová je rovn ž s kyselinou phytanovou složkou lidského mate ského mléka [6]. V lipidech produkovaných bakteriemi Bacillus acidocaldarius [7] a Curtobacterium pusillum [8] se tato kyselina vyskytuje jako majoritní mastná kyselina (až 96 %, [8]).

COOH

COOH

COOH

COOH

kyselina chaulmugrová

kyselina dihydrochaulmugrová

kyselina hydnokarpová

kyselina dihydrohydnokarpová

Obr.2 Analogy kyseliny 11-cyklohexylundekanové

Kyselina 11-cyklohexylundekanová je strukturn blízká kyselin chaulmoogrové a dihydrochaulmoogrové a kyselin hydnokarpové a dihydrohydnokarpové (obr. 2). Kyselina chaulmoogrová (její acyl) je složkou chaulmoogrového oleje (Hydnocarpus kurzii (King) Warb. (Flacourtiaceae)), který se užíval v lidové medicin proti lep e (Mycobacterium leprae) [9]. Na základ strukturní analogie lze p edpokládat, že i kyselina 11-cyklohexylundekanová m že mít antimikrobiální vlastnosti. Rozhodli jsme se proto kyselinu 11-cyklohexylundekanovou p ipravit a ov it její p ípadné antimikrobiální ú inky.

2. Syntéza kyseliny 11-cyklohexylundekanové Holandští auto i [5], kte í kyselinu 11-cyklohexylundekanovou izolovali z mlé ného tuku,

ur ilili její strukturu nejen spektráln , ale porovnali izolovanou látku se synteticky p ipraveným produktem, a potvrdili tak správnost její struktury i pomocí sm sného bodu tání jak samotné kyseliny tak i jejího anilidu. P i totální syntéze byla výchozí látkou kyselina 10-fenyldekanová, kterou hydrogenovali (PtO2, 150 °C, 10 Mpa) na kyselinu 10-cyklohexyl-dekanovou a tu p evedli Arndt-Eistertovou syntézou na methyl-11-cyklohexylundekanoát, který pak hydrolyzovali na žádanou kyselinu.

Kratší totální syntézu publikovali v roce 2004 n me tí auto i [10], kte í kyselinu 11-cyk-lohexylundekanovou p ipravili reakcí cyklohexyl-chloroformiátu a kyseliny 10-undecenové.

Na našem ústavu jsme pro syntézu kyseliny 11-cyklohexylundekanové použili modifikovaný postup n meckých autor [10], p i kterém byl ethylaluminium sesquichlorid použit jako hexanový roztok (0,4 mol.l-1). Problém není se samotnou reakcí, ale izolací isté kyseliny 11-cyklohexylundekanové, kterou je nutné pracn p e istit chromatograficky. Od výchozí nezreagované kyseliny 10-undecenové se d lí velmi špatn , oba pásy jsou blízko sebe. Na TLC Kieselgel 60, hexan-ethylacetát, 7:3 v/v (detekce 5% roztokem kyseliny fosfomolybdenové v ethanolu a zah átím) má kyselina 11-cyklohexylundekanová Rf = 0,45 a kyselina 10-undecenová Rf = 0,40. Bod tání kyseliny 11-cyklohexylundekanové závisí na její istot , 1. podíl o istot 99,5 % m l b.t. 55,5-57,0 °C, 2. podíl o istot 98,4 % m l b.t. 54,5-56,0 °C; lit. [5] uvádí 55,4-56,6 °C (syntetická), 53,4-54,0 °C (izolovaná), [11] b.t. 58-59 °C, [10] b.t. 35-37 °C.

O Cl

O

COOHCOOH

kyselina 11-cyklohexylundekanovákyselina 10-undecenovácyklohecyl-chloroformiát

+

Obr.3 Syntéza kyseliny 11-cyklohexylundekanové

87

3. Antimikrobiální vlastnosti kyseliny 11-cyklohexylundekanovéPorovnání antimikrobiálních vlastností kyseliny 11-cyklohexyludekanové a mastných

kyselin C11:1 a C10:0-C16:0 je uvedeno na „map “ na obr. 4, kde je inhibi ní ú inek jednotlivých kyselin vyzna en intenzitou barvy pole.

Slou enina Slou enina

MK 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80 MK 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80C11:1 C11:1C10:0 C10:0C11:0 C11:0C12:0 C12:0 C13:0 c C13:0C14:0 C14:0C16:0 C16:011-Cyc 11-Cyc

Slou enina Slou eninaMK 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80 MK 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80

C11:1 C11:1 c c cC10:0 c C10:0 c cC11:0 c c C11:0 c c cC12:0 C12:0 C13:0 C13:0C14:0 C14:0C16:0 C16:011-Cyc 11-Cyc

11-Cyc = kys. 11-cyklohexyundekanová 0 - 10 10-25 25 - 50 50 - 90 > 90

c

Bacillus cereus DMF 2001 Escherichia coli DMF 7503c [mmol/l] c [mmol/l]

Inhibice [%]

Saccharomyces cerevisieae DMF 2880 Fusarium culmorum DMF 0103c [mmol/l] c [mmol/l]

Obr. 4 Porovnání antimikrobiálních vlastností testovaných kyselin.

Antimikrobiální ú inky kyseliny 11-cyklohexylundekanové byly srovnávány s ú inkynasycených mastných kyselin, které se vyskytují v mlé ném tuku: kaprinové, undekanové, laurové, tridekanové, myristové a palmitové a pro srovnání ješt s kyselinou 10-undecenovou, která není složkou lipid , ale je známá svými antimikrobiálními ú inky. istota t chto látek byly min.99 %. Jako testované mikroorganismy byly vybrány : Bacillus cereus DMF 2001 jako zástupce G+ baktérií, Escherichia coli DMF 7503 jako zástupce G- baktérií, jako zástupce kvasinek byl vybrán kmen Saccharomces cerevisiae DMF 2880 a z vláknitých hub kmen Fusarium culmorum DMF0103.

Ke stanovení antimikrobiální aktivity testovaných látek byla použita spektrofotometrická metoda. Inokulum, resp. suspenze spor, bylo zao kováno do sady zkumavek obsahujících tekuté medium (Nutriet broth pro bakterie, Malt extrakt broth pro kvasinku a plíse ) s danou koncentrací testovaných karboxylových kyselin (karboxylové kyseliny byly rozpušt ny v ethanolu, jehož finální koncentrace v mediu inila 2 %. Antimikrobiální ú inek ethanolu byl eliminován slepým pokusem). Z t chto zkumavek byly napln ny sterilní mikrotitra ní desti ky, ve kterých probíhala kultivace i m ení absorbance pomocí p ístroje PowerWave XS (650 nm - bakterie, 630 nm - kvasinka a plíse ). Po ur itých asových intervalech byla prom ována absorbance. Ke zvýšení p esnosti m ení byla absorbance v každé jamce m ena 25x a výsledná absorbance byla vyjád ena jako

88

pr m r. Výsledky byly poté statisticky zpracovány. K vylou ení odlehlých hodnot byl použit Dixon v test s hladinou významnosti 0,05 [13]. Data byla vyhodnocena pomocí po íta ovéhoprogramu Microsoft Excel.Výstupem byly k ivky závislosti absorbance na ase (72 h – bakterie, 240 h – kvasinka a plíse ). Pro srovnání inhibi ních ú ink testovaných látek byly vypo tenyplochy pod jednotlivými r stovými k ivkami pro jednotlivé koncentrace použitých látek a po srovnání s kontrolou (bez p ídavku antimikrobiální látky) byly vypo teny procentuální inhibice r stu kultury. Je vid t, že i když kyselina 11-cyklohehylundekanová, nedosahuje inhibi ní ú innostikyselin C11:1, C10:0 a C11 tak nepochybn inhibi ní ú inek má a to v celém rozsahu koncentrací na Bacillus cereus, Escherichia coli a Fusarium culmorum.

4. Záv rBylo zjišt no, že kyselina 11-cyklohexylundekanová má inhibi ní ú inek již od koncentrace

0,05 mmol.l-1na Bacillus cereus, Eschericia coli a Fusarium culmorum. Pozoruhodný je zejména její ú inek v celém rozsahu koncentrací na gramnegativní Escherichia coli a Fusarium culmorum.

Použitá literatura:[1] A. Vanhatalo, K. Kuoppala, V. Toivonen, K. J. Shingfield: Effects of forage species and stage of

maturity on bovine milk fatty acid composition. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2007, 109, 856-867. [2] C. M. Williams: Dietary fatty acids and human health. Ann. Zootech. 2000, 49, 165-180. [3] K. W. Wahle, S. D. Heys, D. Rotondo: Conjugated linoleic acids: Are they beneficial to human health?

Prog Lipid Res. 2004, 43, 553-587. [4] A. L. Lock, D. E. Bauman: Modifying milk fat composition of dairy cows to enhance fatty acids

beneficial to human health. Lipids. 2004, 39, 1197-1206. [5] J. C. M. Schogt, P. H. Begemann: Isolation of 11-cyclohexylundecanoic acid from butter. J Lipid Res.

1965, 6, 466-470. [6] H. Egge, U. Murawsky, P. Gyorgy, F. Zilliken: Minor constituents of human milk. I. Identification of

cyclohexaneundecanoic acid and phytanic acid in human milk fat by a combination gas chromatograph-mass spectrometer. FEBS Letters 1969, 2, 255-258.

[7] M. DeRosa, A. Gambacorta, L. Minale, J. D. Bullock: Cyclohexane fatty acids from a thermophilic bacterium. J. Chem. Soc.,Chem. Commun. 1971,1334.

[8] K. Suzuki, K. Saito, A. Kawaguchi, S. Okuda; K.Komagata: Occurrence of -cyclohexyl fatty acids in Curtobacterium pusillum strains. J. Gen. and Appl. Microbiology 1981, 27, 261-266.

[9] L. Levy: The activity of chaulmoogra acids against Mycobacterium leprae. Am. Rev. Respir. Dis. 1975, 111, 703-705.

[10] Biermann U., Metzger J., O.: Alkylaton of Alkenes: Ethylaluminum Sesquichloride-Mediated Hydro-Alkyl Additions with Alkyl Chloroformates and Di-tert-butylpyrocarbonate. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 10319-10330.

[11] G. S. Hiers, R. Adams: R. -Cyclohexyl derivatives of various normal alipathic acids. IV.J. Am. Chem. Soc.1926, 48, 2385-2393.

[12] J Boer, B. C. P. Jansen, A. Kentie, H. W Knol: The growth -promoting action of vaccenic acid. Journal of Nutrition. 1947, 33, 359-360.

[13] J.Jaroš a kol.: Pravd podobnost a statistika, VŠCHT, Praha 1998

Kontaktní adresa:Jan Šmidrkal, Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická 5, 166 28 Praha 6, e-mail: Jan.Smidrkal@vscht.cz

89

MOŽNOSTI KONZERVACE MLÉ NÝCH VÝROBK NATIVNÍMI MASTNÝMI KYSELINAMI A JEJICH DERIVÁTY

Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

Preservation possibilities of native fatty acids and their derivatives in dairy products

Summary:At present foodstuffs without synthetic additives are preferred. A possibility how to decrease

the amount of preservatives is to substitute them with compounds based on fatty acids and their derivatives. Fatty acid esters with glycerol, glucose, fructose and sucrose are used as surfactants and have also a broad spectrum of antimicrobial activity1. These lipids are commonly found in natural products (e. g. in milk) and they are crucial for the antimicrobial properties of hydrolysed milk fat2.The mechanism by which fatty acids and their derivatives kill microorganisms is not known but electron microscope studies indicate that they disrupt cell membranes. Higher concentrations of surface active compounds cause disruption of cell membranes and change cell permeability3, 4, 5.The objective of this study was to investigate the susceptibilities of exemplary microorganisms to the antimicrobial properties of several fatty acids and their esters. In this paper we summarize the up to now results obtained at our department. Our results indicate that the addition of tested compounds decreases the number of viable microorganisms.

Cíl práce:Cílem práce bylo otestovat antimikrobiální vlastnosti vybraných mastných kyselin a jejich

ester na modelových kmenech mikroorganism a ov it jejich aktivitu v reálném prost edí. Byla použita ada mastných kyselin, jejich p íslušné 1-monoacylglyceroly, monoacylglukosy, monoacylsahcarosy a monoacylfruktosy. U vybraných látek byla ov ena antimikrobiální aktivita v mlé ných výrobcích. V p ísp vku jsou shrnuty dosavadní výsledky získané na ÚTMT.

Úvod:Sou asným trendem v potraviná ství je snaha co nejvíce snížit obsah syntetických aditiv

a nahradit je látkami p írodními. Jedním z možných ešení je nahrazení konzerva ních látek slou eninami na bázi mastných kyselin a jejich derivát . Estery mastných kyselin s polyoly pat ímezi neionické tenzidy a jsou b žn používány v potraviná ském, kosmetickém a farmaceutickém pr myslu. Mají vysoké emulga ní, stabiliza ní a detergen ní ú inky a zárove projevují antimikrobiální aktivitu v i širokému spektru mikroorganism 1. Tyto látky se b žn vyskytují v p írodních produktech (nap . v mléce) a jsou to klí ové složky, které vytvá ejí antimikrobiální schopnosti hydrolyzovaného mlé ného tuku2. Tyto lipidy se v lidském t le p sobením hydrolas rozkládají na stejné látky jako b žn konzumované potraviny. Lze je proto s úsp chem využít také v mlékárenských technologiích.

Antimikrobiální vlastnosti mastných kyselin a jejich derivát jsou již dlouho známé. Ú inek závisí na délce et zce, koncentraci látky a pH prost edí. Snížení pH prost edí výraznzvyšuje inhibi ní ú inek mastných kyselin. P i výb ru optimální délky mastné kyseliny musí být brán ohled nejen na její inhibi ní aktivitu proti danému mikroorganismu, ale také na její rozpustnost6.

Mechanismus inhibi ních ú ink mastných kyselin a jejich derivát na mikroorganismy není dosud zcela objasn n. Povrchov aktivní látky ve vyšších koncentracích zp sobují poškození cytoplazmatických membrán, které vedou až k usmrcení bu ky3. K inhibici r stu mikroorganismdochází d sledkem zm ny bun né permeability6. Antimikrobiální efekt je zp soben inkorporací mastných kyselin do bun ných membrán, což zp sobuje neuspo ádanost okolních lipid a vede ke zvýšení membránové fluidity. Nespecifické zm ny fyzikálních vlastností lipidové dvojvrstvy mohou zp sobit zm ny membránových protein a m nit tak jejich normální funkci. Lipidová dvojvrstva membrán mikroorganism je tedy primárním cílem ú inku mastných kyselin a jejich derivát 4, 5.

90

Nejvyšší antimikrobiální aktivitu vykazují monoestery mastných kyselin (MK) a glycerolu - monoacylglyceroly (MAG). Existují dv isomerní formy (viz obr. 1).

sn-1- nebo -izomer sn-2- nebo -izomer

Obr. 1. Dv izomerní formy monoacylglycerol . (R - uhlovodíkový et zec)

MAG jsou intermediáty p i degradaci triacylglycerol (TAG) nebo diacylglycerol (DAG) p i lypolýze. TAG a následn DAG jsou hydrolyzovány lipasami za vzniku sn-2-MAG, jejichž významný podíl je izomerován ve dvanáctníku na sn-1-MAG a sn-3-MAG. Vzniklé sn-1-MAG a sn-3-MAG mohou být dále hydrolyzovány na rozdíl od sn-2- MAG, který je lipase rezistentní.

Gastrointestinální infekce zp sobené patogeny z potravin jsou stále velkým problémem i v západní spole nosti. Helicobacter pylori je p vodcem chronické gastritidy a žalude ních v eda rizikovým faktorem pro vznik karcinomu žaludku. Tato patogenní bakterie kolonizuje žaludek a st eva více než poloviny lidské populace. Sou asná terapie je doprovázena vedlejšími ú inkya vznikem rezistentních kmen . Podp rná lé ba pomocí MK a MAG uvoln ných nap . z mlé néhotuku hydrolýzou pregastrickou lipasou se jeví jako možné ešení. Pregastrické lipasy uvol ujíp ednostn krátké a st edn dlouhé MK (C4 - C10) ze sn-3 polohy TAG mlé ného tuku, které vykazují nejv tší antimikrobiální aktivitu.Vzniká tak optimální sm s MK a MAG pro inhibici bakterií2, 7, 8, 9. Výhodou p i použití t chto látek je, že si mikroorganismy nevytvá ejí v i MK a MAG rezistenci, což bylo experimentáln prokázáno s použitím H. pylori. MK a MAG jsou díky svému p írodnímu p vodu považovány za netoxické. WHO ozna ila v roce 1996 kyselinu laurovou za GRAS (generally recognize as a safe)2, 7, 8.

Mastné kyseliny a jejich deriváty lze díky jejich antimikrobiálním vlastnostem a p írodnímu p vodu použít jako konzervanty v potravinách. Jejich další využití ovšem p ipadá v úvahu p i podp rné i doprovodné lé b (v kombinaci s antibiotiky) chorob zp sobených adoumikroorganism . Složení stravy m že také ovlivnit rezistenci v i gastrointestinálním infekcím.

Materiály a metody:Byla testována ada látek:

Mastné kyseliny (MK): C10, C11, C12, C13, C14, C11:1, C16:1, C6-C11 (k. cyklohexylundekanová) Monoacylglyceroly (MAG): C10, C11, C12, C13, C14, C16, C16:1 Monoacylglukosy (GLU): C10, C11, C12, C13, C14, C16:1 Monoacylfruktosy (FRU): C10, C12, C14, C16 Monoacylsacharosy (SACH): C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16

Mastné kyseliny byly od firmy Fluka. Mastná kyselina C16:1 byla izolována z makadamiového oleje na ÚTMT, VŠCHT Praha. Estery mastných kyselin byly syntetizovány (krom ester s fruktosou, které byly p ipraveny enzymaticky) na ÚTMT, VŠCHT Praha.

Testované kmeny: G+ bakterie: Bacillus subtilis LCC 666, Bacillus subtilis DMF 2006, Bacillus cereusDMF 2001 G- bakterie: Escherichia coli DBM 3104, Escherichia coli DMF 7503 Kvasinky: Saccharomyces cerevisiae DMF 2880, Geotrichum candidum DMF 0301 Plísn : Fusarium sp. DMF 0101, Fusarium culmorum DMF 0103, Penicilium rugulosum DMF 0003, Penicilium hirsutum DMF 0001, Penicilium chrysogenum DMF 0002,

91

Penicilium roqueforti DMF 0007, Penicilium nalgiovensis DMF 0010, Penicilium expansum DBM 4061, Alternaria sp. DBM 0101, Aspergilus niger DMF 0501

Ke stanovení antimikrobiální aktivity testovaných látek byla používána ada metod: Stanovení MIC (minimální inhibi ní koncentrace) pomocí agarové difusní vpichové metody10.M ení pr m ru kolonií plísní pomocí metody želatinových kazet10, 11.Stanovení r stu v tekuté p d plotnovou metodou s detekcí nár stu kolonií na pevné p d 11.Sledování vlivu pH prost edí na ú inek testovaných látek12.Ov ení antimikrobiální aktivity v mlé ných výrobcích:

Ke stanovení r stu plísn Fusarium culmorum DMF 0103 v obnoveném sušeném mléce - odtu n ném byla použita plotnová metoda s detekcí nár stu kolonií na pevné p d . Dále byl sledován r st bakterie Bacillus cereus DMF 2001 v syrovátce a polotu ném mléce pomocí p ístroje BacTrac12.

V sou asné dob je používáno spektrofotometrické stanovení r stu v tekuté p d pomocí p ístroj PowerWave XS, Bioscreen ® a QUANT. Výstupem jsou r stové k ivky jednotlivých mikroorganism (Bacillus cereus DMF 2001, Escherichia coli DMF 7503, Saccharomyces cerevisiae DMF 2880, Fusarium culmorum DMF 0103).

Popis metody: Kultivace mikroorganism probíhala v tekutém mediu s p ídavkem testovaných látek

v mikrotitra ních desti kách. Inokulum, resp. suspenze spor, bylo zao kováno do sady zkumavek obsahujících medium s danou koncentrací použitých látek. Z t chto zkumavek byly napln nysterilní mikrotitra ní desti ky, ve kterých probíhala kultivace i m ení absorbance. Po ur itých asových intervalech byla prom ována absorbance pomocí p ístroje PowerWave XS

(650 nm - bakterie, 630 nm - kvasinka a plíse ). Ke zvýšení p esnosti m ení byla absorbance v každé jamce m ena 25x a výsledná absorbance byla vyjád ena jako pr m r. Výsledky byly poté statisticky zpracovány. Pro vylou ení odlehlých hodnot byl použit Dixon v test s hladinou významnosti 0,05. Data byla vyhodnocena pomocí po íta ového programu Microsoft Excel. Výstupem byly k ivky závislosti absorbance na ase (72 h – bakterie, 240 h – kvasinka a plíse ).

Výsledky a diskuse:Byly zm eny r stové k ivky testovaných kmen kultivovaných v tekutém mediu

v mikrotitra ních desti kách s p ídavkem inhibi ních látek po dobu 3 dn (72 h), resp. 10 dn(240 h). Výsledky m ení byly graficky vyjád eny jako r stové k ivky B. cereus a E. coli,resp. S. cerevisieae a F. culmorum.

0,0000,1000,2000,3000,4000,5000,6000,700

0 20 40 60 80 [h]

A

K0,050,100,200,400,80

Obr 2. R stové k ivky B. cereus v p ítomnosti r zných koncentrací (mmol/l) MK C11. Pozn.: K – bez inhibi ní látky a rozpoušt dla

92

Z obr. 2 je patrné, že v p ítomnosti MK C11 dochází k prodloužení lag fáze r stu B.cereusa ke snížení nár stu kultury. P i použití vyšších koncentrací nebyl zaznamenán žádný r st kultury. Obdobné k ivky byly získány i pro ostatní kmeny použitých mikroorganism . Pro srovnání inhibi ních ú ink testovaných látek byly vypo teny plochy pod jednotlivými inhibi ními k ivkami pro jednotlivé koncentrace inhibi ních látek a po srovnání s kontrolou byly vypo teny procentuální inhibice r stu kultury. Z obr. 3 je patrné, že nejvyšší koncentrace MK C11 zp sobila 100% inhibici, tedy nebyl zaznamenán žádný nár st B.cereus.

0

20

40

60

80

100

0,05 0,10 0,20 0,40 0,80c [mmol/l]

inhi

bice

[%]

inh.

Obr. 3. Inhibice r stu B. cereus v p ítomnosti r zných koncentrací MK C11.

Pro vzájemné porovnání p sobení jednotlivých koncentrací testovaných látek byly výsledky zracovány do formy p ehledných map (viz obr. 4). Je patrné, že zvýšení koncentrace vede k vyššímu inhibi nímu efektu. Jako p íklad jsou uvedeny výsledky pro B. cereus kultivovaný s p ídavkem MK a MAG C10 – C12.

Slou enina 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80MK C10MK C11MK C12MAG C10MAG C11MAG C12

Bacillus cereus DMF 2001c [mmol/l]

0 - 10 % 10 - 25 % 25 - 50 % 50 - 90 % > 90 %Inhibice

Obr. 4. Inhibi ní p sobení jednotlivých koncentrací vybraných látek na B. cereus.

Záv r:Cílem této práce bylo otestovat antimikrobiální vlastnosti vybraných mastných kyselin

a jejich ester na modelových kmenech mikroorganism . Dále byla ov ena antifungální aktivita vybraných látek v mlé ných výrobcích. Z výsledk je patrné, že p ídavek inhibi ních látek snižuje po et mikroorganism . P i použití vyšších koncentrací nebyl zaznamenán žádný r st kultury. V p ítomnosti antimikrobiálních látek dochází k prodloužení lag fáze r stu mikroorganism

93

a snížení nár stu kultury. Nízké koncentrace mohou podporovat r st kultury. Zvýšení koncentrace vede ke zvýšení inhibi ního efektu. Z dosavadních výsledk vyplývá, že mezi nejvíce aktivní látky pat í MK C10 – C12 a jejich estery, jelikož jejich ú inek je nejvíce širokospektrální v rámci použitých mikroorganism . Ú inek látek roste s po tem uhlík až k C13, poté prudce klesá. V p ípad acylsacharos ú inek roste s po tem uhlík až k C14 – C16. G+ bakterie byly citliv jšínež G-. Snížení pH prost edí vedlo ke zvýšení inhibi ního efektu MK. V mlé ných výrobcích byl ú inek látek nižší než v syntetickém mediu.

Použitá literatura:1. Bergsson G., Arnfinnsson J., Steingrímsson Ó., Thormar H.: In vitro killing of Candida albicans by fatty

acids and monoglycerides, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45, 3209 – 3212 (2001). 2. Sprong R. C., Hulstein M.F.E., van der Meer R.: Bovine milk fat components inhibit food-borne

pathogens (2002). 3. Šilhánková L.: Mikrobiologie pro potraviná e a biotechnology. Victoria Publishing, Praha 1995. 4. Avis T. J., Bélanger R. R.: Specificity and mode of action of the antifungal fatty acid

cis-9-heptadecenoic acid produced by Pseudozyma flocculosa, Apllied and Environmental Microbiology 67 (2001).

5. Gray S. N., Robinson P., Wilding N., Markham P.: Effect of oleic acid on vegetative growth of the aphid-pathogenic fungus Erynia neoaphidis, FEMS Microbiology Letters 68 (1990).

6. Kabara J. J., v knize Antimikrobial in Food (Branen A. R., Davidson P. M., Eds.), Marcel Dekker, New York 1993.

7. Bergsson G., Steingrímsson Ó., Thormar H.: Bactericidal effects of fatty acids and monoglycerides on Helicobacter pylori (2002).

8. Sun C. Q., O’Connor C. J., Roberton A. M.: Antibacterial actions of fatty acids and monoglycerides against Helicobacter pylori (2003).

9. Graham D. Y., Osato M. S.: H. pylori in the pathogenesis of duodenal ulcer: interaction between duodenal acid load, bile and H. pylori (1999).

10. iháková Z.: Antimikrobiální vlastnosti ester kyseliny laurové s polyoly. Diserta ní práce. Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT, Praha 2000.

11. ervenková R.: Antimikrobiální vlastnosti derivát karboxylových kyselin. Diserta ní práce. Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT, Praha 2004.

12. Kolouchová E.: Syntéza a vlastnosti mikrobiáln aktivních lipid . Diserta ní práce. Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT, Praha 2006.

Kontaktní adresa:Ing. Tereza Karlová Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT v Praze Technická 5 166 28, Praha 6 tereza.karlova@vscht.cz

94

VPLYV TEPLOTY A AKTÍVNEJ KYSLOSTI NA RAST GEOTRICHUM CANDIDUMV MLIEKU A V MLIE NOM AGARE

Hudecová Anna, Liptáková Denisa, Valík ubomír, Medve ová Alžbeta Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave

The Effect of Temperature and pH on the Growth of Geotrichum candidum in Milk and on the Skim Milk Agar

Summary:In our research, the effect of cultivation temperatures and pH on the growth dynamic of Geotrichum candidum was studied by measuring colony forming units in milk and colony diameter on the skim milk agar (SMA). The typical sigmoid growth curves were obtained from the both groups of growth data. This enabled us to calculate basic growth parameters as well as to evaluate the influence of environmental factors mentioned above. While the influence of pH on growth of G. candidum was significant in milk the rates of surface growth on solid milk agar were not affected significantly. The following equations resulted from the Ratkowsky´s model at both pH values: Gr6.7 = 0.0174T + 0.0273, (R2

( 6.7) = 0.988) and Gr5.5 = 0.0115T + 0.0851, (R2

( 5.5) = 0.975). Performing the Student`s t-test, no significant differences among radial growth rates at 5 pH values within the range of 5.0 and 7.1 were found. All the calculated rates of surface growth of G. candidum were included in secondary modelling by Ratkowsky´s model with the following statistically significant results: Grradial = 0.01362T + 0.12851; R2

(radial) = 0.971).Except of growth description of G. candidum in fluid or solid medium, the results presented above may also provide the basis for calculation of the time that this yeast-like fungus need, e.g., to increase number by 3 log in milk or to reach 3 mm visible colony on solid milk surfaces. This time data could be important in evaluation of growth potential of G. candidum in cheese where this fungus may contribute to the ripening or on fresh cheeses or quark where acts as contaminant.

ÚvodG. candidum je významná mliekarenská huba, ktorá sa používa hlavne v technológii

spracovania syrov zrejúcich s ples ou, alebo pod mazovou kultúrou. Tiež je prirodzenou sú as oumikroflóry erstvých alebo krátkozrejúcich syrov z kozieho a ov ieho mlieka. V prípade ov iehohrudkového syra sa podie a na jeho finálnych vlastnostiach.

G. candidum sa okrem mlieka a mlie nych výrobkoch bežne vyskytuje napríklad aj na starnúcich liberkách lisovaného droždia, v kyslej kapuste a uhorkách, na škrobe, ale aj v pôde, vo vode, v aktivovaných kaloch z odpadových vôd, na rastlinách, obilninách a pod. Je to saprofyt, ale za podmienok imunitnej nedostato nosti sa môže sekundárne sta patogénnym pre loveka 1, 2.V závislosti od morfológie kolónií je G. candidum považované za mikroorganizmus hrani iacimedzi typickou kvasinkou a vláknitou hubou. Vo vnútri druhu sú preto popísané dva hlavné morfotypy. Jeden je charakterizovaný kme mi s krémovo sfarbenými kolóniami podobnými kvasinkovým, ktoré hojne produkujú artrospóry a vo všeobecnosti majú mierny rast, proteolytickú aktivitu a produkujú organické kyseliny. Optimálna teplota pre jej rast sa nachádza medzi 22 až 25 °C. Druhý typ tvoria biele splstené kolónie s prevahou vegetatívnych hýf s menším množstvom artrospór. Tento morfotyp vykazuje vysokú proteolytickú aktivitu, rýchly rast pri optimálnej teplote 25 až 30 °C a schopnos alkalizova prostredie 3.

G. candidum môže rás v teplotnom rozpätí od 5 do 38 °C, a pri pH od 3 do 11 s optimom 5,5 až 6,0. Jej genera ný as je jeden z najnižších medzi eukaryotmi, t.j. 1,1 h pri 30 °C v kvapalnom médiu. Je senzitívna na obsah NaCl, pri om citlivos sa pohybuje v rozmedzí 1 % až 2,5 %. Rast tejto mliekarenskej huby v syre je limitovaný so ou pri koncentráciách nad 1 %. Tento druh je ve mi odolný vo i zníženej koncentrácii kyslíka a zvýšenému obsahu oxidu uhli itého. Jej rast klesá lineárne so znižovaním koncentrácie kyslíka pri jeho obsahu pod 3 %. Avšak, rast v atmosfére ochudobnenej o kyslík vedie k pred ženiu hýf a strate bo ného vetvenia 3.Na agarových pôdach tvorí G. candidum jemné kožušinkové porasty a podobné kožky vytvára aj na kvapalných pôdach. Obrovská kolónia rastie rýchlo, najrýchlejšie zo všetkých druhov geotrích. Vyskytuje sa vo vegetatívnej forme rozmnožovania artrokonídiami disartikuláciou hýf. Sexuálne rozmnožovanie nie je známe 2. Kmene G. candidum neasimilujú laktózu a dokážu rýchlo metabolizova laktát z mlie neho agaru obsahujúceho 1 % kyseliny mlie nej. Všetky kmene

95

G. candidum izolované z mlieka, tvarohu a syra sú schopné asimilova laktát ako zdroj uhlíka a energie 3, 4, 5.

Na povrchovo zrejúcich syroch lipázy a proteázy G. candidum štiepia lipidy a proteíny na mastné kyseliny a peptidy, ktoré sa alej metabolizujú ostatnými mikrobiálnymi populáciami. Týmto spôsobom G. candidum prispieva k osobitným arómam a finálnym vlastnostiam syrov 4.Na zretí syrov sa podie a tiež prostredníctvom amino- a karboxy-peptidáz, ktoré špeciálne v mäkkých syroch uvo ujú aminokyseliny. Katabolizmom aminokyselín enzýmami G. candidumdochádza k produkcii zlú enín, ktoré sú dôležité pre rozvoj arómy a chuti 6.

Metabolizmus laktátu a tvorba alkalických metabolitov vedie k deacidifikácii povrchu syra. Umožní sa tým rast baktérií citlivých na slabé organické kyseliny, ale aj proteolytickejším baktériám, akými sú mikrokoky, Brevibacterium linens, Arthrobacter a Corynebacterium. Sú asnesa umožní rozvoj aj iných dôležitých organizmov ako je Penicillium camembertii 3.

Po as zretia syra kamembertského typu sa ukázalo že G. candidum zna ne znižuje horkosrozkladom horkých peptidov pomocou aminopeptidázovej aktivity, ako aj inhibíciou rastu druhu Penicillium 7.

V prípade erstvých syrov ako Cottage cheese a tvaroh je G. candidum ako aj iné mikroorganizmy považovaná za kontaminujúcu flóru 3. Zástupcovia Geotrichum sp. znehodnocujú aj niektoré smotanové syry 8. Podie a sa aj na kazení masla, smotany a smotanových produktov 9.

V tejto práci sme sa venovali štúdiu dynamiky rastu kme a G. candidum,ktorý sme izolovali z ov ieho hrudkového syra vyrobeného zo surového mlieka. Cie om bolo popísa jej základné rastové charakteristiky, ako sú rastová rýchlos , trvanie lag-fázy, v závislosti od teploty, hodnoty pH, a typu kultiva ného prostredia, ako aj ur i jej minimálnu teplotu rastu. Ratkowského model, ktorý patrí medzi sekundárne modely prediktívnej mikrobiológie sme použili na linearizáciu závislosti rastovej rýchlosti od teploty prostredia. Pomocou tohto modelu je možné spätne ur i správanie sa danej huby v závislosti od vplyvov prostredia.

Výsledky a diskusiaDynamika rastu G. candidum v UHT mlieku pri dvoch hodnotách pH v závislosti od teploty

Dynamika rastu kultúry G. candidum zámerne inokulovanej do vzoriek UHT mlieka pri hodnote pH 5,5 v závislosti od teploty uchovávania je znázornená na obr. 1 a pri pH 6,7 na obr.2. Rastové parametre sú uvedené v tab. 1.

Ako vidno z obrázkov (obr. 1 a 2) a nameraných rastových parametrov (tab. 1) zvyšovaním kultiva nej teploty sa rastová rýchlos zvyšovala a analogicky lag-fáza mala kratšie trvanie, pre obidve hodnoty aktívnej kyslosti prostredia. V prípade najnižšej z použitých kultiva ných teplôt 10 °C boli namerané hodnoty rastových rýchlostí pre jednotlivé pH prakticky totožné (Gr = 0,041 log KTJ.h-1). Pri teplote 15 °C nadobudla rastová rýchlos v mlieku s pH 5,5 hodnotu 1,5-násobne vyššiu ako v prípade 10 °C a pri pH 6,7 bola takmer 2-násobná. Najvyššiu rastovú rýchlos dosiahla huba pri 25 °C, ktorá bola pri pH 5,5 až 3,5-krát vyššia než pri 10 °C a pri pH 6,7 bol tento rozdiel skoro 5-násobný. Z rastových rýchlosti pri teplote 25 °C pri pH 5,5 a pH 6,7 vyplývajú asy zdvojenia (genera né asy) 2,17 a 1,45 h, v poradí a sú v súlade s genera ným asom 1,1 h pri 30 °C uvedeným v úvode tejto práce 3. Získané rastové hodnoty nám umožnili vypo íta aj minimálnu teplotu rastu pre tento kme dosahujúcu 7 °C pri pH 6,7.

Porovnaním rastových rýchlostí pre jednotlivé pH (tab. 1) možno vidie , že pri najnižších teplotách (10 a 12 °C) boli namerané hodnoty rastových rýchlostí prakticky totožné, resp. bol rozdiel menší ako 9 %, nazna ujúc tak minimálny vplyv pH na rast vláknitej huby. alšímzvýšením teploty dochádza k spomaleniu rastu huby v mlie nom prostredí s nižšou hodnotou pH približne o 20 %. Pri 18 °C bol vplyv odlišného pH najvýznamnejší, pri om rozdiel medzi rastovými rýchlos ami bol až 52 %. Pri posledných dvoch teplotách 20 °C a 25 °C to bolo približne 33 %.

96

0

1

2

3

4

5

6

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

as [h]

log

KTJ

.ml-1

GC mono-culture_25

GC mono-culture_20

GC mono-culture_18 GC mono-culture_15

GC mono-culture_12

GC mono-culture_10

0

1

2

3

4

5

6

0 48 96 144 192 240 288 336

as [h]

log

KTJ

.ml-1

GC mono-culture_25

GC mono-culture_20

GC mono-culture_18

GC mono-culture_15

GC mono-culture_12

GC mono-culture_10

Tabu kaRastové parametre G. candidum v UHT mlieku v závislosti od kultiva nej teploty pri dvoch hodnotách pH 5,5 a 6,7(Gr je rastová rýchlos G. candidum)

teplota [°C] Gr5,5[log KTJ.h-1] lag-fáza5,5[h] Gr6,7[logKTJ.h-1] lag-fáza6,7[h]

10 0,041 12,8 0,041 23,1 12 0,051 15,9 0,056 15,7 15 0,062 8,7 0,077 11,7 18 0,066 5,2 0,138 14,9 20 0,102 3,1 0,154 13,6 25 0,139 2,5 0,208 3,3

Obr. 1: Obr. 2:Dynamika rastu G. candidum v UHT mlieku Dynamika rastu G. candidum v UHT mlieku pri pH = 5,5 v závislosti od teploty uchovávania pri pH = 6,7 v závislosti od teploty uchovávania

Dynamika rastu G. candidum na SMA platniach pri rôznych hodnotách pH v závislosti od tepoloty

Povrchovou inokuláciou vláknitej huby na agarové médium a meraním radiálneho rastu sme získali jej rastové charakteristiky aj na tuhom médiu. V tab. 2 sú zaznamenané jej rastové parametre pri jednotlivých teplotách uchovávania a daných hodnotách pH, ktorých hodnoty sa pohybovali od 5,0 do 7,0. Z nameraných údajov je možné vidie , že pri všetkých testovaných hodnotách pH sa so zvyšujúcou sa teplotou zvyšuje rastová rýchlos G. candidum. Napríklad pri pH 5,5 nadobúda pri 10 °C najnižšiu hodnotu radiálneho rastu (Gr = 0,8 mm.d-1), ktorá je skoro 2-násobne nižšia oproti 15 °C a až 3-krát menšia v porovnaní s teplotou 25 °C dosahujúc pri nej aj najvyššiu hodnotu. Z prezentovaných výsledkov (tab. 2) vyplynulo, že rast huby významne ovplyv ovala len kultiva ná teplota a nie zmena pH hodnôt testovaného média.

97

Tabu kaRastové parametre G. candidum na SMA platniach pri rôznych hodnotách pH v závislosti od teploty uchovávania (Grr je rastová rýchlos kolónie, Dend je kone ný priemer kolónií)

Teplota [°C] pH Grr [mm.h-1] Grr [mm.d-1] lag-fáza [h] Dend [mm]

5,1 0,068 0,81 54,1 63,0 5,5 0,066 0,80 40,1 64,2 6,1 0,071 0,85 41,6 62,8 6,7 0,071 0,85 60,0 63,4

10

7,1 0,054 0,65 29,2 55,8 5,0 0,087 1,04 38,0 67,1 5,5 0,089 1,07 - 68,6 6,0 0,091 1,10 31,8 68,2 6,5 0,071 0,85 2,09E-06 66,4

12

7,0 0,090 1,08 48,3 67,8 5,1 0,122 1,46 - 64,4 5,5 0,117 1,41 - 72,7 6,0 0,117 1,40 - 72,3 6,5 0,107 1,29 - 82,5

15

7,1 0,095 1,14 - 70,1 5,0 0,138 1,66 0,3 103,6 5,5 0,128 1,54 3,08E-06 103,6 6,1 0,141 1,69 13,0 94,8 6,5 0,137 1,65 11,0 112,2

18

7,0 0,128 1,54 1,8 114,4 5,1 0,178 2,13 10,8 69,0 5,6 0,160 1,92 10,4 69,5 5,9 0,174 2,08 9,3 69,5 6,3 0,181 2,17 18,7 70,1

20

7,0 0,159 1,91 4,6 72,5 5,0 0,215 2,58 - 65,5 5.6 0,210 2,53 - 65,8 6.1 0,221 2,65 - 67,6 6.5 0,218 2,61 - 71,2

25

7,0 0,216 2,60 - 61,9

Ratkowského model (obr. 3) linearizuje závislos druhej odmocniny rastovej rýchlosti od teploty. Vplyv teploty na rastovú rýchlos G. candidum v mlieku pri pH 6,7 popisuje rovnica (1) a pri pH 5,5 rovnica (2) s nízkou pravdepodobnos ou omylu reprezentovanou vysokými korela nými koeficientmi:

Gr = 0,0178.T + 0,0256 R2 (Gr) = 0,968 (1)

Gr = 0,0113.T + 0,0791 R2 (Gr) = 0,9118 (2)

kde Gr je rastová rýchlos (log KTJ.h-1), T je teplota inkubácie, R je korela ný koeficient.

98

y = 0,0178x + 0,0256R2 = 0,968

y = 0,0113x + 0,0791R2 = 0,9118

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

9 12 15 18 21 24

Teplota [°C]

dru

há o

dmoc

nina

rast

ovej

rých

lost

i

pH 6.7

pH 5.5 y = 0,0136x + 0,1285R2 = 0,9706

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

8 12 16 20 24

Teplota [°C]

dru

há o

dmoc

nina

rast

ovej

rých

lost

i

Výsledky znázornené v obr. 3 potvrdzujú fakt, že rastová rýchlos G. candidum v mlieku bola významne ovplyvnená pH hodnotou a kultiva nou teplotou, pri om najvä šie rozdiely medzi rastovými rýchlos ami v závislosti od pH boli namerané pri 18, 20 a 25 °C. Zníženie rastovej rýchlosti pri nižšej hodnote pH môže by spôsobené prítomnos ou vä šieho podielu nedisociovanej formy kyseliny mlie nej prechádzajúcej pri vyššej teplote vo vä šej miere do buniek v dôsledku zvýšenej difúzie. alej následnou spotrebou ATP potrebnou na vylú enie H+ iónov ako aj príslušných aniónov, prostredníctvom ktorej si bunky udržujú homeostázu vnútorného prostredia 10.

Obr. 3: Obr. 4:Závislos rastovej rýchlosti od teploty Závislos rastovej rýchlosti od teplotyuchovávania v mlieku pre dve hodnoty pH uchovávania na SMA agarových platniach

Aj v prípade rastu G. candidum na povrchu agarového média so sušeným odstredeným mliekom bolo možné vyjadri závislos rastovej rýchlosti od teploty uchovávania, ktorá je znázornená na Obr. 4. Popisuje ju rovnica (3) s vysokou koreláciou:

Gr = 0,0136.T + 0,1285 R2 (Gr) = 0,9706 (3)

kde Gr je rastová rýchlos (mm.h-1), T je teplota inkubácie, R je korela ný koeficient.

Smernice lineárnych závislostí pre jednotlivé pH hodnoty v rozpätí od 5,0 do 7,0 mali ve mi podobné hodnoty, z oho možno predpoklada , že tento faktor neovplyv oval rast sledovanej huby na tuhom médiu. Táto skuto nos sa pri jednotlivých teplotách potvrdila aj na základe Studentovho t-testu.

99

ZáverCie om našej práce bolo ur i základné rastové vlastnosti kme a známej mliekárenskej

huby G. candidum izolovaného z ov ieho hrudkového syra. Ako modelové médiá sa použili UHT mlieko a agar s odstredeným mliekom. Rast sme vyšetrovali pri teplotách 10 °C, 12 °C, 15 °C, 18 °C, 20 °C a 25 °C, ako aj pri rôznych hodnotách aktívnej kyslosti v prípade mlieka 5,5 a 6,7 a v agare v rozpätí od 5,0 do 7,0.

Dynamika rastu mlie nej huby sa zvyšovala úmerne so stúpajúcou teplotou uchovávania a najrýchlejší rast vykazovala pri najvyššej z aplikovaných teplôt ur ujúc túto teplotu ako najoptimálnejšiu pre rast G. candidum. Vplyv pH prostredia bol významný pri kultivácii v kvapalnom médiu a to spomalením rastu vplyvom nižšej hodnoty aktívnej kyslosti. Na tuhom médiu sa tento ú inok neprejavil.

Uvedené výsledky získané v uvedenej štúdii nám umož ujú ur i vhodné podmienky potrebné pre rast a rozmnožovanie tohto kme a v syroch ako je napríklad ov í hrudkový syr a predpoveda jej správanie sa pri rôznych podmienkach prostredia aplikáciou Ratkowského modelu jedného zo sekundárnych nástrojov prediktívnej mikrobiológie.

Po akovanie:Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy . APVV-20-005605 a z grantu MŠ VEGA . 1/3488/06.

Použitá literatúra:1. BOUAKLINE, A., LACROIX, C., ROUX, N., GANGNEUX, J.P., DEROUIN, F. Fungal contamination

of food in hematology units. Journal of Clinical Microbiology, 38, 2000, p. 4272-4273. 2. KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, A. Taxonómia kvasiniek a kvasinkovitých mikroorganizmov. Alfa,

Bratislava, 1990, 673 s. 3. BOUTROU, R., GUÉGUEN, M. Interests in Geotrichum candidum for cheese technology. International

Journal of Food Microbiology, 102, 2005, p. 1-20. 4. MARCELLINO, N., BEUVIER, E., GRAPPIN, R., GUÉGUEN, M., BENSON, D.R. Diversity of

Geotrichum candidum strains isolated from traditional cheesemaking fabrications in France. Applied and Environmental Microbiology, 67, 2001, p. 4752-4759.

5. COSENTINO, S., FADDA, M.E., DEPLANO, M., MULARGIA, A.F., PALMAS, F. Yeasts associated with Sardinian ewe’s dairy products. International Journal of Food Microbiology, 69, 2001, p. 53-58.

6. JOLLIVET, N., CHATAUD, J., VAYSSIER, Y., BENSOUSSAN, M., BELIN, J.M. Production of volatile compounds in model milk and cheese media by eight strains of Geotrichum candidum link. Journal of Dairy Research 61, 1994, p. 241-248.

7. BEOKHOUT, T., ROBERT, V. Yeasts in food. Hamburg: Woodhead Publishing Ltd, 2003. 448 p. ISBN 185573706X

8. CHAPMAN, H.R., SHARPE, M.E. Microbiology of cheese. In ROBINSON, R.K. The microbiology of milk products. New york: Elsevier Science Publishers, 1990. ISBN 1-85166-399-1, vol. 2, p. 203-291.

9. VARNAM, A.H., SUTHERLAND, J.P. Milk and milk products. Vol. 1, London: Chapman and Hall, 1994. 451 p. ISBN 041245730X

10. PIPER, P., CALDERON, C.O., HATZIXANTHIS, K., MOLLAPOUR, M. Weak acid adaptation: the stress response that confers yeasts with resistance to organic acid food preservatives. Microbiology, 147, 2001, p. 2635-2642.

Kontaktná adresa:Ing. Anna Hudecová, Ing. Denisa Liptáková, PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika

100

VÝSKYT BIFIDOBAKTERIÍ V MATE SKÉM MLÉCE Rada Vojt ch1, Nevoral Ji í2, Flajšmanová Kate ina2, Ro ková Šárka1, Šmehilová Martina1,

Tománková Eva1

1 Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, ZU Praha;2 První pediatrická klinika UK Praha, FN Motol.

Occurence of bifidobacteria in human milk

Summary:The aim of the work was to investigate whether human milk is a primary source of bifidobacteria for infants. Two groups of human milk samples were tested: The first group (13 samples) originated from mothers with babies without bifidobacteria in faecal flora (BIF-). The second group (29 samples) originated from mothers with babies with bifidobacteria in faecal flora (BIF+). The occurrence of bifidobacteria in faeces was tested using cultivation method and FISH. For the detection of bifidobacteria in milk, the samples were subcultivated in TPY broth with mupirocin and subsequently the fructose-6-phosphate phosphoketolase activity (F6PPK) was determined. While 35% of milks from BIF+ group expressed F6PPK activity and therefore contained bifidobacteria, no bifidobacteria were detected in milks from BIF- group. It could be concluded that human milk is not the primary source of bifidobacteria for infants. It seems that bifidobacteria occur in mothers milks as a consequence of contamination from infant intestinal tract.

ÚvodV poslední dob se ve v decké literatu e objevily zprávy o výskytu bakterií mlé ného

kvašení a bifidobakterií v mate ském mléce (MM). Martín a kol. (1) testovali výskyt bakterií mlé ného kvašení v mate ském mléce a st rech z povrchu k že matky a ústní dutiny kojenc . Jako hlavní druh nacházeli Lactobacillus gasseri. Další dv práce (2, 3) informují o výskytu bifidobakterií v mate ském mléce, p i emž vyslovují hypotézu, že mate ské mléko je p irozeným zdrojem bifidobakterií. Tomuto tvrzení však zcela nenapovídá prom nlivý výskyt pozitivních vzork . Zatímco vzorky od matek z japonského venkova obsahovaly bifidobakterie ve 100 % p ípad , vzorky z Dánska a Švédska m ly po ty t chto bakterií výrazn menší a asto byly i zcela negativní. Cílem práce bylo proto ov it hypotézu n kterých autor , že MM je primárním zdrojem bifidobakterií.

Materiál a metodyCelkem bylo testováno 13 vzork MM od dárky , jejichž d ti nem ly p ítomné

bifidobakterie ve stolici (skupina BIF-) a dále 29 vzork od dárky , jejichž d ti m ly naopak bohaté zastoupení t chto bakterií ve stolici (skupina BIF+). Pro testování p ítomnosti bifidobakterií bylo 0,5 ml mléka inokulováno do 9 ml TPY bujónu (Sharlau, Špan lsko) s p ídavkem mupirocinu (100 mg/l) podle (4) a inkubovány p i 37oC po dobu 48 hod. P ítomnost bakterií ve stolici byla testována kultiva n a pomocí FISH (4), v MM potom p ítomnost bifidobakterií p edb žn pomocí fázov -kontrastní mikroskopie pomocí mikroskopu Nikon Eclipse E-800 a dále pomocí detekce fruktoso-6-fosfát fosfoketolázy (5), což je enzym specifický pro rod Bifidobacterium.

Výsledky a diskuse Po ty bakterií u d tí dárky MM jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. Kojenci bez bifidobakterií m ly jako hlavní bakteriální skupinu ve stolici klostridie. Zatímco p ítomnost bifidobakterií byla spolehliv prokázána jak pomocí kultiva ních metod, tak pomocí FISH, po tyklostridií lze ve stolici spolehliv prokázat pouze pomocí FISH, použita byla sonda specifická pro skupinu Cl. butyricum. Výskyt bifidobakterií v MM je uveden v tabulce . 3. Bifidobakterie byly pom rn spolehliv prokázány již pomocí mikroskopie (Obrázek 1 a 2), kdy pozitivní vzorky obsahovaly typické nepravidelné ty inky asto s náznaky v tvení a/nebo schopností autoagregace. U negativních vzork byly pozorovány pouze tukové kuli ky, k pomnožení jiných bakterií nedocházelo vzhledem k p ítomnosti mupirocinu, který má inhibi ní ú inek v i v tšin bakterií vyskytujících se na k ži (stafylokoky, mikrokoky) a rovn ž spolehliv zamezí pomnožení bakterií mlé ného kvašení. Bifidobakterie byly nalezeny pouze ve vzorcích mlék skupiny BIF+. Celkem

101

bylo pozitivních 35 % vzork . Naprostá absence bifidobakterií u BIF- skupiny jasn nazna uje,že mate ské mléko není primárním (endogenním) zdrojem bifidobakterií pro kojence. Neexistuje ani žádné uspokojivé vysv tlení jakou cestou by se m ly bifidobakterie, pop . bakterie mlé néhokvašení do MM dostat. MM uvnit mlé né žlázy je (u zdravých jedinc ) sterilní jako je tomu i u ostatních savc . P irozeným místem výskytu bifidobakterií je trávicí trakt, v etn ústní dutiny. Bifidobakterie jsou v MM tedy s nejv tší pravd podobností p ítomny jako sekundární kontaminace, p i emž jako hlavní zdroj se jeví sám kojenec, v p ípad , že má pln vyvinutou st evní flóru s obsahem bifidobakterií.

Tabulka I Po et klostridií ve stolici d tí negativních na bifidobakterie a výskyt bifidobakterií v mléce jejich matek (skupina BIF-).

Vzorek Po et klostridií Bifidobakterie v mléce matek MA471/2 8,24 - MM486/2 9,06 - MF495/2 7,88 - MM587/2 ND - MM607/2 8,18 - ME621/2 7,53 - ME626/2 ND - MS693/2 7,83 - MM769/2 9,64 - MM853/2 9,15 - MA856/2 8,64 - MA860/2 9,41 - MA895/2 7,83 -

Obr. 1. Bifidobakterie v kultivovaném mate ském mléku.

Obr.2. Mate ské mléko po kultivaci bez p ítomnosti bifidobakterií.

102

Tabulka II Po et bifidobakterií ve stolici kojenc a v mléce jejich matek (skupina BIF+) mezera 3 body.

Vzorek Bifidobakterie kultiva n Bifidobakterie FISH Bifidobakterie v mléce matek

MM665/2 7,16 8,76 - MA673/2 10,67 10,42 - MM707/2 9,87 9,52 - MM709/2 10,32 9,88 - MA750/2 8,95 7,97 - MA755/2 9,63 10,41 - MA770/2 ND 9,03 + MM797/2 10,90 10,71 + MA800/2 9,34 9,29 - MF802/2 9,34 10,12 - MF803/2 7,76 9,19 - MM807/2 10,69 10,57 + MF812/2 10,18 9,97 - MA818/2 10,80 10,24 - MM867/2 10,46 10,49 - MM868/2 10,39 10,42 - MM869/2 9,06 9,31 + MM873/2 10,96 10,67 - MM875/2 10,37 10,61 + MM880/2 10,24 10,19 + MA883/2 10,32 10,04 - MA884/2 10,58 10,68 - MM885/2 10,94 10,94 + MA897/2 10,75 10,76 - MM901/2 9,13 9,10 + MM906/2 9,96 9,96 - MM907/2 10,56 10,10 + MA920/2 9,59 10,04 + MF932/2 10,61 9,53 -

Pod kování:Práce byla sponzorována granty MSM 6046070901, IGA NR/8310-5 a GA R 525/08/H060.

Použitá literatura:1. Martín R., Langa S., Reviriego C., Jimínez E., Marín M.L., Xaus J., Fernández L., Rodríguez J.M.:

Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut. J. Pediatr. 143, 754-758, 2003 2. Gueimonde M., Laitinen K., Salminen S., Isolauri E.: Breast milk: a source of bifidobacteria for infant

gut development and maturation? Neonatology 92, 64-66, 2007 3. Sin kiewicz G., Nordstrom E.A.: Occurence of Lactobacillus reuteri, lactobacilli and bifidobacteria in

human breast milk. Pediatr. Res. 58, 415, 2005 4. Vlková E., Nevoral J., Jen íková B., Kope ný J., Godefrooij J., Trojanová I., Rada V.: Detection of

infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods. J. Microbiol. Meth. 60, 365-373, 2005 5. Orban J.I., Patterson J.A.: Modification of the phosphoketolase assay for rapid identification of

bifidobacteria. J. Microbiol. Meth. 40, 221-224, 2000

Kontaktní adresa:Vojt ch Rada, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, eská zem d lská univerzita v Praze Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol; rada@af.czu.cz

103

INHIBI NÍ Ú INEK LYSOZYMU NA BIFIDOBAKTERIE POUŽÍVANÉ P I VÝROBMLÉ NÝCH KYSANÝCH VÝROBK

Šmehilová Martina, Ro ková Šárka, Rada Vojt ch, Tománková Eva eská zem d lská univerzita v Praze, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky

Inhibition effect of lysozyme on bifidobacteria isolated from fermented milk products

Summary:The lysosyme is an allowed preservative for dairy products. The aim of this work was to compare the effects of lysosyme on bifidobacteria isolated from fermented dairy products, probiotics and other environments. We tested the addition of lysosyme (400μg/ml) in exponencial part of growth curve of 32 strains of bifidobacteria. Bifidobacteria were divided into three groups. First group – sensitive strains isolated from probiotics (12 strains, mainly B. animalis). Second group – species of 9 strains, which were resistant to lysosyme .The specific growth rate in the rest of tested strains (11 strains) was statistically lower in the presence of lysosyme. Our results can be used for the selection of new probiotics strains used in food industry.

Lysozym je povolená konzerva ní látka (E 1105) pro mlé né výrobky. P irozen se lysozym vyskytuje ve slinách, slzách, je vylu ován na sliznicích a kone n je jednou z hlavních antibakteriálních látek p ítomných v mate ském mléce (1). Tento eznym hydrolyzuje glykosidickou ß-1,4 vazbu mezi kyselinou N-acetyl muramovou a 2-acetyl amino-2-deoxy glukosou v peptidoglykanu. Inhibi ní ú inek se proto projevuje hlavn na grampozitivní bakterie (2).

Inhibi ní ú inek lysozymu byl testován u n kterých bakterií mlé ného kvašení. Laktobacily a laktokoky tolerují koncentraci 35μg/ml (3, 4). O ú incích lysozymu na bifidobakterie je málo známo. Gagnon a kol. (5) testovali p t kmen bifidobakerií izolovaných ze stolice kojenc a ty isbírkové kmeny lidských bifidobakterií. erstvé izoláty byly rezistentní v i koncentraci 300 μg/ml, sbírkové odolávaly koncentraci 200-300 μg/ml. Koncentrace lysozymu v mate skémmléce je však ješt vyšší a iní cca 400 μg/ml (6). Cílem práce bylo proto porovnat ú inkylysozymu na bifidobakterie izolované z mlé ných kysaných výrobk , probiotických preparát a dalších prost edí.

Materiál a metoda P ehled použitých bakteriálních kmen je uveden v tabulce 1. Celkem bylo testováno 32 kmen bifidobakterií, p i emž byl testován vliv p ídavku lysozymu (400 μg/ml). Kmeny byly izolovány a identifikovány pomocí API 50CHL, API ID32A test a druhov specifické PCR podle Vlková a kol. (7). Kultury narostlé v TPY médiu (Sharlau, Špan lko) byly p eo koványdo zkumavek (6 opakování pro každý kmen) se stejným médiem a kultivovány p i 37oC ve vodní lázni. V hodinových intervalech byla m ena optická densita p i 540 nm (OD540) pomocí p ístroje DensiLaMetr (Lacheme, R). Bezprost edn po zjišt ní po átku logaritmické fáze r stové k ivkybyl p idán do poloviny zkumavek lysozym (egg lysozyme, Sigma) v koncentraci 400 μg/ml. Výsledky byly vyneseny do graf a byla spo tena specifická r stová rychlost podle vzorce : μ = (lnx – lnx0)/t – t0, kde x a x0 jsou hodnoty OD540 v asech t a t0 v pr b hu exponenciální fáze r stové k ivky.

Výsledky a diskuseVýsledky jsou uvedeny v tabulce 1 a 2 a na obrázcích 1-3. Na základ výsledk je možno

bifidobakterie rozd lit do t í skupin. První skupinu tvo ily kmeny izolované z probiotik (12 kmen ),které byly vysoce citlivé a zastoupené hlavn druhem B. animalis (obrázek 1). Druhou skupinu (9 kmen ) tvo ily kmeny lidského p vodu (B. breve, B. bifidum, B. adolescentis a B. longum),na jejichž r st nem l lysozym vliv (obrázek 2). Specifická r stová rychlost t chto kmen

104

se pohybovala od 0,25 do 0,54 h-1. U zbylých kultur (11 kmen ) došlo po p ídavku lysozymu ke statisticky významnému snížení specifické r stové rychlosti (obrázek 3, tabulka 2). Z výsledkvyplývá, že existuje velká variabilita v citlivosti bifidobakterií v i lysozymu. Obecn kmeny izolované ze zví at se zdají být citliv jší, než kmeny lidského p vodu. Citlivé jsou zejména kmeny izolované z probiotických mlé ných kysaných výrobk . Výsledky mohou být využity pro selekci nových kmen bifidobakterií vhodných pro výrobu probiotik.

Tabulka IVliv lysozymu na r st bifidobakterií (400 μg/ml). Kmen P vod Neroste Pomalejší r st Roste B. adolescentis LUR Stolice dosp lých lidí - - + B. adolescentis H1 Stolice kojenc - - + B. bifidum JKM Stolice kojenc - - + B. bifidum V22 Stolice dosp lých lidí - - + B. breve ATCC 15700 - - + B. breve AB1 Stolice kojenc - - + B. breve KL Stolice kojenc - - + B. breve MJB Stolice kojenc - - + B. longum ATCC 15707 - - + B. adolescentis CCUG 18363 - + - B. breve MV1 Stolice kojenc - + - B. infantis ATCC 17930 - + - B. longum KAM Stolice kojenc - + - B. merycicum 813P2 Výkaly telat - + - B. merycicum 813P3 Výkaly telat - + - B. merycicum 813P4 Výkaly telat - + - B. merycicum 23II Výkaly telat - + - B. merycicum 805T1 Výkaly telat - + - B. merycicum 805III2 Výkaly telat - + - B. merycicum J3II Výkaly jeh at - + - B. animalis CCUG 24606 + - - B. animalis Kysané mléko + - - B. animalis Kysané mléko + - - B. animalis Probiotické kapsle + - - B. animalis Kysané mléko + - - B. animalis Kysané mléko + - - B. animalis Kysané mléko + - - B. bifidum CCM 3762 + - - B. bifidum JOV Stolice kojenc + - - B. pseudolongum subsp.globosum

DSMZ 20092 + - -

B. pseudolongum subsp.pseudolongum

DSMZ 20099 + - -

B. ruminantium DSMZ 6489 + - -

105

Obr. 1. R st B. animalis – inhibice p ídavkem lysozymu (ANIM 1 a 2).

Obr. 2. R st B. breve – rezistence v i lysozymu (BREVE 1 a 2).

Obr. 3. Zpomalený r st B. merycicum vlivem lysozymu (23II L).

106

Tabulka 2Specifická r stová rychlost bifidobakterií v médiu s a bez lysozymu. U všech kmen byla specifická r stová rychlost statisticky významn nižší (P < 0,01) po p ídavku lysozymu. Kmen P vod Kontrola Lysozym B. adolescentis CCUG 18363 0,295 ± 0,09 0,105 ± 0,01 B. breve MV1 Stolice kojenc 0,242 ± 0,05 0,192 ± 0,05 B. infantis ATCC 17930 0,138 ± 0,02 0,073 ± 0,02 B. longum KAM Stolice kojenc 0,168 ± 0,01 0,060 ± 0,03 B. merycicum 813P2 Výkaly telat 0,169 ± 0,01 0,101 ± 0,03 B. merycicum 813P3 Výkaly telat 0,205 ± 0,05 0,106 ± 0,02 B. merycicum 813P4 Výkaly telat 0,162 ± 0,01 0,121 ± 0,03 B. merycicum 23II Výkaly telat 0,118 ± 0,05 0,078 ± 0,02 B. merycicum 805T1 Výkaly telat 0,323 ± 0,06 0,192 ± 0,05 B. merycicum 805III2 Výkaly telat 0,310 ± 0,08 0,175 ± 0,05 B. merycicum J3II Výkaly jeh at 0,368 ± 0,05 0,368 ± 0,05

Pod kování:Práce byla sponzorována granty MSM 6046070901 a GA R 525/08/H060.

Literatura1. Field C.J. (2005): The immunological components of human milk and their effect on immune

development in infants. Journal of Nutrition. 135, 1-4. 2. Lönnerdal B. (2003): Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. American Journal

of Clinical Nutrition. 77, 1537S-1543S. 3. Kozáková D., Holubová J., Plocková M., Chumchalová J., urda L. (2005): Impedance measurement of

growth of lactic acid bacteria in the presence of nisin and lysozyme. European Food Research and Technology. 221, 774-778.

4. Scharfen E.C., Mills D.A., Maga E.A. (2007): Use of human lysozyme transgenic goat milk in cheese making: effect on lactic acid bacteria performance. Journal of Dairy Science. 90, 4084-4091.

5. Gagnon M., Kheadr E.E., Le Blay G., Fliss I. (2004): In vitro inhibition of Escherichia coli O157:H7 by bifidobacterial strains of human origin. International Journal of Food Microbiology. 92, 69-78.

6. Clare D.E., Catignani G.L., Swaisgood H.E. (2003): Biodefense properties of milk: the role of antimicrobial proteins and peptides. Current Pharmaceutical Design. 9, 1-17.

7. Vlková E., Nevoral J., Jencikova B., Kope ný J., Godefrooij J., Trojanová I., Rada V. (2005): Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods. Journal of Microbiological Methods. 60, 365-373.

Kontaktní adresa:Martina Šmehilová,Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, eská zem d lská univerzita v Praze,Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol smehilova@af.czu.cz

107

P EŽÍVÁNÍ BIFIDOBAKTERIÍ V KRAVSKÉM MLÉCE Tománková Eva, Homutová Iva, Šmehilová Martina, Dubná So a, Rada Vojt ch

eská zem d lská univerzita v Praze, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky

Survival of bifidobacteria in cow milk

Summary:New probiotic bacteria were selected by their physiological and technological properties. One of important technological characteristics is ability to survive in cow milk. Hence, the aim of our work was to test ability of human bifidobacteria to ferment cow milk and survive in this condition. Bifidobacteria were isolated from human faecal samples and commercial probiotic products by modified TPY agar, isolates were identified by biochemical test, FISH and PCR. Sensitivity to low pH and bile was tested and auto-aggregation characteristics were measured. Four human origin strains and 4 strains isolated from probiotic product (two of them were human and two animal origin) were tested for their ability to ferment cow milk and survive in fermented milk in aerobic and anaerobic condition in 4 °C. All strains tested fermented cow milk reaching counts from 7.80 to 9.63 log CFU/ml. Human origin bifidobacteria survived for 3-6 week in anaerobic and maximum for 3 week in aerobic storage condition. Animal origin strains were survived in both trials in counts higher than 106 CFU/ml for 12 weeks at least. Human origin strains showed very good physiological properties, were able to fermented cow milk, but their surviving in fermented milk products was poor. It could be concluded that human origin bifidobacteria with better technological features for probiotic use should be selected.

ÚvodTrávicí trakt teplokrevných živo ich v etn lov ka je osídlen velmi komplexní

mikroflórou, která má zásadní vliv na zdravotní stav hostitele. Sou ástí normální st evní mikroflóry dosp lého lov ka je více než 500 r zných druh bakterií (1), dominantní jsou fakultatinv a obligátn anaerobní bakterie rod Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Clostridium,Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Escherichia, Enterobacter, Enterococcus,Klebsiella a Lactobacillus (2, 3).

Pro úpravu rovnováhy gastrointestinální mikroflóry nap íklad po antibiotické lé b ,pr jmových a jiných onemocn ní trávicího traktu, jsou používána probiotika, asto se jedná o bifidobakterie (4). Bifidobakterie jsou grampozitivní, nepohyblivé, sacharolytické, pleomorfní, striktn anaerobní, nesporulující, sacharolytické ty inky (5), které p ízniv ovliv ují zdravotní stav svého hostitele. Produkcí silných organických kyselin snižují pH tráveniny tlustého st eva,ímž potla ují hnilobné bakterie, snižují hladinu sérového cholesterolu v krvi, mají

antikancerogenní aktivitu, napomáhají p i aktivaci imunitního systému a produkují vitamíny skupiny B (1).

K tomu, aby mohlo docházet k pozitivnímu p sobení na p irozenou mikroflóru st evaexogenními bakteriemi, je nutné, aby tyto mikroorganizmy po požití hostitelem prošly celým trávicím traktem až do st eva v neporušeném stavu s vysokou vitalitou. Tzn., musí odolávat velice nízkým hodnotám pH v žaludku, ú ink m žlu ových kyselin a p sobení trávicích enzym .Probiotické bakterie by m ly být schopny adherovat na st evní epitel hostitele a dlouhodobp ežívat v trávicím traktu, pop ípad trávicí trakt trvale kolonizovat. Používané probiotické mikroorganizmy musí být všeobecn uznávané jako bezpe né a bez zdravotních rizik pro hostitele, m ly by vykazovat antagonistickou aktivitu v i patogenním a potenciáln patogenním mikroorganizm m a m ly by celkov pozitivn ovliv ovat zdraví hostitele. Probiotické bakterie musí spl ovat také technologická kritéria, musí být tedy schopné ve vysokých po tech p ežívat procesy, kterými prochází p i p íprav do podoby vhodné pro konzumenta. M ly by odolávat p sobení kyslíku, v p ípad , že jsou podávány v podob mlé ných kysaných výrobk , musí dlouhodob p ežívat p i nízkých hodnotách pH a musí dob e snášet lyofilizaci. Dále by m ly mít dobré senzorické vlastnosti a musí být rezistentní k bakteriofágovým infekcím (6, 7). V tšina druhbifidobakterií je hostitelsky specifická a do výrobk ur ených pro lidskou výživu by tedy m ly být p idávány kmeny výhradn humánního p vodu. Protože ada v sou asné dob používaných probiotik tato kritéria nespl uje (8), je nutné vyvinout vhodné a citlivé metody stanovení, charakterizace a identifikace bifidobakterií trávicího traktu lidí a ur it kmeny vhodné jako

108

probiotikum. Cílem naší práce bylo testování schopnosti bifidobakterií izolovaných z trávicího traktu lidí prokysávat kravské mléko a p ežívat v tomto prost edí.

Materiál a metodyKmeny bifidobakterií byly izolovány ze vzork stolice kojenc a dosp lých

dobrovolník pomocí modifikovaného TPY agaru (MTPY; Sharlau, Špan lsko) s p ídavkem mupirocinu (100 mg/l) a acetátu v koncentraci 1 ml/l (9). Izoláty byly identifikovány na úroverodu na základ detekce pro bifidobakterie specifického enzymu fruktózo-6-fosfát fosfoketolázy, metodou podle Orban a Patterson (10) v porovnání s rodov specifickou PCR (11) a metodou fluorescen ní in situ hybridizace (kit pro kvalitativní stanovení Bifidobacterium sp., RiboTechnologies, Holandsko). Pro druhovou identifikaci byly kmeny charakterizoványsoupravami API 50 CHL a Rapid ID 32 A (BioMérieux, Francie). Vlastní identifikace byla provedena na základ výsledk t chto test po íta ovým programem Bacter (http://kounou.lille.inra.fr:8080/Identification/index.html, Lille, Francie). Výsledky identifikace byly potvrzeny druhov specifickou PCR (12, 13).

Vybrané izoláty bifidobakterií byly testovány na schopnost odolávat žlu i a kyselému prost edí podle Mättö et al. (14). Suspenze bun k byla smíchána s fosfátovým pufrem s pH upraveným na hodnotu 3 pomocí HCl pro tetování tolerance k nízkému pH a s pufrem s p ídavkemžlu e (1,5 %) pro testování odolnosti bifidobakterií k žlu i. Suspenze bun k byla o kována také do fosfátového pufru s pH 7,2 pro kontrolu. Takto p ipravené suspenze byly anaerobn inkubovány ve vodní lázni p i teplot 37 °C. Po ty bun k byly stanoveny po 1 a 2 hodinách (tolerance k nízkému pH), 2 a 3 hodinách (tolerance ke žlu i) a 0, 2, a 3 hodinách (kontrola) pomocí deskové metody s použitím TPY agaru (ADSA, Špan lsko). Ze stanovených hodnot byl vypo ítán úbytek bun k b hem inkubace v testovaných prost edích.

Byly sledovány autoagrega ní vlastnosti izolát bifidobakterií. Bu ky schopné autoagregace vytvá ejí viditelné shluky, které se usazují na dn zkumavky, kultury bakterií neschopné agregace se vyzna ují trvalým zákalem. P es noc narostlá kultura bifidobakterií byla p elita do zkumavky, dob e promíchány a ponechány v klidu, z vrchní ásti byla po 5 hodinách odebrána suspenze a byl m en její zákal (O.D.) p i vlnové délce 600 nm. Schopnost autoagregace byla vyjád enav procentech a vypo tena z následujícího vztahu: A = [1 – (O.D./ O.D.0) x 100], kde O.D. je zákal na konci m ení a O.D.0 zákal na po átku m ení (15).

Byly vybrány 4 kmeny bifidobakterií s autoagrega ními vlastnostmi, odolávající nízkému pH a žlu i a byla testována jejich schopnost prokysávat kravské mléko a p ežívat v kysaném mléce. Bifidobakteriemi bylo zao kováno kravské mléko (10 g sušeného odtu n ného kravského mléka/100 ml vody), které bylo 20 minut vyva eno ve vodní lázni a následn hermeticky uzav eno nebo p ekryto hliníkovou folií. Kultivace probíhala 24 hodin p i 37 °C. Po prokysání byl kultiva nstanoven po et bifidobakterií na TPY agaru (Sharlau, Špan lsko), mléko bylo skladováno v aerobních (Erlenmajerova ba ka p ekrytá hliníkovou folií) a anaerobních (hermeticky uzav ené vialky) podmínkách p i 4 °C. Po ty bifidobakterií byly stanoveny v týdenních intervalech. V porovnání s izoláty lidského p vodu byly na p ežívání v kravském mléce testovány také bifidobakterie izolované z komer n dostupných probiotických výrobk . Tyto kmeny byly identifikovány stejným zp sobem jako bakterie lidského p vodu.

Výsledky a diskusePro testování schopnosti bifidobakterií izolovaných z trávicího traktu lidí prokysávat

kravské mléko a p ežívání v tomto prost edí byly vybrány kmeny s dobrými fyziologickými vlastnostmi, u kterých p edpokládáme schopnost pr chodu trávicím traktem ve vysokých po tech.Vybrané izoláty vykazovaly v tší citlivost k nízkému pH než ke žlu i. Po t ech hodinách inkubace v prost edí s 1,5 % žlu i neklesl po et bifidobakterií ani o jeden ád. P i inkubaci kmen v prost edí s pH 3 došlo k poklesu maximáln o dva ády, u kmene B. bifidum JKM byl zaznamenán pokles pouze 0,05 log KTJ/ml. Kmeny lidského p vodu navíc vykazovaly silnou autoagrega ní aktivitu, která se pohybovala od 70 do 80 %. Autoagrega ní vlastnosti jsou spojovány se schopností kmen

109

adherence na st evní epitel, existuje tedy p edpoklad, že tyto kmeny by mohly trvale kolonizovat trávicí trakt hostitele.

Výsledky identifikace bifidobakterií izolovaných ze stolice kojenc a dosp lýchdobrovolník a z probiotických výrobk jsou uvedeny v tabulce íslo I. Z komer níchprobiotických lyofilizovaných prášk byly izolovány kmeny lidského p vodu, z jogurt to byly druhy B. pseudolongum a B. animalis ssp. lactis, tedy kmeny pravd podobn p vodu animálního.

Tabulka I Výsledky identifikace bifidobakterií.

rodová identifikace druhová identifikace kmen p vod

F6PPK FISH PCR API + Bacter PCR

JOV kojenec + + + B. bifidum B. bifidum

EV2 dosp lý + + + B. bifidum B. bifidum

JKM kojenec + + + B. bifidum B. bifidum

TP1 kojenec + + + B. longum B. longum

BM probiotikum + + + B. bifidum B. bifidum

BV probiotikum + + + B. longum B. longum

DN jogurt + + + B. pseudolongum B. pseudolongum

BB jogurt + + + B. animalis B. lactis

Všechny testované kmeny (Tabulka I) byly schopny dob e prokysávat kravské mléko, po ty bifidobakterií se pohybovaly od 7,80 do 9,12 log KTJ/ml p i kultivaci v Erlenmajerových ba kách p ikrytých hliníkovou folií (aerobní prost edí) a od 7,69 do 9,63 log KTJ/ml p i kultivaci v uzav ených vialkách (anaerobní prost edí). Po ty bifidobakterií stanovené v mléce po kultivaci ob ma metodami se statisticky významn nelišily.

Množství bifidobakterií stanovené b hem skladování je znázorn no na obrázcích 1 a 2. Bifidobakterie p ežívaly v kravském kysaném mléce déle p i skladování v anaerobních podmínkách (obrázek 1) než p i skladování v podmínkách aerobních (obrázek 2). Kmeny lidského p voduizolované p ímo ze vzork stolice i izoláty z probiotických výrobk p ežívaly v anaerobních podmínkách 3 až 6 týdn . Kmeny B. pseudolongum DN a B. animalis ssp. lactis BB izolované z jogurt , které byly p vodn pravd podobn izolované z trávicího traktu zví at, byly detekovány v po tech vyšších než 106 KTJ/ml po dobu 12 týdn a to jak p i skladování v aerobních i anaerobních podmínkách. Bifidobakterie lidského p vodu p ežívaly v kravském mléce maximáln3 týdny p i aerobním skladování, po ty vyšší než 106 KTJ/ml byly zaznamenány pouze po 1 týdnskladování. Jeden kmen dosahoval t chto po t po 2 týdnech skladování.

110

Obr. 1. Po ty bifidobakterií v kysaném kravském mléce stanovené b hemskladování v anaerobních podmínkách.

Obr. 2. Po ty bifidobakterií v kysaném kravském mléce stanovené b hemskladování v aerobních podmínkách.

V kravském mléce p ežívaly výrazn lépe bifidobakterie animálního p vodu než kmeny p vodn izolované z trávicího traktu lov ka. Jedná se z ejm o jeden z d vod , pro jsou do potravin s p ídavkem probiotických bakterií používány kmeny izolované z trávicího traktu zví at (8, 16). Testované kmeny vykazovaly velmi dobré fyziologické vlastnosti, ale jejich použití do mlé ných kysaných výrobk je nevhodné. Testované kmeny sice dob e prokysávají kravské mléko, ale nejsou schopny v tomto prost edí dlouhodob p ežívat. Vzhledem k tomu, že testované bifidobakterie vykazovaly vysokou odolnost k nízkému pH, je jejich pokles p i skladování zp sobený zejména p sobením vzdušného kyslíku než obsahem organických kyselin v kysaném mléce.

111

Záv rByla vybrána ada kmen bifidobakterií izolovaných z trávicího traktu lidí s vhodnými

fyziologickými vlastnostmi, které by mohly být testovány jako nové probiotikum pro lov ka. Naše výsledky ovšem ukazují, že tyto kmeny nejsou schopny dlouhodob p ežívat v kysaném kravském mléce. Z technologického hlediska se tedy jedná o nevhodné kmeny a do budoucna je nutné hledat další izoláty bifidobakterií, které by spl ovaly i technologická kriteria kladená na probiotické bakterie.

Pod kování:Práce byla sponzorována granty MSM 6046070901 a GA R 525/08/H060.

Použitá literatura:1. Leahy S.C., Higgins D.G., Fitzgerald G.F., van Sinderen D.: Getting better with bifidobacteria. J Appl

Microbiol. 98, 1303-1315, 2005. 2. Orrhage K., Nord C.E.: Bifidobacteria and lactobacilli in human health. Drugs Explt Clin Res. 26, 95-

111, 2000. 3. Vaughan E.E., Schut F., Heilig H.G., Zoetendal E.G., de Vos W.M., Akkermans A.D.: A molecular view

of the intestinal ecosystem. Curr Issues Intest Microbiol. 1, 1-12, 2000. 4. Tannock G.W (ed): Probiotics and Prebiotics - where are we going? p. 333, IBT Global, Norflok,

England, 2002. 5. Scardovi V.: Genus Bifidobacterium, pp. 1418-1434 in P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, J.G. Holt

(eds.): Bergey's "Manual of Systematic Bacteriolgy". Williams and Wilkins. Baltimore, 1986. 6. Biavati B., Vescovo M., Torriani S., Bottazzi V.: Bifidobacteria: history, ecology, physiology and

applications. Ann Microbiol. 50, 117-131, 2000. 7. Sheil B., Shanahan F., O’Mahony L.: Probiotic effects on inflammatory bowel disease. J Nutr. 137,

819S-824S, 2007. 8. Vlková E., Rada V., Trojanová I.: Enumeration, isolation and identification of bifidobacteria from dairy

product. Acta Agriculturae Slovenica. 84, 31-36, 2004. 9. Rada V., Petr J.: A new selective medium for the isolation of glucose nonfermenting bifidobacteria from

hen caeca. J Microbiol Meth. 43, 127-132, 2000. 10. Orban J.I., Patterson J.A.: Modification of the phosphoketolase assay for rapid identification of

bifidobacteria. J Microbiol Meth. 40, 221-224, 2000. 11. Kok R.G., De Wall A., Schut F., Welling G.W., Weenk G., Hellingwerf K.J.: Specific detection and

analysis of a probiotic Bifidobacterium strain in infant feces. Appl Environ Microbiol. 60, 3668-3672, 1996.

12. Matsuki T., Watanabe K., Tanaka R., Fukuda M., Oyaizu H.: Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers. Appl Environ Microbiol. 65, 4506-4512, 1999.

13. Ventura M., Reniero R., Zink R.: Specific identification and targeted characterization of Bifidobacterium lactis from different environmental isolates by a combined multiplex-PCR approach. Appl Environ Microbiol. 67, 2760-2765, 2001.

14. Mättö J., Malinen E., Suihko M.L., Alander M., Palva A., Saarela M.: Genetic heterogeneity and functional properties of intestinal bifidobacteria. J Appl Microbiol. 97, 459-470, 2004.

15. Del Re B. Sgorbati B., Miglioli M., Palenzola D.: Adhesion, autoaggregation and hydrophobicity of 13 strains of Bifidobacterium longum. Lett Appl Microbiol. 31, 438-442, 2000.

16. Salminen S.J., Gueimonde M., Isolauri E.: Probiotics that modify disease risk. J Nutr. 135, 1294-1295, 2005.

Kontaktní adresa:Eva Tománková, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, eská zem d lská univerzita v Praze,Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, tomankova@af.czu.cz

Plakátová sd lení

115

SLEDOVÁNÍ VÝSKYTU PSYCHROTROFNÍCH MIKROORGANISMV SYROVÉM MLÉCE

Hoferková Petra, Košinová Marcela, Burdychová Radka Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn

Monitoring occurence of psychrotrophic microorganisms in raw milk

Summary:The group of psychrotrophic microorganisms belongs to the microorganisms representing a risk for human health as well as a risk of milk and milk products spoilage. Some genus are considered to be significant producers of proteolytic and lipolytic enzymes. In this work, we analysed raw milk samples originated from 6 diffrent suppliers from the area of North and Middle Moravia. The screening was performed from january to december 2007. For isolation and enumeration of psychrotrophic bacteria cultivation method described by SN ISO 6730 was used. Isolated strains were inoculated on blood agar, analysed microscopically and identified by biochemical tests and genus-specific PCR. All identified bacterial strains were tested for ability to produce proteolytic and lipolytic enzymes. Higher numbers of psychrotrophic microorganisms were detected in summer months. The most commonly identified genus in raw milk was of the genus Pseudomonas, less frequently the genus Bacillus, Flavobacterium and Alcaligenes. The ability to produce proteases and lipases was found at all identified bacterial strains.

ÚvodMezi nejvýznamn jší zem d lskou a potraviná skou komoditu pat í mléko, které hraje

významnou roli ve výživ lidí. Kvalita mléka a výrobk z mléka se za íná odvíjet od hygienických podmínek a technologického vybavení zem d lské prvovýroby, p es svoz mléka, p íjem mléka v mlékárenském závod až po samotný technologický proces zpracování na sortiment mléka a mlé ných výrobk 2.

Mezi mikroorganismy zp sobující krom zdravotních rizik i rizika vad mléka a mlé nýchvýrobk pat í i skupina psychrotrofních mikroorganism 7. Nej ast jšími zástupci psychrotrofních mikroorganism v syrovém mléce jsou gramnegativní bakterie rod Pseudomonas, Alcaligenes,Achromobacter, Aeromonas, Serratia, Chromobacterium a grampozitivní bakterie rod Bacillus,Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus a Microbacterium9.

Psychrotrofní mikroorganismy se dostávají do mléka primárn z krmiv, prachu a z kontaminované vody. Nejvýznamn jším sekundárním zdrojem psychrotrofních mikroorganismjsou nedostate n išt né a dekontaminované plochy, které se stýkají s chlazeným mlékem, potrubí a chladící nádrže, ve kterých se mléko sou asn chladí4. Psychrotrofní mikroorgnismy jsou schopné r stu a metabolických projev i p i nízkých teplotách, kolem 4 ºC. P i této teplot je mléko uchováváno v mlé nicích, p i p eprav ke zpracovateli i v dob skladování a distribuce hotových výrobk . Vzhledem k tomu, že nízké teploty neinhibují tvorbu a innost enzymatických systémproteas a lipas, m že dojít ke zm nám struktur bílkovin a tuk , zvlášt pak po delší dob skladování surovin a produkt 13.

Cílem této práce bylo sledování výskytu psychrotrofních mikroorganism v syrovém mléce a jejich identifikace pomocí kultiva ních, biochemických a molekulárn -biologických metod.

Materiál a metodika V této práci byly analyzovány vzorky syrového mléka, které pocházely od 6 r zných

dodavatel z oblasti severní a st ední Moravy. Vzorky syrového mléka byly odebírány podle normy SN ISO 707. Celkový po et mikroorganism (CPM) byl stanoven podle normy SN ISO 6610.

Pro izolaci a zjišt ní po tu psychrotrofních bakterií byla použita kultiva ní metoda, popsaná normou SN ISO 6730, kultivace probíhala na živné p d PCA se sušeným mlékem (NOACK,

R) p i teplot 6,5 oC po dobu 10 dn . Izolované kmeny byly vyo kovány na krevní agar, mikroskopicky hodnoceny (Gramovo barvení) a identifikovány pomocí biochemických test(kataláza test, ENTEROtest 16, NEFERMtest 24, ONP a OXI test (Lachema, R) a pomocí rodov -specifických PCR. Pro stanovení proteolytické aktivity byl použit Nutrient Gelatin agar

116

(HiMedia, Indie). Lipolytická aktivita byla stanovena na Spirit Blue agaru (HiMedia, Indie) a Tributyrin agaru (HiMedia, Indie).

U statisticky významného po tu izolát byla provedena molekulárn biologická identifikace zastoupených rod psychrotrofních mikroorganism . Z dob e narostlých mikrobiálních kultur vybraných psychrotrofních bakterií byla izolována DNA. Standardní manipulace s DNA byla provedena podle Sambrooka a Russella8 a Ausubela a kol.1 Kvalita DNA byla ov ena pomocí gelové elektroforézy v agarózovém gelu, po obarvení fluorescen ním barvivem ethidium bromidem byla DNA detekována zá ením v UV sv tle.

PCR byla provedena pro rod Pseudomonas podle metody, kterou uvádí Gunasekera a kol.5a pro rod Bacillus podle návodu, který popisuje Wu a kol.15

Výsledky a diskuseV období od ledna do prosince 2007 bylo vyšet eno celkem 72 vzork syrového mléka.

Celkový po et psychrotrofních mikroorganism (CPP) byl sledován v závislosti na celkovém po tumikroorganism , což uvádí graf . 1 (Obr. 1). Hodnoty CPM se pohybovaly v rozmezí od 7,0.103

do 8,3.106 CFU/ml a CPP od 1,0.103do 8,2.106 CFU/ml. Mléko získané za dobrých hygienických podmínek oby ejn obsahuje mén než 10% psychrotrofních mikroorganism z celkového po tumikroorganism , který nep esahuje 104 v 1 ml3. Po et kolonií nad 105 v 1 ml signalizuje nevyhovující podmínky získávání mléka6. Vyšší po ty CPM a CPP byly stanoveny v jarních a letních m sících, což koreluje s výsledky, které uvádí ve své studii Vylet lová a kol.14.

Obr. 1. Srovnání CPM a CPP v jednotlivých m sících roku 2007

P evážnou v tšinu izolát CPP tvo il typický p edstavitel technologických problém – bakterie rodu Pseudomonas (62%). Bakterie rodu Bacillus tvo ily 37% izolát (Obr. 2). Pseudomonády se ú astní kažení mléka a mlé ných výrobk tím, že produkují extracelulární termostabilní proteolytické a lipolytické enzymy10. Pseudomonas je tak z hlediska možnosti mikrobiologické kontaminace v prvovýrob i p i zpracování mléka technologicky nejvýznamn jšímpotenciálním kontaminantem12, což je v kontrastu s USA, kde bývá na první místo azen spory tvo ící druh Bacillus11. V malé mí e byly identifikovány rody Flavobacterium a Alcaligenes.

0200000400000600000800000

100000012000001400000

Lede

n

Úno

r

Bez

en

Dub

en

Kvte

n

erve

n

erve

nec

Srpe

n

Záí

íjen

List

opad

Pros

inec

M síc

Poet

mik

roor

gani

sm [C

FU/m

l]

CPM

CPP

117

Obr. 2. Srovnání výskytu izolát rodu Pseudomonas a Bacillus ze syrového mléka

Záv rV pr b hu roku 2007 byly po ty CPM a CPP nejvyšší v jarních a letních m sících. Pomocí

rodov specifické PCR bylo 62% identifikovaných izolát za azeno do rodu Pseudomonas a 37% k rodu Bacillus.

Použitá literatura:1. AUSUBEL, F. M., BRENT, R., KINGSTON, R. E., MOORE, D. D., SEIDMAN, J. G., SMITH, J. A.,

STRUHL, K. Current Protocols in Molecular Biology. 1st. ed. New York : Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1994. 350 p.

2. BURDOVÁ, O., BARANOVÁ, M. Sanita ní režim v po nohospodárskej prvovýrobe a jeho vplyv na asociáciu mikroorganizmov mlieka. Mliekarstvo, 2005, ro . 36, . 3, s. 11-15.

3. BURDOVÁ, O., BARANOVÁ, M. Vplyv technologicky nežiadúcej mikroflóry na kvalitu mlieka a mlie nych výrobkov. Mliekarstvo, 2005, ro . 36, . 2, s. 18-20.

4. G RNER, F., VALÍK, . Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava : Malé centrum, 2004. 528 s.

5. GUNASEKERA, T. S., DORSCH, M. R., SLADE, M. B., VEAL, D. A. Specific detection of Pseudomonas spp. in milk by fluorescence in situ hybridization using ribosomal RNA directed probes. Journal of Applied Microbiology, 2003, vol. 94, no. 5, p. 936-945.

6. LUKÁŠOVÁ, J., HOLEC, J., RYŠÁNEK, D., OSTRÝ, V. Hygiena a technologie produkce mléka.1.vyd. Brno : Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 1999. 101 s.

7. MARTH, E. H., STEELE, J. L. Applied Dairy Microbiology. 2nd. ed. New York : Marcel Dekkr, 2001.736 p.

8. SAMBROOK, J., RUSSELL, I. Molecular Cloning: A Laboratory Manual II., 3rd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press : New York, 2001. 2344 p.

9. SORHAUG, T., STEPANIAK, L. Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy products: quality aspects. Trends in Food Science and Technology, 1997, vol. 8, no. 2, p. 35–41.

10. STEPANIAK, L. Dairy enzymology. International Journal of Dairy Technology, 2004, vol. 57, no. 2-3, p. 153-166.

11. STEVENSON, G., ROWE, M., WISDOM, B., KILPATRICK, D. Growth kinetics and hydrolytic enzyme production of Pseudomonas spp. isolated from pasteurized milk. Journal of Dairy Research,2003, vol. 70, no. 3, p. 293-296.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

Pseudomonas Bacillus

Rod

Výsk

yt

118

12. VYLET LOVÁ, M., HANUŠ, O. Vliv kontaminace Pseudomonas fluorescens na hlavní složky a technologické vlastnosti pasterizovaného mléka b hem skladování. Czech Journal of Food Sciences,2000, vol. 18, no. 6, p. 224-234.

13. VYLET LOVÁ, M., BENDA, P., HANUŠ, O., KOPUNECZ, P. Stanovení celkového po tupsychrotrofních bakterií v bazénových vzorcích mléka a jejich vztah k celkovému po tumikroorganism . Czech Journal of Food Sciences, 1999, vol. 17, no. 6, p. 216-222.

14. VYLET LOVÁ, M., HANUŠ, O., URBANOVÁ, E., KOPUNECZ, P. Výskyt a identifikace psychrotrofních bakterií s proteolytickou a lipolytickou aktivitou v bazénových vzorcích mléka v podmínkách technologií prvovýrobního uskladn ní. Veteriná ství, 1999, ro . 49, . 11, s. 480-482.

15. WU, X. Y., WALKER, M. J., HORNITZKY, M., CHIN, J. Development of a group-specific PCR combined with ARDRA for the identification of Bacillus species of environmental significance. Journal of Microbiological Methods, 2006, vol. 64, no. 1, p. 107-119.

16. SN ISO 6610 Stanovení po tu jednotek mikroorganism tvo ících kolonie. Technika po ítání kolonií vykultivovaných p i 30 °C.

17. SN ISO 6730 Stanovení po tu jednotek tvo ících kolonie psychrotrofních mikroorganism . Technika po ítání kolonií vykultivovaných p i 6,5 °C.

18. SN ISO 707 Sm rnice pro odb r vzork .

Kontaktní adresa:Mgr. Petra Hoferková, Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno, p.hoferkova@seznam.cz Ing. Radka Burdychová Ph.D., Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno, burdycho@node.mendelu.cz

119

STANOVENIE MEZOFILNÝCH A PSYCHROTROFNÝCH AERÓBNYCH SPORULUJÚCICH MIKROORGANIZMOV V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU

Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír Slovenské centrum po nohospodárskeho výskumu, Výskumný ústav živo íšnej výroby, Nitra, SR

Estimation of mesophylic and psychrotrophic aerobe sporulating microorganisms in raw cow's milk

Summary:The occurrence of mesophilic and psychrotrophic aerobic sporulating microorganisms (MPAS) in raw cow’s milk (RCM) was studied. 294 samples of raw cow’s milk in 14 farms were taken during one year. Basis of the method for MPAS assessment is to inactivate the milk sample at the temperature 80–82°C for 30 minutes and incubation in cultivation dishes at 30°C for 3 days – mesophilic aerobic sporulates (MAS), and at 7°C for 10 days – psychrotrophic aerobic sporulates (PAS). Results of studied microbiological parameters characterize the studied milk as complying with requirements of the EU regulation 92/46 and standard STN 57 0529. Mesophilic and psychrotrophic aerobic sporeforming microorganisms count (MPAS) ranged from 2.5 to 340 CFU.ml-1. Average value of MPAS was 59.4 CFU.ml-1 and variation coefficient 93.1 %. Count up to 50 CFU.ml-1 was in 55.4% samples, in 85% was the value not higher than 100, and in 3.1% samples was the count of MPAS higher than 200. MPAS count found in the same dishes at incubation for mesophilic and subsequently strictly psychrophilic microorganisms (MAS + SPAS) was on average 56.9 CFU.ml-1, it represents 95.8 % out of the number of sums of individual dishes at two temperatures. Correlation coefficient of these two types of results r = 0.99 gives evidence of close dependence that is expressed by linear regression equation y = x - 2.5056. Use of two incubation temperatures one after another with identical set of dishes enables to exclude overestimation of results with sporulates able to grow at both incubation temperatures.

ÚvodV záujme o najviac uchova pôvodný charakter mlieka a biologicky aktívnych látok v om

obsiahnutých, je snaha používa o najšetrnejšie spôsoby ošetrenia surového kravského mlieka, rôzne kombinácie teploty a asu tak, aby sa zachovala jeho biologická hodnota, pri sú asnom zabezpe ení jeho mikrobiologickej neškodnosti a o možno najdlhšej trvanlivosti. Platí preto, že ím menšia je kontaminácia suroviny, tým vä šia je pravdepodobnos dosiahnutia požadovanej trvanlivosti mliekarenských produktov.

Najvýznamnejšou sú as ou nežiadúcich baktérií sú spórotvorné mikroorganizmy, ktoré sú v aka schopnosti tvorby termorezistentných spór schopné prežíva tepelné ošetrenie a prenika tak do finálnych výrobkov. Spórotvorné mikroorganizmy sú striktne anaeróbne, rod Clostridium,ktoré spôsobujú problémy predovšetkým pri dlhodobom zrení syrov, tzv. neskoré nadúvanie, alebo sú fakultatívne anaeróbne, teda pomnožujú sa za aeróbnych i anaeróbnych podmienok, rod Bacillus, ktorý má vä ší význam pre výrobu konzumného mlieka a erstvých mlie nychvýrobkov. V pasterizovanom mlieku a smotane psychrotrofný Bacillus cereus spôsobuje defekt sladkého zrážania, a v zahus ovanom mlieku rast Bacillus subtilis a Bacillus coagulans spôsobuje nežiadúcu koaguláciu bielkovín. Sú to indikátory mikrobiologickej kvality balených výrobkov s dlhodobou trvanlivos ou. Spóry prežívajúce pasterizáciu obmedzujú dobu možného skladovania a skracujú termíny spotreby mlie nych potravín.

Odber fázových vzoriek mlieka po as celého procesu výroby trvanlivého, tzv.UHT (ultra high temperature) mlieka (tepelné ošetrenie 138°C trvajúce 4 sekundy) a identifikácia pomocou ribotypizácie, biochemických a fyziologických testov a charakteristika izolovaných kme ov rodu Bacillus sved ia o ich prieniku touto technológiou [7]. V mlieku ošetrenom technológiou HTST (high temperature-short time) bol v de výroby zistený výskyt spór schopných revitalizácie v po te 0,15–1,1.ml-1 [4]. Kvantitatívna analýza rastu B. cereus v pasterizovanom mlieku [1] potvrdzuje, že po et dní potrebných na dosiahnutie hygienicky nežiaduceho limitu 104 KTJ.ml-1 závisí od chladotolerantnosti, po tu kontaminujúcich spór a od teploty skladovania produktu, ktorá pri požadovanej trvanlivosti 5 dní nemá by vyššia ako 7°C, optimálne 6 – 4°C. Podobné rastové parametre boli pozorované v ultrapasterizovanom mlieku a smotane s trvanlivos ou 3 mesiace, kde genera ný as B. cereus pri 8°C bol približne 30 hodín, pri 13°C okolo 3 hodín [6].

120

Po et spór je možné ovplyvni obmedzením kontaminácie mlieka ur eného na spracovanie. V prvovýrobe mlieka a pri procese jeho získavania je preto obzvláš nevyhnutné, aby sa do mlieka dostalo o najmenej spór mikroorganizmov. Treba sa zamera na kritické miesta možnej kontaminácie v procese manipulácie s mliekom a zavies takú technologickú disciplínu, aby sa riziko minimalizovalo cestou hygienického programu HACCP. Pre riešenie tohto technologického problému by mohol vyhovova nasledovný konven ný ukazovate . Tepelná inaktivácia pri stanovení mezofilných a psychrotrofných aeróbnych mikroorganizmov (MPAS), a to 82°C po as 30 min., a kultivácia pri aeróbnych podmienkach umož uje užšie sa zamera na pasterizáciu prežívajúce spóry spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov, prevažne rod Bacillus. Použitímdvoch inkuba ných teplôt, 30°C a 7°C, zistíme po et mezofilných i psychrofilných druhov. Zúženie pojmu oproti termorezistentným mikroorganizmom umož uje i sprísnenie tohto kritéria na navrhovaný po et max. 200 KTJ v 1 ml mlieka.[3].

Pri monitorovaní hygienickej kvality mlieka a zis ovaní hladín MPAS v bazénových vzorkách sme sa zaoberali aj vhodnos ou poradia kultiva ných teplôt a vz ahom zisteného po tu aeróbnych sporulátov k výsledkom získaným pri postupe s oboma kultiva nými teplotami.

Materiál a metódyPráca nadväzuje na príspevok z roku 2007, ktorého cie om bol celoro ný monitoring

bakteriálnej kontaminácie mlieka. 294 bazénových vzoriek mlieka odobratých na 14 podnikoch v priebehu celého roka sme použili na štúdium výskytu aeróbnych sporulátov. Metodický postup stanovenia po tu MPAS [2] za ína inaktiváciou vegetatívnych foriem mikroorganizmov, záhrevom vzorky mlieka pri teplote 80-82°C po dobu 30 min., nao kovaním 1ml na kultiva nú Petriho misku a zaliatím živnou pôdou GTK (agar s glukózou, tryptónom a kvasni ným extraktom), obohatenou o 0.1% škrobu. alej je možné inkubova nao kované misky pri (30 ± 1)°C 3 dni – mezofilné sporuláty (MAS), a iné misky pri (6,5 ± 0,5)°C 10 dní – psychrotrofné sporuláty (PAS), alebo použi obe kultiva né teploty pre tie isté misky za sebou, o by malo takú výhodu, že kolónie rastúce pri oboch teplotách by neboli do kone ného výsledku zapo ítané duplicitne. V snahe riešitúto metodickú otázku sme misky pre stanovenie MAS po od ítaní a ozna ení kolónií inkubovali

alej pri 6.5°C po dobu 10 dní v chladni ke na zistenie po tu striktne psychrotrofných aeróbnych sporulátov (SPAS), ktoré pri 30°C nevytvorili kolónie.

Výsledky a diskusiaVýsledky inkubácie kultiva ných misiek spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov sú uvedené v tabu ke I.

Tabu ka I Výsledky inkubácie kultiva ných misiek spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov KTJ.ml-1 Priemer Minimum. Maximum. Var. koef. % MAS 54.0 2 330 99,9 PAS 5.4 0 28 106 SPAS 2.9 0 28 146 MAS + PAS 59.4 2.5 341 93 MAS + SPAS 56.9 2.5 346 98

Po et mezofilných aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov (MAS) bol v rozmedzí od 2 do 330 KTJ.ml-1 s priemernou hodnotou 54 KTJ.ml-1 s varia ným koeficientom Vk = 99.9 %. Pod a histogramu v tabu ke II, poukazujúceho na 61.2 % vzoriek v kategórii s po tomdo 50 KTJ.ml-1 a iba 3.1 % vzoriek nevyhovujúcich, s po tami nad 200 KTJ.ml-1, sa tieto výsledky javia z matematického h adiska ako nevýznamné po ty vo vz ahu k celkovej mikroflóre. Vzh adom na to, že táto skupina mikroorganizmov sa tepelným ošetrením mlieka pred spracovaním na mlie ne potraviny neeliminuje, majú aj zdanlivo nízke po ty MAS závažné negatívne dôsledky pre kvalitu a skladovate nos mlie nych potravín [1].

121

Psychrotrofné aeróbne spórotvorné mikroorganizmy (PAS) mali v sledovanom súbore po ty od 0 do 28, v priemere 5.4 KTJ.ml-1. 63.6 % vzoriek malo výsledky do 5 KTJ.ml-1.Pri skladovaní chladených mlie nych potravín v prípade nízkeho po tu mezofilných mikroorganizmov sa však psychotrofná mikroflóra stáva dominantnou, o môže viesk jej nadmernému pomnoženiu.

Následná kultivácia misiek použitých na stanovenie po tu MAS alej pri 6.5°C 10 dní poskytla podmienky pre tvorbu kolónií striktne psychrotrofných aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov (SPAS). Výsledky SPAS mali rozsah 0 – 28 KTJ.ml-1, v priemere 2.9 KTJ.ml-1,s varia ným koeficientom Vk = 146%. Z celkového po tu samostatne kultivovaných PAS je to 53.7 %. Zvyšných 46.3 % z pôvodného po tu psychrotrofných mikroorganizmov sú alebo mezotolerantné a vytvorili kolónie už po as kultivácie pri 30°C, alebo pri prvej inkubácii stratili schopnos revitalizácie.

Tabu ka II Relatívna po etnos vzoriek (%) v jednotlivých kategóriách po tu spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov. Kategória KTJ.ml-1l (a) a<=50 50<a<=100 100<a<=150 150<a<=200 a>200 MAS 61.2 26.9 7.1 1.7 3.1 MPAS (MAS+PAS) 55.4 29.6 9.2 2.7 3.1 Kategória KTJ.ml-1 (a) a<=5 5<a<=10 10<a<=15 15<a<=20 a>20 PAS 63.6 21.4 6.8 5.1 1.0

y = 0.9773xR2 = 0.9865

r = 0.99

1.0

10.0

100.0

1000.0

1.0 10.0 100.0 1000.0

MPAS (MAS+PAS) [KTJ.ml-1]

MA

S+SP

AS

[KTJ

.ml-1

]

Obr. 1. Stanovenie MPAS inkubáciou jednej kultiva nej misky pri dvoch po sebe nasledujúcich teplotách vo vz ahu k sú tu dvoch misiek pri dvoch rôznych teplotách.

Sú et po tov MAS + PAS vyjadruje celkový po et mezofilných a psychrotrofných aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov (MPAS). Bol v rozpätí 2.5-340 KTJ.ml-1. Priemerná hodnota MPAS bola 59.4 KTJ.ml-1. Podiel z celkovej mikroflóry je 0.12%. 55.4% vzoriek bolo s po tom do 50 KTJ.ml-1, 85% nemalo hodnotu vyššiu ako 100, a iba 3.1% vzoriek malo po et MPAS vä šíako 200. Na základe zistených výsledkov je možné podpori návrh po iato ného limitu pre prípadné zavedenie tohto ukazovate a, teda pre po et mezofilných a psychrotrofných aeróbnych sporulujúcich baktérií (MPAS) maximálne 200 KTJ.ml-1. Podobne i Hanuš a kol. [3] potvrdili reálnos tohto limitu. Celkový po et MPAS zistený na tých istých miskách pri inkubácii na mezofilné a následne na psychrofilné mikroorganizmy (MAS + SPAS) mal priemernú hodnotu 56.9 KTJ.ml-1, o predstavuje 95.8 % z po tu sú tov samostatných misiek pri dvoch teplotách.

122

Korela ný koeficient týchto dvoch typov výsledkov r = 0.99 sved í o tesnej závislosti, ktorá je vyjadrená lineárnou regresnou priamkou s rovnicou y = x - 2.5056. Použite dvoch inkuba nýchteplôt po sebe pri totožnom súbore misiek umož uje vylú i nadhodnotenie výsledkov o sporuláty schopné rastu pri oboch inkuba ných teplotách (obr. 1).

Výsledky spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov (MPAS) nejavili koreláciu so žiadnym zo sledovaných mikrobiologických ukazovate ov. Z prakticko mikrobiologického h adiska je významné pozorovanie, že medzi CPM a MPAS nie je štatistická závislos . Taktiež Rombaut a kol. [5] pozorovali nízky korela ný koeficient r = 0.3. Vidíme, že skupinu spórotvorných mikroorganizmov má osobitný význam sledova samostatne, vzh adom na jej technologické a hygienické dôsledky. V priebehu roka sme pozorovali ur ité kolísanie a zmeny rozptylu týchto hodnôt, avšak vplyv ro ného obdobia sa štatisticky nepotvrdil.

Záver:Vidíme, že skupinu aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov, ktorá je napriek tomu, že jej

hodnoty v porovnaní s hodnotami CPM sú o 3 poriadky nižšie (hovoríme o jednotkách oproti tisícom), má osobitný význam sledova samostatne, vzh adom na jej technologické a hygienické dôsledky. Dlhodobým skladovaním a chladením mlie nych potravín majú as a životný priestor pre pomnoženie i zo zdanlivo zanedbate ných po iato ných po tov KTJ. Výskyt MPAS v surovom mlieku je špecifickým, prísnejším kritériom hygieny získavania mlieka a nedá sa odhadnú na základe niektorého zo základných kritérií mikrobiologickej kvality mlieka. Mliekárne, ktoré sa budú kontrolou tohto ukazovate a snaži o zlepšenie kvality nakupovanej suroviny, môžu tak dosiahnu stabilitu v trvanlivosti a skladovate nosti svojich výrobkov.

Použitá literatura:1. Greifová, M. – Valík, . – Görner, F. – Petríková, J.: Predikcia trvanlivosti pasterizovaného mlieka

z h adiska rastu Bacillus cereus pri (5±1)°C. Bull. potrav. Výsk., 38, 1999, s. 243–250. 2. Hanuš, O. – Kolá , A. – Vylet lová, M. – Pur, I.: erstvé konzumní mléko s prodlouženou trvanlivostí –

nová kvalitní potravina pro lidskou výživu. In: Nové trendy v organiza ních, technologických a hygienických postupech nákupu syrového mléka v kontextu podmínek EU (zbor. z medzinár. konf.). Šumperk, Okresní agrární komora, 2001, s. 81–104.

3. Hanuš, O. – Kolá , A. – Pur, I. – Vylet lová, M.: Rozší ení spot ebního potravinového mlé néhosortimentu v R a lokální kvalita suroviny. In: Den mléka 2002 (zbor. z medzinár. konf.). Praha, ZU, 2002, s. 44–48. ISBN 80-213-0900-8

4. Mayr, R. – Eppert, I. – Scherer, S.: Incidence and identification of psychrotrophic Bacillus spp. in German HTST pasteurized milk. Milchwissenschaft, 54, 1999, s. 29-30.

5. Rombaut, R. – Dewettinck, K. – de Mangelaere, G. – van Vooren, L. – Huyghebaert, A.: Raw milk microbial quality and production scale of Belgian dairy farms. Milchwissenschaft, 57, 2002, s. 625–628.

6. Lauková, D. – Valík, . – Görner, F. – Leskovská, L. – Martinická, L.: Dynamika rastu Bacillus cereusv mlieku a smotane. In: Mléko a sýry 2003 (zbor. z medzinár. konf.). VŠCHT Praha, 2003, s.170-174.

7. Vylet lová, M. – Švec, P. – Pá ová, Z. – Sedlá ek, I. – Roubal, P.: Výskyt kmen Bacillus cereus aBacillus licheniformis v procesu výroby UHT mléka. Czech J. Anim. Sci., 47, 2002, s. 200–205

8. Valík, . – Lauková, D. – Görner, F.: Obsah Bacillus cereus a celkový po et mikroorganizmov v pasterizovanej smotane. In: Bull. potrav. Výsk., ro . 40, 2001, . 3, s. 209–219.

Kontaktná adresa:Ing. Katarína Kirchnerová, PhD., Slovenské centrum po nohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, kirchnerova@scpv.sk

123

SLEDOVÁNÍ MIKROBIOLOGICKÉ KVALITY KOZÍCH SÝR Z TRŽNÍ SÍTJIHOMORAVSKÉHO KRAJE

Cupáková Šárka1, Necidová Lenka1, Dušková Marta1, Belušíková Zora1, Janštová Bohumíra1,Pospíšilová Markéta2, Karpíšková Renáta1,2

1Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2Centrum hygieny potravinových et zc Brno, SZÚ Praha

Monitoring of microbial quality of goat’s cheese from the retail market in the South Moravia

Summary:The aim of this study was to evaluate the microbial quality of goat’s cheese from retail market in the Czech Republic. Microbial characteristic was monitored as folowed: count of Enterobacteriaceae, Escherichia coli,lactic acid bacteria, enterococci, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, identification of Listeria monocytogenes, Salmonella spp. and Staphylococcus aureus. From the point of the actual EU legislation all the samples of goat’s cheese were microbiologicaly corresponding and together with other monitored parameters, can be signed as safe products.

V Evrop se ro n vyprodukuje více než 2 miliony tun kozího mléka, což p edstavuje asi 17 % celosv tové produkce. Nejvýznamn jší producenti kozího mléka jsou situováni do blízkosti St edozemního mo e - ecko, Francie, Portugalsko, Špan lsko a Itálie3. Mimo p ímé konzumace lidmi trpícími alergií na kravské mléko je kozí mléko používáno k výrob sýr , které jsou pro vysoký obsah tuku a nezvyklou chu velmi oblíbené2.

Cílem studie bylo hodnocení mikrobiologické kvality a zdravotní nezávadnosti r znýchdruh kozích sýr , domácí i zahrani ní provenience, dostupných v tržní síty eské republiky a porovnání vybraných ukazatel s kriterii stanovenými Na ízením komise ES . 2073/2005 o mikrobiologických kriteriích pro potraviny.

Materiál a metody:Vzorky

Celkem bylo vyšet eno 50 vzork kozích sýr odebraných z tržní sít v Jihomoravském kraji. Jednalo se o erstvé sýry p írodní, erstvé sýry s r znými druhy p íchutí a sýry s bílou plísní na povrchu, dva vzorky sýr polotvrdých a jeden vzorek tvrdého sýru. Zastoupeny byly sýry jak zahrani ních (Francie, N mecko, Polsko, Rakousko, Holandsko), tak tuzemských výrobc . Odb rvzork byl provád n v období duben - erven 2006.

MetodyZákladní zpracování vzork bylo provedeno dle SN ISO 7218. Byly hodnoceny

následující mikrobiologické ukazatele: po et bakterií eledi Enterobacteriaceae ( SN ISO 21528-2), po et Escherichia coli ( SN ISO 16649-2), po et bakterií mlé ného kvašení ( SN ISO 15214), po et enterokok (rozt r 0,2 ml vzorku na povrch S-B agaru s následnou aerobní kultivací 48 hod. p i teplot 37 °C), po et Staphylococcus aureus ( SN EN ISO 6888-1), pr kaz S. aureus(pomnožení v PPV – aerobn , 24 hodin p i 37 °C; následn vyo kování na B-P agar a aerobní kultivace 48 hodin p i teplot 37 °C), po et Bacillus cereus ( SN EN ISO 7932), pr kaz a stanovení po tu Listeria monocytogenes ( SN EN ISO 11290-1,2), pr kaz Salmonella spp. ( SN EN ISO 6579).

Suspektní izoláty enterokok a S. aureus byly genotypov konfirmovány metodou PCR, zam enou v p ípad enterokok na detekci rodov specifického tuf-genu1 a u S. aureus na detekci specifického DNA fragmentu SA442 a toxin specifických gen (sea – sej)4. Mimo kultiva níhovyšet ení byla u vzork kozích sýr také sledována p ítomnost stafylokokových enterotoxinmetodou RPLA (SET-RPLA, Denka Seiken, Japonsko).

124

Interpretace výsledkU erstvých sýr jsou mikrobiologická kriteria pro potraviny v tržní síti následující: po et

L. monocytogenes (m = 102 KTJ.g-1), p íp. stanovení stafylokokových enterotoxin(negativní/25 g). U zrajících sýr potom: po et L. monocytogenes (m = 102 KTJ.g-1).

Výsledky a diskuse:Stanovené po ty bakterií eledi Enterobacteriaceae se u 17 vzork (37 %) pohybovaly

v rozmezí ádov 101 – 103 KTJ.g-1 (viz. tabulka I.). Zvýšené po ty byly zaznamenány u erstvých i plís ových sýr domácích i zahrani ních výrobc . Jak dále vyplývá z tabulky I. u v tšiny vzork(86 %) byla stanovena hodnota po tu E. coli < 5.101 KTJ.g-1. U zbývajících sedmi vzork se záchyt E. coli pohyboval v rozmezí ádov 101 - 103 KTJ.g-1, p t z t chto vzork pocházelo od stejného tuzemského výrobce. Pom rn variabilním ukazatelem byl i po et enterokok , u tém poloviny vzork (48 %) byly stanoveny hodnoty v rozmezí 101 – 104 KTJ.g-1, u zbývajících 52 % vzorkpotom < 5.101 KTJ.g-1.

Po et bakterií mlé ného kvašení se pohyboval v širokém rozmezí ádov 104 - 108 KTJ.g-1

(viz. tabulka . 1). Po et S. aureus a B. cereus nep esáhl u žádného vyšet ovaného vzorku hodnotu < 5.101 KTJ.g-1. Vyšet ení kozích sýr na p ítomnost stafylokokových enterotoxin SEA – SED metodou RPLA bylo ve všech p ípadech negativní.

Kvalitativní pr kaz S. aureus byl provád n po p edchozím pomnožení, S. aureus byl detekován u 6 vzork erstvých i plís ových sýr p evážn zahrani ního p vodu. U 3 izolátS. aureus byla metodou PCR prokázána p ítomnost gen kódujících stafylokokové enterotoxiny SEG, SEI a u 1 izolátu byly p ítomny geny sec, seg a sei. Metodou RPLA byla potvrzena schopnost tohoto izolátu produkovat SEC.

U žádného z vyšet ovaných vzork nebyla prokázána p ítomnost salmonel. U 2 vzorkerstvého sýru a 2 vzork sýru s plísní na povrchu (vše dovoz Francie) byla prokázána p ítomnost

listerií. Ve t ech p ípadech se jednalo o L. monocytogenes (1x sérotyp 1/2 b, 2x sérotyp 1/2 a), u jednoho vzorku byla prokázána p ítomnost L. innocua. Po et L. monocytogenes byl u všech vzork stanoven < 1.102 KTJ.g-1. V tomto ukazateli tedy hodnocené sýry vyhovují požadavku Na ízení . 2073/2005.

Tabulka I. P ehled vyšet ovaných komodit, jejich p vodu a výsledky vybraných mikrobiologických ukazatel .

EB EC ENT BMK íslo Vzorek, lokalita KTJ.g-1 KTJ.g-1 KTJ.g-1 KTJ.g-1

555 sýr s plísní na povrchu, Polsko < 1.101 < 5.101 < 5.101 2,3.107

556 sýr s plísní na povrchu, Francie < 1.101 < 5.101 >7,5.104 >7,5.107

557 erstvý sýr, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 3,5.106

558 sýr s plísní na povrchu, Francie < 1.101 < 5.101 3,0.103 6,2.107

559 sýr, ? < 1.101 < 5.101 < 5.101 9,5.103

592 sýr s plísní na povrchu, Polsko 1,2.102 < 5.101 < 5.101 9,6.105

593 sýr s plísní na povrchu, Francie 4,5.101 5,0.101 < 5.101 5,7.106

594 erstvý sýr, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 4,7.107

595 erstvý sýr ob. popelem, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 8,2.107

596 erstvý sýr, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 < 5.103

635 sýr s plísní na povrchu, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 7,4.107

636 sýr, Francie* < 1.101 < 5.101 < 5.101 3,5.106

637 sýr s plísní na povrchu, Francie < 1.101 < 5.101 3,9.104 >7,5.107

638 tvrdý bílý sýr, farma B ezí >1,5.103 2,2.103 5,5.104 4,6.107

639 p írodní sýr pep ový, farma B ezí >1,5.103 3,0.102 >7,5.104 7,3.107

640 p írodní sýr esnekový, farma B ezí 1,1.103 < 5.101 1,8.104 8,1.107

641 p írodní sýr petrželkový, farma B ezí >1,5.103 2,5.103 >7,5.104 >7,5.107

125

Tabulka I. - pokra ováníP ehled vyšet ovaných komodit, jejich p vodu a výsledky vybraných mikrobiologických ukazatel .

EB EC ENT BMK íslo Vzorek, lokalita KTJ.g-1 KTJ.g-1 KTJ.g-1 KTJ.g-1

642 p írodní sýr bazalkový, farma B ezí >1,5.103 3,1.103 >7,5.104 >7,5.107

643 m kký sýr (paster. ml.), Francie < 1.101 < 5.101 >7,5.104 >7,5.107

644 erstvý sýr, Petrovice < 1.101 < 5.101 1,3.102 2,5.104

660 erstvý sýr s bylinkami, Rakousko < 1.101 < 5.101 7,5.101 1,8.106

661 sýr s plísní na povrchu, Polsko 5,0.101 5,0.101 2,7.103 5,7.107

662 erstvý sýr p írodní, Rakousko < 1.101 < 5.101 5,0.101 < 5.104

663 sýr s plísní na povrchu, Francie* < 1.101 < 5.101 3,8.103 2,7.107

664 sýr s plísní na povrchu, Francie < 1.101 < 5.101 4,8.103 5,5.107

665 sýr s plísní na povrchu, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 4,5.106

666 erstvý sýr, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 < 5.104

667 erstvý sýr, Petrovice < 1.101 < 5.101 < 5.101 8,6.106

668 p írodní sýr cibulový, farma B ezí >1,5.103 1,5.102 >7,5.104 3,2.108

669 p írodní sýr polotvrdý, Holandsko >1,5.103 < 5.101 < 5.101 6,5.107

701 sýr s plísní na povrchu, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 4,5.106

702 sýr s plísní na povrchu, N mecko >1,5.103 < 5.101 1,2.104 2,8.106

703 sýr s plísní na povrchu, N mecko >1,5.103 < 5.101 2,2.104 6,8.106

704 sýr s plísní na povrchu, Francie >1,5.103 < 5.101 >7,5.104 9,1.108

705 sýr, Holandsko >1,5.103 < 5.101 1,0.102 9,7.106

706 sýr s plísní na povrchu, Francie 1,0.102 < 5.101 2,1.103 4,7.106

707 sýr, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 < 5.104

708 erstvý sýr p írodní, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 1,6.106

709 sýr s plísní na povrchu, Polsko 2,1.102 < 5.101 < 5.101 5,0.105

710 p írodní sýr, Francie* < 1.101 < 5.101 < 5.101 2,0.106

722 sýr s plísní na povrchu, Francie < 1.101 < 5.101 >7,5.104 2,0.108

723 p írodní sýr, Turnov < 1.101 < 5.101 < 5.101 >7,5.107

724 erstvý sýr ob. popelem, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 2,6.107

725 erstvý sýr p írodní, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 < 5.104

726 p írodní sýr polotvrdý, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 < 5.105

727 sýr s plísní na povrchu, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 1,7.107

728 erstvý sýr p írodní, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 3,6.105

729 p írodní sýr horský, Brn nec 2,1.102 < 5.101 3,4.104 5,5.107

730 dezertní sýr, Ratibo ice < 1.101 < 5.101 2,0.104 1,7.108

731 erstvý sýr p írodní, Francie < 1.101 < 5.101 < 5.101 < 5.104

Pozn.: * - pozitivní pr kaz L. monocytogenes

Záv r:Bezpe nost potravin má být v celém potravinovém et zci zajišt na provád ním správné

hygienické praxe a používáním postup založených na zásadách analýzy rizika a kritických kontrolních bod (HACCP). Sou asn musí vyrobené potraviny spl ovat mikrobiologická kritéria daná Na ízením komise ES . 2073/2005. Z pohledu platné legislativy byly všechny vyšet ovanékozí sýry mikrobiologicky vyhovující a v kontextu s dalšími sledovanými parametry je lze ozna itza bezpe né.

Nicmén v souvislosti s ojedin lým nálezem L. monocytogenes je nutno upozornit na nezbytnost uchovávání výrobk p i chladírenských teplotách. To platí nejen pro distribuci a prodej sýr , ale také pro uchovávání v domácnostech spot ebitel .

126

Pod kování:Práce vznikla za finan ní podpory výzkumného zám ru MSM 6215712402 Veterinární aspekty bezpe nosti a kvality potravin.

Použitá literatura:1. CUPÁKOVÁ, Š., POSPÍŠILOVÁ, M., KOLÁ KOVÁ, I., KARPÍŠKOVÁ, R. Genus-specific

identification of enterococci by PCR method. Acta Veterinaria Brno, 2005, vol. 74, no. 4, p. 633-637. 2. KLINGER, I. AND ROSENTHAL, I. Public health and the safety of milk and milk products from sheep

and goats. Revue scientifique et technique,1997, vol. 16, no. 2, p. 482-488. 3. MORGAN, F., MASSOURAS, T., BARBOSA, M., ROSEIRO, L., RAVASCO, F., KANDARAKIS, I.,

BONNIN, V., FISTAKORIS, M., ANIFANTAKIS, E., JAUBERT, G., RAYNAL-LJUTOVAC, K. Characteristics of goat milk collected from small and medium enterprises in Greece, Portugal and France. Small Ruminant Research, 2003, vol. 47, no. 1, p. 39-49.

4. POSPÍŠILOVÁ, M., KARPÍŠKOVÁ, S., KARPÍŠKOVÁ, R. Identifikace druhu Staphylococcus aureusmetodou polymerázové et zové reakce. In VI. Konference mladých v deckých pracovník s mezinárodní ú astí. Sborník. VFU Brno, 2004, s. 52-56.

5. EUROPEAN COMMISION. Na ízení komise . 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. 2005, 26 s.

6. SN EN ISO 6579. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda pr kazu bakterií rodu Salmonella. 2003.

7. SN EN ISO 6888-1. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení po tukoagulázopozitivních stafylokok (Staphylococcus aureus a další druhy) – ást 1: Technika s použitím agarové p dy podle Baird-Parkera. 1999.

8. SN EN ISO 11290-1. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda pr kazu a stanovení po tuListeria monocytogenes – ást 1: Metoda pr kazu. 2005.

9. SN EN ISO 11290-2. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda pr kazu a stanovení po tuListeria monocytogenes – ást 2: Metoda stanovení po tu. 2005.

10. SN ISO 15214. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda stanovení po tu mezofilních bakterií mlé ného kvašení – Technika po ítání kolonií vykultivovaných p i 30 °C. 2000.

11. SN ISO 16649-2. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení po tu beta-glukuronidázopozitivních Escherichia coli - ást 2: Technika po ítání kolonií vykultivovaných p i 44 °C s použitím 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glukuronidu. 2003.

12. SN ISO 21528-2. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metody pro pr kaz a stanovení po tubakterií eledi Enterobacteriaceae – ást 2: Technika po ítání kolonií. 2006.

13. SN ISO 7218. Mikrobiologie potravin a krmiv – Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení. 1998.

14. SN EN ISO 7932. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda stanovení po tu presumptivního Bacillus cereus – Technika po ítání kolonií vykultivovaných p i 30 °C. 2005.

Kontaktní adresa:MVDr. Šárka Cupáková, Ph.D. Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Palackého 1/3, 612 42 Brno

127

SLEDOVÁNÍ R STU A PRODUKCE ENTEROTOXIN STAPHYLOCOCCUS AUREUS B HEM TECHNOLOGIE VÝROBY ERSTVÝCH SÝR

Karpíšková Renata1,2, Necidová Lenka1, Pospíšilová Markéta2,Š ástková-Belušíková Zora1, Dušková Marta1

1Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2Centrum hygieny potravinových et zc Brno, SZÚ Praha

Tracing of Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in soft cheeses during their technological processing

Summary:S. aureus is an important etiological agent in milk and milk products, mostly capable to produce staphylococcal enterotoxins which can cause food-borne intoxications in the consumers. The aim of this study was to trace growth of S. aureus and toxin production in soft cheeses during the technological processing. Raw milk inoculated by one of the five S. aureus strains isolated from milk and milk products were used in the model experiments. All the S. aureus strains used in this study were producers of some staphylococcal enterotoxin (type A, B or C). Cheese semi-products were examined during their technological processing and final products during the 5 days storage. Enterotoxins were detected by the fluorescent immunological method ELFA (MiniVIDAS). This study showed that the amount of enterotoxins varied among tested strains and phases of the technological process. Enterotoxins were detected in soft cheese made from pasteurized milk inoculated by S. aureus in the counts 2,9.105 CFU.g-1. Prevention of S. aureuscontamination and multiplication during the process plan is needed for the production of safe soft cheeses. The most important enterotoxin dose build-up factor can be regulated by strict abidance of cooling conditions during manufacturing, distribution and storage of the product.

Úvod:S. aureus je významným kontaminantem syrového mléka a jedním z nejvýznamn jších

p vodc alimentárních intoxikací. Jeho p ítomnost v syrovém mléce a mlé ných výrobcích z n jvyrobených je nežádoucí. V pr b hu výroby a skladování výrobk m že dojít k pomnožení t chto bakterií a již p i po tech 105 KTJ.g-1 potraviny m že vytvo ené množství toxinu p edstavovatzdravotní riziko pro konzumenta (3).

P ítomné patogenní mikroorganismy v surovin lze inaktivovat dostate ným tepelným záh evem (1), termostabilní stafylokokové enterotoxiny (SEs), které byly za vhodných podmínek naprodukovány již v surovin , se mohou vyskytovat i v potravinách vyrobených z tepelnupraveného mléka. Nap . Ikeda a kol. (5) popsal epidemii, která vznikla v Japonsku v roce 2000, p i níž bylo zaznamenáno více než 10 000 p ípad onemocn ní stafylokokovou enterotoxikózou. Vehikulem bylo sušené mléko vyrobené z pasterovaného mléka.

Z hlediska bezpe nosti potravin je nezbytné v novat pozornost možnému výskytu S. aureus v potravinách k p ímé spot eb , zejména v erstvých sýrech. Požadavky pro stanovení koagulázo-pozitivních stafylokok a stafylokokových enterotoxin (SEs) v erstvých sýrech zahrnuje i Na ízení EK . 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny.

Cílem této studie bylo zjistit chování S. aureus v pr b hu výroby erstvého sýru a jeho schopnost tvo it v daných podmínkách enterotoxiny. Získané výsledky umožní verifikaci vytvo eného systému kritických bod (HACCP) studované komodity.

Materiál a metody:VzorkyK provedení modelových pokus bylo použito syrové kravské mléko, které bylo

zao kováno jedním z p ti kmen S. aureus. Všechny kmeny byly producenty enterotoxin a to typu A, B nebo C (SA843 SEC, SA1057 SEB, SA1089 SEB, SA1185 SEA a SA1200 SEB). Toxinogenní kmeny S. aureus pocházely z mléka a mlé ných výrobk a byly uchovávány ve sbírce mikroorganism CHP , SZÚ Praha p i teplot -75 °C.

Zao kování mléka bylo provedeno dv ma zp soby, první 12 – 16 hodin p ed pasterací. Inokulace mléka byla provád na pro každý vzorek ve dvou denzitách cca 103 a 105 KTJ.ml-1.

128

U druhého pokusu byla inokulace provedena až po pasteraci výchozí suroviny. Z takto upraveného mléka byly p ipraveny modelové vzorky erstvých sýr b žným výrobním postupem: pasterace 72 a 85 °C po dobu 15 sekund (6), p idání CaCl2 a smetanové kultury (Milkom a.s., Laktoflora,

R), p idání sy idla (Milkom a.s., Laktoflora, R) a sý ení p i 30 °C po dobu 1 hodiny, zpracování sý eniny, lisování do tvo ítek a okap sýr p i pokojové teplot (24 °C) do druhého dne, solení, ko en ní, balení, skladování v chladírn p i 4 a 8 °C po dobu 5 dn .

MetodyStanovení po tu koagulázo-pozitivních stafylokok bylo u jednotlivých fázových vzork

provedeno kultivací na p du podle Baird-Parkera (2). Fenotypová konfirmace charakteristických kolonií spo ívala v hodnocení r stu na chromogenním médiu SaSelect (Bio-Rad, Francie) a na krevním agaru, dále v provedení koagulázového testu - ITEST STAFY koaguláza (ITest, Hradec Králové, R) a Staphylo la Seiken (DENKA SEIKEN CO., LTD., Japonsko).

K detekci stafylokokových enterotoxin byla použita fluorescen ní imunologická metoda (ELFA) s využitím p ístroje MiniVIDAS (Vitek Immuno Diagnostic Assay System, bioMérieux, Francie) umož ující detekci sumy enterotoxin SEA – SEE, s detek ním limitem 0,5 ng.g-1

potraviny pro SEA a SEB a 1,0 ng.g-1 potraviny pro SEC – SEE. Citlivost metody se pro jednotlivé SEs m že lišit v závislosti na druhu potraviny.

Výsledky a diskuse:

Zao kované mléko ur ené k p íprav erstvého sýra bylo p ed pasterací skladováno p i chladírenské teplot , což odpovídá podmínkám možné kontaminace mléka p i ve erním dojení. První modelový pokus byl zam en na sledování r stu S. aureus a tvorbu enterotoxin v p irozenkontaminovaném mléce, které bylo následn pasterováno a zpracováno na erstvý sýr. V tabulce 1 jsou uvedeny zjišt né po ty S. aureus v mléce a dále v r zných fázích výroby erstvého sýru. P i inokulaci mléka nízkými po ty S. aureus nedošlo v pr b hu dalších technologických operací k jejich pomnožení. Pastera ní teploty 72 °C i 85 °C po dobu 15 sekund bezpe n eliminovaly stafylokoky v mléce. P i inokulaci mléka vysokými po ty S. aureus (cca 105 KTJ.ml-1) se jako bezpe ná ukázala pouze vyšší pastera ní teplota. Nižší pastera ní teplota eliminovala po etstafylokok cca o 3 ády, v pr b hu technologického procesu však nedošlo u žádného vzorku k p ekro ení kritického po tu S. aureus 105 KTJ.ml-1. Ani v jednom p ípad nebyly u modelových vzork detekovány SEs. Oba použité pastera ní procesy byly dostate nou zárukou snížení po tuS. aureus na hodnoty neschopné vyprodukovat dostate né množství stafylokokového enterotoxinu pot ebného k vyvolání alimentární intoxikace.

Výsledky modelového pokusu popsaného v tabulce 2 p edstavují možnou sekundární kontaminaci S. aureus b hem výroby a skladování erstvých sýr nebo výrobu erstvých sýrz nepasterovaného mléka. Mléko bylo toxinogenními kmeny zao kováno až po pasteraci. Pozitivní pr kaz SEs byl zjišt n jen p i použití toxinogenního kmenu SA1185. Po ty S. aureus u tohoto kmenu dosáhly v pr b hu výrobního procesu nejvyšších hodnot ze všech pokus(až 3,2.106 KTJ.g-1). První fáze výroby, p i které již došlo k detekci SEs byla fáze lisování, 7 hod po zao kování pasterovaného mléka, kdy po et S. aureus dosahoval 4,3.105 KTJ.g-1. B hemtéto doby byl vyráb ný erstvý sýr vystaven p i zasý ení teplot 30 °C po dobu jedné hodiny a dále následovalo lisování výrobku p i pokojové teplot 24 °C po dobu cca 12 hodin. V záv ru chladírenského skladování (5. den) po ty S. aureus stagnovaly nebo mírn klesaly, p esto však produkce enterotoxin byla zaznamenána. To odpovídá zjišt ní, že stanovení po tu S. aureusve finálním výrobku je pouze orienta ní informací, která nemusí odhalovat p ítomnost stafylokokových enterotoxin . Na druhé stran lze na základ získaných výsledk potvrdit, že S. aureus je sice schopen pomalého r stu i p i chladni kové teplot , ale neprodukuje SEs (7).

Metoda ELFA neumož uje kvantitativní stanovení stafylokokových enterotoxin , výsledek je vyjád en jako pozitivní i negativní. Z tohoto d vodu nebylo sledováno množství naprodukovaných enterotoxin v pr b hu výroby a p i skladování sledované komodity.

129

Tabulka I Po ty S. aureus (KTJ.g-1) b hem výroby erstvých sýr (zao kováno kmenem SA1057 p ed pasterací mléka)fáze výroby a skladování past. teplota: 72 °C/15 s past. teplota: 85 °C/15 s p ed pasterací (12h po zao kování) 2,3.103 2,5.105 1,9.103 2,4.105

po pasteraci <5.101 5,0.102 <5.101 <5.101

po zasý ení <5.101 1,5.103 <5.101 <5.101

p i lisování <5.101 4,1.103 <5.101 <5.101

p ed solením <5.101 1,7.104 <5.101 <5.101

1. den skladování 4 °C <5.101 2,6.103 <5.101 <5.101

1. den skladování 8 °C <5.101 4,1.103 <5.101 <5.101

2. den skladování 4 °C <5.101 6,3.103 <5.101 <5.101

2. den skladování 8 °C <5.101 6,9.103 <5.101 <5.101

5. den skladování 4 °C <5.101 3,3.103 <5.101 <5.101

5. den skladování 8 °C <5.101 5,9.103 <5.101 <5.101

Tabulka II Po ty S. aureus (KTJ.g-1) b hem výroby erstvých sýr (zao kováno jednotlivými kmeny po pasteraci mléka); podtržené hodnoty p edstavují vzorky s pozitivním pr kazem stafylokokových enterotoxin

íslo kmene S. aureusfáze výroby a skladování 1057 1057 1089 1089 843 843 1200 1200 1185 1185po pasteraci 3,3.103 5,3.104 4,6.103 1,8.105 4,8.103 2,5.105 < 5.101 1,3.105 3,2.103 2,9.105

po zasý ení 3,4.103 6,5.104 4,8.103 2,4.105 4,9.103 2,4.105 < 5.101 3,6.105 3,7.103 1,4.105

p i lisování 2,1.103 6,6.105 5,5.103 2,0.105 5,3.103 1,5.105 < 5.101 2,4.105 3,6.104 4,3.105

p ed solením 1,5.104 1,0.106 1,8.104 2,5.105 3,0.103 6,9.104 < 5.101 4,2.105 3,5.104 1,6.106

1.den sklad. 4 °C < 5.102 3,4.105 5,5.102 < 5.103 9,3.102 2,2.104 < 5.101 6,3.104 2,2.104 1,6.106

1.den sklad. 8 °C 3,5 103 4,5.105 4,2.103 2,9.105 9,3.102 1,7.104 < 5.101 2,3.105 3,9.104 1,2.106

2. den sklad. 4 °C 2,9.103 2,0.105 < 5.101 1,5.104 8,5.102 2,6.104 < 5.101 8,5.104 4,9.104 1,6.106

2. den sklad. 8 °C 3,1.103 7,3.104 1,3.103 5,3.104 7,3.102 2,7.104 < 5.101 1,8.105 6,9.104 3,2.106

5. den sklad. 4 °C 7,5.102 < 5.103 < 5.101 < 5.102 < 5.101 < 5.102 < 5.101 < 5.103 4,7.104 < 5.104

5. den sklad. 8 °C 1,6.103 <5.104 < 5.101 3,9.104 < 5.101 < 5.102 < 5.101 < 5.103 6,0.104 < 5.104

V tšina erstvých sýr z modelových pokus by nevyhov la požadavk m legislativy, kdy Na ízení EK 2073/2005 p edepisuje limit pro koagulázo-pozitivní stafylokoky 101 – 102 KTJ.g-

1. U šesti z celkových 28 výrobk , kde byl po et S. aureus >105 KTJ.g-1, by bylo dle legislativy nutné provést další vyšet ení na p ítomnost stafylokokových enterotoxin .

130

Záv r:Z výsledk studie vyplývá, že k výrob erstvých sýr neobsahujících stafylokokové

enterotoxiny, nelze použít mléko s po ty S. aureus vyššími než 105 KTJ.g-1. Legislativou (6) stanovená limitní hodnota CPM je u syrového nakupovaného mléka 105 KTJ.ml-1, není tedy reálné, že v syrovém mléce bude bezpe ná hranice po tu S. aureus p ekro ena. Dalším krokem snižujícím po ty bakterií v etn stafylokok , je tepelné ošet ení (pasterace) mléka používaného k výroberstvých sýr . P ítomnost stafylokokových enterotoxin v erstvých sýrech by tedy spíše sv d ila

o sekundární kontaminaci S. aureus. Základním p edpokladem výroby bezpe né potraviny je tedy p edevším dodržování chladírenského et zce (4 - 8 °C) v pr b hu skladování erstvých sýr a zabrán ní sekundární kontaminace b hem výroby.

Výsledky studie potvrdily, že rychlost tvorby stafylokokových enterotoxin v erstvýchsýrech je u r zných kmen S. aureus rozdílná.

Získané poznatky mohou být využity p i stanovení kritických mezí pro kritické kontrolní body HACCP a verifikaci celého systému kontrolních kritických bod technologie výroby erstvých sýr .

Literatura:1.CONTRERAS, A., LUENGO, C., SÁNCHEZ, A., CORRALES, J.C. The role of intramammary pathogens

in dairy goats. Livestock Production Science, 2003, vol. 79, no. 2 – 3, p. 273-283. 2. SN EN ISO 6888-1. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení po tu

koagulázopozitivních stafylokok (Staphylococcus aureus a další druhy) – ást 1: Technika s použitím agarové p dy podle Baird-Parkera. Praha: eský normaliza ní institut, 1999. 16 s.

3.ERCOLINI, D., BLALOTTA, G., FUSCO, V., COPPOLA, S. PCR-based detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in the early stages of raw milk cheese making. Journal of Applied Microbiology,2004, vol. 96, no. 5, p. 1090-1096.

4.EUROPEAN COMMISION. Na ízení komise . 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. 2005, 26 s.

5.IKEDA, T., TAMATE, N., YAMAGUCHI, K., MAKINO, S. Quantitative analysis of Staphylococcus aureus in skimmed milk powder by real-time PCR. The Journal of Veterinary Medical Science, 2005, vol. 67, no. 10, p. 1037-1041.

6.NA ÍZENÍ KOMISE (ES) . 1662/2006, kterým se m ní na ízení Evropského parlamentu a Rady (ES) . 853/2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živo išného p vodu. 2006, 10 s.

7. ROBERTS, T. A., BAIRD-PARKER, A. C., TOMPKIN, R. B. Microorganisms in food: Characteristics of microbial pathogens. 1st printing, 1996. ISBN 0-412-47350-X.

Pod kování:Práce vznikla za finan ní podpory výzkumného zám ru MSM 6215712402 Veterinární aspekty bezpe nosti a kvality potravin.

Kontaktní adresa:MVDr. Lenka Necidová, Ph.D., Ústav hygieny a technologie mléka, FVHE, VFU Brno, Palackého 1-3, 612 42 Brno,e-mail: necidoval@vfu.cz

131

RAST MIKROORGANIZMOV PO AS MODELOVÝCH VÝROB HRUDKOVÝCH SYROV ZO SUROVÉHO OV IEHO A KOZIEHO MLIEKA

Medve ová Alžbeta, Liptáková Denisa, Valík ubomír, Janov íková Lenka, Hudecová Anna Fakulta chemickej a potravinárskej technologie, Bratislava, Slovensko

Growth of microorganisms during the modelled manufacture of lump cheese produced from ewe's and goat raw milk

Summary:Refer to the previous analysis of growth of Staphylococcus aureus and Escherichia coli during milk fermentation 1, 2, the growth characteristics of these contaminants were studied in model cheeses made from raw ewes´ and goats´ milk with or without addition of starter cultures. The initial concentration of E. coliin ewes´ and goats´ cheeses ranged from 102 to 104 CFU/g and its final 6d concentration reached the density from 103 to 106 CFU/g depending on type of milk and starter culture addition. The initial concentrations of S. aureus were about 104 CFU/g and reached the range from 103 to 105 CFU/g in ewes´ milk without addition of lactic acid bacteria culture finally. The growth dynamics of S. aureus and E. coliin cheeses were compared with growth parameters in milk co-culture of E. coli with Lactococcus lactis subsp. lactis and growth parameters of S. aureus with Fresco culture at 18 °C. According to our experimental data, the addition of the lactic acid bacteria culture and following pH decrease on the levels lower than 5.0 for 1 to 2 d were able inhibit growth of S. aureus and E. coli on concentration lower than 104 CFU/g.

Baktérie mlie neho kysnutia sú prirodzenými antagonistami nežiaducich mikroorganizmov v potravinách. Hlavným inhibi ne pôsobiacim faktorom pri fermentácii je kyselina mlie na,znižujúca hodnotu pH. Prostredníctvom kyslomlie nych fermentácií sa predlžuje trvanlivos ,zvyšuje kvalita a v mnohých prípadoch zapezpe uje aj zdravotná neškodnos východiskových surovín. Okrem týchto benefitov proces fermentácie priaznivo ovplyv uje senzorické vlastnosti a akceptovate nos niektorých zložiek potravín.

Staphylococcus aureus je tretím naj astejším agens potravinových otráv vo svete 3, 4. astobýva prítomný na pokožke a slizniciach, v nosných dierkach, hltane, vo vlasoch, v gastrointestinálnom a urogenitálnom trakte udí. Vyskytuje sa tiež na koži, strukoch a mukóznych membránach mlieko produkujúcich zvierat, odkia sa môže šíri na pokožku vemena, ruky doji ova podstielku. Asperger a Zangerl (2003)4 udávajú, že v prípade infikovaného vemena, je S. aureusexkrétovaný do mlieka, kde jeho po ty varírujú od 101 – 108 KTJ/ml, zvy ajne však v po toch 104 KTJ/ml. Pod a Valíka a kol. (2004)5 sa v dobre nadojenom ov om mlieku môže vyskytovav po toch medzi 100 až 200 KTJ/ml. Hoci vä šina kme ov neprodukuje enterotoxíny, sú aj také, ktoré ich produkujú a vyvolávajú stafylokokové enterotoxikózy. Preto je nevyhnutné zabránispracovávaniu surovín kontaminovaných S. aureus, nako ko aj ke jeho bunky môžu by usmrtené, enterotoxíny prekonávajú pasteriza né ošetrenia. V ostatnom ase boli Európskou úniou definované kritériá hygieny procesu pre po ty Staphylococcus aureus, v syroch vyrábaných zo surového mlieka (n = 5, c = 2, m = 104 a M = 105 KTJ/g)6. Tieto štandardy môžu by splnené, ak sa dodržujú pravidlá správnej výrobnej praxe na farmách a mlieko na výrobu syrov sa okamžite schladí alebo ihne spracováva 4, 7, 8.

V potravinárskej praxi je E. coli kontaminantom, ktorý znehodnocuje viaceré potravinárske produkty. Pri výrobe syrov s nízkodohrievanou syrovinou (pri 36 až 40 °C) fermentáciou zbytkovej laktózy vyvoláva ich skoré nadúvanie. Niektoré toxinogénne kmene E. coli sa dokážu prichytina nerezových povrchoch technologických zariadení. Krížovou kontamináciou po as výroby alebo manipulácie s potravinami vstupujú napríklad shiga-toxín produkujúce kmene do potravinového re azca 9, 10, 11. Pasteriza né a steriliza né teploty E. coli devitalizujú, naopak chladenie rast E. coliiba spomalí. Technológie používané pri spracovaní mlieka, napríklad zrecie procesy, po et E. coliiasto ne znižujú. Pod a Burdovej a Laukovej (2001)12 zníženie aktívnej kyslosti pH pod 5,0, rast

a rozmnožovanie E. coli obmedzuje až zastavuje. S. aureus rovnako aj E. coli sú slabí kompetitítori a ich rast je asto obmedzený inými

mikroorganizmami, predovšetkým baktériami mlie neho kysnutia. Dôvody pre slabý rast oboch testovaných mikroorganizmov v prostredí baktérií mlie neho kysnutia sú produkcia organických

132

kyselín (pokles pH), utilizácia kyslíka kompetitívnymi mikroorganizmami (pokles redoxného potenciálu), zníženie nutri ných faktorov a produkcia špecifických antimikrobiálnych faktorov 7, 8.

Cie om práce bolo kvantitatívne analyzova rast S. aureus a E. coli v laboratórne pripravených syroch zo surového kozieho a ov ieho mlieka a ich dynamiku rastu porovna s rastom pozorovaným v UHT mlieku pri súbežnej kultivácii s istými kultúrami baktérií mlie nehokysnutia.

Analýza rastu Staphylococcus aureus a Escherichia coli v laboratórne pripravených syroch zo surového mlieka a v UHT mlieku v prítomnosti baktérií mlie neho kysnutia.

V nadväznosti na predchádzajúce experimenty, v ktorých sme sa venovali analýze rastu S. aureus a E. coli v mlieku v prítomnosti kompetitívnych kultúr baktérií mlie neho kysnutia, v tejto práci sme pokra ovali v charakterizácii rastu oboch kontaminantov v modelových syroch z ov ieho a kozieho mlieka. Syry boli vyrobené zo surového mlieka za laboratórnych podmienok bez prídavku a s prídavkom doplnkovej mezofilnej zákysovej kultúry.

Po iato né koncentrácie E. coli v syroch z ov ieho (obr. 1) a kozieho (obr. 2) mlieka sa pohybovali od 5,0.102 KTJ/g do 1,0.104 KTJ/g a kone né po ty dosahovali hodnoty od 2,0.103 KTJ/g do 2,7.106 KTJ/g v závislosti od druhu mlieka a prídavku štartovacej kultúry. V ov om syre s prídavkom štartovacej kultúry sme pozorovali v 24. h nárast po tov o 2 log poriadky a následne došlo k odumieraniu buniek rýchlos ou GrEc = -0,011 log KTJ/h. V ov om hrudkovom syre bez prídavku štartovacej kultúry sa obsah E. coli po as celej doby uchovávania syra zvýšil o 3 log poriadky, pri om v oboch typoch syrov došlo k prekro eniu limitu 104 KTJ/g (log Nend = 5 až 6), ktorý je zadefinovaný Potravinovým kódexom SR pre syry vyrobené zo surového mlieka.

Po iato né koncentrácie S. aureus v kozom i ov om hrudkovom syre boli poriadkovo 104 KTJ/g a na konci pokusov sa pohybovali v rozmedzí 103 až 105 KTJ/g. V prípade ov iehohrudkového syra s prídavkom štartovacej kultúry za ali bunky S. aureus po 24 h uchovávania syra pri 18 °C odumiera rýchlos ou podobnou ako v predchádzajúcom prípade GrSa = -0,01 log KTJ/h(Nend < 1,0.104 KTJ/g) a v syre bez štartovacej kultúry bol pokles živých buniek zaznamenaný po 96 h rýchlos ou GrSa = -0,015 log KTJ/h, pri om kone ná denzita S. aureus prekro ila limit 105 KTJ/g, kedy môže v prípade enterotoxinogénnych kme ov dôjs k produkcii enterotoxínov.

Obr. 1: Dynamika rastu mikroorganizmov a zmeny hodnôt pH po as zrenia ov ieho hrudkového syra bez a s prídavkom štartovacej kultúry A, pri teplote 18 °C

Ov í hrudkov ý sy r (25 - 18 °C)

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 24 48 72 96 120 144t [h]

log

KTJ

/ml;

pH

OHS_Laktokoky OHS_EC OHS_SAOHS_Laktobacily OHS_pH

Ov í hrudkový syr s kultúrou A (25 - 18 °C)

2

3

4

5

6

7

8

9

0 24 48 72 96 120 144

t [h]

log

KTJ

/ml;

pH

OHS_Laktokoky_A OHS_EC_A OHS_SA_AOHS_Laktobacily_A OHS_pH_A

133

Obsah natívnych laktokokov (stanovených na agare M17) v kozom syre dosahoval hodnotu 6,15 log KTJ/g a laktobacilov (agar MRS) 7,20 log KTJ/g. V prípade ov ieho syra bez prídavku a s prídavkom mezofilnej zákysovej kultúry sa po iato né koncentrácie laktokokov pohybovali v rozmedzí 4,6 až 4,95 log poriadkov a koncentrácie laktobacilov dosahovali 2,7 až 4,8 log poriadkov.

V kozom syre dosiahol maximálnu koncentráciu S. aureus v 21. h uchovávania syra (N = 5,8.105 KTJ/g) a následne za al po et životaschopných buniek klesa rýchlos ou-0,005 log KTJ/h na kone nú hodnotu 3,8.104 KTJ/g. Koncentrácia E. coli sa po as celého obdobia uchovávania syrov zvýšila o 1 log poriadok s maximálnou hodnotou 2,0.103 KTJ/g. U oboch sledovaných mikroorganizmov nedošlo po as celej doby uchovávania kozieho syra k prekro eniulimitov, ktoré by viedli k znehodnoteniu produktu alebo k produkcii toxínov ohrozujúcich zdravie konzumenta. Hodnoty aktívnej kyslosti poklesli za takmer 7 dní z 5,79 na 5,24 rýchlos ou-0,137 h-1.

Kozí hrudkový syr (25 - 18 °C)

2

3

4

5

6

7

8

9

0 24 48 72 96 120 144 168t [h]

log

KTJ/

ml;

pH

KZ_Laktokoky KZ_EC KZ_SA KZ_Laktobacily pH

Obr. 2: Dynamika rastu mikroorganizmov a zmeny hodnôt pH po as zrenia kozieho hrudkového syra bez prídavku štartovacej kultúry, pri teplote 18 °C

Obr. 3: Vplyv Lactococcus lactis subsp. lactis (N0Lc = 104 a 107 KTJ/ml) na rast Escherichia colipo as súbežnej kultivácie v mlieku pri teplote 18 °C

(N0 EC = 2.2 log KTJ/ml; N0 Lc = 7.4 log KTJ/ml; 18°C)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 12 24 36 48t [h]

log

KTJ

/ml;

pH

EC_LC co-culture pH co-culture

LC_EC co-culture EC mono-culture

(N0 EC = 2.0 log KTJ/ml; N0 Lc = 4.5 log KTJ/ml; 18°C)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 24 48 72 96 120t [h]

log

KTJ

/ml;

pH

EC_LC co-culture pH co-culture

LC_EC co-culture EC mono-culture

134

V dobre vykysnutom ov om alebo kozom hrudkovom syre je rozmnožovanie a prípadná tvorba stafylokokových enterotoxínov potla ená fermenta ným metabolizmom baktérií mlie nehokysnutia. Na zabezpe enie správneho kysnutia nemá, pod a Görnera a Valíka (2002)13 a Heriana (2002)14, po as zrenia hrudkového syra po zasyrení mlieka klesnú priemerná vnútorná teplota syreniny pod 18 °C. Z uvedeného dôvodu sme vykonali subkultiva né pokusy pri tejto, v procese výroby syrov, hrani nej teplote. Dynamika rastu E. coli a S. aureus v syroch bola porovnaná s rastovými parametrami pozorovanými v spolo ných kultiváciách E. coli s istou kultúrou Lactococcus lactis subsp. lactis (N0Lc= 104 a 107 KTJ/ml) a S. aureus a kultúra Fresco 1010 v mlieku pri teplote 18 °C.

Prídavky istej kultúry L. lactis spôsobili zníženie dynamiky rastu E. coli v porovnaní s monokultúrou (obr. 3). Napríklad po iato ná denzita L. lactis 107 KTJ/ml pozastavila rast E. coli na koncentráciách nižších ako v prípade monokultúrnej kultivácie pri 18 °C, kedy kone né po tyE. coli dosiahli hodnotu 7,1.103 KTJ/ml. Hodnota rastovej rýchlosti istej kultúry E. coli v mlieku bez prídavku L. lactis bola pri teplote 18 °C GrEc = 0,229 log KTJ/h, kým v mlieku s vysokým prídavkom laktokoka (107 KTJ/ml) bola rastová rýchlos E. coli o 47 % nižšia (0,121 log KTJ/h).

Vplyv L. lactis na E. coli bol vidite ný aj pri nižšom prídavku L. lactis (104 KTJ/ml), nako ko denzity E. coli v stacionárnej fáze nedosiahli svoje maximálne hodnoty. Pre ilustráciu, pri po iato nej koncentrácii 104 KTJ/ml L. lactis, denzita E. coli v stacionárnej fáze dosahovala hodnotu 3,2.106 KTJ/ml pri 18 °C, kým pri mono-kultúre sa kone né denzity E. coli pohybovali rádovo 108 KTJ/ml. Zvýšený prídavok L. lactis (104 KTJ/ml) viedol aj k zníženiu rastovej rýchlosti E. coli v mlieku z hodnoty Grmono-culture,18 °C = 0,229 log KTJ/h na Grco-culture,18 °C = 0,187 log KTJ/ho 18 %.

Pri štúdiu vplyvu komer nej kultúry baktérií mlie neho kysnutia na rast stafylokoka sme v paralelných pokusoch k po iato ným po tom S. aureus 2064 (poriadkovo 103 KTJ/ml) zámerne pridávali zvyšujúce sa prídavky kultúry Fresco 1010. Po as ich spolo nej kultivácie, dosiahli baktérie mlie neho kysnutia stacionárnu fázu za 32-36h, v priemerných maximálnych po toch Nend_Fr = 109 KTJ/ml. Ich rast bol sprevádzaný tvorbu kyseliny mlie nej, v dôsledku ohov prostredí klesala hodnota pH. Z prezentovaných grafov je zrejmé, že S. aureus rástol len pri nezmenených hodnotách pH prostredia, teda len po as tzv. lag-fázy pH, ktorá sa so zvyšujúcim po iato ným prídavkom kultúry Fresco prirodzene skracovala z takmer 31 hodín, pri po iato nommnožstve kultúry Fresco 103 KTJ/ml, až po 21 hodín pri inokule kultúry Fresco N0_Fr = 105 KTJ/ml. So skrátením d žky lag-fázy pH úzko súvisí aj postupný pokles maximálnych po tov stafylokoka v stacionárnej fáze charakterizovaný jeho nárastom oproti jeho po iato ným po tom.

Obr. 4: Dynamika rastu Staphylococcus aureus 2064 a kultúry Fresco 1010 (No Fr = 2,91 a 5,18 log KTJ/ml) po as spolo nej kultivácie v mlieku pri teplote 18 °C

Na obr. 4 sú uvedené rastové iary pri spolo nej kultivácii S. aureus 2064 s po iato ným

(N0 Fr = 5.18 log KTJ/ml; N0 Sa = 2.68 log KTJ/ml; 18°C)

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 12 24 36 48 60t [h]

log

KTJ

/ml;

pH

SA 2.6 pH FR 5.18 FR 5.18 SA_18

(N0 Fr = 2.91 log KTJ/ml; N0 Sa = 2.91 log KTJ/ml; 18 °C)

2

3

4

5

6

7

8

9

0 12 24 36 48 60t [h]

log

KTJ

/ml;

pH

SA_FR1_18 FR1_18_pH FR03_18 SA_18

135

prídavkom kultúry Fresco N0_Fr = 2,91 KTJ/ml a N0_Fr = 5,18 KTJ/ml. Ako možno z grafov vidie ,na kvalitu a kvantitu pomnoženia patogénneho mikroorganizmu malo vplyv množstvo prítomnej inhibi ne pôsobiacej mikroflóry baktérií mlie neho kysnutia. Pri rovnakých po iato ných po tochobidvoch mikrooorganizmov v spolo nej kultúre, dosiahol S. aureus v stacionárnej fáze maximálnu hodnotu svojich po tov 5,1 log poriadku. Jeho rastová rýchlos v tomto prípade bola GrSa = 0,151 log KTJ/h (Td = 1,99 h), a teda zdvojnásobenie stafylokokovej populácie nastalo za 2 h. So zvýšením po iato ného prídavku kultúry Fresco na hodnotu 5,18 log poriadku, sa znížila rastová rýchlos S. aureus v exponenciálnej fáze takmer 4-násobne (GrSa = 0,044 log KTJ/h; Td = 6,8 h) a jeho maximálne po ty v stacionárnej fáze dosiahli nárast len o 0,7 log poriadku v porovnaní s jeho po tom na za iatku. Naproti tomu, ak rástol S. aureus 2064 v prostredí neovplyvnenom prítomnos ou, vo i nemu inhibi ne pôsobiacimi baktériami mlie neho kysnutia, nadobudol ideálne rastové parametre. S rastovou rýchlos ou v exponenciálnej fáze GrSa = 0,118 log KTJ/h dosiahol v stacionárnej fáze po ty o 4,7 log poriadkov vyššie oproti jeho po iato ným po tom.

Záver V našej práci sme zistili, že po iato ná koncentrácia baktérií mlie neho kysnutia aspo

106 až 107 KTJ/ml, resp. KTJ/g, dokáže udrža zdravotne a technologicky nežiaduce mikroorganizmy pod kontrolou v súlade s legislatívnymi nariadeniami. Rýchly pokles aktívnej kyslosti na hodnoty nižšie ako pH 5,0 zohral významnú úlohu v parciálnej inhibícii rastu S. aureusa E. coli v mlieku i kozom syre, pri om ich kone né denzity dosahovali po ty rovné a nižšie ako 104 KTJ/ml. Nižšie po iato né koncentrácie laktokokov a laktobacilov v ov om syre bez prídavku mezofilnej štartovacej kultúry umožnili relatívne rýchly rast S. aureus a E. coli,pri om ich kone né denzity sa pohybovali v rozmedzí od 105 do 106 KTJ/g.

Teplota fermentácie minimálne 18 °C je vhodná pre spomalenie rastu oboch sledovaných kontaminantov využitím princípov biokonzervácie, o je v súlade s prácou Valíka a kol. (2004)5,pod a ktorej sú teploty 18 až 21 °C ve mi dôležité z technologického h adiska pri výrobe syrov zo surového ov ieho mlieka.

Po akovanie:Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy . APVV-20-005605 a z grantu MŠ VEGA . 1/3488/06.

Použitá literatúra:1. LIPTÁKOVÁ, D. – VALÍK, . – JANOV ÍKOVÁ, L. – HUDECOVÁ, A. Vplyv baktérií mlie neho

kysnutia na rast Escherichia coli pri súbežnej kultivácii v mlieku. In: Mikroorganismy na prahu 21. století. Liberec, 2007, s. 194.

2. MEDVE OVÁ, A. – VALÍK, . – BAJUSOVÁ, B. Kompetitívny ú inok baktérií mlie neho kysnutia na rast Staphylococcus aureus. In: Slovak Journal of Animal Science, ro . 40, 2007, . 4, s. 196-203.

3. NORMANNO, G. - LA SALANDRA, G. - DAMBROSIO, A. et al. Occurance, characterization and antimicrobial resistence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from meat and dairy products. In: International Journal of Food Microbiology, vol. 115, 2007, no. 3, p. 290-296.

4. ASPERGER, H. - ZANGERL, P. Staphylococcus aureus. In: ROGINSKI, H. - FUQUAY, J.W - FOX, P.F.: Encyclopedia of Dairy Science. San Diego: Academic Press, 2002, vol. 4, p. 2563-2569.

5. VALÍK, . - GÖRNER, F. - SONNEVELD, K. - POLKA, P. Faktory ovplyv ujúce fermentáciu ov ieho hrudkového syra na salaši. In: ŠT TINA, J. - URDA, L.: Celostátní p ehlídky sýr , 2004: Výsledky p ehlídek a sborník p ednášek seminá e Mléko a sýry 2004. Praha: eská spole nost chemická, 2004a, s. 85-87. ISBN 978-80-86238-42-5.

6. Nariadenie komisie (ES) . 2073/2005 o mikrobiologických kritériách pre potraviny. 7. JAY, J.M. Staphylococcal Gastroenteritis. In JAY, J.M. Modern Food Microbiology. 6th ed.,

Gaithersburg: Aspen Publisher, Inc., 2000, vol. 23. ISBN 0-8342-1671-X, p. 441-459.

136

8. BAIRD-PARKER, T.C. Staphylococcus aureus. In: LUND, B.M. - BAIRD-PARKER, T.C. - GOULD, G.W.: The Microbiological Safety and Quality of Food. Gaithersburg: Aspen Publishers, Inc., 2000, vol. 1, p. 1317-1330.

9. GÖRNER, F. - VALÍK, . Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava: Malé Centrum, 2004. ISBN 80-967064-9-7.

10. RIVAS, L. - FEGAN, N. - DYKES, G.A. Attachment of Shoga toxigenic Escheriachia coli to stainless steel. In: International Journal of Food Microbiology, vol. 115, 2007, no. 3, p. 89-94.

11. LIM, S.K. - LEE, H.S. - NAM, H.M. et al. Antimicrobial resistence observed in Escherichia coli strains isolated from fecal samples of cattle and pigs in Korea during 2003-2004. In: International Journal of Food Microbiology, vol. 115, 2007, p. 283-286.

12. BURDOVÁ, O. - LAUKOVÁ, A. Zdravotná neškodnos mlieka a mlie nych výrobkov. In: Mliekarstvo,ro . 32, 2001, . 1, s. 22-23.

13. GÖRNER, F. - VALÍK, . Mikrobiologické a technologické otázky výroby ov ieho hrudkového syr a bryndze. In: Mliekarstvo, ro . 33, 2002, . 4, s. 16-17.

14. HERIAN, K. Zásady správnej výroby ov ích hrudkových syrov. In: Mliekarstvo, ro . 33, 2002, . 1, s. 42-45.

Kontaktná adresa:Ing. Alžbeta Medve ová, Ing. Denisa Liptáková, PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika

137

ANTIMIKROBIÁLNÍ AKTIVITA LAKTOBACIL A LAKTOKOKN me ková Irena, Dráb Vladimír, Kle acká Jana, Vilímková Miroslava, Roubal Petr,

Rohacká HanaVýzkumný ústav mlékárenský s.r.o.

Antimicrobial activity of lactobacilli and lactococci

Summary:Antimicrobial activity of lactic acid bacteria was tested. 30 strains of newly isolated lactobacilli of human origin and 10 strains of lactococci from Culture Collection of Dairy Microorganisms Laktoflora® (CCDM) were used. Their ability to inhibit growth of spoilage bacteria B. cereus, B. licheniformis, P. aeruginosa and Cl. butyricum was proved. Organic acids inhibitory effect was excluded by the culture neutralization. Cleavage by catalase or proteinase K was a tool for further characterisation of inhibitory substances. There were 6 strains with strong antimicrobial activity among lactobacilli. The most effective were Lbc. helveticus RL 20-P and Lbc. rhamnosus RL 29-P, that inhibited bacilli and pseudomonases. Lactococci inhibited grampositive bacteria – antimicrobial effect other than caused by acids was found only at the control nisin positive strains Lc. lactis ssp. lactis CCDM 702 a CCDM 731.

ÚvodBakterie mlé ného kvašení mají schopnost tvo it adu slou enin s antimikrobiálními

vlastnostmi. Fermentací cukr vznikají organické kyseliny, které zp sobují pokles pH kultiva níhomédia a okyselení cytoplazmy bun k. Nedisociované formy m ní propustnost membrány a narušují tak bun ný transport1. Dalšími významnými látkami jsou peroxid vodíku, oxid uhli itý a bakteriociny2, což jsou látky bílkovinné povahy, které inhibují bakterie p íbuzných druh 3. Prvním bakteriocinem produkovaným bakteriemi mlé ného kvašení, který byl izolován a schválen pro použití p i výrob sýr , je nisin produkovaný n kterými kmeny Lc. lactis4.

Cílem této práce je charakterizovat nov izolované kmeny laktobacil z hlediska jejich antimikrobiálních vlastností, porovnat jejich ú innost vzhledem k laktokok m a vybrat kmeny se silnou antimikrobiální aktivitou, které by mohly být – po prov ení dalších biochemických a fyziologických vlastností – využity p i potla ování nežádoucí mikroflóry.

MetodikaTestováno bylo 30 kmen laktobacil izolovaných z lidských zdroj a identifikovaných

pomocí test API 50 CHL a 10 kmen laktokok ze sbírky CCDM Laktoflora® (tab. I). Použity byly kultury laktobacil v MRS bujónu (37 °C/16 h anaerobn ) a laktoko v LM17 bujónu (30 °C/16 h).

Antimikrobiální aktivita byla testována v i P. aeruginosa CCM 3955 a izolát m VÚM B. cereus SPA 12, B. licheniformis SPA 9, Cl. butyricum 112. Klostridia byla pomnožena v BB bujónu s resazurinem a laktátem (37 °C/48 h anaerobn ), ostatní technologicky nežádoucí mikroorganismy na GTK agaru (30 °C/24 h) a poté set eny sterilním tamponem do fyziologického roztoku.

Provedena byla vždy dv paralelní stanovení agar well-diffusion metodou a agar spot testem5 na GTK agaru za podmínek vhodných pro daný technologicky nežádoucí kmen. Metodikou dle literatury6 byl testován inhibi ní vliv kultur bakterií mlé ného kvašení v bujónu a neutralizovaných filtrát t chto kultur, v etn filtrát po reakci s katalasou (št pení peroxidu vodíku) nebo proteinasou K (št pení peptidových vazeb).

138

Tabulka I Testované kmeny bakterií mlé ného kvašení RL 1-P Lbc. rhamnosus RL 4-P Lbc. paracasei ssp. paracaseiRL 14-P Lbc. rhamnosusRL 15-P Lbc. salivariusRL 16-P Lbc. fermentumRL 18-P Lbc. rhamnosusRL 19-P Lbc. paracasei ssp. paracaseiRL 20-P Lbc. helveticusRL 21-P Lbc. paracasei ssp. paracasei RL 22-P Lbc. acidophilus RL 23-P Lbc. fermentum RL 24-P Carnobacterium divergens RL 25-P Lbc. fermentum RL 26-P Lbc. plantarum RL 27-P Lbc. fermentum RL 28-P Lbc. buchneri RL 29-P Lbc. rhamnosus RL 30-P Lbc. rhamnosus CCDM 48 Lc. lactis ssp. lactisCCDM 416 Lc. lactis ssp. lactis CCDM 421 Lc. lactis ssp. lactis CCDM 702 Lc. lactis ssp. lactis, nisin produkující CCDM 731 Lc. lactis ssp. lactis, nisin produkující CCDM 823 Lc. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactisCCDM 824 Lc. lactis ssp. cremoris CCDM 885 Lc. lactis ssp. cremoris CCDM 890 Lc. lactis ssp. cremoris CCDM 946 Lc. lactis ssp. cremoris

Výsledky a diskuse Výchozí soubor bakterií mlé ného kvašení byl na základ testování kultur v bujónu zúžen

na ú inné kmeny, jejichž kultury byly neutralizovány, sterilovány filtrací, p ípadn dále ošet eny.Výsledky jsou shrnuty v tab. II. Pro jejich interpretaci je d ležité zjišt ní, že Cl. butyricum je inhibováno samotnou proteinasou a pro P. aeruginosa m že agar spot test poskytovat falešnpozitivní výsledky.

139

Tabulka IIAntimikrobiální ú innost filtrát bakterií mlé ného kvašení (+ inhibuje, - neinhibuje, +/- slabá inhibice, BC – B. cereus, BL – B. licheniformis, PA – P. aeruginosa, CB – Cl. butyricum)

agar well-diffusion assay agar spot test BC BL PA CB BC BL PA CB

neutralizovaný - - - - - - neutr. + katalasa - - - - - - +/- - RL 1-P

neutr. + proteinasa - - - + - - - + neutralizovaný +/- +/- +/- - +/- +/- +/- - neutr. + katalasa +/- +/- +/- - +/- +/- - - RL 4-P neutr. + proteinasa +/- +/- +/- + +/- +/- - + neutralizovaný - +/- +/- - - - + - neutr. + katalasa - +/- +/- - - - + - RL 14-P neutr. + proteinasa - +/- +/- - - - + - neutralizovaný - +/- - + +/- - + - neutr. + katalasa - +/- - + - - + - RL 15-P neutr. + proteinasa - +/- - + +/- - + +/- neutralizovaný +/- +/- - - +/- - + +/- neutr. + katalasa +/- +/- - - +/- - + +/- RL 16-P neutr. + proteinasa +/- +/- +/- - - - + +/- neutralizovaný - - + - - - +/- - neutr. + katalasa - - + - - - - - RL 18-P neutr. + proteinasa - - + + - - - + neutralizovaný - - - - - - - + neutr. + katalasa - - - - - - - - RL 19-P neutr. + proteinasa - - - + - - - + neutralizovaný + + + - + + + - neutr. + katalasa + + + - + + + - RL 20-P neutr. + proteinasa + + + +/- - + + - neutralizovaný +/- +/- +/- - - - + + neutr. + katalasa +/- +/- +/- - - - + + RL 21-P neutr. + proteinasa +/- +/- +/- + - - + + neutralizovaný - - - + + +/- + - neutr. + katalasa - - - + + +/- - - RL 22-P neutr. + proteinasa +/- - - + - +/- - + neutralizovaný + - - - - - - - neutr. + katalasa + - - - - - - - RL 23-P neutr. + proteinasa + - + + - - - +

140

Tabulka II – pokra ováníagar well-diffusion assay agar spot test BC BL PA CB BC BL PA CB

neutralizovaný + - - - + - + - neutr. + katalasa + - - - + - + -

RL 24-P

neutr. + proteinasa + - - + + - + + neutralizovaný + - - + - - + + neutr. + katalasa + - - + - - + +

RL 25-P

neutr. + proteinasa + - - + - - + + neutralizovaný - - - +/- - - + + neutr. + katalasa - - - +/- - - + +

RL 26-P

neutr. + proteinasa - - - +/- - - + + neutralizovaný + - - - + + + +/- neutr. + katalasa + - - - + - + +

RL 27-P

neutr. + proteinasa + - - - + - + + neutralizovaný - - - - + - + - neutr. + katalasa + - - - + - + -

RL 28-P

neutr. + proteinasa - - - + + - + + neutralizovaný + + + - - - + - neutr. + katalasa + + + - - - + -

RL 29-P

neutr. + proteinasa + + - + - - + + neutralizovaný - - + - - - + + neutr. + katalasa - - + + - - + +

RL 30-P

neutr. + proteinasa - - + + - - + + neutralizovaný - - - - - - +/- +/- neutr. + katalasa - - - - - - +/- -

CCDM 48

neutr. + proteinasa - - - +/- - - +/- +/- neutralizovaný - - - - - - + +/- neutr. + katalasa - - - - - - + +/-

CCDM 416

neutr. + proteinasa - - - +/- - - + + neutralizovaný +/- +/- - + + + + + neutr. + katalasa +/- +/- - + + + + +

CCDM 702

neutr. + proteinasa +/- +/- - +/- + + + + neutralizovaný +/- +/- - + + +/- + + neutr. + katalasa +/- +/- - + + +/- + +

CCDM 731

neutr. + proteinasa +/- +/- - +/- + +/- + +

141

Záv rTvorba nejú inn jších antimikrobiálních metabolit nekyselé povahy byla zjišt na

u laktobacil RL 20-P a RL 29-P, které inhibovaly jak testované bacily tak pseudomonády. Dalšími perspektivními kmeny jsou RL 24-P, RL 25-P, RL 26-P, RL 27-P a RL 30-P.

S výjimkou nisin produkujících kmen CCDM 702 a CCDM 731 byla antimikrobiální aktivita laktokok zp sobena tvorbou organických kyselin. Nisin byl ú inný v i testovaným bacil m a klostridiím, avšak ne v i pseudomonádám.

Pod kování:Tato práce vznikla s finan ní podporou MŠMT p i ešení výzkumného zám ru 2672286101 Mléko – významná sou ást zdravé a bezpe né výživy.

Použitá literatura:1. Ammor, S., Tauveron, G.,Dufour, E., Chevallier, I. (2006): Antibacterial activity of lactic acid bacteria

against spoilage and pathogenic bacteria from the same meat small-scalle facility. 1 – Screening and characterisation of the antibacterial compounds. Food Control 17: 454 – 461.

2. Ouwehand, A.C., Vesterlund, S. (2004): v knize Lactic Acid Bacteria. Microbiological and Functional Aspects, str. 375 – 391. Marcel Dekker, New York, 2004.

3. Rodrígez, e., Gonzáles, B., Gaya, P., Nunez, m., Medina, M. (2000): Diversity of bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from row milk. Int. Dairy J. 10: 7 – 15.

4. Christiansen, P., Petersen, M.H., Kask, S., Moller, P.L., Petersen, M., Nielsen, E.W., Vogensen, F.K., Ard , Y. (2005): Anticlostridial activity of Lactobacillus isolated from semi-hard cheeses. Int. Dairy J. 15: 901 – 909.

5. Hernández, d., Cardell, E., Zárate, V. (2004): Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Tenerife cheese: initial characterisation of plantacirin TF711, a bacteriocine-like substance produced by Lactobacillus plantarum TF711. J. Appl. Microbiol. 99: 77 – 84.

6. T ma, 3., Vogensen, F.K., Ard , Y. (2005): Antiklostridiální aktivita laktobacil izolovaných z polotvrdých sýr . Mléka ské listy 93: 18 – 21.

Kontaktní adresa:Ing. Irena N me ková, Výzkumný ústav mlékárenský, s.r.o., Ke Dvoru 12a, 160 00 Praha 6, tel.: +420 235 354 551-2, fax: +420 235 358 607, nemeckova@milcom-as.cz

142

ANTIBAKTERIÁLNÍ Ú INKY FOSFÁTOVÝCH TAVICÍCH SOLÍ NA VYBRANÉ MIKROORGANIZMY KONTAMINUJÍCÍ TAVENÉ SÝRY

Bu ková Leona, Pleva Pavel, Bu ka František Ústav potraviná ského inženýrství FT UTB ve Zlín ,

Antibacterial effect of phosphate-type emulsifying agents against selected microorganisms in processed cheeses

Summary:The article aims to evaluate the impact of 3 different commercially available food-grade phosphate-type emulsifying agents (HBS, S9 and 690) on the 16 tested strains of gram-negative and gram-positive bacteria and on the 13 strains of bacteria, which were isolated from non-sterilized processed cheeses. Five different concentrations (0.1, 0.2, 0.3, 0.4 and 0.5 w/v) of tested salts were evaluated for their effectiveness in inhibiting the growth of tested bacteria. To determine the individual sensitivities of the selected bacterial strains liquid media were supplemented with applied phosphates and for determination of microbial growth the optical density (OD600) was measured. Results show, that emulsifying agents S9 and 690 contained orthophosphates, pyrophosphates and short-chain polyphosphates are generally ineffective against all tested bacteria. The long-chain polyphosphates (in emulsifying salts HBS) were able to inhibit all the tested gram-positives. The minimum inhibitory concentration of the HBS was between 0.2 – 0.3 w/v, which prevented growth of tested gram-positive bacteria in liquid culture. The polyphosphate (HBS) were ineffective against the tested gram-negative bacteria.

Úvod

Fosfáty v potravinách významn ovliv ují vlastnosti p ítomných protein . Jejich ú inek je spojen p edevším s úpravou podmínek prost edí, kde mohou zp sobit zm nu pH, iontové síly roztoku, odšt pení kationt , apod.1 P i výrob tavených sýr se v mlékárenské praxi fosfáty a polyfosfáty (ve form sodných solí) p idávají jako tavicí soli v koncentraci 2-3 % w/w, a to z d vodu zajišt ní jemné a homogenní struktury taveného sýru bez separace vody, tuku a protein 2.

Fosfáty mají funkci tzv. emulgujících inidel upravujících p i výrob tavených sýrprost edí tak, aby p ítomné kaseiny mohly uplatnit své vlastnosti emulgátor . Toho je dosaženo zejména odšt pením vápníku z kyselých aminokyselin a fosfoserylových zbytk proteinové matrice, a dále prost ednictvím peptizace, hydratace a bobtnání bílkovin nebo emulgace tuk 3.Schopnost chelatace kationt je u fosfát ovlivn na nap . po tem monomer v molekule (s rostoucím po tem fosfore nan roste afinita ke kationt m), konkrétním kationtem kovu, teplotou, pH apod. Tato vlastnost se uplat uje i p i výrob tavených sýr , kdy vápenaté ionty jsou od kaseinp itahovány k fosfát m vyššími elektrostatickými silami a naopak na kasein se váží sodné ionty 1,3.Krom již zmín ných vlastností mají fosfáty pufrovací schopnost, mohou ovlivnit tvorbu gelu nebo dokonce inhibi n p sobit na mikroorganizmy 1.

Antimikrobní ú inky fosfát se projevují p edevším na grampozitivní bakterie, n kterémikromycety a kvasinky 4-9. Ú inky fosfát na gramnegativní bakterie bývají v literatu epopisovány z ídka. V laboratorních podmínkách byl zjišt n inhibi ní efekt na Aeromonashydrophila 10. U grampozitivních bakterií je inhibi ní efekt závislý na délce et zce fosfát (fosfáty s delšími et zci mají v tší inhibi ní ú inky než fosfáty s kratšími et zci), na teplot a pH prost edí (vyšší citlivost p i pH > 7,4), po áte ní populaci mikroorganizm nebo p ídavku iont kov 6,11-13.U bakterií tvo ících spory mají polyfosfáty navíc inhibi ní vliv na germinaci spor 7,12,14,15.U Bacillus cereus byl popsán vliv polyfosfát na morfologii bun k rostoucích v exponenciální fázi, což se projeví lyzí bun k a neschopností tvorby septa p i jejich d lení. Subletální koncentrace polyfosfát zp sobují u této bakterie výrazné prodloužení délky jejich bun k, které mohou mít až tvar vláken 12. Princip p sobení polyfosfát s dlouhým et zcem spo ívá v chelataci p edevším divalentních iont kov (Ca2+ a Mg2+), které jsou esenciální pro udržení integrity bun né st nygrampozitivních bakterií tím, že vytvá ejí p í né m stky mezi molekulami teichoových kyselin bun né st ny 16. Chelatace divalentních iont se m že také projevit tak, že tyto ionty jsou nedostupné pro n které nezbytné fyziologické procesy r stu. Bylo zjišt no, že protein zodpov dný

143

p i d lení bun k za tvorbu septa (FtsZ protein) má GTP-ázovou aktivitu, která je striktn závislá na p ítomnosti ho e natých iont 12. Odšt pení výše zmín ných iont pak má za následek baktericidní nebo bakteriolytický efekt 12,16. Bylo rovn ž prokázáno, že p ídavek polyvalentních iont kov do kultiva ního média inhibi ní efekt polyfosfát na mikroorganizmy oslabí 11-13,16.

Krom sledování vlivu polyfosfát na mikroorganizmy v laboratorních podmínkách byly také studovány jejich ú inky na mikroorganizmy v reálných podmínkách. Molins et al.17 zjistili, že p ídavek fosfát m že snížit po et bakterií Clostridium sporogenes na skladovaných masných výrobcích, Suarez et al.8 popsali inhibi ní ú inky komer ních fosfát na mikromycety (Byssochlamys nivea, Aureobasidium pullulans a Penicillium glabrum) izolované z potraviná ských provoz . V literatu e jsou rovn ž popisovány inhibi ní ú inky polyfosfát na bakterie, které mohou zp sobit kažení mlé ných potravin, zejména roztíratelných sýrových výrobk . P ídavek polyfosfátu t chto výrobk m že zpomalit nebo zabránit r stu nežádoucích bakterií tvo ících spory (zejména klostridií), které se mohou podílet na kažení t chto výrobk tvorbou plynu, kyseliny máselné nebo produkcí toxin 7,14,15,18.

Cílem této práce bylo sledovat antimikrobní ú inky t í komer ních tavicích solí na bázi fosfát v r zném kondenza ním stupni na sbírkové mikroorganizmy a následn na bakterie, které byly izolovány z dlouhodob skladovaných tavených sýr .

Materiál a metody

Za ú elem zjišt ní antibakteriálních ú ink fosfátových tavicích solí byly vybrány: (i) HBS – sm s polyfosfát s vysokým kondenza ním stupn m a orthofosfát ; (ii) S9 – sm s polyfosfát(nižší stupe polymerace než HBS) a orthofosfát ; (iii) 690 – sm s orthofosfát a difosfát . HBS a S9 vyrábí BK Ladenburg GmbH, N mecko; 690 produkuje Chemische Fabrik Budenheim, N mecko.

Ú inky tavicích solí na r st mikroorganizm byly sledovány na sbírkových bakteriích a na bakteriích izolovaných z tavených sýr . Pro zjišt ní spektra ú inku testovaných tavicích solí na mikroorganizmy byly vybrány bakterie, které mohou kontaminovat potraviny, pop . mohou mít i klinický význam. Zvoleno bylo 8 gramnegativních bakterií (Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Citrobacter sp., Klebsiella sp., Pseudomonasfluorescens a Flavobacterium sp.) a 8 grampozitivních bakterií (Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus cereus, B. subtilis, B. brevis, B. sphaericus a B. stearothermophilus).

Pro zjišt ní citlivosti vybraných bakterií k fosfátovým tavicím solím bylo použito 5 koncentrací každé z tavicích solí (0,1; 0,2; 0,3; 0,4 a 0,5 % w/v). Mikroorganizmy byly kultivovány v masopeptonovém bujonu (MPB). Tavicí soli byly v p íslušné koncentraci p idány p ímodo tekutého kultiva ního média (pH upraveno na 7,0 pomocí 1M NaOH), které bylo následnautoklávováno (15 min, 121 °C). Média obohacená o p íslušné soli byla rozpipetována do zkumavek po 5 ml a následn zao kována 100 l p es noc narostené kultury bakterií z ed né1:100 (1,8–6,3·106 CFU/ml). Kontrolní vzorky obsahovaly MPB bez fosfátových solí. Testované bakterie byly kultivovány 24 hodin p i 30 °C nebo 37 °C (B. stearothermophilus p i 45 °C), bakterie rod Bacillus a Micrococcus byly kultivovány za t epání. R st mikroorganizm byl zjiš ován spektrofotometricky m ením optické denzity bun k p i 600 nm (OD600)na spektrofotometru s diodovým polem LIBRA S6 (Biochrom, Anglie).

Ve druhé fázi experimentu byly testovány inhibi ní ú inky fosfátových tavicích solí na bakterie, které byly izolovány z hermeticky uzav ených výrobk skladovaných p i 6 ± 2 °C po dobu 18 a 24 m síc . Výrobky obsahovaly 40% w/w sušiny a 45 % w/w tuku v sušin .Z vyizolovaných bakterií byly pro tento experiment vybrány grampozitivní aerobní sporulující ty inky, kataláza pozitivní (izoláty NTS 01, NTS 02, NTS 03, NTS 04, NTS 05, NTS 06) a gramnegativní ty inky kataláza pozitivní, oxidáza negativní (izoláty NTS 07, NTS 08, NTS 09, NTS 10, NTS 11, NTS 12, NTS 13). P es noc narostená kultura bakterií z ed ná 1:100

144

(1,4–7,8·106 CFU/ml) byla zao kována (100 l) do 5 ml MPB obsahujícího p íslušnou tavicí s l a následn inkubována p i 37 °C po dobu 24 hodin, grampozitivní ty inky byly kultivovány za t epání. R st bakterií byl zjiš ován spektrofotometricky stejným zp sobem jako u sbírkových kmen bakterií.

Výsledky a diskuzeEfekt t í komer ních fosfátových tavicích solí s r zným stupn m kondenzace byl testován

u 29 kmen bakterií pomocí spektrofotometrické analýzy nár stu bakterií m ené p i vlnové délce 600 nm. Metoda m ení optické denzity bun k p i 600 nm je vhodnou metodou pro rychlé zjišt ní inhibi ního efektu ur ené látky, v našem p ípad fosfátových tavicích solí, na mikroorganizmy. Minimální inhibi ní koncentrace byla v našem p ípad definována jako množství fosfátové tavicí soli nutné ke snížení optické denzity bakterií pod 0,075, což koresponduje s hodnotou uvedenou v práci Loessner et al.7

Výsledky nazna ují, že nebyl zjišt n výrazný inhibi ní efekt zvolených tavicích solí na gramnegativní bakterie, což je v souladu s našimi d ív jšími studiemi 19. Z tohoto d vodu jsou u gramnegativních bakterií uvád ny pouze ú inky nejvyšších koncentrací (0,5 % w/v) testovaných tavicích soli. Výsledky p sobení zvolených tavicích solí na gramnegativní bakterie jsou shrnuty v tabulce I. Z výsledk je patrné, že u žádné z testovaných tavicích solí nebylo dosaženo koncentrace, která by striktn inhibovala r st testovaných gramnegativních bakterií. V tší efekt byl pozorován pouze u gramnegativních aerobních, kataláza i oxidáza pozitivních ty inek (Ps. fluorescens a Flavobacterium sp.), u kterých došlo k poklesu hodnoty optické denzity bun kv i kontrole o cca 55 %. U gramnegativních ty inek z eledi Enterobacteriaceae k výrazn jšími poklesu nár stu nedošlo. Prakticky zanedbatelné ú inky byly zjišt ny u gramnegativních bakterií, které byly získány z tavených sýr , což m že být vysv tleno tím, že tyto mikroorganizmy byly izolovány z prost edí s tavicími solemi a mohou být k jejich p ítomnosti lépe p izp sobeny než testované sbírkové kmeny bakterií. Uvedené výsledky jsou v souladu s prací Loessner et al.7, kte ítaké nepozorovali inhibi ní efekt tavicích solí s polyfosfáty na sledované gramnegativní bakterie.

Tabulka I P sobení testovaných tavicích solí na gramnegativní bakterie †

Kontrola (OD600)

0.5% HBS 0.5% S9 0.5% 690

Escherichia coli 0.348 0 0 0 Serratia marcescens 0.788 0 + + Salmonella Typhimurium 0.308 + + + Proteus vulgaris 0.976 0 0 + Citrobacter sp. 0.632 + 0 + Klebsiella sp. 0.320 0 + 0 Pseudomonas fluorescens 0.423 ++ ++ + Flavobacterium sp. 0.266 0 + ++ NTS 07 0.766 0 0 0 NTS 08 0.829 0 0 0 NTS 09 0.684 0 0 0 NTS 10 0.745 0 0 0 NTS 11 0.579 0 + 0 NTS 12 0.790 0 + + NTS 13 0.535 0 0 0

† Inhibi ní efekt testovaných látek je vyjád en pomocí procenta optické denzity (OD600)inokulovaného bujonu obsahujícího tavicí s l (v uvedené koncentraci) vztažené v i hodnotoptické denzity (OD600) kontrolního vzorku bez tavicí soli inokulovaného danou kulturou; OD600 25 % +++; 25% < OD600 50 % ++; 50% < OD600 75 % +; OD600 > 75 % 0.

145

Inhibi ní efekt komer ních fosfátových tavicích solí na grampozitivní bakterie je uveden v tabulce II. Z výsledk je patrné, že z testovaných tavicích solí vykazovala výrazn jší inhibi níefekt pouze tavicí s l HBS. U tavicích solí S9 a 690 nebyl zaznamenán významný inhibi ní ú inek. V literatu e jsou publikovány práce 6,11, které zkoumaly inhibi ní ú inky fosfátových solí s r znýmstupn m kondenzace na mikroorganizmy. Tito auto i došli k záv ru, že ím více obsahují tavicí soli polyfosfát s vysokým kondenza ním stupn m, tím je v tší jejich antibakteriální ú inek. Jejich záv ry jsou v souladu s našimi výsledky, kdy na testované bakterie m la nejv tší inhibi ní efekt tavicí s l HBS, která obsahuje polyfosfáty v nejvyšším kondenza ním stupni.

Tavicí s l HBS byla schopna p i koncentraci 0,1 % w/v inhibovat r st bakterií druhBacillus sphaericus a B. stearothermophilus, u kterých nebyl p i této koncentraci pozorován prakticky žádný nár st. U kmen Staphylococcus aureus, Corynebacterium glutamicum a izolátz tavených sýr NTS 01 a NTS 04 byla zaznamenána minimální inhibi ní koncentrace této tavicí soli p i 0,2 % w/v. U ostatních testovaných grampozitivních bakterií (M. luteus, B. cereus, B. subtilis, B. brevis) zastavovala tavicí s l HBS jejich r st v koncentraci 0,3 % w/v. K podobným záv r m dosp li i Loessner et al.7, kte í zjistili, že 0,3% w/v HBS je v laboratorních podmínkách schopna inhibovat r st v tšiny testovaných grampozitivních bakterií. Maier et al.12 testovali ú inkyHBS na morfologii B. cereus a dosp li k záv ru, že koncentrace 0,1 % w/v a vyšší p sobí na tuto bakterii inhibi n tím, že v logaritmické fázi r stu dochází k lyzi bun k této bakterie. Jiní auto i 6,11

ov ovali efekt fosfát na bakterie druhu S. aureus a zjistili, že inhibi ní koncentrace t chto solí se pohybují v rozmezí 0,1 – 0,5 % w/v.

U grampozitivních izolát z dlouhodob skladovaných nesterilovaných tavených sýrdošlo rovn ž v d sledku p sobení tavicí soli HBS k zastavení r stu t chto bakterií. U izolátz tavených sýr byla zjišt na minimální inhibi ní koncentrace soli HBS 0,3 % w/v s výjimkou dvou izolát (NTS 01 a NTS 04), na které již p sobila inhibi n koncentrace nižší (0,2 % w/v). Zajímavé je p sobení HBS na dva izoláty, NTS 02 a NTS 05. Nižší koncentrace této soli m ly na zmín nébakterie minimální ú inky, zatímco koncentrace 0,3 % w/v p sobila už inhibi n . Takové chování bakterií m že být zp sobeno tím, že tyto kmeny byly izolovány z tavených sýr a lze u nich p edpokládat lepší p izp sobení k p ítomnosti fosfátových tavicích solí, které tak mohou v nižších koncentracích tolerovat.

Hodnoty minimální inhibi ní koncentrace HBS jsou v laboratorních podmínkách pom rnnízké. Lze p edpokládat, že v komplexní matrici, jakou jsou nap . tavené sýry, bude nutno minimální koncentraci, která bude mít inhibi ní efekt na p ítomné mikroorganizmy, zejména pak bakterie tvo ící spory, zvýšit. Tento p edpoklad potvrzují i výsledky již publikovaných prací 7,15,ve kterých je pro zpomalení r stu nežádoucí mikroflóry tavených sýr doporu ována koncentrace polyfosfátových tavicích solí alespo 0,5 %.

Záv r

V laboratorních podmínkách bylo zjišt no, že z fosfátových tavicích solí má výrazné antibakteriální ú inky pouze tavicí s l HBS obsahující sm s polyfosfát s vysokým kondenza ním stupn m a orthofosfát na testované grampozitivní bakterie. U gramnegativních bakterií nebyl pozorován výrazn jší efekt. U tavicích solí S9 a 690 nebyla zaznamenána striktní inhibice u žádného z testovaných kmen bakterií. Lze tedy íci, že inhibi ní efekt tavicích solí na mikroorganizmy je závislý na kondenza ním stupni polyfosfát .

Pod kováníPráce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM 7088352101.

Kontaktní adresa:Mgr. Leona Bu ková, Ph.D., Ústav potraviná ského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , nám. T. G. Masaryka 275, 762 72 Zlín, tel. +420 576 031 511, e-mail: bunkova@ft.utb.cz

146

147

Použitá literatura:1. Molins, R.A. (1991). Phosphates in food. Boca Raton: CRC Press, 261 s. 2. Cari , M., Gantar, M., and Kaláb, M. (1985). Effects of emulsifying agents on the microstructure and

other characteristics of process cheese – a review. Food Microstructure, 4, 297-312. 3. Guinee, T. P., Cari , M., and Kaláb, M. (2004). Pasteureized processed cheese and substitute/imitation

cheese products. In Fox, P.F. et al., Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2: Major cheese groups. 3. ed. (pp. 349–394). London: Elsevier Applied Science.

4. Kim, T.J., Jeong, C.J., Park, K.Y., Shin, J.W., and Lee, J.Y. (2002). Anti-candidal effect of polyphosphate. Journal of Bacteriology and Virology, 32, 381-391.

5. Knabel, S.J., Walker, H.W., and Hartman, P.A. (1991). Inhibition of Aspergillus flavus and selected Gram-positive bacteria by chelation of essential metal-cations by polyphosphates. Journal of Food Protection, 54. 360-365.

6. Lee, R.M., Hartman, P.A., Olson, D.G., and Williams, F.D. (1994). Bactericidal and bacteriolytic effects of selected food-grade phosphates, using Staphylococcus aureus as a model system. Journal of Food Protection, 57, 276-283.

7. Loessner, M.J., Maier, S.K., Schiwek, P., and Scherer, S. (1997). Long-chain polyphosphates inhibit growth of Clostridium tyrobutyricum in processed cheese spreads. Journal of Food Protection, 60, 493-498.

8. Suarez, V.B., Frison, L., De Basilico, M.Z., Riveira, M., and Reinheimer, J.A. (2005). Inhibitory activity of phosphates on molds isolated from foods and food processing plants. Journal of Food Protection, 68, 2475-2479.

9. Zaika, L.L. and Kim, A.H. (1993). Effect of sodium polyphosphates on growth of Listeriamonocytogenes. Journal of Food Protection, 56, 577-580.

10. Velazquez, L.D., Escudero, M.E., and de Guzman, A.M. (2001). Antibacterial effects of different food-related phosphates using Aeromonas hydrophila. Journal of Food Protection, 64, 195-200.

11. Jen, C.M.C. and Shelef, L.A. (1986). Factors affecting sensitivity of Staphylococcus aureus 196E to polyphosphates. Applied and Environmental Microbiology, 52, 842-846.

12. Maier, S.K., Scherer, S., and Loessner, M.J. (1999). Long-chain polyphosphate causes cell lysis and inhibits Bacillus cereus septum formation, which is dependent on divalent cations. Applied and Environmental Microbiology, 65, 3942-3949.

13. Zaika, L.L., Scullen, J., and Fanelli, J.S. (1997). Growth inhibition of Listeria monocytogenes by sodium polyphosphate as affected by polyvalent metal ions. Journal of Food Science, 62, 867-872.

14. Eckner, K.F., Dustman, W.A., and Rysrodriguez, A.A. (1994). Contribution of composition, physicochemical characteristics and polyphosphates to the microbial safety of pasteurized cheese spreads. Journal of Food Protection, 57, 295-300.

15. Varga, L. (2005). Use a long-chain polyphosphate mixture for shelf-life extension of processed cheese spreads. Acta alimentaria, 34, 493-498.

16. Lee, R.M., Hartman, P.A., Stahr, H.M., Olson, D.G., and Williams, F.D. (1994). Antibacterial mechanism of long-chain polyphosphates in Staphylococcus aureus. Journal of Food Protection, 57, 289-294.

17. Molins, R.A., Kraft, A.A., Walker, H.W., and Olson, D.G. (1985). Effect of poly- and pyrophosphates on the natural bacterial flora and inoculated Clostridium sporogenes PA 3679 in cooked vacuum packaged bratwurst. Journal of Food Science, 50, 876-880.

18. Briozzo, J., de Lagarde, E.A., Chirife, J., and Parada, J.L. (1983). Clostridium botulinum type A growth and toxin production in media and process cheese spread. Applied and Environmental Microbiology, 45, 1150-1152.

19. echová, L., Nováková, A., and Bu ka, F. (2007). Vliv p ídavku r zných druh tavicích solí na r stvybraných mikroorganizm . In Sborník XVI. konference mladých mikrobiolog – Tomáškovy dny 2007, Brno, LF MU, s. 9.

148

ANTIFUNGÁLNÍ AKTIVITA KYSELINY OCTOVÉ A MLÉ NÉ NA PLÍSE RODU FUSARIUM

Šantinová Eva, Chumchalová Jana, Ondrá ková Iva, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha

Antifungal activity of acetic and lactic acid against Fusarium strains.

Summary:The aim of this work was to observe the influence of lactic acid and acetic acid at the concentrations produced by lactobacilli strains on the growth of Fusarium culmorum 301, Fusarium culmorum 302,Fusarium graminearum 608 and Fusarium graminearum 821. The inhibitory activity of acids was detected by agar diffusion method. Organic acids were applied at concentrations between 10 and 500 mmol/l. The active acidity of acids was adjusted to pH 3. Monitoring of inhibition zones was investigated after seven days cultivation. The activity of both acids against Fusarium culmorum 301 followed the trend of increasing inhibition depending on rising value of acid concentration. In case of Fusarium culmorum 302, well – observed inhibition zones originated, too. Fusarium graminearum 608 and Fusarium graminearum 821 were more resistant against acetic acid treatment. Lactic acid showed no effect on Fusarium graminearum 608and Fusarium graminearum 821.

ÚvodOrganické kyseliny jsou metabolické produkty, které vznikají zkvašováním sacharid

bakteriemi mlé ného kvašení. Tyto kyseliny zp sobují pokles pH a tím potla ují r st patogenních mikroorganism , tedy i plísní. Mlé né bakterie, p edevším zástupci rodu Lactobacillus, vykazují produkci sm si organických kyselin. V nejvyšších koncentracích jsou produkovány kyselina mlé ná, octová a kapronová, a proto mají nejv tší vliv. Zmín né kyseliny mohou inhibovat i stimulovat r st plísn nebo potla it tvorbu i ú innost mykotoxinu1-3.

Cílem této práce bylo sledovat kultiva ní metodou vliv kyseliny mlé né a octové na r stplísn Fusarium culmorum 301, Fusarium culmorum 302, Fusarium graminearum 608 a Fusariumgraminearum 821.

Materiál a metody

Kmeny plísní Kmeny plísní Fusarium culmorum 301, Fusarium culmorum 302, Fusarium graminearum608 a Fusarium graminearum 821, pocházejí z Výzkumného ústavu rostlinné výroby, Odd leníšlechtitelských metod, Praha, eská republika.

KyselinyKyselina mlé ná 90 %, M = 90,08 g/mol, 1210 g = 1000 ml Kyselina octová 99,5 %, M = 60,05 g/mol

Byly p ipraveny pracovní roztoky kyselin o koncentraci 10, 50, 100, 300 a 500 mmol/l. Roztoky kyselin byly upraveny na hodnotu pH 3 pomocí 10 % NaOH.

Agarová difusní metoda Na každé Petriho misce obsahující vrstvu 25 ml 1 % hm. bakteriologického agaru byl

vytvo en vrt. Do n j se napipetovalo 450 l roztoku kyseliny o p íslušné koncentraci. Poté byly misky p elity 10 ml soft PD agaru obsahujícího 105 spor p íšlušného kmene plísn . Následovala inkubace p i 30 °C po dobu 7 dní. Sledoval se vznik p ípadné vyjasn né inhibi ní zóny, tedy potla ení r stu plísn v okolí vrtu. Kontrolou byla miska obsahující ve vrtu pouze sterilní destilovanou vodu.

149

VýsledkyNa základ sledování antifungální aktivity kyseliny mlé né a octové agarovou difuzní

metodou byl zjišt n jejich inhibi ní ú inek na 4 kmeny plísn rodu Fusarium.Dle Tab. I popisující vliv obou kyselin na Fusarium culmorum 301 je možno sledovat

trend vzr stající inhibice spole n s rostoucí koncentrací kyselin. Inhibice byla viditelná až od koncentrace 50 mmol/l. Kyselina mlé ná potla ovala plíse mén než kyselina octová.

Fusarium culmorum 302 bylo potla eno kyselinami tém ve stejné mí e jako Fusariumculmorum 301, rozdíl byl pouze v ú inku kyseliny octové o koncentraci 500 mmol/l. Tato koncentrace zp sobila velmi silnou inhibici této plísn (Tab. II).

Plíse Fusarium graminearum 608 vykazovala oproti dv ma p edešlým plísním v ip sobení kyseliny octové již v tší odolnost, kyselina mlé ná tuto plíse nepotla ila v bec (Tab. III).

Fusarium graminearum 821 bylo potla eno kyselinou octovou až od koncentrace 100 mmol/l, koncentrace 300 a 500 mmol/l zp sobily totální inhibici této plísn . Kyselina mlé nážádný ú inek na tuto plíse nevykázala (Tab. IV), tak jak to bylo zaznamenáno i u kmene Fusarium graminearum 608.

Kyselina octová byla ú inná proti všem ty em sledovaným kmen m plísn . Kyselina mlé ná inhibovala oba dva kmeny plísn Fusarium culmorum, zbylé dva kmeny Fusariumgraminearum byly v i p sobení této kyseliny rezistentní.

Tabulka I Inhibi ní ú inek kyseliny octové a mlé né na plíse Fusarium culmorum 301Koncentrace kyseliny [mmol/l] Aktivita kyseliny octové Aktivita kyseliny mlé né

10 - - 50 + + + 100 + + + + 300 + + + + + + + + 500 + + + + + + + +

Tabulka II Inhibi ní ú inek kyseliny octové a mlé né na plíse Fusarium culmorum 302Koncentrace kyseliny [mmol/l] Aktivita kyseliny octové Aktivita kyseliny mlé né

10 + + 50 + + 100 + + 300 + + + + 500 + + + + + +

Tabulka III Inhibi ní ú inek kyseliny octové a mlé né na plíse Fusarium graminearum 608Koncentrace kyseliny [mmol/l] Aktivita kyseliny octové Aktivita kyseliny mlé né

10 - - 50 - - 100 + - 300 + + + - 500 + + + -

150

Tabulka IV Inhibi ní ú inek kyseliny octové a mlé né na plíse Fusarium graminearum 821Koncentrace kyseliny [mmol/l] Aktivita kyseliny octové Aktivita kyseliny mlé né

10 - - 50 - - 100 + - 300 + + + + + - 500 + + + + + -

- … žádná inhibi ní aktivita + … náznak inhibice + + … inhibice + + + … siln jší inhibice + + + + … velmi silná inhibice + + + + + … totální inhibice

Diskuse

Bakterie mlé ného kvašení jsou schopné r st v mléce. V mlékárenství se využívá p i výrob fermentovaných mlé ných výrobk mimo jiné jejich schopnosti produkovat organické kyseliny. Koncentrace naprodukovaných kyselin uvád né ve studiích jsou rozdílné v závislosti na použitém médiu a kmeni. V MRS bujónu produkovaly kmeny laktobacil kyselinu mlé nouo koncentraci 400 až 851 mM/l, kyselinu octovou o koncentraci 25 až 150 mM/l. V obnoveném odst ed ném mléce byla kyselina mlé ná naprodukována v koncentraci 13 až 127 mM/l, kyselina octová v koncentraci 8 až 100 mM/l 4. Z výsledk m ení vyplývá, že koncentrace kyseliny octové, která m že být naprodukována v obnoveném odst ed ném mléce, m že zp sobit až totální inhibici všech testovaných kmen rodu Fusarium. V p ípad kyseliny mlé né ani nejvyšší testovaná koncentrace (500 mmol/l), které m že být dosaženo kultivací kmen laktobacil v MRS bujónu, neinhibovala r st dvou plísní druhu Fusarium graminearum.

Také ve studii zabývající se p sobením kyseliny mlé né na fusaria bylo zjišt no,že samotná kyselina mlé ná použitá v koncentraci odpovídající produkci kmenem Lactobacillusplantarum, zp sobila pouze 6-20 % inhibici dvou kmen Fusarium avenaceum ve srovnání s filtrátem získaným po kultivaci kmene v MRS bujónu. V p ípad p sobení na Fusarium culmorum a Fusarium graminearum nebyla pozorována žádná inhibice3. Stejné výsledky byly zaznamenány také v našem p ípad p i testování kmen Fusarium graminearum.

V jiné studii byla sledována produkce organických kyselin kmenem Lactobacillussanfrancisco CB1 a jejich ú innost na plísn . Bylo stanoveno, že tento kmen produkuje široké spektrum organických kyselin (nap . octová, kapronová), které jsou aktivní v i plísni Fusariumgraminearum 5.

Záv rV provedeném pokusu byly získány výsledky, které by mohly být v budoucnu zohledn ny

p i výrob potravin. Aktivita testovaných kyselin by mohla být využita v kombinovaných fermentovaných výrobcích na bázi mléka a rostlinných produkt , protože rod Fusarium je astým kontaminatem obilovin a kuku ice.

Pod kování:Tato práce vznikla s podporou výzkumného zám ru CEZ: MSM 6046137305 a projektu CZ – HU: 4 – 2007 – 5.

151

Použitá literatura:1. Gourama H. and Bullerman L. B. (1995): Antimycotic and antiaflatoxigenic effect of lactic acid bacteria:

a review. J. Food Prot. 57: 1275-1280. 2. Plocková M., Stiles J., Chumchalová J. and Halfarová R. (2001): Control of mould growth by

Lactobacillus rhamnosus VT1 and Lactobacillus reuteri CCM 3625 on milk agar plates. Czech J. Food Sci. 19: 46-50.

3. Laitila A., Alakomi H-L., Raaska L., Mattila-Sandholm T. and Haikara A. (2002): Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro and in malting barley. J. Appl. Microbiol. 93: 566-576.

4. Hudá ek J., Zalán Z., Chumchalová J. a Halász A.: Protektivní vlastnosti vybraných kmen rodu Lactobacillus. Celostátní p ehlídky sýr , Praha – leden 2007, Výsledky p ehlídek a sborník p ednášekseminá e Mléko a sýry 2007, Praha, R, 24.-25.1.2007, str.67 – 73, vydavatel SCH.

5. Corsetti A., Gobetti M., Rossi J. and Daminiani P. (1998): Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of mixture of organic acids by Lactobacillus sanfrancisco CB1: Appl. Biotechnol. 50: 253-256.

Kontaktní adresaEva Šantinová (eva.santinova@seznam.cz), Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT, Praha, Technická 5, 16628 Praha 6

152

VYUŽITIE METÓDY RAMP (RANDOMLY-AMPLIFIED MICROSATELLITE POLYMORPHISM) NA TYPIZÁCIU BAKTÉRIÍ MLIE NEHO KYSNUTIA

ZO SLOVENSKEJ BRYNDZE Chebe ová Viera1, Bertaová Gabriela1, Kuchta Tomáš1, Pangallo Domenico2

1 Výskumný ústav potravinársky, Bratislava; 2 Ústav molekulárnej biológie SAV, Bratislava

Application of ramp (randomly-amplified microsatellite polymorphism) method for typing of lactic acid bacteria from slovakian bryndza cheese

Summary:Lactid acid bacteria (LAB) belong to the predominant natural microflora of the sheep cheese Slovakian bryndza, which play an important role in its quality and safety. LAB strains were isolated by selective cultivation on MRS medium and identified on the basis of morphology and biochemical features (evaluated by test API 50CHL). From selected colonies, DNA was isolated and genotypic characterization was carried out by PCR producing randomly-amplified microsatellite polymorphism (RAMP). RAMP demonstrated a good discrimination and made it possible to differentiate genera Lactobacillus, Lactococcus and Pediococcus.

ÚvodBaktérie mlie neho kysnutia (lactic acid bacteria, LAB) predstavujú najviac zastúpenú

prirodzenú mikroflóru Slovenskej bryndze, spomedzi ktorých zástupcovia rodov Lactobacillusa Lactococcus sú najviac zodpovední za jej kvalitu a zdravotnú neškodnos . Metodickým problémom pri identifikácii baktérií mlie neho kysnutia zo Slovenskej bryndze je ve ký po et izolátov s nerozlíšite nou morfológiou kolónií. Druhovú identifikáciu je možné vykona pomocou mikrobiologických a biochemických skúšok, o je však pri spracovaní vä šieho po tu vzoriek a kolónií asovo resp. finan ne ve mi náro né. Na tento ú el je možné použi viacero DNA-metód založených na polymorfizme fragmentov amplifikovaných pomocou polymerázovej re azovej reakcii (PCR) [1]. Ke že však je ažké vybra metódu, ktorá by bola na danom súbore bakteriálnych druhov dostato ne diskriminatívna a sú asne jednoduchá i reprodukovate ná, cie om tejto práce bolo vyskúša v tejto aplikácii metódu RAMP (randomly-amplified microsatellite polymorphism). Táto metóda bola pôvodne vyvinutá na analýzu rastlín a je založená na PCR s jedným primérom náhodným a s druhým primérom orientovaným na sekvenciu mikrosatelitu, pri om sa používajú reak né podmienky s nízkou selektivitou.

Materiál a metódyMikroorganizmy

Vzorku Slovenskej bryndze (plnotu ná letná bryndza z Hornej Sú e) sme spracovali štandardnou mikrobiologickou technikou a analyzovali na selektívnom médiu MRS Lactobacillus agar (Merck, Darmstadt, Nemecko; anaeróbna kultivácia pri 37 ºC po as 3 až 5 dní).

Z vyrastených kolónií na MRS Lactobacillus agare sme na základe kolóniovej morfológie náhodne vybrali 20 kolónii, ktoré sme podrobili morfologickej, fyziologickej (farbenie pod aGrama, katalázová skúška, KOH test, rast baktérií v zvislom agarovom st pci, tvorba plynu z glukózy) a biochemickej analýze s identifika ným systémom API 50CHL (BioMérieux, Marcy l'Étoile, Francúzsko).

Izolácia DNA DNA sme z odobratých kolónií izolovali použitím súpravy InstaGene (Bio-Rad, Hercules, California, USA) pod a návodu výrobcu.

Amplifikácia DNA PCR sme robili v objeme 25 μl reak nej zmesi s primérmi K7 5´CAACTCTCTCTCTCT

3´a 1254 5´CCGCAGCCAA 3´ [2]. Reak ná zmes sa skladala z 1× koncentrovaného tlmivého roztoku, MgCl2 3,5 mmol.l-1, 1,25 U HotStarTaq Plus polymerázy (Qiagen, Hilden, Nemecko), 700 mmol.l-1 priméru K7, 700 mmol.l-1 priméru 1254 a 240 mmol.l-1 každého dNTP (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Amplifikácia prebiehala v cykléri Personal Cycler

153

(Whatman Biometra, Göttingen, Nemecko) s teplotným programom pozostávajúcim z úvodnej denaturácie pri 95 ºC po as 15 min a z 30 cyklov amplifikácie (denaturácia pri 94 ºC po as 60 s, annealing pri 40 ºC po as 90 s, polymerizácia pri 68 ºC po as 180 s) a závere nej polymerizácie pri 68 ºC po as 10 min [3]. PCR produkty sa analyzovali elektroforézou v 1,5% agarózovom géli SeaKem LE (FMC Bioproducts, Rockland, Maine, USA).

Výsledky a diskusia

Metódu sme použili na RAMP-typizáciu 20 izolátov zo vzorky Slovenskej bryndze z výrobne Horná Sú a, ktoré sme vopred charakterizovali na základe morfologických a biochemických vlastností (tab. I). Pre jednotlivé kmene sa získalo 7 - 16 fragmentov DNA o ve kosti pribl. 186 bp - 2220 bp (obr. 1, obr. 2). Na základe získaných RAMP-profilov bolo možné identifikova 8 genotypov (tab. II).

Získané výsledky predbežne poukazujú na dobrú diskriminatívnos metódy RAMP v rámci rodov Lactobacillus, Lactococcus a Pediococcus.Na riadne posúdenie parametrov metódy je však potrebné analyzova vä ší po et alších kme ov.

Obr. 1. RAMP-profily izolátov zo Slovenskej bryndze uvedených v tab. 1.: 1 - 3 A/1, 2 - 3 A/2, 3 - 3 A/3, 4 - 3 A/4, 5 - 3 A/5, 6 - 3 A/6, 7 - 3 A/7, 8 - 3 A/8, 9 - 3 A/9, 10 - 3 A/10, 11 - 3 A/8, 12 - 3 B/6, L - štandard molekulových hmotnosti - n x 250 bp (Invitrogen, Carlsbad, California, USA).

154

Obr. 2. RAMP-profily izolátov zo Slovenskej bryndze uvedených v tab. 1.: 1 - 3 B/5, 2 - 3 B/6, 3 - 3 B/7, 4 - 3 B/3, 5 - 3 B/4, 6 - 3 B/2, 7 - 3 B/4, 8 - 3 B/1, 9 - 3 B/9, 10 - 3 B/8, L - štandard molekulových hmotnosti - n x 250 bp (Invitrogen, Carlsbad, California, USA).

Tabu ka IZoznam a popis izolovaných kme ov zo Slovenskej bryndze.

íslokme a

morfológiakolónií

kat.test

KOHtest

tvorbaplynu

rastpri

15ºC

rastpri

45ºCAPI 50 CHL

3 A/1 ty inky - - - + - Lb. plantarum 3 A/2 ty inky - - + - + Lb. fermentum 3 A/3 ty inky - - - + - Lb. plantarum**

3 A/4 ty inky - - - + - Lb. paracasei ssp. paracasei3 A/5 ty inky - - - + - Lb. plantarum*

3 A/6 ty inky - - - + - Lb. plantarum3 A/7 ty inky - - - + - Lb. collinoides 3 A/8 ty inky - - + - + Lb. fermentum**

3 A/9 ty inky - - + + - Lb. paracasei ssp. paracasei3 A/10 ty inky - - - + - Lb. paracasei ssp. paracasei3 B/1 tetrády - - - + - Lb. curvatus 3 B/2 ty inky - - + + - Lb. collinoides 3 B/3 ty inky - - - + - Lb. curvatus 3 B/4 ty inky - - + - + Lb. fermentum**

3 B/5 koky - - - - + Lc. lactis ssp. lactis3 B/6 koky - - - - + Lc. lactis ssp. lactis**

3 B/7 tetrády - - - + - Pediococcus spp. 3 B/8 ty inky - - - + - Lb. plantarum3 B/9 ty inky - - - - + Lb. crispatus

3 B/10 tetrády - - - + - Pediococcus spp.**

* identifikácia na úrovni 36,5% pod a API ** identifikácia na základe iastkových výsledkov

155

Tabu ka II Zoznam kme ov pod a RAMP typov.

RAMP typ Príklad (kme )1 3 A/1, 3 A/3, 3 A/5, 3 A/6, 3 B/8 2 3 A/2, 3 A/8, 3B/4 3 3 A/4, 3 A/9, 3 A/10, 3 B/3 4 3 B/1, 3 B/7, 3 B/10 5 3 B/5, 3 B/6 6 3 A/7 7 3 B/2 8 3 B/9

Použitá literatúra:1. Drahovská, H. - Kuchta, T.: Typizácia baktérií založená na analýze DNA. Bulletin potravinárskeho výskumu, 41, 2002, s. 149-161. 2. Wu, K. S. - Jones, R. - Danneberger, L. - Scolnik, P. A.: Detection of microsatellite polymorphism without cloning. Nucleic Acids Research, 22, 1994, s. 3257-3258. 3. Pangallo, D. - Karpíšková, R. - Tur a, J. - Kuchta, T.: Typing of food-borne Listeria monocytogenes by the optimized repetitive extragenic palindrome-based polymerase chain reaction. New Microbiologica, 25, 2002, s. 449-454.

Kontaktná adresa:Ing. Viera Chebe ová, Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, 824 75 Bratislava 26, Slovensko. chebenova@vup.sk

156

PCR-TYPIZÁCIA PSEUDOMONÁD IZOLOVANÝCH Z OV IARSKYCH PREVÁDZOK Kostolníková Mária1, Bertaová Gabriela2, Pangallo Domenico3, Kore ová Janka1

1 Výskumný ústav potravinársky Bratislava, pracovisko Modra,2 Výskumný ústav potravinársky, Bratislava, 3 Ústav molekulárnej biológie SAV, Bratislava

PCR – Typing of Pseudomonas isolates obtained from sheep plants

Summary:Microbial contaminants of working surfaces from sheep milk- and cheese-processing plants were isolated for purposes of surveing their adherence ability on solid surfaces and potential biofilm formation. This ability was manifested in all isolates of Pseudomonas genus, which according to the literature is relatively resistant towards the external influence and disinfectants, with a high ability of biofilm formation. Humid environments provide good conditions for the growth of cultures of this genus, in which it contaminates rubber and plastic surfaces and containers. On the basis of morphological and biochemical identification by Neferm test (Lachema), the isolates were classified to belong to Pseudomonas aeruginosa species (20 strains). Out of these, DNA was isolated and typisation was done by two methods, namely, repetetive extragenic palindrome polymerase chain reaction (REP-PCR) and the random amplified microsatellite polymorphic DNA (RAMP). Ps. aeruginosa CCM 1960, CCM 1961 and CCM 3955 were used as reference strains. The methods were optimized by the selection of the suitable temperature program. Both methods facilitated differentiation of Pseudomonas aeruginosa strains.

ÚvodZo 4 prevádzok spracúvajúcich ov ie mlieko a syry (výrobných zariadení a výrobkov) sa

izolovali kontaminujúce baktérie, a to gramnegatívne a grampozitívne baktérie z rodov Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Pseudomonas a z e ade Enterobacteriaceae za ú elom zistenia schopnosti bakteriálnych kme ov tvori biofilm na tuhých povrchoch. Táto vlastnosbaktérií je dôležitá, pretože tým sa stávajú potenciálne odolnými vo i bežným istiacima dezinfek ným postupom [1].

Najvyššiu schopnos adherencie na testované tuhé povrchy preukázalo 20 izolátov z rodu Pseudomonas. Ide o G-, pohyblivé, striktne aeróbne pali ky, oxidáza-pozitívne aj negatívne, kataláza-pozitívne, na prostredie a živiny ve mi prispôsobivé, psychrotrófne, tvoriace žltozeleno fluoreskujúci, modrozelený a zelený pigment. Sú ve mi rezistentné vo i nepriaznivým vplyvom prostredia a môžu sa rozmnožova aj pri nízkej teplote a pri minimálnom obsahu živín, ale v prostredí s dostato nou vlhkos ou. Ich zdrojom môže by kontaminovaná pitná voda, umývadlové misy, škáry v dlážke, klimatiza né zariadenia, zvlh ova vzduchu, voda v kvetinových vázach, stroje na umývanie kuchynského a jedálenského riadu, nedostato ne istené a dekontaminované plochy, najmä v prvovýrobe mlieka a mlieko, ktoré s týmito plochami prišlo do styku. Pre ich rezistenciu odolávajú aj ú inkom niektorých dekontamina ných inidiel, a preto sa z prostredia ažko eliminujú. Tento rod je v prírode zna ne rozšírený a niektoré kmene z tohoto rodu sú patogénne, po rozmnožení v potravine spôsobujú alimentárnu otravu [2, 3].

Cie om tejto práce bolo identifikova izoláty pomocou klasických fenotypických metód a navrhnú ako pomerne rýchlu a jednoduchu alternatívu molekulárno-biologickú metódu REP-PCR (repetitive extragenic palindrome-based polymerase chain reaction) a RAMP (random amplified microsatellite polymorphic). Sú as ou práce bolo overenie aplikovate nosti týchto typiza ných metód na súbore izolovaných kme ov Pseudomonas sp.

Materiál a metódyIzolácia a druhová identifikácia biochemickými testami:

Vzorky z nerezových povrchov výrobných zariadení sme odoberali priamo v prevádzkach vatovým tampónom z plochy 100 cm2. Vzorky z ov ieho mlieka, ov ej hrudky, erstvého ov ieho a údeného syra sme spracovali štandardnou mikrobiologickou technikou. Ako kultiva né médium bolo pre izoláciu pseudomonád použité médium Pseudomonas Isolation Agar (HiMedia). Zo selektívneho média sa vybrali typické kolónie pseudomonád, ktoré sa inokulovali na GTK agar (HiMedia), pri om kultivácia prebiehala pri 37ºC po as 24-48 h. Po overení istoty kultúry, farbení pod a

157

Grama a mikroskopickom hodnotení morfológie sa kmene identifikovali na základe biochemických testov súpravou NEFERMtest 24 (Mikrolatest, Lachema).

Polymerázová re azová reakcia:· DNA sa izolovala použitím InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA). · Polymerázová re azová reakcia prebiehala v 25 μl reak nej zmesi s primérmi pre RAMP - K7:5´CAACTCTCTCTCTCT3´, 1254: 5´CCGCAGCCAA3´ [4] a pre REP-PCR – REP 1R-I: III ICG ICG ICA TCI GGC a REP 2-I: ICG ICT TAT CIG GCC TAC [5]. · Zloženie reak nej zmesi: tlmivý roztok - 1× koncentrovaný, MgCl2 - 2,5 mmol.l-1, HotStarTaq Plus polymeráza - 1,25 U, priméry - 700 mmol.l-1, každý dNTP - 240 mmol.l-1.· Amplifikácia prebiehala v cykléri Biometra Personal (Whatman Biometra, Göttingen, Nemecko) s teplotným programom: - úvodná denaturácia 95ºC, 15 min; - 30 cyklov amplifikácie - denaturácia: 94ºC, 60 s; - annealing: 40ºC, 90 s; - polymerizácia: 68ºC, 180 s; - závere ná polymerizácia: 68ºC, 10 min. PCR produkty sa analyzovali elektroforézou v 1,5% agarózovom géli (SeaKem LE Agarose, FMC Bioproducts) [6].

Výsledky a záver Všetky izoláty boli identifikáciou druhovo zaradené ako Pseudomonas aeruginosa (tab. I)

Tabu ka I Zoznam izolovaných a identifikovaných kme ov rodu Pseudomonas z ov iarskej prevádzky.

ozna eniekme a zdroj výskytu ozna enie kme a zdroj výskytu

2/15/P1 ov ia hrudka 6 dní 2/13/P1 ov ia hrudka 24 h 2/15/P2 ov ia hrudka 6 dní 2/13/P2 ov ia hrudka 24 h7/4/P1 nerez filter 2/13/P3 ov ia hrudka 24 h7/4/P2 nerez filter 2/14/P2 ov ia hrudka 48 h 7/1M/P1 ov ie mlieko 2/14/P3 ov ia hrudka 48 h 7/1M/P2 ov ie mlieko 2/17/P1 ov ie mlieko 7/2 S/P1 erstvý ov í syr 2/17/P2 ov ie mlieko 7/2 S/P2 erstvý ov í syr 7/3US/P1 údený syr 7/2 S/P3 erstvý ov í syr 7/3US/P2 údený syr 9/4/P1 nerez filter 7/3US/P3 údený syr 9/4/P2 nerez filter

158

PCR typizácia

Obr. 1. RAMP profily: 1 - kme 2/15/P1, 2 - 2/15/P2, 3 - 7/4/P1, 4 - 7/4/P2, 5 - 7/1M/P1,6 -7/1M/P2, 7 - 7/2 S/P1, 8 - 7/2 S/P2, 9 - 7/2 S/P3, 10 - 9/4/P1, 11 - 9/4/P2, 12 - CCM 1961,13 - CCM 1960, 14 - CCM 3955, L - štandard molekulových hmotností 250 bp.

Tabu ka II Preh ad RAMP typov RAMP typ (výskyt v kme och) ve kos fragmentov DNA [bp] s relatívnou kvantitou

1 (kmene 2-4) 412 ( ), 390 ( ), 350 ( ), 332 ( ), 319 ( ), 300 ( ), 280 ( ), 260 ( ), 242 ( ), 233 ( ), 230 ( ), 215 ( ), 199 ( )

2 (kmene 6-9) 412 ( ), 389 ( ), 368 ( ), 351 ( ), 320 ( ), 280 ( ), 272 ( ), 258 ( ),218 ( ), 200 ( )

3 (kme 12) 477 ( ), 447 ( ), 370 ( ), 298 ( ), 280 ( ), 268 ( ), 258 ( ), 250 ( ), 232 ( ), 222 ( )

4 (kme 13) 477 ( ), 430 ( ), 408 ( ), 385 ( ), 322 ( ), 307 ( ), 290 ( ), 269 ( )( ) - najvyššia intenzita, ( ) - stredne silná intenzita, ( ) - najslabšia intenzita

159

Obr. 2. REP – PCR profily: 1 - kme 2/13/P1, 2 - 2/13/P2, 3 - 2/13/P3, 4 - 2/14/P2, 5 - 2/14/P3,6 -2/17/P1, 7 - 2/17/P2, 8 - 7/3US/P1, 9 - 7/3US/P2, 10 - 7/3US/P3, 11 – CCM 3626 Lb. plantarum,NK – negatívna kontrola, L - štandard molekulových hmotností n x 250 bp.

Pomocou REP-PCR i RAMP sa pre jednotlivé izoláty amplifikovali charakteristické profily (obr. 1, obr. 2) pri om s jednotlivými genotypmi sa získalo 8 – 13 fragmentov DNA (tab. II) o ve kostipribl. 125 – 2750 bp. Na základe získaných profilov bolo možné rozlíši kmene v rámci druhu. Na overenie týchto metód je nutná analýza alších kme ov.

Použitá literatúra: 1. Norwood, D. E. - Gilmour, A.: The differencial adherence capabilities of two Listeria monocytogenes

strains in monoculture and multispecies biofilms as a function. Letters in Applied Microbiology, 33,2001, s. 320-324.

2. Görner, F. - Valík, .: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava: Malé centrum, 2004, 528 s. 3. Lindsay, D. - Brözel, V. S. - Mostert, J. F. - von Holy, A. 2002. Differencial efficacy of a chlorine

dioxide - containing sanitizer against single species and binary biofilms of a dairy - associated Bacilluscereus and a Pseudomonas fluorescens isolate. Journal of Applied Microbiology, 92, 2002, s. 352-361.

4. Kun - sheng, W. - Jones, R. - Danneberger, L. - Scolnik, P.: Detection of microsatellite polymorphisms without cloning. Nucleic Acids research, 22, 1994, s. 3257 - 3258.

5. Versalovic, J. - Koeuth, T. - Lupski, J. R.: Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research, 19, 1991, s. 6823-6831.

6. Pangallo, D. - Karpíšková, R. - Tur a, J. - Kuchta, T.: Typing of food - borne Listeria monocytogenes by the optimized repetetive extragenic palindrome - based polymerase chain reaction. New Microbiologica, 25, 2002, s. 449-454.

Kontaktná adresa: Mgr. Gabriela Bertaová, Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, 824 75 Bratislava 26, Slovensko. bertaova@vup.sk

160

VÝSKYT BAKTERIÍ MLÉ NÉHO KVAŠENÍ V PASTEROVANÝCH VAJE NÝCHHMOTÁCH

Miller Petr1, Ku erová Kate ina1, Chumchalová Jana1, Míková Kamila2

1Ústav technologie mléka a tuk , 2Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha

Occurrence of lactis acid bacteria in pasteurized liquid whole eggs

Summary:The aim of this work was to discover occurrence of lactic acid bacteria in pasteurized liquid whole eggs and to isolate and identify typical strains and their undesirable metabolites. It was isolated 45 LAB’s strains out of which 30 were identified as Enterococcus faecium, 12 as Enterococcus faecalis and 3 as Lactobacillusparacasei. Lipolytic and proteolytic activities and exopolysacharides and biogenous amines production were determinated. These undesirable features can cause flavour changes of products and health risks for consumers. All strains showed lipolytic activity and 13 strains showed proteolytic activity. Production of biogenous amines wasn’t approved for any of tested strain. Slime production was 17 strains observed.

Úvod

Bakterie mlé ného kvašení jsou Gram positivní, katalasa negativní, obvykle nepohyblivé, nesporulující ty inky i koky. Osidlují nejr zn jší stanovišt a p irozen se vyskytují také v celé ad potravin. Pro své unikátní vlastnosti je ada druh BMK používána jako zákysové kultury

v mlékárenství. V ur itých typech potravin jsou považovány za nežádoucí mikrofloru. Tekuté vaje né sm si jsou pasterované vaje né obsahy (vaje ný žloutek, bílek a vaje ná

melanž, tedy homogenizovaná sm s bílku a žloutku v jejich p irozeném pom ru). Mezi nežádoucí mikroflóru kažení pat í mikrokoky, pseudomonády, r zné sporuláty, aeromonády a houby, ale i salmonely. Pat í sem také BMK, které se ve vejcích mohou vyskytovat p irozen i následkem sekundární kontaminace nap . p i výtluku vajec. [1]

Pasterace vaje né melanže probíhá obvykle p i teplot 65 °C po dobu 2,5 minut. Tento záh ev je pln dosta ující pro devitalizaci salmonel nikoli však pro n které druhy BMK. Proto mohou tyto bakterie p ežít a ve výrobcích, které již nejsou dále tepeln ošet eny se pomnožit a zp sobit senzorické a texturní vady výrobku.

MetodyIzolace a identifikace: Z pasterovaných vaje ných melanží bylo izolováno celkem

45 kmen BMK. 15 kmen z p dy MRS (37 °C, anaerobn ), 15 z LM17 (30 °C, aerobn )a 15 z Slanetz-Bartley (37 °C, aerobn ). Kmeny byly dle základních morfologických a fenotypických znak rozd leny do rod a ty následn druhov identifikovány pomocí API CHL50 i ENCOCCUStestu.

Proteolytická aktivita: D kaz rozkladu bílkovin byl zjiš ován kultivací bakterií na masopeptonovém agaru s odst ed ným mlékem.

Lipolytická aktivita: D kaz rozkladu lipid byl zjiš ován tvorbou zón v okolí kolonií bakterií rostoucích na tributyrin agaru.

Produkce exopolysacharid : D kaz tvorby exopolysacharid byl zjiš ován dle Christensenovi metody a metody s agarem s kongo ervení. [2]

Produkce biogenních amin : D kaz tvorby biogenních amin byl zjiš ován plotnovými metodami dle Joostena [3] a dle Bover Cida [4].

VýsledkyV pr b hu roku 2007 bylo p i komer ních rozborech vaje ných melanží od eských

dodavatel izolováno 45 kmen BMK, z toho bylo 30 identifikováno jako Enterococcus faecium,12 jako Enterococcus faecalis a 3 jako Lactobacillus paracasei (tabulka I). Tyto rozbory byly vedeny s cílem stanovit ve vaje ných melanžích po et BMK se zam ením na rody Lactobacillus,

161

Lactococcus a Enterococcus. Kmeny 1-15 byly izolovány z misek po ítaných jako laktobacily, 31-45 jako laktokoky a 51-65 jako enterokoky. Toto zjišt ní jednak vypovídá o selektivitp íslušných metod a také o fekálním zne išt ní vzork .

Tabulka I Identifikace izolovaných BMK.

Ozna eníkmene Kmen Ozna ení

kmene Kmen Ozna eníkmene Kmen

1 Enterococcus faecium 31 Enterococcus faecium 51 Enterococcus faecalis 2 Enterococcus faecium 32 Enterococcus faecium 52 Enterococcus faecium 3 Enterococcus faecium 33 Enterococcus faecium 53 Enterococcus faecalis 4 Enterococcus faecium 34 Enterococcus faecium 54 Enterococcus faecalis 5 Enterococcus faecium 35 Enterococcus faecium 55 Enterococcus faecium 6 Enterococcus faecium 36 Enterococcus faecium 56 Enterococcus faecium 7 Enterococcus faecium 37 Enterococcus faecium 57 Enterococcus faecalis 8 Enterococcus faecium 38 Enterococcus faecium 58 Enterococcus faecium 9 Enterococcus faecium 39 Enterococcus faecium 59 Enterococcus faecium

10 Enterococcus faecium 40 Enterococcus faecalis 60 Enterococcus faecalis 11 Enterococcus faecium 41 Enterococcus faecium 61 Enterococcus faecalis 12 Enterococcus faecium 42 Enterococcus faecalis 62 Enterococcus faecalis 13 Lactobacillus paracasei 43 Enterococcus faecium 63 Enterococcus faecalis 14 Lactobacillus paracasei 44 Enterococcus faecium 64 Enterococcus faecalis 15 Lactobacillus paracasei 45 Enterococcus faecium 65 Enterococcus faecalis

U všech izolát byla stanovena proteolytická a lipolytická aktivita, produkce biogenních amin a exopolysacharid . Vzhledem k relativn nízkému pastera nímu ošet ení (64,5-65,5 °C, 2,5 min.), které je limitováno na jedné stran spolehlivým potla ením patogen (Salmonella spp.) a na druhé termostabilitou suroviny, mohou tyto produkty metabolismu p estát tento záh ev a dostat se do potravin. Hlavn v potravinách, které jsou bu v bec nebo jen minimáln tepeln upravovány (majonézy, cukrovinky), mohou tyto látky vyvolat nežádoucí senzorické zm ny a zdravotní rizika u konzument . Lipolytickou aktivitu vykazovaly všechny izolované kmeny. Proteolytickou aktivitu vykazovalo 13 kmen (všechny kmeny E. faecalis a 1 kmen E. faecium). Produkce biogenních amin (histaminu a tyrosinu) nebyla plotnovými metodami prokázána u žádného kmene.

Tabulka II Charakterizace izolovaných BMK.

Kmen Proteolytická aktivita

Lipolytická aktivita Kmen Proteolytická

aktivita Lipolytická

aktivita Kmen Proteolytická aktivita

Lipolytickáaktivita

1 - + 31 - +/- 51 + + 2 - + 32 - + 52 - + 3 - + 33 - +/- 53 + + 4 - + 34 - + 54 + + 5 + +/- 35 - + 55 + + 6 - + 36 - +/- 56 - + 7 - +/- 37 - + 57 + + 8 - + 38 - + 58 - +/- 9 - + 39 - + 59 - +

10 - + 40 + + 60 - + 11 - + 41 - + 61 + + 12 - + 42 + + 62 + + 13 - + 43 - + 63 + + 14 - + 44 - + 64 + + 15 - + 45 - + 65 + +

+...positivní, -...negativní, +/-...nízká aktivita

162

Produkce exopolysacharid byla zkoumána dv ma základními metodami: Christensenovou zkumavkou a Kongo metodou. Tyto metody ur ené k detekci exopolysacharid jako indikátorvirulence u patogenních bakterií se poda ilo aplikovat i na enterokoky (laktobacily na t chto médiích nerostly). Ovšem díky asové náro nosti a subjektivit vyhodnocení je snaha tyto metody nahradit jinými, nicmén díky své jednoduchosti se stále používají. Produkce exopolysacharidbyla potvrzena u 17 kmen a u 11 nepotvrzena. Pro 3 kmeny se výsledky metod rozchází a pro 11 kmen Christensenova metoda poskytuje nejednozna né výsledky.

Tabulka III Stanovení produkce exopolysacharid .

Kmen Kongo metoda

Christensenova metoda Kmen Kongo

metoda Christensenova

metoda Kmen Kongo metoda

Christensenovametoda

1 + + 31 + + 51 - - 2 + + 32 + + 52 + +/- 3 + + 33 + + 53 - - 4 - +/- 34 + + 54 - - 5 + + 35 + - 55 - - 6 + + 36 + + 56 + + 7 + +/- 37 + +/- 57 - +/- 8 + +/- 38 - +/- 58 + + 9 + - 39 - +/- 59 + +

10 + - 40 - - 60 + + 11 + + 41 - - 61 - - 12 + +/- 42 - - 62 - - 13 N N 43 + + 63 - +/- 14 N N 44 + + 64 - - 15 N N 45 - +/- 65 - -

+...positivní, -...negativní, +/-... nejednozna né, N...neroste

Záv rCelkem bylo izolováno 45 kmen BMK, z toho bylo 27 identifikováno jako Enterococcus

faecium, 11 jako Enterococcus faecalis a 3 jako Lactobacillus paracasei.Lipolytickou aktivitu m lo 45 kmen , proteolytickou 14. Produkce biogenních amin

(histaminu a tyrosinu) nebyla pomocí dvou plotnových metod prokázána u žádného z kmen .Tvorba exopolysacharid byla ur ována pomocí agaru s kongo ervení a Christensenovy zkumavky. Byla potvrzena u 17 kmen a u 10 nepotvrzena.

Pod kování:Tato práce byla podpo ena výzkumným zám rem MŠMT 6046137305.

Použitá literatura:1. KADLEC, P. Technologie potrravin I. 1st ed. 2002. 269 p. ISBN 80-7080-509-9. 2. FREEMAN, D.; FALKINER, F.; KEANE, C. New method for detecting slime procuction by coagulase

negative staphylococci. J Clin Pathol, 1989, 42, 872-874. 3. JOOSTEN, H.M.L.J.; NORTHOLD, M.D. Detection, growth and amine-producing capacity

of lactobacilli in cheese. Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55, 2536-2359. 4. BOVER CID S., HOLZAPFELl W.H. Improved screening procedure for biogenic amine production

by lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol., 1999, 53, 33-41.

Kontaktní adresa:petr.miller@vscht.cz

163

SLEDOVÁNÍ PROCESU FERMENTACE SLADKÉ SYROVÁTKY A SM SI SLADKÉ SYROVÁTKY A MLÉKA

Legarová Veronika, Kou imská Lenka Katedra kvality zem d lských produkt , FAPPZ, ZU v Praze

Monitoring of fermentation process of cheese whey and mixtures of cheese whey and milk

Summary:Bacteria cultures, known as starters, are used in the manufacture of cultured milk products. They are added to the product and allowed to grow there under controlled conditions. In this study the cheese whey was fermented by different thermophillic bacteria starter cultures available from market cultures producer. Fermentation process was monitored by titratable acidity changes and pH value changes. The acidity change takes place when the bacteria ferment lactose to lactic acid. Fermentation curves were compared and the suitability of cultures for fermented whey drinks preparation was discussed.

Úvod

Syrovátka vzniká jako vedlejší produkt p i výrob sýr , tvarohu a kaseinu. Je to z ed nýroztok laktózy, protein , tuku, solí a vitamin ve vod . Existují dva základní druhy syrovátky – sladká a kyselá. Sladká syrovátka vzniká p i výrob tvrdého sýra. Do mléka se p idává bu syntetický nebo p írodní enzym chymosin. Tento enzym št pí -kasein na kaseinomakropeptid (p echází do syrovátky) a para- -kasein, který následn koaguluje a je odd len od syrovátky.

Nejd ležit jší složkou syrovátky jsou bílkoviny, jejichž význam tkví ve vysoké biologické hodnot . Celkový obsah bílkovin (N–látek) v syrovátce kolísá od 14 do 24 %. Bílkoviny obsažené v syrovátce p edstavují jeden z nejhodnotn jších b žn dostupných bílkovinných materiál . Je to p i ítáno vhodnému složení jejich aminokyselin s obsahem lysinu o 40 % vyšším než v kaseinu. Denní dávka aminokyselin pro lov ka vážícího 70 kg je obsažena ve 23 g kaseinu, v 17 g vaje ných bílkovin nebo ve 14 g syrovátkových bílkovin.1

Tuk je v syrovátce p ítomen bu jen v nepatrném množství nebo se nevyskytuje v bec. Obsah tuku je závislý na druhu vyráb ného sýra a jeho tu nosti. Hlavní složkou popelovin syrovátky jsou fosfore né a vápenaté soli. ást vápníku p i sý ení se váže s kaseinem na nerozpustný para -kasein a v této form p echází do sýra. Naopak p i výrob tvarohu p echází z kaseinu do syrovátky ve form nerozpustné soli. Proto syrovátka obsahuje po výrob tvarohu vyšší množství vápníku. Mimo fosforu a vápníku obsahuje syrovátka ješt draslík, sodík, ho ík,železo, síru a chlór. Tyto prvky jsou p ítomny v syrovátce v ionizované form (kationty a anionty).

Syrovátka obsahuje také celou adu vitamin , a to hlavn skupiny B (B1, B2, B6, B12), dále pak vitamin E, C i A, kyselinu pantotenovou, kyselinu listovou a biotin1.

Syrovátka obsahuje 50 % všech složek mléka, je tedy hodnotným zdrojem vitamina minerálních látek5.

Hlavní složkou syrovátky je laktóza, která tvo í 70 – 80 % z celkové sušiny. Vyskytuje se ve dvou izomerních formách: –laktóza a –laktóza, která je hygroskopická a je tedy p í inouhygroskopi nosti sušené syrovátky1.

Tabulka . I: Složení syrovátky

tekutá syrovátka (%hm) sušená syrovátka (%hm) složka sladká kyselá sladká kyselá voda 93 93,5 4,6 3,9 laktóza 4,9 4,4 73,3 68,7 proetiny 0,8 0,7 12 12 minerálie 0,5 0,7 7,9 11,5 tuk 0,2 0,04 1,3 0,8 kyselina mlé ná 0,2 0,5 1,7 4,6

7 Zdroj: Pr mysl potravin, 1993, .5

164

Syrovátkové bílkoviny

Syrovátkové bílkoviny jsou p irozenou sou ástí mléka. P i výrob sýr , tvaroh a kaseinu se nesráží a odchází v podob syrovátky. Hlavní komponenty syrovátkových bílkovin jsou

-laktoglobulin ( -LG), -laktalbumin ( -LA), sérový albumin, imunoglobuliny a proteoso–peptonová frakce. Význam syrovátkových bílkovin spo ívá v jejich vysoké nutri ní hodnot , která je vyšší než u kaseinu1.

Syrovátkové bílkoviny jsou termolabilní, p i tepelném ošet ení mléka nad 60 ºC, na rozdíl od kaseinu, denaturují. Nejcitliv jší na teplotu jsou v prvé ad imunoglobuliny, dále sérový albumin, -laktoglobulin a -laktalbumin.

Gajd šek2 uvádí, že p i 15 sekundové výdrži p i 74 ºC se projeví první známky denaturace u imunoglobulin , u sérum albuminu a -laktoglobulinu p i 84 – 86 ºC a -laktalbuminu až p i teplot 100 ºC po nejmén 5 minutové výdrži.

P i záh evu se rozbalí globulární struktura, a tím dojde k odkrytí funk ních skupin aminokyselin, p edevším thiolových, ímž se zp ístupní chemickým reakcím. Prost ednictvím thiolové skupiny se syrovátkové proteiny váží s dalšími mlé nými proteiny ( -kaseinem,

-laktalbuminem) za vzniku dimer spojených disulfidickou vazbou. Spojením s -kaseinem disulfidickým m stkem pak m ní vlastnosti kaseinových micel. Zv tšují jejich objem a hydrata ní obal, nebo váží vodu. P i srážení se tak vytvá í m k í sraženina s menším sklonem k uvol ování syrovátky. To je pozitivn hodnoceno p i výrob fermentovaných mlé ných výrobk , naopak p i výrob ady sýr je tento jev nežádoucí, protože nízká tuhost sý eniny zp sobuje technologické problémy.

Významné jsou reakce SH skupin (degradací methioninu vznikají sulfidy a bisulfidy), které zp sobují po vysokém tepelném ošet ení (nad 75 ºC) tzv. va ivou chu mléka.

Syrovátkové bílkoviny nevratn denaturují nejen p i záh evu, ale i v p ítomnosti vápenatých iont a v prost edí o pH v tším než 8,6. Denaturované mlé né bílkoviny mají pon kud vyšší nutri ní hodnotu ve srovnání s bílkovinami syrového mléka2.

Využití syrovátky

Syrovátka je využívána p edevším v potraviná ském a farmaceutickém pr myslu a ke krmným ú el m. Stále se hledají nové zp soby využití a technologie zpracování, nebo se zvyšující se výrobou sýr roste i výroba syrovátky.

P es vysokou nutri ní a biologickou hodnotu je ekonomicky efektivní využití syrovátky velkým problémem mlékárenského pr myslu na celém sv t . I na tomto úseku mlékárenské výroby však bylo dosaženo zna ných úsp ch . Pr myslové zpracování syrovátky je koncentrováno do n kolika velkých závod , které vyráb jí adu produkt v sušené nebo zahušt né form 3.

V Evrop se používá syrovátka hlavn pro výrobu d tské výživy, dietetických výrobk ,mlé ných výrobk , pe iva, okolády a krmiv. Krom toho existují další možnosti využití k výrobady výrobk jako nap . výroba laktoferrinu, sfingomyelinu, osteopontinu, které mají použití

v kosmetice a ve farmaceutickém pr myslu4.Aplikace syrovátky pat í jednozna n k trend m p i výrob funk ních, konvenientních

a wellness potravin a potravin pro pot šení. Dodává vysokou výživovou hodnotu a širokou paletu fyzikáln -chemických vlastností, které jsou p edností nov vyvíjených produkt . Umož ujenejr zn jší inovace v sortimentu mlé ných výrobk , dezert , pomazánek, dresink , mražených krém , peka ských výrobk , nápoj (i v prášku), ty inek, snack a cukrovinek. Spot ebiteli jsou p ízniv hodnoceny: dobré jemné mlé né aroma a chu , a také textura6.

Syrovátka nebo upravené produkty v tekutém, zahušt ném nebo i sušeném stavu se používají v r zných odv tvích potraviná ského pr myslu. Pro své vlastnosti jsou produkty využívány p i výrob sušenek a pe iva (struktura ní vlastnosti bílkovin, hn dnutí pe iva), okoládya cukrovinek (regulované hn dnutí, modifikace krystalizace sacharózy), uzenin a solených výrobk

165

(emulga ní vlastnosti bílkovin, schopnost želatinace), p i výrob r zných krém , tavených sýr ,hotových jídel, p íp. energetických a vitaliza ních nápoj apod.3

Syrovátkové nápoje jsou neopomenutelným artiklem všech sv tových potraviná skýchveletrh . Velmi vhodnými produkty jsou nápoje z fermentované p írodní syrovátky, v nichž je laktóza mlé nými bakteriemi áste n nebo pln hydrolyzována. K fermentaci se používají mlé né bakterie, n kdy v kombinaci s kvasinkami. Surovinou m že být jak syrovátka s obsaženými bílkovinami, tak i deproteinovaný produkt, s obsahem solí i áste n demineralizovaný. P ednostífermentovaných nápoj je, že obsahují nejen cenné složky syrovátky, ale i cenné produkty vytvo ené mikroorganismy (kyselina mlé ná, t kavé kyseliny, enzymy, aromatické látky). Nevýhodou m že být p íliš vysoký obsah solí a kyselin, nebo nap . nestabilita bílkovinného zákalu6.

Zájem o syrovátkové nápoje stoupá p edevším u žen, které je konzumují hlavn kv linízkému obsahu energie, p íznivému ú inku na trávicí trakt a ad fyziologických ú inkjednotlivých složek6.

Metodika

V práci byly sledovány zm ny složení sladké syrovátky a sm si mléka a syrovátky p i fermentaci termofilními mléka skými kulturami. Pro fermentaci byly použity 4 typy jogurtových kultur. Byla hodnocena kysací schopnost, vhodnost použité suroviny a použitých mikroorganism ,podmínky fermentace i organoleptické vlastnosti nápoje.

Hlavní surovinou byla p i všech experimentech sušená syrovátka Lactosérum z Jihlavské mlékarny Moravia Lacto a. s. Pro p ípravu nefermentovaných syrovátkových nápoja nefermentovaných nápoj na bázi sm si syrovátky a mléka byla použita rekombinovaná syrovátka (sušená syrovátka rozmíchaná v teplé pitné vod , a to vždy 10 g syrovátky ve 100 ml teplé pitné vody) nebo sm s rekombinované syrovátky a mléka v pom ru 75 % syrovátky a 25 % mléka a 50 % syrovátky a 50 % mléka. Po celou dobu experiment byl používán stejný typ mléka a to Jiho eské lahodné mléko polotu né, vysokotepeln pasterované od mlékárny Madeta a. s. U všech typvzork následovala pasterace p i teplot 78 °C po dobu 30 sekund.

Pro p ípravu fermentovaných syrovátkových nápoj byly použity stejné suroviny ve shodných pom rech. Na základ konzultací s odborníky z Výzkumného ústavu mlékárenského (VÚM) byly vybrány 4 nejb žn jší typy jogurtové kultury a to WV2, J2, RX a KAN IV. Ve všech p ípadech se jedná o sm sné jogurtové kultury, které jsou tvo eny kmeny: Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus a Streptococcus thermophilus. Samotná syrovátka byla za aseptických podmínek o kována jednotlivými typy kultur (1% zákys) a kultivována p i 43 °C po dobu 6 hodin. Doba kultivace je výrobcem (VÚM) doporu ena u t chto typ jogurtové kultury 3,5 až 4,5 hodiny. V našem experimentu jsme však dobu kultivace protáhli, aby bylo docíleno úplného sražení obsahu jednotlivých vzork .

V p esných hodinových intervalech (0 – 6 hodin) byly zjiš ovány hodnoty SH a pH a z t chto hodnot byly následn vytvo eny kysací k ivky. B hem doby kultivace byly také posuzovány organoleptické vlastnosti jednotlivých vzork s danou kulturou po každé hodin .Ze získaných hodnot byl vybrán jednozna n nejvhodn jší typ jogurtové kultury pro p ípravufermentovaných syrovátkových nápoj a nápoj na bázi sm si syrovátky a mléka v pom rech 75 % syrovátky a 25 % mléka a 50 % syrovátky a 50 % mléka. B hem páté a šesté hodiny kultivace došlo k úplnému sražení vzork a zhoršení jejich organoleptických vlastností. Zam ili jsme se proto na hodnoty vzork po uplynutí t í a ty hodin kultivace.

Hlavními ukazateli pro výb r nejvhodn jšího typu kultury, byly jednozna n organoleptické vlastnosti, rychlost prokysání, hodnoty pH a SH, kterých vzorky s danými kulturami dosáhly po 3 a 4 hodinách kultivace.

166

Výsledky

Samotná rekombinovaná syrovátka bez p idané kultury m la pr m rnou titra ní kyselost 6,34 SH a hodnotu pH 6,37, po p idání (0+) jednotlivých typ jogurtové kultury (KAN IV, RX, J2, WV2) se hodnoty výrazn nelišily do t etí hodiny kultivace. Poté za alo docházet k výraznému r stu hodnost SH a snižování hodnot pH u kultury KAN IV.

0

5

10

15

20

25

30

35

0 0+ 1 2 3 4 5 6

as (h)

SH

0

1

2

3

4

5

6

7

pH

KAN IV (SH)RX (SH)WV2 (SH)J2 (SH)KAN IV (pH) RX (pH)WV2 (pH)J2 (pH)

Obr. 1. Kysací k ivky syrovátkových nápoj bez kultury a po p idání jogurtové kultury

Pro p ípravu fermentovaných syrovátkových nápoj a nápoj na bázi sm si syrovátky a mléka, které byly dále testovány, byla použita jogurtová kultura typ KAN IV, která vykazovala optimální hodnoty kyselosti (Obr. 1.) v nejkratším ase a vzorky s touto kulturou byly nejlépe hodnoceny v p edb žné senzorické analýze.

V následující asti práce byly sledovány kysací k ivky fermentovaných syrovátkových nápoj (bez p idání mléka, 0 %mléka) a fermentovaných nápoj na bázi sm si syrovátky a mléka v pom ru: 25 % mléka a 75 % syrovátky a 50 % mléka a 50 % syrovátky s použitím jogurtové kultury KAN IV.

Pr m rné hodnoty aktivní kyselosti m ené pHmetrem byly u všech typ syrovátkových nápoj tém shodné a nevykazovaly výrazné rozdíly (Obr. 2.). V p ípad pr m rných hodnot titra ní kyselosti (SH), byly rozdíly mezi vzorky výrazné. Nejvyšších hodnot SH v nejkratším asedosáhl syrovátkový nápoj s obsahem 50 % syrovátky a 50 % mléka. Z grafu (Obr. 2.) je patrné, že hodnoty SH v ase stoupaly se stoupajícím podílem mléka ve vzorku nápoje.

Na základ získaných hodnot z kysacích k ivek byly syrovátkové nápoje dále senzoricky posuzovány a byl vyhodnocen finální produkt s nejp ízniv jšími vlastnostmi viz p ísp vek:„Porovnání organoleptických a fyzikáln -chemických vlastností nápoj na bázi syrovátky“ (Kou imská, L., Legarová, V., Dvo áková, B., Sborník p ednášek seminá e Mléko a sýry 2008).

167

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 0+ 1 2 3 4 5 6

as (h)

SH

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

pH

0%mléka (SH)

25%mléka (SH)

50%mléka (SH)

0%mléka (pH)

25%mléka (pH)

50%mléka (pH)

Obr. 2. Kysací k ivky fermentovaných syrovátkových nápoj

Záv rCelkovým cílem práce bylo sledování zm n sladké syrovátky b hem fermentace, posouzení

vhodnosti dané mléka ské kultury a vyhodnocení výsledk výzkumu zam eného na kvalitu fermentovaných syrovátkových nápoj a nápoj na bázi sm si syrovátky a mléka. Byly sledovány kysací k ivky vzork syrovátky s p ídavkem 4 typ jogurtové kultury, ze získaných hodnot byla vybrána jedna kultura, která byla nejlépe senzoricky hodnocena a vzorky s touto kulturou KAN IV dosáhly za nejkratší as kultivace požadovaných hodnot SH, což je d ležitým kritériem i z hlediska ekonomického. Následn byla tato kultura testována pro p ípravu vzork syrovátkových nápojs p ídavkem mléka, kde byl nejlépe hodnocen vzorek s obsahem 50 % mléka a 50 % syrovátky.

Záv ry této práce by mohly krom v deckého p ínosu být uplatitelné v praxi, nebo mohou pomoci našim mlékárenským podnik m rozší it sortiment výrobk ze syrovátky, která je vedlejším produktem p i výrob sýr , a jejíž úprava na n které finální produkty vhodné pro konzumenty je energeticky, finan n i technologicky pom rn náro ná a složitá.

Použitá literatura:1. FORMAN, L., MERGL, M. a kol. Syrovátka – její využití v lidské výživ a ve výživ hospodá ských

zví at. 1. vyd. Praha: St edisko technických informací potraviná ského pr myslu – Výzkumného ústavu potraviná ského pr myslu v Praze, 1959. 343 s.

2. GAJD ŠEK, S. Laktologie. 1. vydání. Brno: Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , 2003. 84 s., ISBN 80-7157-657-3.

3. GAJD ŠEK, S., Mléka ství II, 1. vyd., Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , 2002, 142 s., ISBN 80-7157-342-6.

4. HRUDKOVÁ, A. (2001) l.: 4378; Vyd.: 28. 2. 2002 dostupné z http://www.agronavigator.cz. 5. SIENKIEWICZ, T., RIEDEL, C. L. Whey and whey utilization. 2. edit. Verlag Th. Mann,

Gelsenkirchen-Buer, Germany, 1990. 379 s. ISBN 3-7862-0086-6. 6. SUKOVÁ, I., Syrovátka v potraviná ství. Ústav zem d lských a potraviná ských informací, Praha, 2006,

60 s., ISBN 80-7271-173-3. 7. TOMÁŠKA, M., ŠTURDÍK, E. Srvátka ako biotechnologická surovina. Pr mysl potravin, 1993, ro . 44,

. 5, s. 208-209, ISSN 0033-1988.

Kontaktní adresa:Ing. Veronika Legarová, Katedra kvality zem d lských produkt , FAPPZ, ZU v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, e-mail: legarova@af.czu.cz

168

SLEDOVÁNÍ PO TU PROBIOTICKÝCH MIKROORGANISMVE FERMENTOVANÝCH MLÉ NÝCH VÝROBCÍCH

Burdychová RadkaÚstav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn

Selective enumeration and monitoring of probiotic counts in fermented milks

Summary:In this study, the selective enumeration and monitoring of survival of probiotic bacteria Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in fermented milks was carried out. MRS - vancomycine agar was used for selective enumeration of L. rhamnosus, MRS – clindamycine for selective detection of Lactobacillus acidophilus and BSM (Bifidus selective medium) agar for selective enumeration of Bifidobacterium lactis.To reach health benefits, the concentration of probiotics have to be 106 CFU/g of a product which is complicated with different grow characteristics of probiotic mixtures and low viability of probiotics in milk conditions. With the aim to select the probiotic mixture with optimal grow characteristic to reach required counts, two fermented milks with the same probiotic mixture (Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis) but from two different producers of probiotics (A and B) were analyzed for their bacterial populations using the above described selective bacteriological media. All milk products contained probiotic microorganisms claimed to be present in declared quantity (at least 106/g). The number of probiotics from producer B was higher than from producer A and showed better grow characteristics. The counts of all probiotic strains from producer B grow in fermented milks, which was not the case of probiotics of producer A, where the numbers of L. acidophilus and B. lactis were reduced during ripening.

ÚvodSou asným trendem je používat p i výrob fermentovaných potravin spolu se startovacími

kulturami probiotické mikroorganismy1. Pro dosažení p íznivých ú ink pro lidské zdraví je spot ebitel m doporu ována denní konzumace alespo 100 g mlé ného výrobku s minimálním obsahem 10 milión (106) probiotických bakterií v 1 g nebo 1 ml výrobku2. Výb r probiotických kultur závisí nejen na schopnosti tvo it vhodné organoleptické vlastnosti konkrétního výrobku, ale také na typu použité startovací kultury. Je totiž známo, že se n které probiotické kultury vlivem negativního p sobení startovací mikroflóry (a podmínek prost edí) pouze minimáln pomnožují a je proto pot ebné použít dostate ný po et živých bun k p ímo p i výrob tak, aby byl po celou dobu trvanlivosti výrobku zaru en požadovaný po et živých bun k v 1 g nebo 1 ml výrobku3.

Cílem této práce bylo sledování zastoupení a po tu probiotických mikroorganimsLactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis a Lactobacillus rhamnosus v mlé ných výrobcích s jejich deklarovaným zastoupením, a to s použitím startovacích kultur od dvou r zných výrobc(A a B). Použité probiotické kultury m ly stejné druhové zastoupení.

Materiál a metody

Probiotické a startovací kultury Probiotické bu ky Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium

lactis byly získány p ímo od výrobc kultur (A, B). Startovací kultury S. thermophilus byly dodány výrobci startovacích kultur (Chr. Hansen, Dánsko; Sacco, Itálie) v lyofilizovaném stavu.

P íprava médií Streptococcus thermophilus (ST) agar4. Médium bylo p ipraveno smícháním následujících

komponent: 10,0 g tryptonu, 1,0 g sacharosy, 5,0 g kvasni ného extraktu a 2,0 g K2HP04.Komponenty byly rozpušt ny v 1 l destilované vody. pH média bylo upraveno na 6,8 0,1, do média bylo p idáno 6 ml 0,5 % bromkresolové erven a 12 g agaru. MRS – vankomycin agar

169

byl p ipraven p ídavkem vankomycinu (2 mg/l, Sigma-Aldrich, N mecko). MRS – clindamycinagar byl p ipraven p ídavkem 0,5 mg/l clindamycinu (Sigma-Aldrich, N mecko). BSM (Bifidus selektivní agar; Fluka, USA) byl p ipraven dle návodu výrobce. Podmínky kultivace jsou popsány v této práci5.

Mikrobiologický rozbor fermentovaných mlé ných nápojVýrobky byly analyzovány v den výroby a 7, 14, 21, 28 a 35 dn po výrob . P íprava

vzork pro analýzu a p íslušná ed ní byla provedena dle SN EN ISO 8261. Pro kultivaci S. thermophilus byl použit ST agar. Petriho misky se vzorky byly kultivovány aerobn p i 37 °C po dobu 72 h. Pro kultivaci probiotických bun k L. rhamnosus byl použit MRS – vankomycin agar, pro kultivaci L. acidophilus MRS – clindamycin agar a pro kultivaci B. lactis BSM agar. Stupeed ní byl volen tak, aby výsledný po et KTJ na jedné plotn byl 15 až 100. Petriho misky se

vzorky byly kultivovány anaerobn p i 37 °C po dobu 72 h.

Výsledky a diskuse

Mikrobiologickým rozborem mlé ných výrobk byly stanoveny po ty životaschopných probiotických bun k L. rhamnosus, L. acidophilus a B. lactis. Po ty uvedených mikroorganism ,stanovované po celou dobu trvanlivosti výrobk jsou uvedeny na Obr. 1 a 2. Bylo zjišt no, že požadované celkové množství probiotických kultur (106) bylo dodrženo u všech sledovaných výrobk . Po et jednotlivých probiotických kultur od výrobce kultur B byl vyšší než po etjednotlivých probiotik od výrobce kultur A. Po ty jednotlivých probiotických bakterií výrobce B se po celou dobu trvanlivosti mlé ných výrobk zvyšovaly. Po et probiotických bakterií L. acidophilus a B. lactis pocházejících od výrobce A se b hem trvanlivosti mlé ných výrobkprokazateln snižovaly. Analýzou byla prokázána nutnost výb ru vhodných probiotických kultur pro konkrétní aplikaci ve fermentovaných mlé ných výrobcích.

Zastoupení probiotických bakterií v mlé ném nápoji, výrobce A

0102030405060708090

100

0 1 2 3 4 5 6

týdny

KTJ

/g.1

06

Obr. 1: Po ty probiotických bakterií (výrobce A) v mlé ných výrobcích b hem skladování( ) Bifidobacterium lactis, ( ) Lactobacillus acidophilus, ( ) Lactobacillus rhamnosus

170

Zastoupení probiotických bakterií v mlé ném nápoji, výrobce B

0102030405060708090

100

0 1 2 3 4 5 6

týdny

KTJ/

g.10

6

Obr. 2: Po ty probiotických bakterií (výrobce B) v mlé ných výrobcích b hem skladování( ) Bifidobacterium lactis, ( ) Lactobacillus acidophilus, ( ) Lactobacillus rhamnosus

Záv rBylo zjišt no, že požadované celkové množství probiotických kultur (106) bylo dodrženo

u všech sledovaných výrobk . R stové charakteristiky jednotlivých probiotických druhpocházejících od výrobc A a B se b hem doby trvanlivosti mlé ných výrobk zna n lišily. Analýzou byla prokázána nutnost výb ru vhodných probiotických kultur pro konkrétní aplikaci ve fermentovaných mlé ných výrobcích.

Použitá literatura:1. TANNOCK, G. W.: Probiotics and Prebiotics: Where are We Going? Norwitch: Caister Academic Press. 2002, 333 p. ISBN-10: 0-9542464-1-1. 2. SHAH, N. P.: Probiotic bacteria: Selective enumeration and survival in dairy foods. J. Dairy Sci. 2000, 83: 894–907. 3. TAMINE, A. Y., MARSHALL, M. E., ROBINSON, R. K.: Microbiological and technological aspects of milks fermented by bifidobacteria . J. Dairy Res. 1995, 62: 151. 4. DAVE, R. I., SHAH, N. P.: Evaluation of media for selective enumeration of Streptococcus thermophilus,Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacteria. J Dairy Sci. 1996, 79: 1529–1536. 5. BURDYCHOVÁ, R.: Mikrobiologická detekce probiotických mikroorganism ve fermentovaných mlé ných výrobcích. Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis. 2007. sv. LV, . 2, s. 15--20. ISSN 1211-8516.

Kontaktní adresa:Ing. Radka Burdychová, Ph.D., Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Ústav technologie potravin, Zem d lská 1, 613 00 Brno. email:burdycho@node.mendelu.cz

171

CHARAKTERISTIKA RASTU A PRODUKTOV METABOLIZMU LACTOBACILLUS REUTERI PO AS FERMENTÁCIE GLYCEROLU

Greifová Mária, Kraj ová Eva, Greif Gabriel, Pagurko Anton, Schmidt Štefan, Staruch Ladislav

Fakulta chemickej a potravinárskej technologie, STU v Bratislave, Radlinského 9, Bratislava, SR.

Characterization of growth and metabolite production of Lactobacillus reuteri during glycerol fermentation

Summary:This work characterises the growth of L. reuteri in MRS broth at the temperatures 18, 25, 30, 37 °C as well as its growth in milk at 37 °C. L. reuteri is able to ferment saccharides with exception of erythritol, arabinose, xylose, adonitol, xylopyranoside, dulcitol, mannopyranoside, inulin and xylitol. The stain is resistent to vancomycine, gentamicine, netilmicine and nalidixic acid, while having highest sensitivity to penicillin a piperacillin. Production of 1,3-propandiol and lactic and acetic acids during anaerobic cultivation (37 °C) of L. reuteri in MRS broth comprising various starting concentrations of glycerol (0,5; 1 a 2 %) was monitored by HPLC. Moreover, antimicrobial activity of L. reuteri growing in MRS broth (neat or contaning glycerol) against L. monocytogenes, S. aureus, B. cereus, E.coli, B. subtilis and Ps. fluorescens was tested. Larger inhibition zones were observed on media containing glycerol.

Lactobacillus reuteri má trvalé miesto v gastrointestinálnom ekosystéme udí, hydiny, ošípaných a iných zvierat. Predpokladá sa, že má úlohu symbionta v revnom ekosystéme produkciou antimikrobiálnych zložiek vo i celej rade G+ a G- patogénov, kvasiniek a plesní [1,2]. Po as anaerobnej fermentácie glycerolu produkuje reuterin ( -hydroxypropionaldehyd),1,3-propandiol, etanol, kyselinu mlie nu a CO2.

Magnusson [3] zistil, že náhodný prídavok glycerolu spôsobil dramatické zvýšenie inhibi ného efektu u L. coryniformis Si3 proti nieko kým vláknitým hubám a kvasinkám. Po asizolácie metabolitov glycerolu z L. coryniformis Si3 detekoval rovnaké množstvo 3-hydroxypropionovej kyseliny a 1,3- propandiolu, ale len stopové množstvo 3-HPA ( -hydroxypropionaldehyd).

Reuterín, širokospektrálna antimikrobiálna zložka, opísaná z Lactobacillus reuteri, je jedna z najintenzívnejšie študovaných nízko molekulových inhibi ných zložiek [4,5]. Reuterín je produkovaný z glycerolu hladujúcimi bunkami za anaeróbnych podmienok a aktívna zložka reuterín je rovnováhou zmesi monomernej, hydratovanej monomernej a cyklickej dimernej formy 3-HPA [6] (obr. 1,2). Je aktívny proti nieko kým rozli ným typom mikroorganizmov vrátane G+ a G- baktériám, kvasinkám a plesniam [7]. Antifungálna aktivita bola ukázaná vo i rodom Candida,Torulopsis, Saccharomyces, Aspergillus a Fusarium.

H2C OH

HC OH

H2C OH

H2O

3-hydroxypropionaldehyd

H2C OH

H2C

HC O

H2C OH

H2C OH

H2C

NADH NADH+H+

Reduktáza

Dehydratáza

(O)

H2C

H2CO

OH

H2C OH

kyselina 3-hydroxypropiónová

Obr. 1. Metabolická cesta pre produkciu reuterinu

172

Produkcia reuterínu bola skôr pozorovaná u L. brevis, L. buchneri [8], L. collinoides [9] a L. coryniformis [5].

Cie práce charakteristika rastu a zmien pH L. reuteri v MRS médiu pri 18, 30, 37 °C a v mlieku pri 37 °C, schopnos L. reuteri fermentova rôzne sacharidy pomocou API testu, odolnos , resp. citlivos L. reuteri vo i 14 antibiotikám - disková metóda tvorba kyseliny mlie nej, octovej, etanolu a 1,3-propandiolu pri 37 °C anaerobnej kultivácii

L. reureri v MRS bujóne s rôznym obsahom glycerolu (0,5; 1; 2 %) - HPLC - RID metódou, antimikrobiálna aktivita L. reuteri vo i L. monocytogenes, S. aureus, Ps. aeruginosa , E.coli,

B. cereus, B. subtilis - dvojvrstvovou plat ovou metódou v MRS médiu s a bez glycerolu

Materiál a metódyTestovaný mikroorganizmus: L. reuteri Protectis (BioGaia, Švédsko) Indikátorové mikroorganizmy Listeria monocytogenes NCTC 4886 (National Collection of Type Cultures, UK), Escherichia coli CCM 3988 (Czechoslovak collection of microorganisms Brno, R), Pseudomonas aeruginosa CCM 3955, Staphylococcus aureus CCM 3953, Bacillus cereus (izolovaný na KPT, FCHPT STU Bratislava), Bacillus subtilis CCM 2216

Rast Lactobacillus reuteri v MRS médiu a mlieku, zmena pH Na posúdenie rastu a výpo et rastových charakteristík bola robená stacionárna kultivácia v MRS bujóne pri 37 °C za aeróbnych podmienok. Rastové charakteristiky boli vypo ítané z rovnice:

log N(t) = A + D exp [- exp (-B (t - M))] (10).

Test utilizácie sacharidov mikroorganizmami Test skvasovania sacharidov sledovaným mikroorganizmom sa vykonal pomocou API 50 CH (BIOMÉRIEUX, Marcy - l´Etoile, Francúzsko ) pod a autorov Rada & Petr [11].

Test citlivosti na vybrané antibiotiká No ná kultúra L. reuteri sa testovala pod a nami upraveného postupu autorov Cebecci & Gürakan [11] na citlivos resp. vnímavos na vybrané antibiotiká (MAST DISKY, Mast Group Ltd., Merseyside, UK): netilmycín (30 g) – NET30, gentamycín (10 g) – GM10, vankomycín (30 g) – VA30, ceftriaxon (30 g) – CRO30, cefotaxím (30 g) – CTX30, cefuroxím (30 g) – CXM 30, cefazolín (30 g) – CZ30, piperacilín (100 g) – PRL100, ampicilín (10 g) – AP10, penicilín G (10 U) – PG10, kyselina nalidixová (30 g) – NA30, klindamycín (2 g) – CD2, erytromycín (15 g) E15, tetracyklín (30 g) –T30. Metóda je modifikáciou agarovej difúznej metódy [12].

HC O

H2C

H2C OH

OO

OHOH

HC OH

OH

H2C

H2C OH

3-hydroxypropionaldehyd

dimér hydrátovaná forma

Obr. 2. Dimerizácia reuterinu

173

Tvorba metabolitov pri anaerobnej kultivácii L. reureri v MRS bujóne s rôznym obsahom glycerolu pri 37 °C [2] Po as 48 h anaeróbnej kultivácie L. reuteri v MRS bujone s rôznym obsahom glycerolu (0,5 %, 1% a 2 %) boli v dvojhodinovom intervale vyšetrované vzorky na obsah kyseliny mlie nej, octovej a 1,3-propandiolu pomocou HPLC-RID. Predanalytická úprava vzorky: MRS bujón po kultivácii L. reuteri sa odstredil pri 9000 ot.min-1.Supernatant sa prefiltroval cez mikrofilter 0.22 m Chromafil AO filters (Macherey-Nagel, Düren, Germany) a následne aplikoval na kolónu.Podmienky analýzy: Pumpa: DeltaChrom™ SDS 030 (Watrex, Bratislava, Slovenská republika), manuálny dávkova Rheodyne 7725i, dávkovacia slu ka 20 l, kolóna: Polymer IEX H+

(250 x 8 mm) (Watrex, Bratislava, Slovenská republika), vyhrieva kolóny DeltaChrom™ Temperature Control Unit (50±0,1 °C), mobilná fáza: 1 mM H2SO4, prietok mobilnej fázy: 0,5 cm3.min-1, detekcia: refraktometrický detektor RI K-2301 (Knauer, Berlin, Germany), PC a zbera dát v programe Clarity (DataApex, Praha, eská republika).

Antimikrobiálna aktivita L. reuteri vo i vybraným indikátorovým baktériám – dvojvrstvovou plat ovou metódou v MRS agare bez a s glycerolom Antimikrobiálna aktivita bola uskuto nená dvojvrstvovou difúznou metódou pod a Magnusona et al. [3]. L. reuteri bol inokulovaný asi v 2,5 cm linií na MRS agar a následne kultivovaný pri 37 °C 48 h za anaerobnych podmienok. PM boli po vyrastení laktobacila preliate mäkkym maltozovým agarom (Merck, Germany) s koncentráciou indikátorového kme a cca 106 KTJ/ml. Po 24 h aerobnej kultivácií pri 37 °C bola vypo ítaná plocha inhibície. Test sa uskuto nil v paralelkách.

Výsledky a diskusia

Rast Lactobacillus reuteri v MRS médiu a mlieku, zmena pH

Obr. 3. Charakteristika rastu L. reureri v MRS médiu pri teplotách 18, 30, 37 °C a v mlieku pri 37 °C a zmena pH po as rastu

0 40 80 120

5

6

7

8

9

as [h]

log(

KTJ/

ml)

37 °C 30 °C 18 °C

0 40 80 1203.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

as [h]

pH

37 °C 30 °C 18 °C

0 10 20 30 40 504.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

log(

KTJ/

ml)

as [h]

3

4

5

6

7

pH

174

Tabu ka IRastové charakteristiky L. reureri v MRS médiu pri teplotách 18, 30, 37 °C a v mlieku pri 37 °C

MRS bujón mlieko Charakteristiky rastu 18°C 30 °C 37 °C 37 °C

m [log (KTJ/ml). h-1] [h]

0,06011,6

0,2110,7

0,3352,5

0,2522,3

Test utilizácie sacharidov mikroorganizmami Dôležitou vlastnos ou baktérií je ich schopnos utilizova jednotlivé sacharidy. Pre zistenie schopnosti utilizova rôzne sacharidy sa využili testy API 50 CH. L. reuteri bol schopný fermentova po 48 hodinách 40 sacharidov z celkového po tu 49 okrem erytritolu, arabinozy, xylózy, adonitolu, xylopyranozidu, dulcitolu, manopyranozidu, inulínu a xylitolu.

Tvorba metabolitov pri anaerobnej kultivácii L. reureri v MRS bujóne s rôznym obsahom glycerolu pri 37 °C

Obr.4. Zužitkovanie glycerolu a tvorba 1,3-PD Obr.5. Chromatografický záznam štandardov(A) a reálnej vzorky(B):Glu - glukóza, KM - kyselina mlie na, Gly - glycerol, KO -kyselina octová, 1,3-PD - 1,3 propandiol, Et-OH - etanol

0 10 20 30 40 50

0

1

2

3

as kultivácie [h]

c 1,3

-PD

[mm

ol/L

]

0,00

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

c Gly [m

mol

/L]

0.5% Gly 1.0% Gly 2.0% Gly

[min.]as

0 5 10 15 20 25

[V]

Nap

ätie

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

KM

Gly

1,3-PD

E:\DP2007\KM+GLYCEROL+1,3PD

175

Test citlivosti na vybrané antibiotiká Významnou vlastnos ou laktobacilov je ich odolnos a naopak citlivos na rôzne antibiotiká. Celkovo zo 14 použitých antibiotík L. reuteri bol odolný na 4 z nich, vankomycinu, gentamicínu, netilmicinu a k.nalidixovej. V ich prípade nevznikla žiadna inhibi ná zóna. Naopak najvä šia inhibi ná zóna a teda najvä šiu citlivos vykazal vo i penicilinu a piperacilinu Z viacerých štúdií vyplýva, že odolnos na antibiotiká je u každého mikroorganizmu, aj v rámci kme ovmikroorganizmov, jedine ná.

Antimikrobiálna aktivita L. reuteri vo i vybraným indikátorovým baktériám - dvojvrstvovou plat ovou metódou v MRS agare bez a s glycerolomL. reuteri po as rastu za anaerobných podmienok tvorí fermentáciou glycerolu viaceré antimikrobiálne zložky, okrem iných aj reuterín. Sauvageot et al.(13) popísali mechanizmus rozkladu glycerolu laktobacilmi tak, že dochádza k dehydratácií glycerolu na 3-HPA, ktorý môže by oxidovaný na kyselinu 3-hydroxypropionovú alebo redukovaný na 1,3-propandiol (obr.1.). Reuterín je rovnováhou zmesi monomernej, hydratovanej monomernej a cyklickej dimernej formy 3-HPA (obr.2). Na jeho antimikrobiálny ú inok sme poukázali dvojvrstvovou plat ovou metódou pri ktorej L. reuteri rastol na MRS agare bez a s glycerolom za anaerobnych podmienok. Vyjasnená zóna okolo testovaných mikroorganizmov bola u každého vä šia na PM s glycerolom. Pre porovnanie bola pre každú baktériu vypo ítaná plocha inhibície, ktorá sa vyjadrila v % oproti celkovej ploche PM. Taktiež na PM s glycerolom bol pozorovaný slabší porast baktérie oproti PM bez glycerolu (tabu ka II).

Tabu ka II Antimikrobiálna aktivita L. reuteri vo i vybraným indikátorovým baktériám vyjadrená ako % vyjasnenej plochy z celkovej plochy PM

% vyjasnenej plochy z celkovej plochy PM Mikroorganizmus MRS bez glycerolu MRS s glycerolomL. monocytogenes

S. aureus P. aeruginosa

E. coli B. cereus

B. subtilis

13,116,218,424,722,229,1

20,724,722,938,824,439,3

Záver Boli testované rastové rastové podmienky pre L.reuteri v MRS médiu a v mlieku L. reuteri je schopný fermentova sacharidy okrem erytritolu, arabinozy, xylózy, adonitolu,

xylopyranozidu, dulcitolu, manopyranozidu, inulínu a xylitolu L. reuteri je odolný vo i vankomycinu, gentamicínu, netilmicinu a k.nalidixovej, najvä šiu

citlivos vykazal vo i penicilinu a piperacilinu. L. reuteri po as rastu v MRS bujóne s glycerolom pri 37 °C utilizoval glukózu na kyselinu

mlie nu, octovú a etanol (CO2-nestanovené) a glycerol na 1,3-propandiol L. reuteri pri raste na MRS médiu tvorí antimikrobiálne látky ú inné vo i všetkým testovaným

baktériám; na MRS s glycerolom tvorí vä šie množstvo antimikrobiálnych metabolitov, odokazuje vä šia vyjasnená plocha okolo L. reuteri a slabší nárast baktérií oproti PM s MRS agarom bez glycerolu

176

Použitá literatúra:1. Rodríquez, E., Arqués, J.L., Rodríquez, R., Nu ez, M., Medina, M.: Reuterin production by lactobacilli

isolated from pig faeces and evaluation of probiotic traits. Letters in Applied Microbiology, 2003, 37, 259-263

2. El-Ziney, M.G., Arneborg, N., Uyttendaele, M., Debevere, J., Jakobsen, M.: Characterization of growthand metabolite production of Lactobacillus reuteri during glucose/glycerol cofermentation in batch and continuos cultures. Biology Letters, 20(10), 1998, s. 913-916.

3. Magnusson, J.,Ström, K., Ross, S., Sjögren, J., Schnürer, J.: Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Letters, 2003, 219, s. 129-135.

4. Chung, T.C., Axelsson, L., Lindgren, S.E., Dobrogosz, W.J. : In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri. Microbial Ecology in Health and Disease 1989, 2, s.137-144.

5. Nakanishi, K., Tokuda, H., Ando, T., Yajima, M., Nakajima, T., Tanaka, O., Ohmomo, S. : Screening of lactic acid bacteria having the ability to produce reuterin. Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria 2002, 13, s. 37-45.

6. Talarico, T.L., Casas, I.A., Chung, T.C., Dobrogosz, W.J. 1988. Production and isolation of reuterin, a growth inhibitor produced by Lactobacillus reuteri. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1988, 32, s. 1854-1858.

7. Plocková M., Stiles J., Chumchalová J., Halfarová R.: Control of Mould Growth by Lactobacillus rhamnosus VT1 and Lactobacillus reuteri CCM 3625 on Milk Agar Plates. Czech J. Food Sci.2002, 19, s. 46-50

8. Schütz, H., Radler, F.: Anaerobic reduction of glycerol to propanediol-1,3 by L. brevis and L. buchneri. Systematic and Applied Microbiology 1984, 5, s.169-178.

9. Claisse, O., Lonvaud-Funel, A.: Assimilation of glycerol by a strain of Lactobacillus collinoides isolated from cider. Food Microbiology 2000,17, s.513-519.

10. Gibson, A.M.- Bratchell, N.- Roberts, T.A.: Predicting microbial growth of salmonellae in a laboratory medium as afeected by pH, sodium chloride and storage temperature. International Journal of Food Microbiology, 6, 1988, s.155-178

11. Rada, V., Petr, J.: A new selective medium for the isolation of glucose non-fermenting bifidobacteria from hen caeca. Journal of Microbiological Methods, 43, 2000, s. 127-132.

12. Cebecci, A., Gürakan, C.: Properties of potential probiotic Lactobacillus plantarum strains. Food Microbiology, 20, 2003, s. 511-518.

13. Sauvageot, N., Muller, C., Hartke, A., Auffray, Y. & Laplace, J.M.: Characterisation of the diol dehydratase pdu operon of Lactobacillus collinoides. FEMS Microbiology Letters 2002a, 209, s.69-74.

Po akovanie:Práca bola podporená projektom APVV-0310-06 a grantom VEGA 1/0746/08.

Kontaktná adresa:Ing.Mária Greifová, PhD., e-mail: maria.greifova@stuba.sk FCHPT-STU Bratislava, Ústav biotechnológie a potravinárstva, Oddelenie potravinárskej technológie, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, SR.

177

DETEKCE BUN NÉ LYZE U LAKTOKOKŠviráková Eva, Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Plocková Milada

Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha

Cell lysis detection in lactococci

Summary:This work was aimed at the determination of lytic properties of chosen Lactococcus lactis strains (AM2, NIZO B643, HMM 81, NIZO R5 and LCC 416) by three different methods (determination of cell lysis in citrate buffer; activation of cell lysis by mitomycin C in LM17 broth; determination of cell lysis on GM17 agar with Micrococcus lysodeikticus lysate). Evaluation of lactococci lyses was dependent on used method, however, four Lc. lactis strains (AM2, NIZO B643, HMM 81 and NIZO R5) were assessed as lytic strains and one Lc. lactis LCC 416 strain was assessed as non-lytic strain by usage of all three methods.

ÚvodO lyzi bakterií mlé ného kvašení, v etn laktokok , je projevován mimo ádný zájem

v souvislosti s jejich použitím ve form zákysových kultur v mlékárenských fermenta níchtechnologiích. Kontrola a zvyšování lyze zákysových kultur jsou považovány za základní parametry pro kontrolu a urychlení zrání p edevším polotvrdých a tvrdých sýr 1.

Lyze bakterií vychází z degradace peptidoglykanu bun né st ny endogenními peptidoglykanovými hydrolasami, nazývanými lyziny2. Bun né lyze byly zjišt ny u mnoha gramnegativních i grampozitivních bakterií3. Lyze bakteriálních bun k m že být stanovena r znými zp soby. Jde nap . o stanovení lytické aktivity bun k na agaru obsahujícího degradované bun né st ny4; aktivaci bun né lyze mutagenními inidly (nap . mitomycinem )5; zjišt ní úbytku živých bun k v ase za konstantního pH stanovením celkových po t bakterií plotnovou metodou6;enzymatickou detekci produkt bun né lyze (nap . vnitrobun né vysokomolekulární komponenty - DNA) vyplavených z bun k po lyzi6; elektronovou mikroskopii bun k po lyzi6; zjišt ní lyze bun kv systému pufr 7; stanovení enzymatické aktivity proteolytických enzym vyplavených z bun kpo lyzi8 a jiné metody.

Cíle prácePráce byla zam ena na stanovení lytických vlastností vybraných kmen Lactococcus

lactis (AM2, NIZO B643, HMM 81, NIZO R5 a LCC 416) t emi r znými metodami (stanovení bun né lyze v citrátovém pufru, aktivace bun né lyze mutagenním inidlem mitomycinem C v bujónu LM17 a stanovení bun né lyze na agaru GM17 s lyzátem bun k Micrococcuslysodeikticus).

Materiál a metodyPoužité kmeny

Použité bakteriální kmeny byly uloženy ve Sbírce bakterií, plísní a kvasinek (Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT v Praze, Praha, R):

Lc. lactis subsp. cremoris AM2 (p vod: Moorepark Research Centre, Fermoy, Co. Cork, Irsko; znaky: autolytický kmen), Lc. lactis subsp. cremoris NIZO B643 (p vod: Netherlands Institute for Dairy Research (NIZO), Department of Biophysical Chemistry and Genetics, Ede, NL; znaky: autolytický kmen), Lc. lactis subsp. cremoris HMM 81 (p vod: Sbírka bakterií, kvasinek a plísní, Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT v Praze, Praha, R; izolát ze syrového mléka - mastitidní dojnice, kravín Hostomice, R; znaky: autolytický kmen), Lc. lactis subsp. lactis NIZO R5 (p vod: Netherlands Institute for Dairy Research (NIZO), Department of Biophysical Chemistry and Genetics, Ede, NL; znaky: autolytický kmen, produkce nisinu typu A),

178

Lc. lactis subsp. lactis LCC 416 (p vod: Laktoflora® Sbírka kultur mléka skýchmikrorganism , Milcom a.s., Praha, R; znaky: neautolytický kmen, produkce nisinu typu A).

Kultivace laktokokLaktokoky byly kultivovány (inokulum 1 % obj.) v bujónu LM17 p i teplot 30 °C

po dobu 16 h za aerobních podmínek.

Stanovení po tu laktokokPo et laktokok byl stanoven plotnovou metodou9. Kultivace laktokok probíhala v agaru

M1710 s laktosou (agar LM17) p i teplot 30 °C po dobu 72 h za aerobních podmínek.

Stanovení lyze laktokok v citrátovém pufru Lytické schopnosti laktokok byly zjiš ovány na základ zm n absorbancí (A650) bun k

kultivovaných v citrátovém pufru (citrát sodný 0,05 mol.l-1, pH 5) s p ídavkem NaCl (15 g.l-1)p i teplot 13 °C po dobu 12 dn 7. Bun ná lyze = [(A0 - At)/A0] × 100 [%], kde: A0 byla absorbance bun k m ená v 0.dni kultivace a At byla absorbance bun k m enáve 12.dni kultivace.

Stanovení lyze laktokok v bujónu LM17 s mitomycinem CLytické schopnosti laktokokok byly zjiš ovány na základ zm n absorbancí (A615) bun k

kultivovaných v bujónu LM17 s mitomycinem C (2,0 g.ml-1) p i teplot 30 °C po dobu 8 h5.

Stanovení lyze laktokok s lyzátem bun k M. lysodeikticusLytické schopnosti laktokok stanoveny plotnovou metodou11,4 na agaru GM17

s lyofilizovanými bu kami M. lysodeikticus (0,2 % hm.).

Výsledky

Lyze laktokok v citrátovém pufru Výsledky bun ných lyzí testovaných laktokok v citrátovém pufru (pH 5) s p ídavkem

NaCl (15 g·l-1) p i teplot kultivace 13 °C v asech kultivace 0. a 12.dne jsou uvedeny v Tab. I. Výsledky p edstavují pr m r ze t í paralelních stanovení.

Tabulka ILyze laktokok v citrátovém pufru s p ídavkem NaCl (15 g·l-1) p i teplot kultivace 13 °C po dobu 12 dn

Kmen Lc. lactis Bun ná lyze [%] Kultivace [den] 0 12

AM2 0 34 NIZO B643 0 46

HMM 81 0 62 NIZO R5 0 67 LCC 416 0 0

V citrátovém pufru docházelo k lyzi všech kmen , krom kmene Lc. lactis LCC 416. Bun ná lyze se u ty kmen Lc. lactis (AM2, NIZO B643, HMM 81 a NIZO R5) po 12 dnech kultivace individuáln lišila a pohybovala se v rozmezí od 34 do 67 %. Všechny ty ikmeny byly za azeny mezi vysoce lytické kmeny (bun ná lyze více než 15 %). Literatura7 adila laktokoky podle lytických vlastností na vysoce lytické (bun ná lyze více než 15 %), mírn lytické

179

(bun ná lyze v rozmezí 10 až 15 %) a nelytické (bun ná lyze do 10 %). Námi použitá teplota kultivace 13 oC byla odvislá od zvolené metodiky7. Z technologického hlediska se jednalo o horní hranici teploty zrání sýr s nízkodoh ívanou sý eninou (v praxi se používají spíše nižší teploty do 10 oC). P i vyšších teplotách zrání dochází ke vniku intenzivn jší chutí sýra, ale i k vyššímu riziku vzniku vad.

Sledováním spontánních bun ných lyzí u laktokok v systému pufru nebo médiu M17 (za podmínek optimálních bun ných lyzí) se v minulých letech zabývaly r zné výzkumné skupiny12,11. Za hlavní výhodu použití pufrového testu byl považován fakt, že bun né lyze mohly být hodnoceny jednoduše p i r zných podmínkách prost edí (pH, teplota, aktivita vody atd.). P i použití složit jších systém , které více p ipomínaly prost edí reálného sýra (nap . sýrový výluh nebo pseudosý enina), bylo stanovení bun né lyze obtížn jší13.

Lyze laktokok v bujónu LM17 s mitomycinem C Výsledky bun ných lyzí testovaných laktokok v citrátovém pufru (pH 5) s p ídavkem

mitomycinu C (2,0 g.ml-1) p i teplot 30 °C po dobu 8 h jsou uvedeny na Obr. 1a-e. Výsledky p edstavují pr m r z p ti paralelních stanovení.

Obr. 1a-d. Závislost absorbance kmen : Lc. lactis AM2 (a), Lc. lactis NIZO B643 (b), Lc. lactisHMM 81 (c), Lc. lactis NIZO R5 (d) na dob kultivace v bujónu LM17 s mitomycinem C (2,0 g.ml-1) p i teplot 30 °C po dobu 8 h.

180

Obr. 1e Závislost absorbance Lc. lactis LCC 416 na dob kultivace v bujónu LM17 s mitomycinem C (2,0 g.ml-1) p i teplot 30 °C po dobu 8 h.

P i kultivaci laktokok v bujónu LM17 s mitomycinem C bylo zjišt no, že p i použití mitomycinu C (2,0 g.ml-1) byly u všech ty kmen Lc. lactis (AM2, NIZO B643, HMM 81 a NIZO R5), krom kmene Lc. lactis LCC 416, po 8 h kultivace zjišt ny vysoké bun né lyze od 89 do 98 %. Mitomycin C zde p sobil jako aktivátor bun né lyze. Ú inky mutagenních inidel (nap . mitomycinu C) i stresu prost edí (nap . teplotní šok) na aktivaci lyze u bakterií mlé néhokvašení jsou popsány v literatu e1. Námi použitá teplota kultivace 30 oC byla odvislá od zvolených metodik11,4. Z mikrobiologického hlediska se jednalo o optimální teplotu r stu testovaných laktokok .

B hem našich experiment byly lyze u lyzujících laktokok zp sobeny aktivací a uvoln ním profág z DNA laktokok . Všechny laktokoky, krom kmene Lc. lactis LCC 416, obsahovaly profágy. Procesy aktivace a uvoln ní profág z laktokok byly popsány v literatu e5.Fágy se v sýra ských technologiích mohou využívat k omezení vývoje ho ké chuti, nap . u sýrs nízkodoh ívanou sý eninou14.

Lyze laktokok na agaru GM17 s lyzátem bun k M. lysodeikticus Výsledek bun né lyze vybraného kmene Lc. lactis NIZO R5 kultivovaného v agaru

GM17 p i teplot 30 °C po dobu 2 dn s p ídavkem lyzátu bun k M. lysodeikticus (0,2 % hm.) je uveden na obr. 2.

Obr. 2. Lytické zóny kolem kolonií kmene Lc. lactis NIZO R5.

181

Testované laktokoky byly kultivovány na povrchu agaru GM17, který obsahoval komer nílyzát (lyofilizovaných) bun k M. lysodeikticus4. Lyzát bun k obsahující m.j bun né st nyM. lysodeikticus sloužil jako substrát pro endogenní peptidoglykanové hydrolasy, tzv. lyziny laktokok 1. P i našich experimentech bylo zjišt no, že p i difúzi lyzin agarem docházelo k rozpoušt ní bun ných st n M. lysodeikticus, což se projevilo tvorbou jasných lytických zón v okolí kolonií laktokok . Pr m ry lytických zón se po 2 dnech kultivací pohybovaly od 1,5 do 3,0 mm. Po 6 dnech kultivace došlo ke zv tšení pr m ru vzniklých zón v okolí kolonií laktokok ; nejv tší pr m r m il 12,0 mm. Nejmenší a nejh e viditelné zóny byly detekovány u kmene Lc. lactis AM2. U kmene Lc. lactis LCC 416 nebyly detekovány žádné lytické zóny.

Záv ryVšechny laktokoky, krom kmene Lc. lactis LCC 416, kultivované v citrátovém pufru p i teplot 13 °C za 12 dní byly vysoce lytické; bun né lyze se pohybovaly od 34 do 67 %. Všechny laktokoky, krom kmene Lc. lactis LCC 416, kultivované v bujónu LM17 s p ídavkem mitomycinu C (2,0 g.ml-1) p i teplot 30 °C po dobu 8 h, byly vysoce lytické; bun né lyze se pohybovaly od 89 do 98 %. Mytomycin C p sobil jako aktivátor lyzí. V okolí kolonií všech laktokok , krom kmene Lc. lactis LCC 416, kultivovaných na agaru GM17 obsahujícího komer ní lyzát bun k M. lysodeikticus (0,2 % hm.) p i teplot 30 °C po dobu 2 dn , byly detekovány lytické zóny o pr m ru od 1,5 do 3,0 mm. Za použití všech t ech detek ních metod byly ty i kmeny Lc. lactis (AM2, NIZO B643, HMM 81 a NIZO R5) hodnoceny jako lytické a jeden kmen Lc. lactis LCC 416 jako nelytický.

Hodnocení lyzí BMK je závislé na použité metod 15,1. K vytvo ení jednozna ných záv rby bylo t eba prov it lytické schopnosti testovaných laktokok pomocí dalších metod (nap . detekce laktátdehydrogenasy, r zných peptidas pepN, pepC a pepI)16.

Pod kování:Tato práce byla podpo ena Ministerstvem školství, mládeže a t lovýchovy eské republiky

(výzkumný zám r MSM 6046137305) .

Použitá literatura:1. Lortal S., Chapot-Chartier M.P.: Role, mechanisms and control of lactic acid bacteria lysis in cheese.

Int. Dairy J. 15, 857-871 (2005). 2. Smith T.J., Blackman S.A., Foster S.J.: Autolysins of Bacillus subtilis: multiple enzymes with multiple

functions Microbiology 146, 249-262 (2000). 3. Shockman G.D., Höltje J.-V.: Microbial peptidoglycan (murein) hydrolases. V knize: Bacterial Cell

Wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds.), s. 131-166. Elsevier, Amsterdam 1994. 4. Garde S., Gaya P., Medina M., Nuñez M.: Autolytic behaviour of Lactococcus lactis subsp. cremoris

and Lactococcus lactis subsp. lactis wild isolates from ewes´ raw milk cheeses. Milchwissenschaft 57 (3), 143-147 (2002).

5. O‘Sullivan, D., Ross, R. P., Fitzgerald, G. F., Coffey, A.: Investigation of the relationship between lysogeny and lysis of Lactococcus lactis in cheese using prohage-targeted PCR. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2192-2198 (2000).

6. Chapot-Chartier M.-P., Daniel C., Rousseau M., Vasal L., Gripon J.-C.: Autolysis of two strains of Lactococcus lactis dutiny cheese ripening. Int. Dairy J. 4, 251-269 (1994).

7. Boutrou R., Sepulchre A., Gripon J.C., Monnet V.: Simple tests for predicting the lytic behavior and proteolytic activity of lactococcal strains in cheese. J. Dairy Sci. 81, 2321 - 2328 (1998).

8. Bie R., Sjoström G.: Autolytic properties of some lactic acid bacteria used in cheese production: Part I.: Material and method. Milchwissenshaft 30, 653-657 (1975).

9. SN ISO 7218 (560103): Mikrobiologie potravin a krmiv - Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení. NI, Praha 1998.

182

10. Terzaghi B.E., Sandine W.E.: Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages.Appl. Environ. Microbiol. 29, 807-813 (1975).

11. Østlie H.M., Vegarud G., Langsrud T.: Autolysis of lactococci: Detection of lytic enzymes by polyacrylamise gel electrophoresis and characterization in buffer systems. Appl. Environ Microbiol. 61, 3598-3603 (1995).

12. Niskasaari K.: Characteristics of the autolysis of variants of Lactococcus lactis subsp. cremoris.J. Dairy Res. 56, 639-649 (1989).

13. Roberts M., Wijesundera C., Bruinenberg P.G., Limsowtin G.K.Y.: Development of an aseptic cheese curd slurry system for cheese ripening studies. Austr. J. Dairy Technol. 50, 66-69 (1995).

14. Crow V.L., Martley F.G., Coolbear T., Roundhill S.J.: The influence of phage-assisted lysis of Lactococcus lactis subsp. lactis ML8 on Cheddar cheese ripening. Int. Dairy J. 5, 451-472 (1995).

15. Hannon J.A., Wilkinson M.G., Delahunty C.M., Wallace J.M., Morrissey P.A., Beresford T.P.: Use of autolytic starter systeme to accelerate the ripening of cheddar cheese. Int. Dairy J. 13, 313-323 (2003).

16. Kilcawley K.N., Wilkinson M.G., Fox P.F.: Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations from microbial or animal sources. Enzyme Mikrob. Technol. 31(3),310-320 (2002).

Kontaktní adresa: Eva Šviráková, Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT v Praze, Technická 5, 166 28 Praha 6, R, tel: +420 220 443 271, fax: +420 220 443 285, e-mail: eva.svirakova@vscht.cz

183

AUTOLÝZA LACTOBACILLUS HELVETICUS 121 Ondrá ková Iva, Ku erová Kate ina, Šantinová Eva, Plocková Milada

Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha

Autolysis of Lactobacillus helveticus 121

Summary:The Lactobacillus helveticus strain 121 used in this study was confirmed to be helveticus species by API-test and by PCR with species-specific primers. Autolysis of this strain was evaluated by an assay using three different buffers, followed by observation of Gram staining by optical microscopy. Using these techniques we compared two methods: i) cultivation during 12 days at a controlled temperature of 13 °C and ii) cultivation for 4 hours at 42 °C using a BioTek cell. The strongest autolysis achieved using the 12 day assay in a phosphate buffer with pH 6 was 28.9%. Whereas, when the 4-hours method at 42 °C in a phosphate buffer with pH 7 was used, the maximal autolysis was 1.5%. It was able to evaluate the autolysis by light microscopy. The lysed / damaged cells were red in contrast to no-lysed cells colored in blue-violet. Lactobacillus helveticus 121 is therefore considered as a medially autolytic strain.

Úvod:

Klí ovým faktorem p i zrání sýru, b hem kterého se definuje jeho senzorický profil, je proteolýza. Rozpad bakteriální bu ky zp sobený vlastními enzymy, neboli autolýza, umož ujei intracelulárním enzym m, dostat se do matrice sýra a zapojit se do procesu zrání (7).

Na zrání sýr má nejv tší vliv hydrolytické št pení protein , zejména oligopeptid , které se senzoricky projevuje zm nou textury, chuti a v n sýr v pr b hu zrání. Proteolytický systém laktobacil je z funk ního hlediska velice podobný proteolytickému systému laktokok , je ovšem mnohem bohatší co se tý e zastoupení a aktivit proteinas a peptidas. Vzhledem ke vztahu mezi rozsahem autolýzy a rychlostí proteolýzy je tendence vybírat pro výrobu sýr kmeny s vysokou autolytickou a sou asn proteolytickou aktivitou (3). Pro zkrácení doby zrání sýr a zvýšení organoleptických vlastností produkt je proto d ležité se p edevším soust edit na výb r vhodných zákysových kultur (4).

Jednou z možností jak zvýšit míru proteolýzy je p ídavek vysoce autolytických laktobacil ,a to zejména druhu Lactobacillus helveticus. Sýry s p ídavky autolytických laktobacil jsou totiž hodnoceny jako lahodn jší a mén ho ké (3,4).

Nejjednodušší metodou zvýšení autolytické schopnosti je použití plasmidových konstruktnesoucích geny pro produkci r zných enzym , jak peptidoglykanových hydrolas tak peptidas, proteinas i pop . lipas. Bohužel, sou asný legislativní rámec tyto prost edky nepovoluje, a proto se pozornost obrací na izolaci nových vhodných kmen s vysokou enzymatickou aktivitou (7).

Cíle práce:

Cílem této práce bylo pro kmen Lb. helveticus 121 zjistit: fenotypickou a genotypickou charakteristiku,autolytickou aktivitu pomocí dvou kultiva ních metod v pufrových systémech, autolytickou aktivitu pomocí optického mikroskopu.

Materiál a metody:

Použité kmeny Lb. helveticus 121 (Laktoflora, CR) Lb. helveticus 466 (Laktoflora, CR)

184

Fenotypizace a genotypizace laktobacilZkoumané kmeny byly fenotypicky charakterizovány pomocí API-testu (Biomerieux, France) s použitím CHL50 kultiva ního média dle instrukcí výrobce (5,6). Genotypické potvrzení druhu bylo provedeno pomocí PCR s využitím druhov specifických primer MC10 (5‘-CATTATAGGCTCCTTTCTCATG-3‘) a MC13 (5‘-CAACCTTGTTAGCAGGCTTC-3‘) (8).

Screening autolytické aktivity v pufrových systémech B hem kultivace v pufrech byla m ena absorbance p i 650 nm pomocí dvou metod:

1) Klasická metoda (1): kultivace po dobu 12 dní p i 13 °C v termostatu s využitím 0,1 M citátového, fosfátového a McIlvainova pufru s p ídavkem 15 g/l NaCl o r zném pH.

2) Kontinuální metoda: kultivace po dobu 4 hodin p i 42 °C v cele p ístroje Biotek s využitím 0,1 M fosfátového pufru s p ídavkem 15 g/l NaCl o pH 7.

Procento autolýzy bylo vypo ítáno dle rovnice 1:

Rovnice 1: % autolýzy = [ (A0 – At)/ A0] x 100

kde A0 je po áte ní stav absorbance a At je absorbance m ená v ase t (1).

MikroskopieFixní preparáty bun k odebraných v ase 0h a 4h b hem kontinuální screeningové metody byly barveny dle Grama a pozorovány optickým mikroskopem p i tisíci násobném zv tšení.

Výsledky a diskuse:

Fenotypizace a genotypizace Lactobacillus helveticus 121 zkvašuje pouze glukosu, galaktosu a laktosu a tvo í PCR produkt o velikosti 1269 bp (Obr. 1) což jsou specifické znaky pro kmeny Lb. helveticus.

Obr. 1. PCR s druhov specifickými primery, sloupec: 1, 4 – 1 kb ladder, 2 – Lb. paracasei ST68 (negativní kontrola), 3 – Lb. helveticus 121

Autolytická aktivita P i 12ti denní kultivaci v 0,1 M pufrech p i pH 6 vykazoval kmen 121 nejvyšší autolýzu ve fosfátovém pufru, a to 28,9 % (Tabulka I).

185

Tabulka I % autolýzy u kmene Lb. helveticus 121 po kultivaci v r zných pufrech pH 6 o koncentracích 0,1 M s p ídavkem 15 g/l NaCl p i 13 °C po dobu 12 dní.

Pufr citrátový fosfátový McIlvaine

% autolýzy 12,7 28,9 17,3

Ve fosfátovém pufru o pH 7 u ty hodinové kontinuální kultivace p i 42 °C v cele Biotek bylo u kmene 121 1,5 % autolyzovaných bun k, kdežto u srovnávacího kmene Lb. helveticus 466 dosáhla autolýza po ty ech hodinách 50ti procent (Graf.1).

Graf. 1. Porovnání autolýz Lb.helveticus 121(-) a Lb.helveticus 466 ( ) pomocí m ení absorbance p i 650 nm p ístrojem BioTek b hem 16h.

Z mikroskopických záznam pro kmen Lb.helveticus 121 bylo patrno, že bun ná st na byla jen áste n narušena, bu ky lyzovaly jen ojedin le a byly zbarveny mod e (Obr.2) na rozdíl od Lb.

helveticus 466, kde došlo k jednozna nému odlišení mod e zbarvených nelyzovaných bun k p edkultivací v pufru a erven zbarvených zlyzovaných bun k po kultivaci v pufru (Obr.3).

a) b)

Obr. 2. Mikroskopický obraz a) Lb.helveticus 121 p ed kultivací ve fosfátovém pufru, b) Lb. helveticus 121 po 4h kultivace p i 42 °C.

186

c) d)

Obr. 3. Mikroskopický obraz c) Lb.helveticus 466 p ed kultivací ve fosfátovém pufru, d) Lb.helveticus 466 po 4h kultivace p i 42 °C.

Záv r:Barvení dle Grama umožnilo názorné rozlišení zlyzovaných a nezlyzovaných bun k a dob ekorelovalo s výsledky nam enými v pufrových systémech pomocí kontinualní metody. Využití p ístroje BioTek se zvýšením kultiva ní teploty na 42 °C je jednoduchá a rychlá metoda ke screeningu autolytické aktivity. Výsledky však nejsou srovnatelné s klasickou metodou. Kmen Lactobacillus helveticus 121 považujeme za st edn autolytický

Pod kování:Tato práce byla podpo ena Ministerstvem školství, mládeže a t lovýchovy eské republiky (výzkumný zám r MSM 6046137305) .

Použitá literatura:1. Boutrou R., Sepulchre A., Gripon J.-C., Monnet V.: Simple tests of predicting the lytic behaviour and

proteolytic activity of lactococcal strains in cheese. J. Of Dairy Sci. 81, 2321-2328 (1998). 2. Delcour J., Ferain T., Hols P.: Advances in the genetics of thermophilic lactic acid bacteria, Current

Opinion in Biotechnol. 11, 497–504, (2000) 3. Hannon J.A., Kilcawley K.N., Wilkinson M.G., Delahunty C.M., Beresford T.P.: Flavour precursor

development in Cheddar cheese due to lactococcal starters end presence and lysis of Lactovacillushelveticus. Int. Dairy J. (2005).

4. Hannon J.A., Wilkinson M.G., Delahunty C.M., Wallace J.M., Morrissey P.A., Beresford T.P.: Use of autolytic starter systems to accelerate the ripening of Cheddar cheese. Int. Dairy J. 13, 313-323 (2003).

5. Hébert E.M., Raya R.R., Tailliez P.,G.S. de Giori: Characterization of natural isolates of Lactobacillusstrains to be used as starter cultures in dairy fermentation, Int. J. of Food Microbiol. 59, 19–27, (2000)

6. Fitzsimons N.A.,,1 Cogan T.M.,,1 Condon S.,,2 Beresford T.: Phenotypic and Genotypic Characterization of Non-Starter Lactic Acid Bacteria in Mature Cheddar Cheese, Appl. and Envir. Microbiol. 65, 3418–3426, (1999)

7. Lortal S., Chapot-Chartier M.-P.: Role, mechanisms and control of lactic acid bacteria lysis in cheese. Int. Dairy J. 15, 857-871 (2005).

8. Ventura M., Callegari M.L., Morelli L.: S-layer gene as a molecular marker for identification of Lactobacillus helveticus, FEMS Microbiology Letters 189, 275-279, (2000)

Kontaktní adresa:Iva Ondrá ková, VŠCHT Praha, Technická 5, 16628 Praha 6, eská republika,e-mail: Iva.Ondrackova@vscht.cz

187

VLIV PO TU SOMATICKÝCH BUN K NA VYBRANÉ PARAMETRY MLÉKA DOJNIC ESKÉHO STRAKATÉHO PLEMENE

Skýpala Martin, Falta Daniel, Chládek Gustav Ústav chovu a šlecht ní zví at, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn

The influence of somatic cell count on chosen parameters of Czech Pied Cattle

Summary:The somatic cell count (SCC) in bovine milk is an indicator of udder health and milk quality and can be related to the cellular immune response after an inflammatory stimulus. The aim of our experiment was verified the higher somatic cell count have an efficient on the milk yield, milk components and technological properties of milk. The object of observation was 28 cows of Czech Pied Cattle on the 4th lactation to the 100-day of lactation. The cows were divided to 2 groups according to the somatic cell count (SCC): group 1 (G1; n = 14; SCC up to 400 000/1 mL) and group 2 (G2; n = 14; SCC above 400 000/ 1 mL). It was evaluated milk yield (kg), milk components (milk protein content, milk fat content, milk lactose content, solids-not-fat content) and technological properties of milk (active acidity, rennet coagulation time, quality of curd, freezing point of milk). It was found significant difference (P<0.05) only in milk yield. No significant differences (P>0.1) were found in rest monitored parametrs. There was lower milk yield in G1 (13.6 kg) than in G2 (15.8 kg). Lower values of active acidity, renet coagulation time, milk fat content and freezing point of milk were found in cow´s milk from the G1. On the other hand values of milk protein content, milk lactose content, solids-not-fat content and quality of curd were lower in the milk from the G2.

Úvod Po et somatických bun k (PSB) v mléce je jako p edm t výzkumných publikací zaznamenáván od roku 1910 [6]. Podle [8] je po et somatických bun k v mléce užíván jako m ítkozdraví mlé né žlázy a kvality mléka. V mnoha zemích je po et somatických bun k používán jako parametr hygienické kvality mléka a zpen žování syrového mléka [14]. Obsah somatických bun kv mléce má své fyziologické opodstatn ní. Jedná se o kolostrální a epiteliální t líska, bu ky z krve a mlé né žlázy [18]. Somatické bu ky existují v mnoha typech, v etn neutrofil , makrofág ,lymfocyt , eosinofil a r zných typ epiteliálních bun k mlé né žlázy [6]. Ve zdravé mlé né žláze jsou p evládajícím typem makrofágy (35-79 %), následují lymfocyty (16-28 %), polymorfonukleární neutrofily (3-26 %) a epiteliální bu ky (2-15 %) [9]. Zvýšení po tusomatických bun k (SB) m že být vyvoláno zm nou vn jších podmínek chovu (vážení dojnic, zooveterinární opat ení), které mohou zp sobit v tší zatížení organismu dojnic (stress). Dalším faktorem, který ovliv uje zvýšení obsahu SB v mléce je výživa a krmení. V neposlední ad se na zm n obsahu SB podílí i zm na vnit ního prost edí mlé né žlázy - vznik mastitid [16]. Mastitida je zán tlivá reakce tkán vemene jako odpov na infekci. Tento zán t je charakterizován p ísunem bílých krvinek do mlé né žlázy a poté následuje zvýšení endogenních mlé ných proteináz [7]. [17] udávají, že mastitidní mléko vykazuje vyšší proteolytickou aktivitu než mléko normální, což má za následek zvýšení proteinázy plasminu, který hydrolyzuje kasein. Podle [12] mastitida snižuje v mléce obsah tuku, kaseinu, laktózy a sušiny a naopak se zvyšuje obsah sérových protein a chlorid . Také [10] uvádí, že mléko s vyšším po tem somatických bun kinhibuje r st startovacích kultur, zatímco mléko s nižším po tem je dobré medium pro r st bakterií mlé ného kvašení.

188

Materiál a metodika Objektem sledování bylo 28 krav eského strakatého plemene na 4. laktaci do 100. lakta ního dne. Dojnice byly rozd leny do 2 skupin podle po tu somatických bun k (PSB): skupina 1 (G1; n = 14; PSB do 400 tis./1 ml) a skupina 2 (G2; n = 14; PSB nad 400 tis./1 ml). Byl hodnocen nádoj (kg), obsahové složky (obsah bílkovin, obsah tuku, obsah laktózy, obsah tukuprosté sušiny) a technologické ukazatele (aktivní kyselost, sy itelnost, kvalita sý eniny, bod mrznutí mléka). V laborato i pro rozbor mléka (Brno-Chrlice) byly stanoveny tyto ukazatele: obsah tuku, bílkovin, laktózy a tukuprostá sušina infra erveným absorp ním analyzátorem BENTLEY 2000, po et somatických bun k pomocí fluoro-opto-elektronické metody p ístrojem SOMACOUNT 500, bod mrznutí byl stanoven p ístrojem kryoskop CRYOSTAR. Ostatní ukazatele byly zjišt ny v laborato i Ústavu chovu a šlecht ní zví at MZLU v Brn . Sy itelnost mléka byla stanovena pomocí "Nefelo-turbidimetrického sníma e koagulace mléka" m ící principem popsaným v [1]. Bylo použito sy idlo Laktochym 1:5000 (Milcom Tábor) v množství 1 ml na 50 ml mléka po z ed ní sy idla 1:4. Kvalita byla hodnocena po 60 minutové inkubaci 50 ml zasý eného mléka p i 35 0C a posouzena dle tabulky v [2] hodnotící vzhled sý eniny a syrovátky (t ída 1 = nejlepší, t ída 5 = nejhorší). Aktivní kyselost byla m ena pH-metrem CyberScan PC 510 (Eutech Instruments).

Výsledky a diskuze

Tabulka I

Základní statistické charakteristiky sledovaných ukazatel u jednotlivých skupin

skupina 1 (G1) skupina 2 (G2) UkazatelSx Vx(%) Sx Vx (%)

SP

Nádoj (kg) 13,6 2,33 17,20 15,8 3,25 20,61 * Bílkoviny (%) 3,30 0,28 8,35 3,27 0,33 10,09 NSTuk (%) 4,21 0,68 16,25 4,62 1,96 42,46 NSLaktóza (%) 4,99 0,15 3,04 4,90 0,20 3,99 NSTps (%) 8,67 0,36 4,10 8,51 0,79 9,28 NSAktivní kyselost (pH) 6,70 0,07 0,98 6,72 0,12 1,73 NSSy itelnost (s) 169 32,60 19,30 199 75,19 37,88 NSKvalita sý eniny (t .) 1,87 0,70 37,49 1,46 0,84 57,66 NSBM (-m 0C) 534,1 7,59 1,42 534,3 8,61 1,61 NS

SP - statistická pr kaznost, * - statisticky pr kazný vliv (P<0,05), NS - statisticky nepr kazný vliv

Zjistili jsme statisticky pr kazn (P<0,05) nižší pr m rný denní nádoj (13,6 kg) u krav s po tem somatických bun k do 400 000 v 1 ml (G1) než v mléce dojnic s po tem somatických bun k nad 400 000 v 1 ml (G2), kde bylo nam eno pr m rné množství mléka 15,8 kg. Naše výsledky u tohoto parametru jsou v rozporu s pracemi uvád nými nap . autory [11], kte í popisují pokles množství mléka se zvyšujícím se po tem somatických bun k v mléce, jakožto výsledek zhoršené syntetické aktivity mlé né žlázy. Také [5] konstatují, že krávy trpící klinickou mastitidou mají denní nádoj o 0,5 kg nižší ve srovnání se zdravými dojnicemi. Pokud jde o obsah tuku v mléce, u skupiny G1 bylo zjišt no 4,21 % tuku, tedy mén , než v mléce skupiny G2 (4,62 %). Vyšší obsah tuku v mléce s v tším po tem somatických bun k zjistil i [4, 7].

xx

189

Obr. 1 Rozdíly pr m rných hodnot mezi skupinami u nádoje (kg).

Obr. 2 Rozdíly pr m rných hodnot mezi skupinami v obsahu tuku (%).

Obsah bílkovin v mléce u G1 byl 3,3 %, což je hodnota statisticky nepr kazn vyšší oproti dojnicím ze skupiny G2, kde pr m rný obsah bílkovin byl 3,27 %. [3] zjistil, že p i zvýšeném po tu leukocyt v mléce klesá obsah bílkovin. Naproti tomu fakt, že p i zvýšeném po tu somatických bun k je obsah bílkovin v mléce vyšší popisují [7, 11]. Obsah laktózy v mléce skupiny G1 byl 4,99 %, tato hodnota je vyšší, než-li obsah laktózy v mléce dojnic skupiny G2, který byl 4,9 %. Námi zjišt né údaje jsou ve shod s [7, 13].

Obr. 3 Rozdíly pr m rných hodnot mezi skupinami u obsahu bílkovin (%).

Obr. 4 Rozdíly pr m rných hodnot mezi skupinami v obsahu laktózy (%).

G1 G2

skupiny

11

12

13

14

15

16

17

18

nádo

j (kg

)

G1 G2

skupiny

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

tuk

(%)

G1 G2

skupiny

3,0

3,1

3,2

3,3

3,4

3,5

3,6

bílk

ovin

y (%

)

G1 G2

skupiny

4,75

4,80

4,85

4,90

4,95

5,00

5,05

5,10

5,15

lakt

óza

(%)

190

Obsah tukuprosté sušiny u skupiny G1 byl 8,67 %, tedy o 0,16 % více než u skupiny G2, kde byl nam en obsah tukuprosté sušiny 8,51 %. Stejn tak [4] ve své práci uvád jí vyšší obsah tukuprosté sušiny u mléka s nižším po tem somatických bun k. Aktivní kyselost (pH) byla zjišt na u skupiny G1 6,70 a u skupiny G2 hodnota 6,72. Podobn [7] zjistili vyšší pH mléka s v tším po tem somatických bun k. Nepatrné zvýšení pH u mléka s vyšším po tem somatických bun k uvádí též [9].

Obr. 5 Rozdíly pr m rných hodnot mezi skupinami u obsahu tukuprosté sušiny (%).

Obr. 6 Rozdíly pr m rných hodnot mezi skupinami v aktivní kyselosti (pH).

Sy itelnost byla u mléka z 1. skupiny 169 s, zatímco mléko z 2. skupiny se sráželo déle (199 s). Rozdíl mezi t mito dv ma skupinami je statisticky nepr kazný. Delší dobu srážení mléka s vyšším po tem somatických bun k uvád jí také [8, 15, 17]. Mnoho prací uvádí, že mléko s vyšším po tem somatických bun k vykazuje pomalejší rychlost tvorby sý eniny a také sý enina je k eh í. Je možné, že r st bakterií mlé ného kvašení je inhibován antibakteriálními látkami produkovanými bílými krvinkami [7], které nejvíce zvyšují po et somatických bun k v mléce. Z výsledk uvedených v tabulce I vyplývá, že sý enina mléka z G1 je mén kvalitní (t . 1,87) než sý enina z G2 (t . 1,46). Naproti tomu [3] tvrdí, že u mléka s vyšším po temsomatických bun k klesá pevnost sý eniny.

Bod mrznutí mléka byl u sledovaných skupin prakticky totožný; u skupiny G2 (-534,3 m 0C) a u skupiny G1 (-534,1 m 0C). Rovn ž [13] zjistili vyšší bod mrznutí u mléka s vyšším po tem somatických bun k.

G1 G2

skupiny

8,0

8,1

8,2

8,3

8,4

8,5

8,6

8,7

8,8

8,9

9,0

9,1

9,2

Tuku

pros

tá s

ušin

a (%

)

G1 G2

skupiny

6,62

6,64

6,66

6,68

6,70

6,72

6,74

6,76

6,78

6,80

Akt

ivní

kys

elos

t (pH

)

191

Obr. 7 Rozdíly pr m rných hodnot mezi skupinami u sy itelnosti (s).

Obr. 8 Rozdíly pr m rných hodnot mezi skupinami v kvalit sý eniny (t ída).

Záv r Po et somatických bun k v kravském mléce slouží jako indikátor zdraví mlé né žlázy a kvality mléka a m že souviset s bun nou imunitní odezvou po zán tlivém procesu. P edm temnašeho experimentu bylo ov it, zda vyšší po et somatických bun k má vliv na nádoj, obsahové složky a technologické ukazatele mléka. Zjistili jsme statisticky pr kazn (P<0,05) nižší nádoj u skupiny 1 (G1; 13,6 kg) oproti skupin 2 (G2; 15,8 kg). Dále byla u G1 zjišt na nižší aktivní kyselost (pH), sy itelnost (s) a obsah tuku (%) než ve G2. Naopak u obsahu bílkovin (%), obsahu laktózy (%), obsah tukuprosté sušiny (%), kvality sý eniny (t ída) a bod mrznutí (- 0C) byly hodnoty u G1 vyšší oproti G2. Tyto uvedené rozdíly však nebyly statisticky pr kazné.

Pod kováníP ísp vek byl zpracován s podporou Výzkumného zám ru . MSM6215648905 „Biologické a technologické aspekty udržitelnosti ízených ekosystém a jejich adaptace na zm nu klimatu“ ud leného Ministerstvem školství, mládeže a t lovýchovy eské republiky.

Použitá literatura[1] EJNA, V., CHLÁDEK, G.: A coagulation time of individual milk samples and its relationship with a

number and phase of lactation in Holstein cows. [in Czech] Sborník: Mléko a sýry. 1. vyd. Praha: eská spole nost chemická, 2005, s. 3

[2] GAJD ŠEK, S.: Mléka ství II (cvi ení). Brno: MZLU. 1999, 92 s. [3] HAENLEIN, G. F. W., SCHULTZ, L. H., ZIKAKIS, J. P.: Composition of proteins in milk with

varying leucocyte contents. J. Dairy Sci., 1973, 56: 1017-1024 [4] HAMPTON, O., RANDOLPH, H. E.: Influence of mastitis on properties of milk. II. Acid

production and curd firmness. J. Dairy Sci., 1969, 52: 1562-1565 [5] JONES, G. M., PEARSON, R. E., CLABAUGH, G. A., HEALD, C. W.: Relatioships between somatic

cell counts and milk production. J. Dairy Sci., 1984, 67:1823-1831 [6] KEHRLI, M. E., SHUSTER, D. E.: Factors affecting milk somatic cells and their role in health of the

bovine mammary gland. J.Dairy Sci., 1994, 77:619-627 [7] KLEI, L., YUN, J., SAPRU, A., LYNCH, J., BARBANO, D., SEARS, P., GALTON, D.: Effects of

milk somatic cell count on cottage cheese yield and quality. J. Dairy Sci., 1998, 81:1205-1213

G1 G2

skupiny

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250S

yite

lnos

t (s)

G1 G2

skupiny

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

Kva

lita

sýen

iny

(tíd

a)

192

[8] LINDMARK-MÅNSSON, H., BRÄNNING, C., ALDÉN, G., PAULSSON, M.: Relatioship between somatic cell count, individua leukocyte populations and milk components in bovine udder quarter milk. International Dairy Journal, 2006, 16:717-727

[9] LANE, H. L. RICHTER, R. L. RANDOLPH, H. E.: Influence of mastitis on properties of milk. VI. Buffer capacity. J. Dairy Sci., 1970, 53: 1389-1390

[10] LINDMARK-MÅNSSON, H., SVENSSON, U., PAULSSON, M., ALDÉN, G., FRANK, B., JOHNSSON, G.: Influence of milk components, somatic cells and supplemental zinc on milk processability. International Dairy Journal, 2000, 10:423-433

[11] NG-KWAI-HANG, K. F., HAYES, J. F., MOXLEY, J. E., MONARDES, H. G.: Variability of test-day milk production and composition and relation of somatic cell counts with yield and compositional changes of bovine milk. J. Dairy Sci., 1984, 67:361-366

[12] RANDOLPH, H. E., ERWlN, R. E., RICHTER, R. L. Influence of Mastitis on Properties of Milk.VII. Distribution of Milk Proteins 1. J. Dairy Sci., 1974, 57: 15-18

[13] RASMUSSEN, M., D., LARSEN, L. B.: Milking hygiene: new issues and opportunities from automatic milking. Ital.J.Anim.Sci., 2003, 2:283-289

[14] SURYIASATHAPORN, W., VINITKETKUMNUEN, U., CHEWONARIN, T., BOONYAYATRA, S., KREAUSUKON, K., SCHUKKEN, Y.H.: Higher somatic cell counts resulted in higher malondialdehyde concentrations in raw cows' milk. International Dairy Journal, 2006, 16: 1088-1091

[15] TEPLÝ M. et al.: Mléko a jeho produkce k pr myslovému zpracování. Praha: SNTL, 1979, 376 s. [16] TOUŠOVÁ, R., STÁDNÍK, L.: Sledování obsahu somatických bun k mléka v závislosti na r zných

initelích u holštýnsko - fríských krav. Sborník: Den mléka, Praha, 1999 [17] VERDI, R. J., BARBANO, D. M., DELLAVALLE, M. E., SENYK, G.F.: Variability in true protein,

casein, nonprotein nitrogen, and proteolysis in high and low somatic cell milks. J. Dairy Sci., 1987, 70:230_242

[18] ŽIŽLAVSKÝ, J., MIKŠÍK, J., GAJD ŠEK, S., KUCHTÍK, J.: Somatické bu ky v mléce krav v prvních 100 dnech laktace. Živo . Výr., 34, 1992, 1:359-363

Kontaktní adresaMSkypala@seznam.cz, Falta.Daniel@seznam.cz, chladek@mendelu.cz Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Z m d lská 1, 613 00 Brno

193

VLIV POLYMORFISMU GENU CSN2 NA PO ET SOMATICKÝCH BUN KU ESKÉHO STRAKATÉHO A HOLŠTÝNSKÉHO MLÉ NÉHO SKOTU.

Sojková K.1, íha J.2, Manga I.3, Dvo ák J.31VÚCHS Rapotín, s. r. o., 2Agrovýzkum Rapotín, s.r.o.

3Ústav morfologie, fyziologie a genetiky živo ich MZLU v Brn

Effects of CSN2 gene on somatic cells count in Czech Spotted and Holstein dairy cows

Summary:We analyzed effects of CSN2 gene on somatic cells count in milk recording. The CSN2 gene is one of the most tested genes in marker assisted selection breeding programmes. It is also important as marker usable for milk production and quality parameters. Somatic cells count is one of the key attributes in milk quality and health problems indicators. We selected 225 individuals of Holstein and Czech Spotted Cattle breeds for testing association. Distributions of genotypes was calculated in these subpopulations. For data analysis we use GLM procedure with effects of lactation number, breed and genotype of the CSN2 gene. Significant associations were found in somatic cells count. Individuals with A1A1 genotype have significant higher somatic cells count than other groups in several tests. Linear trend of somatic cells count in A1A2 genotype was also detected. The positive findings is that valuable A2A2 genotype is associated with the lowest number of somatic cells. This offers new possibilities in selection of dairy cattles.

This work was supported by the projet MZe R 1G58073 and MSM 2678846201.

SouhrnV práci hodnotíme vliv genu CSN2 na po et somatických bun k v mléce na údajích

vztahujících se k mlé né užitkovosti. Gen CSN2 je jedním z nejvíce testovaných genv chovatelských programech s využitím genetických marker . Je také d ležitý jako marker pro parametry mlé né produkce a zpracovatelské kvality mléka, v etn mlé ných výrobk . Po etsomatických bun k je jedním z klí ových atribut indikujících kvalitu mléka a zdravotní problémy zví at. Experimentální soubor tvo í 225 jedinc holštýnského a eského strakatého skotu. V t chto subpopulacích byla vyhodnbocena frekvence sledovaného genotypu. K samotné datové analýze jsme použili metodu GLM, s efekty aktuální laktace, plemene a genotypu genu CSN2. Ve sledované veli in – po tu somatických bun k – byla zjišt na na základ statistického zpracování celá adasignifikantních rozdíl . Dojnice s genotypem A1A1 vykazují výzmnamn vyšší po et somatických bun k než ostatní skupiny ve v tšin provedených test . Byl rovn ž potvrzen lineární trend nár stu po tu somatických bun k pro jedince s genotypem A1A2. Pozitivním výsledkem je zjišt ní,že genotyp A2A2 je spojen s nejnižším po tem somatických bun k pro ob plemena. Tento výsledek nabízí nové možnosti v selekci mlé ného skotu s využitím selekce podle genu CSN2.

ÚvodGenetické markery (mikrosatelitní markery, SNPs, atd.) jsou díky své vazb na užitkové i

kvalitativní znaky produkce hospodá ských zví at ve velké mí e používány ve šlechtitelských programech. asto bývají využívány jako QTL (Quantitave Trait Loci), ETL (Economic Trait Loci) a tvo í tak spolu s ostatními metodami kontroly užitkovosti v chovatelském procesu šlecht ní na o ekáváné hodnoty sledovaných znak (Meuwissen, 2003). Je nutné, aby chovatelé ve spolupráci s metodami molekulární biologie a genetiky byli schopni tyto markery identifikovat v chovaných populacích, prokázat jejich vazbu na požadované znaky a této vazby vhodn využít. P íkladem takovýchto marker jsou v mlé né produkci skotu nap íklad r zné muta ní markery pro polymorfizmy gen DGAT1, kapa kasein (CSN3), beta kasein (CSN2), laktoglobulin LGB (Tsiaras, 2005), PIT-1 – specifický transkrip ní faktor regulující expresi r stového hormonu (GH) (Renaville, 2005), IGF-2 a další. Jejich vliv na parametry mlé né produkce byl vyhodnocen množstvím autor (Renaville, 2005, Kucerova, 2004, Walawski, 1997, Van den Berg, 1990, Hill, 1993).

194

Gen pro beta kasein je, mimo své primární vazby na p ítomnost požadované formy beta kaseinu jako potenciáln využitelné látky prosp šné lidskému zdraví (Wong et al., 1996, Swinburn, 2004), ve vazb k mnoha dalším kvantitaivním znak m mlé né produkce skotu. Vazbou polymorfizmu beta kaseinu na znaky mlé né užitkovovsti u lokáln chovaných plemen skotu se v minulosti zabývala nap . práce (Caroli et al, 2003; ).

V této práci se zabýváme vlivem polymorfizm genu pro beta kasein na jeden z klí ovýmparametr syrového kravského mléka – po et somatických bun k. V sou asné dob se ve vztahu k tomuto parametru testují nap . také markery pro geny CGIL4, CCL2, IL8, CCR2 a IL8RA.(Sharma et al., 2006; Leyva-Baca et al., 2007). Po et somatických bun k je hlavním faktorem ur ujícím bezpe nost mléka jako potravinového zdroje, je jedním z indikátor zdravotního stavu zví at, taktéž je ur ujícím faktorem pro zpracovatelskou kvalitu mléka a jedním z parametrsledování mlé né užitkovosti (Ingalls, 2002; Ma et al., 2000). Auto i poukazují na snížení výt žnosti u zpracování sýr ; po zni ení bakterií se uvol ují enzymy, které jsou rezidentní k procesu pasterizace a mohou zp sobit poškození mlé ného tuku a protein . To m že vést ke zm ne chu ových vlastností mléka, které m že konzument považovat za objektivnproblematické. Navíc to m že negativn ovlivnit trvanlivost mléka, a to i když je ádn chlazeno.

Vzhledem k hypotézám o zdraví prosp šném vlivu beta kaseinu (Clarke, 2007) v práci testujeme jeho vazbu k po tu somatických bun k v syrovém kravském mlévce. Pro zachycení specifických faktor podmínek chovu krav s mlé nou užitkovostí v R jsme vybrali pro naši studii jedince z chov podobných parametr (výživa, mlé ná produkce) tak, aby byla zastoupena v Rnejvíce chovaná plemena s mlé nou užitkovostí – eské ervenostrakaté a holštýnské.

Materiál a metodyDatový soubor obsahoval 225 jedinc . Izolace DNA z biologických vzork byla provedena

pomocí Jet Quick Blood and Cell Culture DNA Spin Kit (Genomed). Ur ení polymorfizmu beta kaseinu bylo provedeno pomocí PRC-RFLP metody (McLachlan, 2003). Po ošet ení datového souboru na odlehlé a chyb jící hodnoty bylo do následující analýzy zahrnuto 198 jedinc . V takto ošet eném datovém souboru je zahrnuto 134 jedinc plemene eské ervenostrakaté a 64 jedincplemene holštýn. U 157 sledovaných jedinc byl sledován logaritmovaný po et somatrických bun k na první laktaci, u 41 jedinc na páté a vyšší laktaci.

Pro hodnocení vlivu genu CSN2 na logaritmovaný po et somatických bun k (logSB) byl použit lineární model s pevnými efekty plemeno, laktace a genotyp CSN2 v úplném schématu porovnání (se všemi možnými smíšenými efekty).

log 22 2 *2 * *

ijkl j k l

j k j l k l

j k l ijkl

SB CSN laktace plemenoCSN laktace CSN plemeno laktace plemenoCSN laktace plemeno e

m= + + + ++ * + + *+ +

Všechny sledované efekty spl ují pro logaritmovaný po et somatických bun kp edpoklady homogenity rozptyl (Levene v test) a testy normálního rozd lení uvnit skupin efekt , logaritmovaný po et somatických bun k spl uje test normálního rozd lení.

Post-hoc testy jsou provedeny pomocí Tukeyho HSD testu pro nestejný po et pozorování.

Výsledky a diskuze

Základní parametry datového souboru pro prom nou logSB a efekty plemeno a laktaceobsahuje tabulka I. V tabulce II jsou uvedeny základní popisné statistiky pro jednotlivé genotypy genu CSN2 vzhledem k po tu somatických bun k.

195

Tabulka IZákladní charakteristiky datového souboru pro logaritmický po et somatických bun k v mléce. laktace plemeno logSB

pr m rlogSBN

logSBmin

logSBmax

logSBstddev

1 CSTR 4.145 104 1.099 7.731 1.305 5 CSTR 4.927 30 2.079 7.608 1.246 1 H 5.002 53 2.639 7.585 1.156 5 H 6.126 11 4.997 7.954 1.065 Všechny skupiny 4.603 198 1.098 7.954 1.352

Tabulka IILogaritmické po ty somatických bun k a základní statistické charakteristiky vzhledem ke genotyp m CSN2.CSN2 logSB

pr m rlogSB min

logSBmax

logSBstddev

A1A2 4.616 2.708 7.620 1.078 A2 4.365 1.099 7.731 1.433 A1 5.732 2.079 7.954 1.414 Všechny skupiny 4.612 1.099 7.954 1.340

Tabulka III ukazuje zjišt né frekvence genotyp genu CSN2 v námi vybrané subpopulaci. Výsledky korespondují nap . s pracemi (Thompson et al., 1964; Bech, Kristiansen, 1990).

Tabulka III Logaritmické po ty somatických bun k a základní statistické charakteristiky vzhledem ke genotyp m CSN2. Frekvence genotyp CSN2 u obou sledovaných plemen.

N=198 Plemeno STR Plemeno H A2 51.24% 36.21% A1A2 41.32% 48.28% A1 7.44% 15.52%

Testovaný model má pro datový soubor parametry, které jsou shrnuty v tabulce IV. Nulová hypotéza o rovnosti variability modelu a reziduí je t mito výsledky vyvrácena (p<0.001).

Tabulka IVParametry lineárního modelu. Kvalita proložení.

model R R^2 Upravené R^2 F p

logSB 0.502 0.252 0.203 0.115 0.001

Tabulka V obsahuje výsledky analýzy celého modelu pro všechny sledované efekty. Efekt laktace je pr kazný vzhledem k po tu somatických bun k (p=0.022). Taktéž efekt plemene se ukázal jako vysoce pr kazný na této úrovni analýzy (p=0.00097). Zajímavý je trend nazna enýu efektu beta kaseinu (p=0.724). Tento trend ukazuje, že v rámci n kterých skupin jednotlivých genotyp dochází pravd podobn k diferenciaci po tu somatických bun k. Proto je efekt podrobn jianalyzován pomocí post-hoc test .

196

Tabulka V Hodnocení jednotlivých efekt lineárního modelu. Efekt S Stupn P F p Abs. len 1598.844 1 1598.844 1117.664 0.000 CSN2 7.633 2 3.816 2.668 0.072 Laktace 7.635 1 7.635 5.337 0.022Plemeno 16.149 1 16.149 11.289 0.001CSN2*laktace 1.632 2 0.816 0.570 0.566 CSN2*plemeno 6.373 2 3.187 2.228 0.111 laktace*plemeno 0.820 1 0.820 0.573 0.450 CSN2*laktace*plemeno 0.762 2 0.381 0.266 0.766 Chyba 238.897 167 1.431

.

Grafy 1, 2, 3 ukazují množství somatických bun k v rámci sledovaných efekt . Krávy na páté a vyšší laktaci mají signifikantn vyšší po et somatických bun k než krávy na nižších laktacích. Rovn ž krávy plemene holštýn mají vysoce pr kazn vyšší po et somatických bun k než dojnice plemene eské ervenostrakaté.

Sou asný efekt: F(1, 167)=5.3372, p=.02210Vertikály ozna ují 0.95 intervaly spolehlivosti

1 5laktace

4.4

4.6

4.8

5.0

5.2

5.4

5.6

5.8

6.0

6.2

6.4

logS

B

Sou asný efekt: F(1, 167)=11.289, p=.00097Vertikály ozna ují 0.95 intervaly spolehlivosti

CSTR Hplemeno

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

5.2

5.4

5.6

5.8

6.0

6.2

6.4

logS

B

Graf 1, 2 Grafická reprezentace po tu somatických bun k v závislosti na po adí laktace a plemenné p íslušnosti.

Genotyp A2A2 je ve sledovaném souboru zví at asociován s nejnižším po temsomatických bun k. Naopak genotyp A1A1je asociován s nejvyšším po tem somatických bun k.Lineární trend nárustu po tu somatických bun k s výskytek alely A1potvrzují i výsledky pro genotyp A1A2. A koliv není efekt genotypu beta kaseinu pr kazný celkov a výsledkem je pouze statistický trend, provedené pos-hoc testy ukazují, existenci pr kazného rozdílu v po tusomatických bun k mezi genotypy A1A2 a A1A1, a vysoce pr kazný rozdíl mezi genotypy A2A2 a A1A1 (tabulka VI). Podle výsledk je tedy z ejmé, že genotyp A2A2 je asociován s nižším po tem somatických bun k v mléce sledovaných jedinc . Rovn ž vliv alely A2 na po et somatických bun kve sledovaném souboru je pr kazný (tabulka VI).

197

Sou asný efekt: F(2, 167)=2.6679, p=.07236Vertikály ozna ují 0.95 intervaly spolehlivosti

A2 A1A2 A1

CSN2

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

logS

B

Graf 3 Po et somatických bun k v závislosti na genotypu CSN2.

Tabulka VI Post-hos Tukey v HSD test pro nestejná N. Rozdíly v po tu somatických bun k v závislosti na genotypu CSN2. Tukey v HSD test CSN2 {1} {2} {3} 1 A2 0.389 0.0022 A1A2 0.389 0.0143 A1 0.002 0.014

Graf 4 ukazuje graficky rozdíly v po tu somatických bun k v rámci všech sledovaných efekt(smíšený efekt CSN2*laktace*plemeno).

gen.CSN2*laktace*plemeno

laktace 1 laktace 5

gen. CSN2: A2

plem

eno:

CS

TR H

2

3

4

5

6

7

8

9

logS

B

gen. CSN2: A1A2

plem

eno:

CS

TR H

gen. CSN2: A1

plem

eno:

CS

TR H

Graf 4 Grafická analýza efektu CSN2*laktace*plemeno.

198

P edevším u dojnic na první laktaci se projevují popsané výsledky. U plemene holštýn se výsledky potvrzují také pro dojnice na páté a vyšší laktaci. Nehomogenita výsledk u plemene eské ervenostrakaté na páté a vyšší laktaci m že být zp sobena dvojí užitkovostí plemene,

špatným zdravotním stavem stáda i efektem chovu a také malou etností skupiny.

Záv rPro sledovaný soubor zví at byl vyhodnocen vliv polymorfizmu genu CSN2 na po et

somatických bun k v mléce. Soubor byl tvo en jedinci plemene holštýn a eské ervenostrakaté.Soubor 225 (resp. 198) jedinc byl analyzován pomocí lineárního modelu s pevnými efekty laktace, plemene a genotypu. Výsledky ukazují signifikantní rozdíly v po tu somatických bun k v závislosti na plemenné p íslušnosti a po adí laktace dojnic. Statisticky významné rozdíly se však projevily i v post-hoc testech provedených podle genotyp genu CSN2, což se potvrdilo i p i rozboru efektinterakcí.

Asociace menšího po tu somatických bun k s genotypem A2A2 (resp. alelou A2) u obou plemen je pozitivním výsledkem. Umož uje využít selekci na alelu A2 i její zvýšení v populacích pro snížení po tu somatických bun k v mléce a tím pomoci zaru it jeho požadovanou kvalitu.

Pod kování:Práce vznikla za podpory projekt MZe R 1G58073 and MSM 2678846201.

Použitá literatura:1. Bech, A. M. & Kristiansen, K. R. (1990). Milk protein polymorphism in Danish dairy cattle and the

influence of genetic variants on milk yield. J. Dairy Res 57, 53-62. 2. Caroli, A., Chessa, S., Bolla, P., Budelli, E. & Gandini, G. C. (2004). Genetic structure of milk protein

polymorphisms and effects on milk production traits in a local dairy cattle. Journal of Animal Breeding and Genetics 121, 119-127.

3. Clark A. J. (2007). a2 Milk™ Overview of Technology. In proceedings of Milk Technology Conference 2007. June 5-6. Denver, CO.

4. Hill, J. P. (1993). The relationship between -lactoglobulin phenotypes and milk composition in New Zealand dairy cattle. J. Dairy Sci. 76:281–286.

5. Leyva-Baca, I., Schenkel, F., Sharma, B. S., Jansen, G. B. & Karrow, N. A. (2007). Identification of single nucleotide polymorphisms in the bovine CCL2, IL8, CCR2 and IL8RA genes and their association with health and production in Canadian Holsteins. Animal Genetics 38, 198-202.

6. Ma, Y., Ryan, C., Barbano, D. M., Galton, D. M., Rudan, M. A. & Boor, K. J. (2000). Effects of Somatic Cell Count on Quality and Shelf-Life of Pasteurized Fluid Milk. Journal of Dairy Science 83, 264-274.

7. McLachlan C.,N.,S., : Breeding and milking cows for milk free of beta-casein A1, 2003-11-27, US2003221200.

8. Meuwissen, T. (2003) Genomic selection: the future of marker assisted selection and animal breeding. In: MAS: A fast track to increase genetic gain in plant and animal breeding?, FAO , electronic forum on biotechnology in food and agriculture, 17-18 october 2003, Turin.

9. Ingalls W. (2002). Somatic Cells, Mastitis and Milk Quality. Electronic material:http://www.moomilk.com/archive/u-health-20.htm. Kansas City, MO.

10. Ku erová, J., et. al. (2004). The influence of markers CSN3 and ETH10 on milk production parameters in The Czech pied cattle. Journal of central european agriculture, vol 5, no2, 303-308.

11. Renaville R, Gengler N. (2005) Method for identifying animals for milk production qualities by analysing the polymorphism of the Pit-1 and kappa-casein genes, 2005-06-23, US2005136440.

12. Sharma, B. S., Jansen, G. B., Karrow, N. A., Kelton, D. & Jiang, Z. (2006). Detection and Characterization of Amplified Fragment Length Polymorphism Markers for Clinical Mastitis in Canadian Holsteins. Journal of Dairy Science 89, 3653.

13. Swinburn, B. (2004). Beta Casein A1 and A2 in Milk and Human Health. Report to New Zealand Food Safety Authority, Jul 13.

199

14. Thompson, M. P., Kiddy, C. A., Johnston, J. O. & Weinberg, R. M. (1964). Genetic Polymorphism in Caseins of Cows' Milk. II. Confirmation of the Genetic Control of {beta}-Casein Variation. Journal of Dairy Science 47, 378.

15. Tsiaras, A. M., Bargouli, G. G., Banos, G. & Boscos, C. M. (2005). Effect of Kappa-Casein and Beta-Lactoglobulin Loci on Milk Production Traits and Reproductive Performance of Holstein Cows. Journalof Dairy Science 88, 327.

16. Van Den Berg G (1993). Genetic polymorphism of -caseinand -lactoglobulin in relation to milk composition and cheesemaking properties. International Dairy Federation. Proceedings of the IDF Seminar Held in Palmerston North. New Zealand: 123–133.

17. Walawski et al. (1997). Association between beta-lactoglobulin (BLG) polymorphism and diagnostic indicators of subclinical mastitis in Black and White cows. Roczniki naukowe Zootechniki 24 (4), 9 – 22.

18. Wong W. C. , Heng S. F., Liu A. H., Husband A. J., Smithers G. W., Watson D. L. (1996). Modulation of immune responses by bovine –casein. Immunology and Cell Biology 74, 323–329.

Kontaktní adresa:Mgr. Kamila Sojková, Rapotín, Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Výzkumník 267, 788 13, Viký ovice, kamila.sojkova@vuchs.cz

200

VLIV SY IDLA NA VÝT ŽNOST SÝR EIDAMSKÉHO TYPU Ros lek Martin1, Kou imská Lenka1, Legarová Veronika1, T ma Št pán2

1Katedra kvality zem d lských produkt , FAPPZ, eská zem d lská univerzita v Praze 2Plastcom a. s., Mlékárna P íšovice

The effect of rennet on the yield of Edam cheese production

Summary:Edam cheese was produced using three different kinds of rennet. The amount of cheese from each batch was weighed. The yield of production differs according to the used type of rennet and was also affected by the composition of the final product (fat in dry matter content). The effect of rennet on the sensory quality of cheese was not found.

ÚvodPojmem sýr ozna ujeme výrobek obsahující p edevším mlé nou bílkovinu, mlé ný tuk

a v malé mí e ostatní sou ásti mléka (cukr, minerální látky)1. Sýry obsahují podle druhu až 30 % bílkovin, do 30 % tuku, stopové množství mlé ného cukru a minerální látky, vitamíny a celou adubiologicky d ležitých látek, jako jsou nap . esenciální aminokyseliny2.

Sýr, jako výrobek, je v erstvém stavu nebo v ur itém stupni prozrání, který získáváme srážením mléka, smetany, podmáslí nebo jejich r zných sm sí sy idlem nebo kyselinou mlé nouvzniklou kysáním a dalším zpracováním takto získané sraženiny.1 Síla sy idla je vyjád ením jeho srážecí mohutnosti. Hlavním inidlem ur ujícím jakost a charakter sý eniny je doba sy idlového srážení mléka. Doba srážení je nep ímo úm rná dávce sy idla, množství sy idla je p i stejné dobsý ení p ímo úm rné množství zpracovaného mléka. ím je kratší doba srážení, tím mén syrovátky sý enina obsahuje3.

Sýry a jejich výroba jsou neodd liteln spojené s d jinami lidstva. Samotné sýry se za alyvyráb t z mléka od okamžiku, kdy lov k p ed mnoha tisíci lety za al chovat a využívat mléko od r zných domácích zví at jako jsou ovce, kozy, hov zí dobytek a jiné2. Spot eba a obliba sýru nás i ve sv t má rostoucí tendenci4. Vyrábí se nejen s r zným obsahem tuku v sušin ,ale i s množstvím nejr zn jších p íchutí.

V sou asnosti výroba sýr nabyla již moderní velkopr myslový charakter, kde se sýry vyráb jí ve velkých množstvích na automatických linkách a vyráb jí se p i tom sýry ve vyrovnané kvalit , zdravotn nezávadné a za dostupné ceny. Na druhou stranu se však udržuje i tzv. malovýroba v malých soukromých mlékárnách, i jen v domácnostech, kde mají mléko z vlastního chovu hospodá ských zví at1.

Výt žnost výroby sýr je závislá nejen na složení vstupní suroviny, (hlavn obsahu kaseinu) ale zárove na technologickém procesu výroby. Cílem p edložené práce bylo zmapování možnosti zvýšení výt žnosti výroby sýr eidamského typu. Experimentální ást byla v nována výrob sýr eidamského typu za použití n kolika druh sy idel p i jednotlivých výrobách v návaznosti na senzorické posouzení kvality vyrobených sýr .

Materiál a metodyP i experimentu bylo použito t ech druh sy idel (XA), (XB) a (XC) od r zných výrobc

v b žném technologickém postupu výroby eidamu schválenou technology Mlékárny P íšovice.Bližší specifikace sy idel není uvedena z d vodu pokra ujícího technologického výzkumu v mlékárn . Receptura výroby se odchýlila pouze od množství daného sy idla v závislosti na jeho síle. Všechny výroby v rámci jednoho dne byly ze spole ného zásobníku na mléko. Byly vyráb nysýry typu eidamská cihla (EC) a eidamský blok (EB) s obsahem tuku v sušin 30 a 45 %. Výt žnostbyla zjiš ována vážením prázdných i plných klecí se sýry z výrob. Senzorický profil vzork byl posuzován školenými hodnotiteli za použití grafické nestrukturované orientované stupnice.

201

Výsledky a diskuseV tabulce I jsou uvedeny celkové hmotnosti sýr z jednotlivých výrob p i použití sy idel

XA, XB a XC. Vliv sy idla na výt žnost je znázorn n i na obr. 1.

Tabulka I Celkové hmotnosti sýr z jednotlivých výrob

Ozna ení výroby Výroba . 1/ hmotnost sýr

Výroba . 2/ hmotnost sýr

Výroba . 3/ hmotnost sýr

Výroba . 4/ hmotnost sýr

9.10.EC-12-30 % 1246,5 kg (XA) 1255,5 kg (XA) 1199,0 kg (XB) 1135,5 kg (XC) 9.10.EB-8-30 % 723,0 kg (XA) 730,5 kg (XA) 698,0 kg (XB) 665,5 kg (XC)

10.10.EC-12-45 % 1207,0 kg (XA) 1227,0 kg (XB) 1206,5 kg (XC) 10.10.EB-8-45 % 720,5 kg (XA) 743,0 kg (XB) 747,0 kg (XC)

Vliv sy idel na výt žnost sýr

1246,51255,5

1199

1135,512071227

1206,5

723 730,5

698665,5720,5 743 747

0100200300400500600700800900

100011001200

1 2 3 4

íslo výroby

Hm

otno

st s

ýr v

Kg

9.10.EC-12-30% 10.10.EC-12-45% 9.10.EB-8-30% 10.10.EB-8-45%

Obr. 1. Vliv sy idel na výt žnost sýr z jednotlivých výrob

V 1. a 2. výrob sýr s tu ností 30 % t.v.s. bylo použito stejné sy idlo (XA). Pr m rnáhmotnost vyrobených sýr byla 1251 kg (cihla) a 726,75 kg (blok). Ve 3. výrob (sy idlo XB) je znatelný pokles ve výt žnosti o 4,2 % (cihla) a 4,0 % (blok). Ve 4. výrob (sy idlo XC) je ztráta na výt žnosti oproti sy idlu XA znatelných 9,2 % (cihla) a 8,4 % (blok), což reprezentuje 115,5 kg resp. 61,25 kg!

P i výrob sýr s tu ností 45 % t.v.s. byla p i použití sy idla XB ve 2. výrob zjišt na vyšší výt žnost o 1,7 % (cihla) resp. o 3,1 % (blok) v porovnání se sy idlem XA. P i použití sy idla XC byla p i výrob cihly zjišt na tém stejná výt žnost. P i výrob bloku (sy idlo XC) byla výt žnost v porovnání se sy idlem XA o 3,7 % vyšší.

202

Záv rPoužitím r zných sy idel ve výrob bylo prokázáno, že mohou mít výrazný vliv na výnos

kone ného produktu a s tím související finan ní ztráty mlékárny p i používání nevhodných sy idel. Výt žnost sýr v závislosti na použitém sy idle souvisí i se složením finálního výrobku

(obsahem tuku v sušin ). D ležité je také dodržení pot ebných technologických parametr jako jsou doba dosoušení, doba doh ívání a lisování sýrového zrna bez p ístupu vzduchu, které mají za následek nedokonalé spojení jednotlivých sýrových zrn za vzniku nepravidelné struktury (trhliny v sýrové hmot ). Toto má pak vliv i na tvorbu sýrového prachu, který je nezachytitelný a odchází jako ztráta výt žnosti do odpadu.

Posouzením senzorické jakosti vyrobených sýr nebyla v experimentu zaznamenána zm na organoleptických vlastností v závislosti na sy idle.

Použitá literatura:1. erná, E., Mergl, M. Laboratorní kontrolní metody v mléka ství. SNTL – Nakladatelství technické

literatury Praha, 1974, 216s. 04-821-74. 2. Keresteš, J. Syry, výživa a zdravie. Otava v.o.s, 2007, 156 s. ISBN 80-969693-6-4. 3. Prokš, J. Mléka ství díl II., SNTL – Nakladatelství technické literatury Praha, 1965, 365 s. ISBN 04-802-

65.4. Hrubá, M., Veselá, Z. Situa ní a výhledová zpráva mléko. MZe Praha, 2007, 115 s. ISBN 978-80-7084-

611-7.

Kontaktní adresa:Bc. Martin Ros lek, Katedra kvality zem d lských produkt , FAPPZ, ZU v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, e-mail: martin.rosulek@post.cz.

203

VYHODNOCENÍ VÝT ŽNOSTI EIDAMSKÝCH SÝRŠustová Kv toslava

Ústav technologie potravin, MZLU v Brn

Evaluation of yield of Edam cheese

Summary:Dairy norm required for produced 1 kg Edam cheese with 30 % dry fat matter 11.2 l of milk in winter and 11.4 l of milk in summer months. Dairy norm required for produced 1 kg Edam cheese with 45 % dry fat matter 10.20 l of milk in winter and 10.40 l of milk in summer months. The lowest milk consumption was in July (11.50 l/kg) and the highest milk consumption was in February (10.70 l/kg) on the Edam cheese with 30 % dry fat matter. The lowest milk consumption was in July too (10.70 l/kg) and the highest milk consumption again was in February (9.98 l/kg) on the Edam cheese with 45 % dry fat matter. The lowest concentration of milk protein was monitored in July (3.25 %) and the highest concentration of milk protein was monitored in December (3.49 %).

Cílem práce bylo zhodnocením výt žností eidamských sýr ve vztahu k bílkovinám. K hodnocení výt žnosti byly vybrány sýry s obsahem tuku v sušin (TVS) 30 % a 45 %. V pr b hucelého roku bylo sledováno v každém m síci množství zpracovávaného mléka a kilogramy vyrobených sýr v mlékárn . Na základ t chto hodnot byla vypo tena spot eba mléka v litrech na výrobu 1 kg sýra. Výsledky zjišt né spot eby mléka na 1 kg eidamského sýru jsou znázorn nyv grafech 2 až 5. Podniková norma ve sledované mlékárn rozlišovala p i výrob eidamských sýr spot ebumléka podle ro ního období. V zimním období ( íjen až b ezen) platila norma 11,2 l/kg 30 % eidamu a 10,2 l/kg 45 % eidamu. V letním období (duben až zá í (platila norma pro spot eba mléka 11,4 l/kg u 30 % eidamu a 10,4 l/kg u 45 % eidamu. U 30 % eidam se nejv tší spot eba mléka na kg sýra zjistila v ervenci (11,5 l/kg) a nejnižší spot eba byla zjišt na v únoru (10,7 l/kg). Obdobn i u eidam se 45 % TVS byla nejvyšší spot eba mléka na 1 kg sýru zjišt na v ervenci (10,7 l/kg) a nejnižší op t v únoru (9,98 l/kg). U t chto eidam však byla spot eba mléka ast ji vyšší než požadovala norma, a to i v zimních m sících listopad až leden. V zimním období byla spot eba mléka na výrobu 1 kg obou druh eidamských sýr nižší než v období letním. To je dáno p edevším obsahem bílkovin v t chto m sících. Nejnižší obsah bílkovin byl zaznamenán v letních m sících, emuž odpovídala také nejv tší spot eba mléka na výrobu sýr (viz grafy 6 a 7). Variabilita obsahu bílkovin je uvedena v grafu 1. Nejnižší m sí ní pr m r bílkovin byl nam en v ervenci (3,25 %) a nejvyšší v prosinci (3,49 %). Vyšší hodnoty bílkovin byly nam eny také v m sících íjen a listopad. Maximální obsah bílkovin byl zjišt n v m síci zá í (3,96 %) a minimální v dubnu (2,88 %). Nejnižší variabilita bílkovin byla zjišt na v listopadu (2,36 %) a nejvyšší v zá í (5,90 %). Výsledky hodnocení složení a jakosti mléka vykazovaly sezónní charakter. Nejlepší složení mléka pro výrobu sýr bylo zjišt no v podzimních a zimních m sících, kdy byl zaznamenán vyšší obsah bílkovin a tuku. Stanovenou podnikovou normu na spot ebu mléka na výrobu obou typ eidamských sýrse poda ilo splnit jen v n kterých m sících. V letních m sících byla spot eba mléka vyšší, v zimních m sících spot eba mléka klesala. Je t eba vzít v úvahu, že spot ebu mléka, krombílkovin, m že ovliv ovat také zp sob ošet ení mléka p ed sý ením, zp sob zpracování sý eniny, únik tuku a bílkovin do syrovátky. Nicmén problém s rozdílnou výt žností sýr v pr b hu roku byl ovlivn n p edevším obsahem bílkovin, který v letních m sících klesal. Variabilita obsahu bílkovin v mléce se následn projevila i ve variabilit složení sýr . Bylo by vhodné standardizovat obsah tuku v mléce používaném na výrobu eidamských sýr s ohledem na obsah bílkovin, a tím áste n eliminovat sezónní rozdíly ve složení sýr a únik nadbyte ného tuku do syrovátky.

204

3,13,153,2

3,253,3

3,353,4

3,453,5

leden

únor

beze

nduben

kvten

erven

erven

ecsrp

en záí

íjen

listop

ad

prosin

ec

Bílk

ovin

y v

%

0

1

2

3

4

5

6

7

Varia

ní k

oefic

ient

v %

pr m r var. koef.

Obr. 1. Variabilita obsahu bílkovin v mléce v % v pr b hu roku

11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

duben kv ten erven ervenec srpen zá í

Spot

eba

mlé

ka v

l/kg

Skute ná spot eba mléka Spot eba mléka podle normy

Obr. 2. Spot eba litr mléka na 1 kg eidamu 30 % TVS v letním období

10,610,710,810,9

1111,111,211,311,4

íjen listopad prosinec leden únor b ezen

Spot

eba

mlé

ka v

l/kg

Skute ná spot eba mléka Spot eba mléka podle normy

Obr. 3. Spot eba litr mléka na 1 kg eidamu 30 % TVS v zimním období

205

10

10,2

10,4

10,6

10,8

duben kv ten erven ervenec srpen zá í

Spot

eba

mlé

ka v

l/kg

Skute ná spot eba mléka Spot eba mléka podle normy

Obr. 4. Spot eba litr mléka na 1 kg eidamu 45 % TVS v letním období

9,8

10

10,2

10,4

10,6

10,8

íjen listopad prosinec leden únor b ezenSpot

eba

mlé

ka v

l/kg

Skute ná spot eba mléka Spot eba mléka podle normy

Obr. 5. Spot eba litr mléka na 1 kg eidamu 45 % TVS v zimním období

10,210,410,610,8

1111,211,411,6

lede

n

únor

bez

en

dube

n

kvte

n

erve

n

erve

nec

srpe

n

záí

íjen

listo

pad

pros

inec

Spot

eba

mlé

ka v

l/kg

3,1

3,2

3,3

3,4

3,5

3,6

Obs

ah b

ílkov

in v

%

spot eba mléka (l/kg) Obsah bílkovin v mléce v %

Obr. 6. Porovnání spot eby mléka a obsahu bílkovin v mléce u eidam 30 % TVS

206

9,810

10,210,4

10,610,8

lede

n

únor

bez

en

dube

n

kvte

n

erve

n

erve

nec

srpe

n

záí

íjen

listo

pad

pros

inec

Spot

eba

mlé

ka v

l/kg

3,2

3,3

3,4

3,5

3,6

Obs

ah b

ílkov

in v

%

spot eba mléka (l/kg) Obsah bílkovin v mléce v%

Obr. 7. Porovnání spot eby mléka a obsahu bílkovin v mléce u eidam 45 % TVS

Kontaktní adresa:Ing. Kv toslava Šustová, Ph.D., Ústav technologie potravin, Agronomická fakulta, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno, eská republika, sustova@mendelu.cz

207

KONTINUÁLNÍ, ENZYMOVÁ P ÍPRAVA GALAKTOOLIGOSACHARIDS ÁSTE NOU OPTIMALIZACÍ DOBY ZDRŽENÍ V MEMBRÁNOVÉM REAKTORU

Hellerová Klára, urda Ladislav Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha,

Continual enzymatic preparation of galactooligosaccharides with partial optimalisation of residence time in membrane reactor

Summary:The galactooligosaccharides (GOS) were prepared by transgalactosylation reaction. Many factors influence this reaction, e.g. substrate concentration, enzyme origin, and temperature. Reaction can be carried out in batch or continual reactor. We used stirred batch reactor and membrane reactor with ultrafiltration membrane (150 KDa) for continuous synthesis. Lactose (584 mmol.L-1) in phosphate buffer was used as substrate. Concentration of used enzyme (Maxilact LX 5000) was 2 g.L-1.Higher yield of GOS was achieved by batch hydrolysis, in comparison with continual hydrolysis. GOS concentration was in the batch mode over 20 mmol.L-1 higher than concentration in continuous experiment under the same conditions. Due to 10 mmol.L-1 decrease of GOS after prehydrolysis in continuous experiment, it was necessary to optimize reaction conditions. We used various residence times from 35 to 75 min. In conclusion, it is evident that for stable production of GOS it is proper to use 65 min long residence time. Content of GOS in the product is in this case increased by 5 – 10 mmol.L-1.

Úvod:Galaktooligosacharidy (GOS) pat í vedle glukooligosacharid , fruktooligosacharid mezi

nejd ležit jší oligosacharidy 1. Biologicky významná je jejich prebiotická funkce. GOS tak p ispívají k nár stu st evní mikroflory bifidobakterií a laktobacil , postnatální stimulaci imunitního systému a také poskytují obranu v i bakteriálním a virovým infekcím díky zabrán ní p ilnutí bakterií na epitelárním povrchu 3. Další biologickou funkcí GOS je zlepšení absorpce vápníku a ho íku, p ispívají k detoxikaci t la, dále redukují cholesterol a zlepšují syntézu vitaminskupiny B 4. Sladivost oligosacharid je 0,3 – 0,6 krát nižší než sladivost sacharosy v závislosti na chemické struktu e a molekulové hmotnosti p ítomných oligosacharid 2.

Obr. 1. P íklad struktury GOS; n = po et galaktosových jednotek 1

Vyráb jí se z laktosy, enzymovou syntézou. Tato reakce, jejíž mechanismus je znázorn nníže, m že probíhat jak vsádkov tak kontinuáln .

enzym + laktosa enzym-laktosa enzym-laktosa galaktosyl-enzym + glukosa galaktosyl-enzym + akceptor galaktosyl-akceptor + enzym

Touto reakcí vznikají hlavn disacharidy, dále tri- a tetra- , vyšší oligosacharidy vznikají v mnohem menší mí e. Vedle základní struktury GOS na obr. 1 vzniká p i transgalaktosyla ní

208

reakci ada dalších GOS, ve kterých se galaktosa váže na glukosový zbytek n kolika typy vazeb, hlavn 5:

-D-Galp-(1 3)-D-Glcp-D-Galp-(1 4)-D-Glcp-D-Galp-(1 2)-D-Glcp

Na glukosovém zbytku m že docházet rovn ž k v tvení, molekuly galaktosy jsou obvykle spojeny vazbami (1 4) a (1 6). To jaké GOS vzniknou a v jakém množství je ovliv ováno celou adoufaktor , jedná se nap . o: pH (lit 6), p vod a koncentrace enzymu, koncentrace substrátu 7.P i kontinuální syntéze m že být využito ultrafiltrace i nanofiltrace.

Materiál :Substrátem pro reakce byla laktosa (Promil, PML a.s., R) ve fosfátovém pufru

(pH = 6,75, složení: 0,01 mol.L-1 K2HPO4 (Penta, R), 0,015 mol.L-1 KCl (Lachema, R), 0,012 mol.L-1 MgCl2 . 6 H2O (Penta, R)) o koncentraci 584 mmol.L-1. Koncentrace použitého kvasinkového enzymu Maxilact LX 5000 (DMS Food Specialities, Nizozemí) byla 2 g.L-1.

Metodika:

Vsádkový pokus Vsádková reakce probíhala v reaktoru p i teplot t = 37 ˚C, po dobu 3 hodin. Množství

substrátu bylo 100 g. Vzorky byly pr b žn odebírány a následn inaktivovány v termostatovém bloku p i t = 95 ˚C po dobu 10 minut. Množství vznikajících sacharid bylo analyzováno pomocí HPLC s ELS detekcí.

Kontinuální pokus Kontinuální reakce probíhala na laboratorní stanici ARNO 700 s keramickou membránou

o NMWCO 150 kDa. Do nerezového reaktoru se nalily 2 L substrátu, následovala temperace na 37 ˚C, poté se p idal enzym a reakce se nechala probíhat 45 minut. Po tomto ase se spustila filtrace a zárove s tím byl do reaktoru p ivád n erstvý substrát. B hem celé doby reakce se pr b žn odebíraly vzorky, které se následn analyzovaly na HPLC s ELS detekcí.

Optimalizace kontinuálního pokusu Metoda byla optimalizována za použití r zných pr tok , úpravou tlaku na stanici

ARNO 700. Použité tlaky byly 0,1; 0,112; 0,14 a 0,4 MPa. K optimalizaci byly p ipraveny 2 L laktosy v pufru, které se nechaly 15 minut p edhydrolyzovat za konstantní teploty t = 37 °C. Po tomto ase se spustila filtrace a zárove s tím se do reaktoru za al p ivád t erstvý substrát. Doba kontinuální reakce byla 60 minut. Vzorky byly odebírány každých 15 minut a následnanalyzovány na HPLC.

Stanovení cukr pomocí HPLC na vápenaté, iontov – vým nné kolonK 1 mL vzorku na ed ného destilovanou vodou v pom ru 1:1 byl p idán 1 mL vnit ního

standardu (fruktosa c = 100 g.L-1(Penta, R)). Z této sm si byly odebrány 0,2 mL, k nim bylo následn p idáno 0,1 mL destilované vody a 1,1 mL potraviná ského ethanolu. Sm s se nechala 30 minut stát p i laboratorní teplot a poté se odst edila p i 5000 min-1 . Odebral se 1 mL supernatantu, ze kterého se na termostatovém bloku odpa il p i 78 ˚C ethanol. K odparku byly p idány 2 mL demineralizované vody. Vzorek byl p ed nást ikem na kolonu p efiltrován p esmikrofiltr a kolonu Chromafix C18 na zachycení polárních látek 8.

209

Výsledky:Vsádkový a kontinuální pokus:

Vsádková hydrolýza laktosy v pufru byla provedena za využití enzymu Maxilact LX 5000. Nejvyšší koncentrace vznikajících GOS 52 mmol.L-1 (viz obr. 2) bylo dosaženo po 30. minutách.

A

0100200300400500600700

0 50 100 150 200

[min]

c 1 [m

mol

.L-1

]

0

10

20

30

40

50

60

c 2 [m

mol

.L-1

]

laktosaglukosagalaktosaGOS

Obr. 2. Zastoupení sacharid p i vsádkové hydrolýze laktosy v pufru; koncentrace enzymu 2 g.L-1,uvedené výsledky jsou pr m rem ze dvou stanoveníC1 koncentrace glukosa, galaktosa, laktosa; C2 koncentrace GOS

P i kontinuální hydrolýze laktosy v pufru o stejné koncentraci substrátu jako u vsádkového pokusu bylo získáno 30 mmol.L-1. Tato hodnota je tedy nižší než v p ípad vsádkového procesu, což je v rozporu se studií 9 . Reakce probíhala za konstantního tlaku 0,22 MPa, pr m rný tok permeátu byl 38,8 g/ min.

0

100

200

300

400

500

600

0 50 100 150 200 250 300

[min]

c 1 [m

mol

.L-1

]

0

10

20

30

40

50

60

c 2 [m

mol

.L-1

]

laktosaglukosagalaktosaGOS

Obr. 3. Zastoupení sacharid p i kontinuální hydrolýze laktosy v pufru (prodloužený pokus);koncentrace enzymu 2 g.L-1, pH = 6,75C1 koncentrace glukosa, galaktosa, laktosa; C2 koncentrace GOS

210

Optimalizace doby zdržení: Jak je vid t z obr. 3 došlo po za átku p idávání nového substrátu k na ed ní koncentrace

vzniklých oligosacharid , proto bylo nutno p istoupit k optimalizaci stávající metodiky. Byly zkoušeny 4 r zné tlaky a tím tedy doby zdržení (viz obr. 4). Doby zdržení se pohybovaly od 35 do 75 minut. Doba p edhydrolýzy byla v t chto experimentech zkrácena na 15 min, protože ve 45. min již za íná rozklad GOS a pokra uje ješt v první fázi p idávání erstvého substrátu p ibližndo 60. min, než dojde k ustálení produkce GOS. Z obr. 5 a 6, kde je znázorn no zastoupení GOS a laktosy p i t chto kontinuálních pokusech, je vid t, že nejmenší pokles koncentrace GOS byl získán pro dobu zdržení 65 minut.

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60

[min]

Q [g

/min

]

55 min65 min75 min35 min

Obr. 4. Hodnoty toku permeátu pro r zné doby zdržení.

0

10

20

30

40

50

0 20 40 60 80

[min]

c [m

mol

.L-1

]

55 min65 min75 min35 min

Obr. 5. Vliv doby zdržení na koncentraci GOS.

0100200300

400500600700

0 20 40 60 80

[min]

c [m

mol

.L-1

]

55 min65 min75 min35 min

Obr. 6. Vliv doby zdržení na koncentraci laktosy.

211

Záv r:Zkrácení doby p edhydrolýzy ze 45 na 15 min se pozitivn projevilo na koncentraci GOS

v permeátu. Optimální doba zdržení se pohybuje v rozmezí 55 – 65 min. Doba zdržení 35 min je p íliš krátká pro enzymovou reakci, dochází proto k nár stu obsahu laktosy a k poklesu obsahu GOS v permeátu. Zdržení 75 min je naopak p íliš dlouhé – za íná docházet k rozkladu GOS, vedle GOS se mírn snižuje i koncentrace laktosy v permeátu, naopak nar stá obsah monosacharid .Výsledky ukazují, že je nutné optimalizovat též dobu p edhydrolýzy, respektive v kombinaci s dobou zdržení; p esto i provedená áste ná optimalizace p inesla zvýšení obsahu GOS z p vodních 30 mmol.L-1 na 35 – 40 mmol.L-1.

Pod kování:Práce byla podpo ená MŠMT R (MSM 6046137305).

Použitá literatura:1. Velíšek J.(ed.): Chemie potravin, díl 1, kap.4, str. 182 - 196, OSSIS, Tábor 1999. 2. Crinttenden R. G., Playne M. J.: Production, properties and applications of food – grade

oligosaccharides. Trends in Food Science & Technology 7, 353 – 361 (1996). 3. Kunz C., Rudloff S.: Health promoting aspects of milk oligosaccharides. International Dairy Journal 16,

1341–1346 (2006). 4. Czermak P., Ebrahimi M., Grau K., Netz S., Sawatzki G., Pfromm P.H.: Membrane-assisted enzymatic

production of galactosyl-oligosaccharides from lactose in a continuous process. Journal of Membrane Science 232 , 85–91 (2004).

5. Van Laere K. M. J., Abee T., Schols H. A., Beldman G., Voragen A. G. J.: Characterization of a Novel b-Galactosidase from Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 Active towards Transgalactooligosaccharides. Applied and enviromental microbiology 66, 1379 – 1384 (2000).

6. Mahoney R. R.: Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review. Food Chemistry 63, 147-154 (1998).

7. Boon M.A., Nanesen A.E.M., van ‘t Riet K.: Effect of temperature and enzyme origin on the enzymatic synthesis of oligosaccharides. Enzyme and Microbial Technology 26 , 271–281 (2000).

8. Šípalová O.(2005): Diplomová práce, Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT, Praha 9. Chockchaisawasdee S., Anthanasopoulos V. I., Niranjan K., Rastall R. A.: Synthesis of Galacto-

oligosaccharide From Lactose Using h-Galactosidase From Kluyveromyces lactis: Studies on Batch and Continuous UF Membrane-Fitted Bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 89, 434 – 443 (2005).

Kontaktní adresa:Hellerová Klára, Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6e- mail: klara.hellerova@vscht.cz

212

VYUŽITÍ BLÍZKÉ INFRA ERVENÉ REFLEKTAN NÍ SPEKTROSKOPIE V ANALÝZE KOZÍCH SÝR

Dra ková Michaela, Janštová Bohumíra, P idalová Hana, Vozková Lenka, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka

Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie VFU Brno

Use of near-infrared reflectance spectroscopy for goat’s cheese analysis

Summary:The aim of this study was to determine the physical and chemical properties of goat’s cheese by near-infrared reflectance spectroscopy. Samples (n = 81) were obtained from a Czech farm. Sampling was done after the kids have been weaned, in a period from May 2006 to July 2007 in regular time intervals. Fat content, total solids, fat in solids, NaCl content, titratable acidity, water activity and pH were analysed by reference method. Spectra were measured in the reflectance mode with a compressive cell between 10000 and 4000 cm-1, averaging 100 scans. The instrument was calibrated by partial least squares (PLS) method and cross validation was applied to avoid overfitting. The calibration models were developed using region 4081 – 8667 cm-1 and evaluated by statistical values. The best calibration models were obtained for pH (R = 0.959, SEC = 0.053; R = 0.898, SECV = 0.083), water activity (R = 0.935, SEC = 0.003; R = 0.864, SECV = 0.004) and titratable acidity (R =0.821, SEC = 3.48; R = 0.777, SECV = 3.85). The results demonstrate that near-infrared spectroscopy is a useful method to evaluate physico-chemical composition of goat’s cheese samples.

ÚvodChov koz má v eské republice bohatou tradici. Ke zvýšenému zájmu o chov došlo u nás

za átkem devadesátých let minulého století. D vodem rostoucího zájmu o výrobky z kozího mléka je stoupající poptávka po zdravotn nezávadných a dietetických potravinách. K nej ast jšímu využití kozího mléka pat í zpracování na výrobu sýr . Kozí sýry pat ící do skupiny erstvé sýry nezrající p edstavují nejb žn jší vyráb né sýry z kozího mléka.1,2

Sýry adíme mezi nejhodnotn jší potraviny z pohledu svého složení. Jsou významným zdrojem bílkovin, vápníku, fosforu aj. Dále mají nízký obsah laktózy, takže sýry mohou konzumovat i lidé s intolerancí.3,4

V dnešní dob je tendence získat vyšší kvalitu u kontrolovaných výstupních surovin i finálních produkt , proto se výzkum zam uje na vývoj p esných, rychlých a ú inných metod pro stanovení fyzikáln -chemických vlastností potravin.5 Metoda NIR spektroskopie umož uje multikomponentní analýzu r zných produkt od kapalných k pevným látkám a osv d ila se jako metoda pro rutinní technologickou kontrolu, kde je rychlost analýzy (nap . kontrola meziprodukt )asto d ležit jší než vysoká p esnost. Klasické analytické metody nemohou v sou asné dob splnit

nároky na rychlost a množství provád ných rozbor p i provozní kontrole.Cílem práce bylo vytvo it kalibra ní modely pro stanovení fyzikáln -chemických

parametr kozích sýr pomocí FT-NIR spektroskopie.

Materiál a metodikaVzorky sýr byly získány na farm v Jihomoravském kraji. Pro vytvo ení kalibra ních

model bylo odebráno 81 vzork p írodních nezrajících kozích sýr . Odb r vzork byl realizován po odstavu k zlat v období kv ten 2006 až ervenec 2007 v pravidelných asových intervalech. Na farm bylo chováno 75 koz plemene Bílá krátkosrstá koza na 1. až 8. laktaci, pr m rná denní dojivost byla 2-3 l mléka, pr m rná ro ní dojivost 600-800 l mléka. V období od poloviny kv tnado poloviny listopadu byla kozám k dispozici pastva. Krmná dávka byly dopln na 0,5 kg sena, maximáln 1 kg jádra, vitaminovou minerální sm sí a solí k lizu. V zimním období krmná dávka zahrnující 3 kg travní senáže, 1 kg cukrovkové siláže, 1 kg sena a maximáln 1 kg jádra, vitaminovou minerální sm s a s l k lizu. Dojení bylo provád no strojn 2x denn .

Ve vzorcích byly stanoveny obsah tuku, tuk v sušin , sušina, titra ní kyselost, pH ( SN570107, 1965)6 a obsah NaCl ( SN 570107- ást 12, 1980)7. Aktivita vody byla stanovena pomocí aw-metru Thermoconstanter TH 200 (Novasina, Švýcarsko).

213

Vzorky byly p ed stanovením homogenizovány nastrouháním. Vzorky sýr byly prom eny na spektrometru NIR Nicolet Antaris (Thermo electron Corporation, Madison, USA) ve spektrálním rozsahu 10000 – 4000 cm-1 se 100 scany. as snímání jednoho spektra se pohyboval okolo 1,5 min. Spektra byla m ena na integra ní sfé e v režimu reflektance s kompresní kyvetou. Nam ená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst verze 6.2.1.509 (Thermo Elektron Corporation, Madison, USA) metodou PLS ( áste ných nejmenších tverc ). Stejné vzorky byly použity pro k ížovou validaci. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí statistického a grafického softwaru STAT Plus. Pro srovnání hodnot nam ených pomocí FT-NIR s hodnotami zjišt nými v laborato i byl použit párový T-test.8

Signature: Not signed

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

Abs

orba

nce

5000 6000 7000 8000 9000 10000 Wavenumbers (cm-1)

Obr. 1. Pr m rné spektrum vzorku kozího sýru

Výsledky a diskuseObrázek 1 zobrazuje pr m rné spektrum vzorku kozího sýru. V tabulce I jsou uvedeny

referen ní hodnoty sledovaných parametr , jejichž rozp tí jsou vyjád ena jako sm rodatnéodchylky pr m ru. Hodnocení kalibra ních model bylo provedeno na základ posouzení sm rodatné odchylky kalibrace (SEC), sm rodatné odchylky validace (SECV) a korela níchkoeficient (R) (tabulka II).

Tabulka I Referen ní hodnoty parametr n x min max SD Tuk (%) 80 24,47 19,86 30,83 2,64 Sušina (%) 81 47,35 44,08 67,07 3,56 Tuk v sušin (%) 80 51,83 31,64 63,76 5,72 NaCl (%) 76 1,93 1,06 2,78 0,47 Titra ní kyselost (ºSH) 76 96,4 83,0 107,5 5,3 Aktivita vody 75 0,974 0,934 0,990 0,012 pH 81 4,90 4,66 5,68 0,18

n – po et vzork , x - pr m r, min a max – minimální a maximální hodnota, SD – sm rodatná odchylka

Kalibra ní modely pro všechny sledované parametry byly vytvo eny pomocí PLS algoritmu a metoda byla ov ena pomocí cross validace. Dob e fungující model by nem l mít více jak 15 PLS faktor .9 Uvedení auto i získali PLS faktory pro: sušinu 5, pH 4, SH 6, NaCl 10 a tuk 4. V naší práci jsem získali obdobné výsledky (tabulka II). Kalibra ní modely byly získány bez derivace spekter s výjimkou parametr sušiny a pH, kde byla použita 1. derivace (tabulka II).

214

Tabulka IIKalibra ní a valida ní výsledky

kalibrace validace parametr derivace PLS

faktory R SEC CCV(%) R SECV PCV

(%)Tuk (%) - 7 0,773 1,66 6,78 0,681 1,94 7,92 Sušina (%) 1 5 0,751 0,861 1,84 0,633 1,03 2,21 Tuk v sušin (%) - 6 0,751 3,19 6,11 0,668 3,63 6,96 NaCl (%) - 7 0,879 0,224 11,58 0,826 0,267 13,81 Titra ní kyselost (ºSH) - 3 0,821 3,48 3,57 0,777 3,85 3,95 Aktivita vody - 12 0,935 0,003 0,293 0,864 0,004 0,422 pH 1 5 0,959 0,053 1,07 0,898 0,083 1,68

R – korela ní koeficient, SEC – sm rodatná odchylka kalibrace, SECV – sm rodatná odchylka validace, CCV – kalibra ní varia ní koeficient, PCV – predik ní varia ní koeficient

Nejlepší kalibra ní modely byly získány pro pH (R = 0,959, SEC = 0,053; R = 0,898, SECV = 0,083), aktivitu vody (R = 0,935, SEC = 0,003; R = 0,864, SECV = 0,004) a titra ní kyselost (R =0,821, SEC = 3,48; R = 0,777, SECV = 3,85) (graf 1-3).

Využití FT-NIR pro stanovení jakostních ukazatel erstvých kozích sýr využili i další auto i,9 kte í dosáhli nejlepší výsledky pro titra ní kyselost (R = 0,951, SEC = 0,849, R 0,901, SECV = 1,12).

y = 0,9249x + 0,3734R = 0,9594

y = 0,8746x + 0,6221R = 0,8984

4,6

4,7

4,8

4,9

5,0

5,1

5,2

5,3

4,7 4,8 4,9 5,0 5,1 5,2 5,3

laboratorní hodnoty

pred

ikov

ané

hodn

oty

kalibrace validace kalibrace validace

Graf. 1. Kalibra ní a valida ní model pro pH

y = 0,8665x + 0,1303R = 0,9353

y = 0,8266x + 0,1693R = 0,8639

0,9550,9600,9650,9700,9750,9800,9850,9900,995

0,955 0,960 0,965 0,970 0,975 0,980 0,985 0,990 0,995

laboratorní hodnoty

pred

ikov

ané

hodn

oty

kalibrace validace kalibrace validace

Graf. 2. Kalibra ní a valida ní model pro aktivitu vody

215

y = 0,6735x + 31,85R = 0,8212

y = 0,645x + 34,596R = 0,7775

80

85

90

95

100

105

110

80 85 90 95 100 105 110

laboratorní hodnoty (SH)

pred

ikov

ané

hodn

oty

(SH

)

kalibrace validace kalibrace validace

Graf. 3. Kalibra ní a valida ní model pro titra ní kyselost

U modelu pro obsah NaCl byly získány výsledky pro kalibraci R = 0,879 a SEC = 0,224, pro validaci R = 0,826 a SECV = 0,267 (graf 4). Tento model byl podle posouzení parametr CCV a PCV mimo rozsah spolehlivé kalibrace. Obdobné výsledky pro obsah soli v kozích sýrech získali i jiní auto i.9 Obsah soli byl také sledován modifikovanou PLS metodou.11 Uvedení auto i se zam ili na r znou úpravou spekter a výb r region o rozdílné vlnové délce. Pro obsah soli získali R = 0,90 a SECV = 0,26 v rozsahu 1100 – 2500 nm a korekci na rozptyl.

Námi zjišt né výsledky byly statisticky zhodnoceny pomocí programu STAT Plus.8 Mezi referen ními hodnotami a vypo ítanými hodnotami pomocí FT-NIR nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly (p = 0,05).

y = 0,7718x + 0,4416R = 0,8794

y = 0,7318x + 0,5245R = 0,8260

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

laboratorní hodnoty (%)

pred

ikov

ané

hodn

oty

(%)

kalibrace validace kalibrace validace

Graf. 4. Kalibra ní a valida ní model pro NaCl

Záv rByly vytvo eny kalibra ní modely pro stanovení obsahu tuku, sušiny, tuku v sušin ,

obsahu NaCl, titra ní kyselost, aktivitu vody a pH. Tyto modely byly ov eny pomocí k ížové validace a posouzeny na základ korela ních koeficient (R) kalibrace a validace mezi referen ními a predikovanými hodnotami, a také na základ sm rodatných odchylek kalibrace (SEC) a validace (SECV). Dalším kritériem pro zhodnocení použitelnosti byly kalibra ní varia ní koeficient (CCV) a predik ní varia ní koeficient (PCV). Pro sledované parametry obsah sušiny, aktivita vody, titra níkyselost a pH byly vytvo eny velmi spolehlivé kalibra ní modely. Pro parametry obsah tuku a tuk v sušin byly modely spolehlivé. Model pro obsah NaCl byl mimo rozsah spolehlivé kalibrace. Výsledky ukazují, že blízká infra ervená reflektan ní spektroskopie p edstavuje vhodnou metodu pro vyhodnocení fyzikáln -chemického složení kozích sýr .

216

Pod kování:Práce vznikla za podpory výzkumného zám ru MSM6215712402 Veterinární aspekty bezpe nosti a kvality potravin.

Použitá literatura:1. Vyhláška Ministerstva zem d lství . 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mlé né

výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje. Sbírka zákon , 2003, ástka 32, s. 2488-2516. 2. FANTOVÁ, M. A KOL. Chov koz. 1. vyd. Praha: Nakladatelství Brázda, s. r. o., 2000. 192 s. 3. KOPÁ EK, J. Jak vhodn komunikovat na téma sýr? (1. ást). Potraviná ský Revue, 2005, . 3, s. 29-

32.4. KOPÁ EK, J. Jak vhodn komunikovat na téma sýr? (2. ást). Potraviná ský Revue, 2005, . 4, s. 23-

26.5. BLAZQUEZ, C., DOWNEY, G., O'DONNELL, C., O'CALLAGHAN, D., HOWARD, V. Prediction of

moisture, fat and inorganic salts in processed cheese by near infrared reflectance spectroscopy and multivariate data analysis. J. Near Infrared Spectrosc., 2004, vol. 12, no. 3, p. 149-157.

6. SN 570107. Metody zkoušení sýr , tvaroh , krém a pomazánek. Vydal Ú ad pro normalizaci a m ení, Praha, 1965, s. 28.

7. SN 570107, ást 12. Metody zkoušení p írodních a tavených sýr . Stanovení obsahu chloridu sodného.Vydal Ú ad pro normalizaci a m ení, Praha, 1980, s.4.

8. MATOUŠKOVÁ, O., CHALUPA, J., CÍGLER, M., HRUŠKA, K. STAT-Plus uživatelská p íru ka,verse 1.01., 1992. Veterinary Research institute, Brno, CR., s. 168.

9. LUŽOVÁ, R., ŠUSTOVÁ, K., HORÁKOVÁ, R. Stanovení jakostních ukazatel erstvých kozích sýrpomocí NIR spektroskopie. Mléko a sýry 2007, 2007, s. 195-197.

10. ALBANELL, E. CÁCERES P., CAJA G., MOLINA E., GARGOURI A. Determination of fat, protein and total solids in ovine milk by near-infrared spectroscopy. J. AOAC Int., 1999, vol. 82, p. 753-758.

11. BLAZQUEZ, C., DOWNEY, G., O’DONNELL, C., O’CALLAGHAN, D., HOWARD, V. Prediction of moisture, fat and inorganic salts in processed cheese by near infrared reflectance spectroscopy and multivariate data analysis. J. Near Infrared Spectrosc., 2004, vol. 12, p. 149-157.

Kontaktní adresa:MVDr. Michaela Dra ková, Ph.D., Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, 612 42 Brno, e-mail: drackovam@vfu.cz

217

STANOVENÍ VITAMÍNU B2 V MLÉCE Nohálová Zuzana, Kramá ová Daniela, Lazárková Zuzana, Hoza Ignác

Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , Fakulta technologická, Ústav potraviná ského inženýrství

Determination of vitamin B2 in milk

Summary:Riboflavin is a water soluble vitamin forming yellow solution in aqueous solution. Considering its photolability, it is necessary to perform the isolating procedure in the absence of light to avoid its conversion to lumiflavine which is biologically inactive. In natural material is usually bound as a part of flavine cofactors participating in many metabolic pathways. These cofactors are important for saccharide, lipid and amino acid metabolisms. Human body converts riboflavine into FAD serving as a coenzyme for glutathionreductase and other enzymes. Glutathionreductase enables reduction of glutathione which plays an essential role in protection of organisms from reactive oxygen. Milk sample was hydrolyzed with HCl and proteins were precipitated with TCA. Subsequently, the sample was quantitatively transferred into volumetric flask, filtered and applied to column under the following conditions: inject volume 20 μl, column SUPELCOSIL - LC8 (15 cm x 4,6 mm; 5 m), temperature 30°C, mobile phase methanol:CH3COONa with the flow 0,8 ml.min-1,gradient elution. Analysis was performed using chromatographic equipment Hewlett Packard 1100 with UV detection at 270 nm.

ÚvodVitamín B2 (riboflavin) se adí do skupiny vitamín B, kterou nazýváme B-komplex. Jde

o vitamín rozpustný ve vod , který se vyskytuje v mnoha potravinách živo išného a rostlinného p vodu. Riboflavin byl poprvé objeven v mléce. Jde o žlutozelenou krystalickou látku, jejíž vodné roztoky mají schopnost fluorescence. V biochemických systémech se vyskytuje ve formkoenzym , flavinmononukleotidu (FMN) a flavinadenindinukleotidu (FAD)1,2. Podporuje uvol ování energie, dobrou kondici a vitalitu, r st a plodnost. Dále je d ležitý pro metabolismu cukr , tuk a aminokyselin. Jako sou ást enzym v dýchacím et zci je nezbytný pro základní bun ný metabolismus. Spole n s vitaminem A zlepšuje vid ní za šera. Riboflavin se varem neni í, ale rozkládá se p sobením sv tla. UV paprsky riboflavin rozkládají za vzniku lumichromu (kyselé nebo neutrální pH) nebo lumiflavinu (zásadité pH). V neutrálních a slab kyselých roztocích je prakticky stálý, je odolný v i vysoké teplot i atmosférickému kyslíku. V alkalickém prost edíje labilní a rozkládá se na fyziologicky neú inné rozkladné produkty1,3,4. P íznaky nedostatku vitamínu B2 jsou popraskané rty v koutcích úst, zán ty sliznice jazyka, bolesti a tlak v o ích, o ní zákal, bolesti hlavy, olupování pokožky v obli eji, poruchy chrupu, chudokrevnost a poruchy srdce. K nejlepším zdroj m vitamínu B2 pat í játra, mléko a mlé né výrobky, ryby a vejce, pivovarské kvasnice a v menší mí e obilná zrna5,6. Denní doporu ená dávka je pro pr m rn fyzicky pracující osobu 1,7 mg.den-1 a pro d ti 1 mg.den-1.

Mléko obsahuje živiny pot ebné pro rostoucí organismus dít te a mladého lov ka i látky pot ebné pro výživu v dosp losti. Význam kravského mléka spo ívá p edevším v obsahu hodnotných bílkovin (3,2 %). Obsahuje tuk, který je velmi lehce stravitelný, mlé ný cukr laktózu (4,6 %), která má nejen energetickou hodnotu, ale též p ízniv podporuje innost n kterýchst evních mikroorganism a tím i využitelnost n kterých živin. Mléko je naším hlavním zdrojem vápníku, který je zde velmi dob e využitelný, dále obsahuje fosfor, draslík, ho ík, sodík, chlór, síru i adu stopových prvk . Mléko má velmi málo železa, proto dlouhodobá výhradn mlé ná strava by vedla vždy k chudokrevnosti. Mléko obsahuje i adu vitamín jako B2 nebo A (i provitamín karoten), vitamín B1, B6, E, K i malé množství vitamínu D a C. Jejich obsah závisí na zp sobukrmení dojnic a zp sobu jejich života. Kozí mléko nem že konkurovat kravskému a produkuje se prakticky výhradn v rámci malochovu pro domácí spot ebu i p ímý prodej. Mezi dva hlavní d vody pat í vyšší produk ní schopnost krav a fakt, že kvalita kozího mléka více závisí na kvalitkrmiva, než je tomu u mléka kravského. Koza má totiž v tší tendenci p evád t do svého mléka jedy a choroboplodné organismy, které se do ní dostanou (byly zaznamenány otravy z kozího mléka, která sežrala Rulík zlomocný) apod. V podstat totéž by se dalo íci o mléku ov ím. Ov í mléko

218

obsahuje v pr m ru 6 % tuku a sacharid kolem 5,1 %. Nicmén , ov í mléko je obzvláštvýborným zdrojem protein (cca 5,4 %)4,6.

Cílem naší práce bylo stanovit obsah vitaminu B2 syrovém mléce krav, ovcí a koz a vzájemn toto množství porovnat. Pro vlastní stanovení obsahu riboflavinu byla zvolena chromatografická separa ní technika HPLC (High Performance Liquid Chromatography) s UV detekcí.

Materiál a metodyZákladním principem všech chromatografických metod je opakované ustalování

rovnováhy rozpušt né látky mezi dv ma fázemi, z nichž jedna je pohyblivá (mobilní) a druhá zakotvená (stacionární). HPLC neboli vysoce ú inná kapalinová chromatografie má stacionární fázi polárnía mobilní fázi nepolární. U reverzní HPLC neboli RP-HPLC, která se používá pro stanovení vitamínu B2, je tomu práv naopak, mobilní fáze je polární a stacionární fáze je nepolární. HPLC HP 1100 na pracovišti UPI, UTB ve Zlín je sestaven ze zásobník mobilní fáze, degaseru, pump, vst ikovacího ventilu, termostatované kolony a detektoru. Obecn se nej ast ji používají dva zp soby dávkování mobilní fáze: gradientov , tj. s m nícím se vzájemným pom rem mobilních fází a izokraticky, tj. po celou dobu analýzy je složení mobilní fáze stejné. Pro stanovení vitamínu B2v mléce bylo použito gradientové eluce mobilních fází: methanolu a 0,12 M CH3COONa. Pro detekci je používán detektor s UV detekcí.

Riboflavin byl stanovován v ov ím, kozím a kravském syrovém mléce. Vzorky byly odebrány do tmavých lahví na soukromé farm , byly uloženy v lednici p i teplot 6-8°C a druhý den analyzovány. Pro stanovení riboflavinu v mléce bylo použito metody RP-HPLC s UV detekcí.

Nejprve bylo nutno riboflavin z mléka izolovat. Vzorek mléka byl zhomogenizován a poté bylo odebráno 20 ml k vlastnímu stanovení. Vzorek mléka byl odpipetován do 250 ml erlenmayerovy ba ky, která byla obalena hliníkovou folií. Postupn bylo ke vzorku p idáno 80 ml 0,2 mol.l-1 HCl. Poté byl vzorek zah íván 60 minut ve vodní lázni o teplot 97°C. V 50 minut byl p idán 1 ml 60% TCA a v 60 minut taktéž. Po ochlazení byl obsah erlenmayerovy ba kykvantitativn p eveden do 100 ml odm rné ba ky a ta byla dopln na redestilovanou vodou po zna ku. Celý obsah byl zfiltrován dvoustup ov . Po celou dobu stanovení byl vzorek chrán np ed sv tlem, protože vitamin B2 je fotolabilní. Chromatografické podmínky pro následnou separaci vzorku byly následující:

p íprava vzorku: filtrace (0,45 m, nylon) objem dávkovací smy ky: 20 lkolona: Supelcosil LC-8, 15 x 4,6 mm, 5 mmobilní fáze: methanol : 0,12 mol.l-1 CH3COONa, gradientová eluce pr tok mobilní fáze: 0,8 ml.min-1

teplota kolony: 30°Cdetektor: UV (270 nm) reten ní as: 9,6 min

Výsledky a diskuseKaždý vzorek mléka byl m en p tkrát, poté byla vypo ítána pr m rná plocha pík z p ti

stanovení a z této pr m rné plochy pík byla dle kalibra ní k ivky vypo ítána koncentrace vitamínu B2 v jednotlivých vzorcích mléka. Kalibra ní k ivka byla sestrojena jako závislost plochy píku na koncentraci riboflavinu ( g.ml-1). Kalibra ní ada byla sestrojena v koncentracích 0,5; 1,0; 1,5 a 2 g.ml-1). Výsledky byly zpracovány na hladin významnosti 0,05.

219

y = 54,323x + 4,0756R2 = 0,9901

0

20

40

60

80

100

120

140

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50

koncentrace [ g.ml-1]

ploc

ha p

íku

[mA

.V.s

-1]

Obr. 1. Kalibra ní k ivka s regresní rovnicí pro stanovení riboflavinu metodou HPLC

Tabulka IVýsledky m ení stanovení riboflavinu v mléce kravském, kozím a ov ím.

Název vzorku Pr m rná plocha píkmA.V.s-1

Obsah riboflavinu (μg.100ml-1)

kravské mléko 19,40 5,66 kozí mléko 38,82 12,54 ov í mléko 12,70 3,18

Obr. 2. Chromatogram: stanovení riboflavinu v kravském mléce

Jak je na první pohled z Tabulky I patrné, nejvyšší obsah riboflavinu byl v mléce kozím, pak kravském a nejnižší v mléce ov ím. Vzhledem k tomu, že u koz se jedná o chov volný, nikoliv stájový, je jasné, že vyšší hladina riboflavinu je ovlivn na stravou. Bohužel toto se nepotvrdilo z hlediska stanovení riboflavinu u ov ího mléka. Literatura3,4 udává obecn vyšší množství riboflavinu u mléka kravského, než bylo námi nam eno. Toto m že být ovlivn no charakterem stravy a sezónními podmínkami u chovu skotu.

riboflavin

220

Záv rPomocí RP-HPLC bylo stanoveno množství riboflavinu v mléce kravském

(5,66 μg.100 ml-1), kozím (12,54 μg.100 ml-1) a ov ím (3,18 μg.100 ml-1). Jak je patrno z tabulky I., nejvyšší obsah riboflavinu a tudíž i nejlepším zdrojem riboflavinu z testovaných vzork je mléko kozí, kde je v porovnání s mlékem kravským až dvojnásobek vitaminu B2.

Literatura1. HLÚBIK, P., OPLTOVÁ, L. Vitaminy. 1. vydání. Praha: Grada Publishing, 2004 2. VELÍŠEK, J. Chemie potravin 2. VŠCHT Praha, Tábor: OSSIS, 1999 3. HENRY, C.J.K., CHAPMAN, C. Nutrition Handbood for Food Processors. Woodhead Publishimg,

2002. 416 p. ISBN 1-85573-665-9 4. CABALLERO, B., ALLEN, L. Encyclopedia of Human Nutriton. Oxford, UK: Elsevier, 2005 5. RYLEY, J., KAJDA, P. Vitamins in thermal processing, Food Chemistry, 1994, vol. 49, p.119-129 6. JAKOBSEN, J. Optimisation of the determination of thiamin, 2-(1-hydroxyethyl)thiamin,

and riboflavin in food samples by use of HPLC. Food chemistry, 2008, vol. 106, p.1209-1217

Kontaktní adresaIng. Daniela Kramá ová, Ústav potraviná ského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , nám. T.G.Masaryka 275, 762 72 Zlín; email: kramarova@ft.utb.cz

221

SEPARACE LAKTOFERINU ZA VYUŽITÍ MONOLITICKÉ KOLONY S NÁSLEDNOU SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ

Horna Aleš1, Zítka Ond ej2, Adam Vojt ch2,3, Zeman Ladislav3, Doležal Petr3,Kizek René2

1Ústav potraviná ského inženýrství, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , 2Ústav chemie a biochemie, a 3Ústav výživy zví at a pícniná ství, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn

Separation of lactoferrin by using of monolithic column coupled with spectrometric detection

Summary:Lactoferrin is a glycoprotein with iron-binding properties. It is consisted of about 700 aminoacid residues. Its molecular weight is of about 77 000 Da. Owing to its iron-binding properties, lactoferrin is thought to play a role in iron uptake by the intestinal mucosa of the suckling neonate. Thus it appears to be the source of iron for breast-fed infants. It also appears to have antibacterial, antiviral, antifungal, anti-inflammatory, antioxidant and immunomodulatory activities. The main aim of this work was to suggest a method to distinguish structure of lactoferrin easily and with low demanding on instruments and costs and to determine this protein in colostrum. As structural distinguishing method we used flow injection analysis with electrochemical detection (FIA-ED). Based on the results obtained it can be concluded that electrochemical analysis enables to distinguish a change of protein structure easily and rapidly. For separation of lactoferrin from colostrum samples monolithic column and pH and ionic gradient was used. The lactoferrin separated was consequently measured by optimized UV-VIS spectrometry at 280 nm. The content of lactoferrin in colostrum samples varied from subunits to unit of gram per litre.

Protein laktoferin, jiným názvem laktotransferin, byl objeven v roce 1939 v kravském mléce. Jméno proteinu je odvozeno od jeho nejvýznamn jší biologické role a tou je schopnost vázat ionty železa. Až v roce 1960 byl laktoferin izolován z lidského mléka. Relativní molekulová hmotnost laktoferinu je podobná dalším železo vázajícím protein m a experimentáln byla ur enajako 74 817 u buvola a 76 165 u lov ka. Bylo zjišt no, že laktoferin je glykoprotein složený z konzervativního po tu aminokyselin (691 lov k a 685 prase). Nejmén obsahují laktoferiny methioninu (okolo 0.6 %), histidinu (okolo 1.3 %) a trpytofanu (okolo 1.5 %). Nejvyšší zastoupení má alanin okolo 10 %, leucin okolo 9 % a glycin kolem 7 %. Porovnání aminokyselinového složení u lidského laktofeinu je ukázáno na obrázku 1. Hololaktoferin (protein bez navázaného kovu) je formován z jednoho lineárního polypeptidového et zce vytvá ející dv kulovité domény. Každá z t chto domén obsahuje vazebné místo pro železo.

Obr. 1. Aminokyselinové složení lidského laktoferinu. Upraveno podle expasy.ch.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Am

inok

ysel

inov

é slo

žení

(%)

Ala ArgAsnAspCys Gln Glu Gly His Ile LeuLys MetPhe Pro Ser Thr Trp Tyr Val

222

Mezi doposud známé biologické funkce laktoferinu pat í udržování stálé a rovnom rnéhladiny železa v organismu. Vlastní ízení této rovnováhy železa se odehrává p evážn v tenkém st ev , kde je železo p ijímáno z potravy. Bylo objeveno, že krom iont železa je laktoferin schopný do stejného místa vázat i další kovy, ale s nižší silou. Význam této vazby je však stále nejasný. Vedle tak životn d ležité funkce laktoferinu, jako je chránit a udržovat koncentraci železa, bylo studováno, že p ítomnost laktoferinu ve st evech ovliv uje také druhové zastoupení bakterií. A nejen to, je dokonce schopen výrazným zp sobem chránit st eva p ed p sobenímnebezpe ných choroboplodných bakterií. A navíc byl pozorován zajímavý vztah k ízení bun néhor stu, diferenciaci bun k a protizán tlivé aktivit . Všechna tato fakta ukazují na možný vztah laktoferinu ke zhoubným nádor m a procesu nebezpe ného rozši ování nemoci (metastazování). Následn se také ukázal velmi významným železo vázajícím proteinem dalších exokrinních sekret ,jako jsou žlu , pankreatická š áva a st evní sekrety. V krevní plazm je laktoferin pravd podobnsyntetizován bílými krvinkami (leukocyty). Nejvyšší hladina až 7 g/l je pozorována v prvotním mléce (kolostru). V mléce se v pr b hu tvorby mléka sníží jeho koncentrace oproti kolostru p ibližn asi desetkrát. Dále ho m žeme v nižším množství najít v slzách, nosních tekutinách, slinách a sekretech pohlavních orgán . I p esto, že byl laktoferin objeven i v dalších lidských sekretech, jeho nejvýznamn jším zdrojem je mléko. Je ovšem známo, že mnoho lidí není schopno mléko pít, což souvisí se schopností rozšt pit mlé ný cukr. Tito lidé však p ichází o významný zdroj biologicky velmi dob e dostupného železa. Takový problém u malých d tí m že pomoci vy ešit genové inženýrství. Jedním z velmi slibných produkt tohoto biotechnologického odv tví je rýže, která produkuje lidský laktoferin. Rekombinantní protein se z ejm nejd íve stane sou ástímlé ných p ípravk pro p ed asn narozené d ti. Brzké využití se p edpokládá také u d tí od HIV pozitivních matek, kterým Sv tová zdravotnická organizace nedoporu uje kojit. Zjistilo se, že laktoferin má u zví at výrazný protivirový, protibakteriální, protiplís ový a protizán tlivý ú inek.P i podání laktoferinu telat m bylo pozorováno výrazné zlepšení jejich zdravotního stavu. Je však pot ebné zajistit, aby podávaný protein byl v jeho p irozené struktu e. Všechny pozitivní ú inky a vlastnosti proteinu laktoferinu jsou podmín ny jeho biologicky aktivní strukturou. Pokud p i p íprav mléka i mlé ných výrobk dojde ke zm n jeho struktury, ztrácí v tšinu biologicky významných vlastností.

Materiály a metody:Standard laktoferinu (DMW) byl získán od NATURA ingredients (Holandsko). Všechny

ostatní použité chemikálie byly od Sigma-Aldrich (USA). Zásobní roztok standardu laktoferinu (1 mg/ml) byl p ipraven rozpušt ním v pracovním fosfátovém pufru (5 mM, pH = 7,25) a skladován ve tm p i 4 °C.

Izolace laktoferinu Vzorky kravského kolostra byly skladovány p i -20 °C a po rozmražení byly zamíchány a

z homogenního roztoku bylo odebráno 100 l a z ed no 10 × do pracovního fosfátového pufru. Následn byly vzorky 30 sekund míchány a centrifugovány p i 14 000 rpm po dobu 20ti minut (Hettich, N mecko). Byl odebrán supernatant a ten filtrován p es 0,45 m filtr. Získaný vzorek byl následn 10 × z ed n pracovním fosfátovým pufrem. P ipravený vzorek o objemu 1 ml byl dávkován do separa ního systému jenž byl sestaven z peristaltické pumpy Minipuls 3 (Gilson, Francie), katexového CIM disk v monolitické kolon (BIA separations, Slovinsko) a UV/VIS-detektorem (ESA, USA). Vzorek byl dávkován kontinuáln peristaltickou pumpou od 0 do 1 minuty, následn po dobu od 1 do 21 minuty probíhalo promývání separa ního disku. Proteiny s nižším pI než 7,25 za aly být vymývány p i pr toku 0,75 ml/min. Laktoferin tak byl zkoncentrován na disku. Od 21. minuty byl pr tok snížen na 0,25 ml/min a probíhala eluce pomocí 1,5 M NaCl v 5 mM fosfátovém pufru. Po 35 minutách byla separace laktoferinu z kolostra ukon ena. Získané chromatogramy byly vyhodnoceny pomocí programu Clarity Data Apex.

223

Separace laktoferinu na SDS-PAGE Laktoferin byl ed n v pracovním fosfátovém pufru, hmotnostní marker (Biorad) a vzorky

byly nanášeny do jamek v gelu (PLB s p ídavkem 2-mercaptoethanolu). Vertikální elektroforéza SDS-PAGE byla dodána firmou Biometra (N mecko). Elektroforetické podmínky byly následující: 120 V v pr b hu 5 hodin (systém byl chlazen tekoucí vodou). Separace probíhala na 12.5% polyakrylamidovém gelu p ipraveném podle standardního protokolu. Po separaci byl gel barven coomassie blue.

Obr. 2. Zjednodušené schéma postupu izolace laktoferinu z kravského kolostra.

Výsledky a diskuze

Detekce laktoferinu probíhala pomocí UV/VIS detektoru spojeného on-line s vyhodnocovacím programem. Byla snímána vlnová délka 280 nm, která je vhodná pro ur ováníkoncentrace protein . P i aplikaci známých koncentrací laktoferinu v mobilní fázi byla za pomoci detektoru získána striktn lineární závislost (R2 0.9985). Minimální pozorované množství laktoferinu se pohybovalo okolo 20 ng/ml.

Je známo, že izolace protein z kolostra je pom rn obtížná. V našem p ípad nejd íve prob hlo odstran ní tuk pomocí intenzivní centrifugace. Získaný vzorek byl dále ed nv pracovním fosfátovém pufru tak, aby koncentrace majoritních protein (kaseiny, globuliny) byla výrazn snížena.

Obr. 3. UV/VIS chromatografický záznam laktoferinu eluovaného z monolitické kolony.

Peristaltická pumpa

CIM disk sSO3

skupinami

vzorek

UVdetektor výstup

Data

Schéma separa ního system

50 AU50 AU

1 g5 g

10 g

50 g

100 g

1 g5 g

10 g

50 g

100 g

laktoferin

tok mobilní fáze

224

Takto upravený vzorek byl separován za využití nov zavád ných technik monolitických kolon. Separace protein na CIM disku obsahujícího –SO3 skupiny probíhala na základ zm nynáboje protein p i r zném pH a iontové síle.

Jak je známo pI (isoelektrický bod) je hodnota pH, p i které je molekula peptidu nebo proteinu elektricky neutrální. Pokud je však hodnota pH vyšší než je pI proteinu, má protein celkový záporný náboj.

Obr. 4. SDS-PAGE izolovaného laktoferinu a vzorku ed ného mléka.

Obr. 5. Zm na množství laktoferinu ve vzorcích kravského kolostra odebíráno ihned po otelení.

Laktoferin500 ng

MlékoLadder

kDa250150

50

75100

37

25

20

15

Laktoferin500 ng

MlékoLadder

kDa250150

50

75100

37

25

20

15

Laktoferin500 ng

MlékoLadder Laktoferin500 ng

MlékoLadder

kDa250150

50

75100

37

25

20

15

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1 6 12 24 36 48 60 72

as odb ru (h)

Mno

žstv

í lak

tofe

rinu

(g/l)

225

Tohoto efektu je využito p i kationtov vým nné chromatografii na monolitické kolon .Další výhodou samotného monolitického disku je vysoká poréznost a tedy pom rn nízký pracovní tlak, kterému je kolona i látky v ní vystaveny. Laktoferin v koncentraci 100 μg/ml byl nanesen na monolitickou kolonu v pracovním 5 mM fosfátovém pufru. Nízká iontová síla a fyzikáln -chemické vlastnosti laktoferinu vedly k jeho zadržení na monolitické kolon . V p ípad , že byla iontová síla zvyšována (od 1 M NaCl), docházelo k uvoln ní laktoferinu do mobilní fáze. Navíc se ukázalo, že v promývacím kroku je výhodn jší vyšší rychlost toku mobilní fáze v porovnání s vymýváním, kde je výhodn jší snížení rychlosti mobilní fáze. Laktoferin je z monolitické kolony uvol ován kvantitativn a velmi selektivn (Obr. 3). Celkov jde o velmi šetrný zp sob separace. Tento fakt byl potvrzen i v p ípad , že jednotlivé odebrané frakce byly naneseny na polyakrylamidový gel.

Po optimalizování parametr separace bylo možné separovat laktoferin z reálného vzorku kravského kolostra. Vzorek mléka byl odebírán v pr b hu 72 h po porodu. Pr m rná koncentrace laktoferinu se pohybovala kolem 0.6 g/l. Ve sledovaných vzorcích byl pozorovatelný postupný vzestup hladiny laktoferinu do 24 h. Poté se hodnota laktoferinu postupn snižovala (Obr. 5).

Pod kování:Práce na tomto projektu byla podporována spole ností RADANAL s.r.o. Pardubice.

Použitá literatura:1. ADAM, V.; HRDINOVA, V.; KRIZKOVA, S.; ZITKA, O.; HORNA, A.; ZEMAN, L.; KIZEK, R.

Laktoferin, vyznamny zelezotransportni protein. Náš Chov, 2007, ro . LXVII. . 7, s. 22-23. 2. ADAM, V.; KIZEK, R. Laktoferin: Nova zbran na rakovinu? 21. Stoleti, 2007, ro . 4. . 9, s. 107-108. 3. HORNA, A.; HUSKA, D.; STEJSKAL, K.; KRIZKOVA, S.; SUPALKOVA, V.; BABULA, P.; ADAM,

V.; HAVEL, L.; BEKLOVA, M.; KIZEK, R. Use of electrochemical techniques for lactoferrin determination. In STRLIC, M.; BUCHBERGER W. (eds.). 12th International Symposium on Separation Sciences, Lipica 2006: Sept 27 - 29, Section for Analytical Chemistry of the Slovenian Chemical Society and Austrian Society for Analytical Chemistry. Lipica, Slovenia, 2006, s. 122-124, P12.

4. HORNA, A.; ZITKA, O.; KRIZKOVA, S.; HRDINOVA, V.; NAKIELNA, J.; ADAM, V.; TRNKOVA, L.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. Coupling of monolithic column sample preparation and flow injection analysis - Electrochemical detection for determination of lactoferrin: easy, low cost and structural distuinguishing. In SANDRA, T.; DUMONT E.; SANDRA P. (eds.). 31st International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC 2007: June 17 - 21, I.O.P.M.S. vzw, Belgium. International Convention Centre, Ghent, Belgium, 2007, s. 775-775, P19.45.

5. KUKACKA, J.; ZITKA, O.; HORNA, A.; STEJSKAL, K.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; ZEMAN, L.; PRUSA, R.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. A new tool for distinguishing of different structural forms of lactoferrin. Faseb J., 2007, ro . 21. . 5, s. A635-A635.

6. KUKACKA, J.; ZITKA, O.; HORNA, A.; STEJSKAL, K.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; ZEMAN, L.; PRUSA, R.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. A new tool for distinguishing of different structural forms of lactoferrin. In BALES, C. W. (eds.). Experimental Biology 2007: April 28 - May 2, The Federation of American Societies for Experimental Biology. Washington, DC, USA, 2007, s. A635-A635.

7. STEJSKAL, K.; HORNA, A.; HUBALEK, J.; ADAM, V.; KIZEK, R. Investigation of lactoferrin by means of electrochemical techniques. In KRACMAR, S.; VAVRECKA J.; BUNKA F.; VYSKOCIL I. (eds.). Vyziva zvirat 2006 - PROTEINY: June 6, Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno. Brno, Czech republic, 2006, s. 230-233.

8. ZITKA, O.; ADAM, V.; KRIZKOVA, S.; HORNA, A.; DOLEZAL, P.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. An analysis of lactoferrin using monolithic column coupled with UV-VIS and electrochemical detector. In TUKIENDORF, M. (eds.). V Medzynarodowe Warsztaty Akademickie w Naukach Rolniczych i Medycznych: November 8-10, Centrum Onkologii. Rejviz, Czech Republic, 2007, s. 24-25.

226

9. ZITKA, O.; HORNA, A.; STEJSKAL, K.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. Suggestion and optimization of method for study of structural changes of lactoferrin. In SKARPA, P.; FRYSCAKOVA E.; RYANT P.; CERKAL R.; STREDA T. (eds.). MendelNet06 Agro:Nov 29, Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno. Brno, Czech Republic, 2006, s. 136-136.

10. ZITKA, O.; HORNA, A.; STEJSKAL, K.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. Study of structural changes of lactoferrin using flow injection analysis with electrochemical detection on the surface of glassy carbon electrode. Acta Chim. Slov., 2007, ro . 54. . 1, s. 68-73.

11. ZITKA, O.; HORNA, A.; STEJSKAL, K.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; ZEMAN, L.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. Flow injection analysis with electrochemical detection as a tool for distinguishing of structural changes of lactoferrin. In TRNKOVA, L.; JANDERKA P. (eds.). VII. Pracovni setkani fyzikalnich chemiku a elektrochemiku: January 29-30, Masarykova univerzita. Brno, Czech Republic, 2007, s. 142-143.

12. ZITKA, O.; KRIZKOVA, S.; HRDINOVA, V.; NAKIELNA, J.; ADAM, V.; HORNA, A.; TRNKOVA, L.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. Coupling of monolithic column sample preparation and flow injection analysis – electrochemical detection for determination of lactoferrin: easy, low cost and structural distinguishing. In BLATTNA, J.; HORNA A.; MACKA M.; ZIMA T. (eds.). Vitamins 2007 - Nutrition and Diagnostics: September 19-21, University of Pardubice. Prague, Czech Republic, 2007, s. 235-236.

Kontaktní adresa:Ing. Aleš Horna, CSc., Ústav potraviná ského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , T.G. Masaryka 275, CZ-762 72 Zlín, eská republika

227

T KAVÉ LÁTKY HOUBOVÝCH SMETANOVÝCH OMÁ EKPudil František1, Jenknerová Jana1, Janda Václav2

1 Ústav chemie a analýzy potravin, 2 Ústav technologie vody a prost edí, VŠCHT Praha

Volatile components of mushroom cream sauces

Summary:In the laboratory conditions, three different mushroom cream sauces were prepared. Fresh shiitake mushrooms (Lentinus edodes), champions (Agaricus bisporus) and dried boletus (Boletus reticulatus) wereadded to the basis of cream and onion, respectively. Isolation of volatiles was done by SPME method at 50o C and the main components were identified by GC-MS method. The mixed sample with added caraway seeds and a sample of commercially produced mushroom sauce were also analysed.

SouhrnV laboratorních podmínkách byly p ipraveny neochucené základy omá ek ze smetany,

cibule a z erstv sklizených plodnic Houževnatce jedlého (Lentinus edodes), dále ze zakoupených plodnic Žampionu krémového (Agaricus bisporus) a ze sušených plodnic H ibu dubového (Boletusreticulatus). Z omá ek byly p i teplot 50o C metodou SPME izolovány t kavé látky a analyzovány plynovou chromatografií s hmotnostn spektrometrickou detekcí. Pro srovnání byl analyzován též sm sný vzorek p ipravených omá ek po dochucení kmínem a vzorek komer n dodávané houbové omá ky. Byly identifikovány hlavní aromatické složky.

ÚvodCílem práce bylo porovnání složení houbových omá ek p ipravených z r zných druh hub

a houbové omá ky komer n vyráb né.

Materiál a metodyPro p ípravu omá ek byly využity následující houby. Houževnatec jedlý(Lentinus edodes)

–houba shiitake byl vyp stován v laborato i z komer n dostupných blok firmy Damycel, Praha 10, Malešice (http://www.shopware.cz/shiitake/). erstvé plodnice žampionu krémového (Agaricusbisporus) byly zakoupeny v obchodní síti Tesco (Národní t ída, Praha) od firmy eské houby a.s.,Sob slav (http://www.ceskehouby.cz). H ib dubový (Boletus reticulatus) pocházel z vlastního sb ru v okolí Brd, který byl uskute n n v lét roku 2007. Sklizené plodnice h ibu dubového byly usušeny v domácí sušárn p i teplot 35 °C a následn namlety. Komer n dodávaná Apetito omá ka – tavená sýrová omá ka s houbami byla zakoupena v obchodní síti Tesco (Zli ín, Praha) od výrobce TPK, spol.s.r.o., Hodonín. Jako základ pro p ípravu omá ek bylo použito Jiho eské máslo 82% firmy Madeta (http://www.madeta.cz), smetana 12 % rovn ž od firmy Madeta (Mlékárna Kunín) a cibule. Sm sná omá ka byla dochucena kmínem firmy Kotányi, Praha 6 (http://koreni.kotanyi.cz ). P edchozí ty i suroviny byly zakoupeny v obchodní síti Tesco (Národní t ída, Praha).

P stování houby shiitake Substrátový blok byl umíst n do p epravky p ekrytou plastovou fólií a ponechán

v laborato i u otev eného okna, kde byl zaru en dostatek sv tla a teplota byla udržována na cca 15 °C. Blok byl každý den n kolikrát mlžen vodou pomocí rozprašova e. K vývinu plodnic shiitake došlo za týden od za átku p stování. Zralé plodnice byly sklizeny 10 dní po zahájení kultivace.

P íprava omá ek Byl p ipraven neochucený základ omá ek z cibule, smetany a erstvých plodnic. Malá

oloupaná a na kosti ky nakrájená cibule byla zp n na na asi 10g másla po dobu 3 minut. Poté bylo p idáno 100 g nakrájených erstvých hub nebo 20 g mletých sušených hub. Sm s byla dušena pod poklicí po dobu 10 minut. Nakonec bylo p idáno 100 ml smetany a vzniklá omá ka byla ještb hem dalších 10 minut pova ena. Po odebrání vzork k analýze (cca 10 ml) byl p ipraven sm snývzorek všech t í omá ek a dochucen p ídavkem 1g kmínu.

228

Identifikace t kavých látek Analýza t kavých látek omá ek byla provád na plynovou chromatografií ve spojení

s hmotnostní spektrometrií na p ístroji Fisons Instruments GC 8000 s hmotnostním detektorem MSD 800 (Fisons Instruments, Itálie). Pro separaci t kavých látek byla zvolena kapilární kolona 30 m × 0,32 mm se stacionární fází TR-5 s tlouš kou filmu 1 m (Thermo Fisher Scientific, USA). Teplota kolony byla programována od 50 °C (2 min izotermní prodleva) do 220 °C rychlostí 5 °C/min. Teplota nást iku byla 230 °C. Nosným plynem bylo helium. Energie ionizujících elektron byla 70eV.

Vzorek byl nast ikován technikou SPME po adsorpci na vlákno se zakotvenou fází 65 mCarbowaxTM – divinylbenzene (Supelco Park, USA). T kavé látky z p ipravených omá ek umíst ných v uzav ených vialkách byly izolovány p i teplot 50 °C po dobu 60 min. Pro identifikaci látek byla využita knihovna hmotnostních spekter NIST (NIST, Velká Británie).

Výsledky a diskuse

Obr. 1. GC-MS analýza extraktu t kavých látek z omá ky z erstvých plodnic houževnatce jedlého,identifikace viz tab.I.

Tabulka I Identifikované látky analýzy extraktu z omá ky z erstvých plodnic houževnatce jedlého, chromatogram viz obr.1.

Rt (min) Identifikovaná látka Poznámka 8,992 2-heptanon 9,616 alken ? 10,927 sirný derivát 11,505 silikon kontaminant 12,238 1-okten-3-ol 12,449 3-oktanon 13,155 oktanal 14,026 alifatický derivát 16,162 2-nonanon 16,639 silikon kontaminant 16,923 dipropyldisulfid 17,216 1,2-dithiacyklopentan 18,592 alken ? 19,499 2-methylheptan 20,031 dekanal 21,801 silikon kontaminant 22,681 derivát pyranu ? 24,129 2-methyl-3-pentanthiol 25,532 2,4,6-trimethyloktan 26,458 silikon kontaminant 28,292 2-methyldodekan ? – nejistá identifikace

229

Obr. 2. GC-MS analýza extraktu t kavých látek z omá ky z erstvých plodnic žampionu krémového, identifikace viz tab.II.

Tabulka II Identifikované látky analýzy extraktu z omá ky z erstvých plodnic žampionu krémového, chromatogram viz obr.2.

Rt (min) Identifikovaná látka Poznámka 9,093 2-heptanon 12,091 benzaldehyd 12,531 3-oktanon 15,007 2-fenylacetaldehyd 16,235 2-nonanon 16,703 silikon kontaminant 16,996 dipropyldisulfid 17,281 dithiacyklopentan 21,865 silikon kontaminant 22,763 2-undekanon 24,203 neidentifikováno 26,513 silikon kontaminant

Obr. 3. GC-MS analýza extraktu t kavých látek z omá ky ze sušených plodnic h ibu dubového, identifikace viz tab.III.

230

Tabulka III Identifikované látky analýzy extraktu z omá ky ze sušených plodnic h ibu dubového, chromatogram viz obr.3.

Rt (min) Identifikovaná látka Poznámka 9,066 2-heptanon 9,607 neidentifikováno, sm sný pík 16,199 2-nonanon 16,685 silikon kontaminant 16,969 dipropyldisulfid 17,263 dithiacyklopentan 19,399 alken 21,856 silikon kontaminant 22,718 2-undekanon 22,874 neidentifikováno 24,166 3-pentanthiol 26,513 silikon kontaminant 28,512 2-undekanon ? – nejistá identifikace

Obr. 4. GC-MS analýza extraktu t kavých látek z omá ky ze sm si vybraných hub, identifikace viz tab.IV.

Tabulka IV Identifikované látky analýzy extraktu z omá ky ze sm si vybraných hub, chromatogram viz obr.4

Rt (min) Identifikovaná látka Poznámka 9,057 2-heptanon 12,312 1-okten-3-ol 12,504 2-ethylhexanal 14,081 cykloalkan ? 15,007 1,3,5-cykloheptatrien 16,217 2-oktanon 16,694 silikon kontaminant 16,978 dipropyldisulfid 17,262 3,3´-thiobis-1-propen 21,617 cykloalken ? 22,727 2-undekanon 24,175 (1-methylethyl)thiooctová kyselina 26,504 silikon kontaminant 28,539 2-tridekanon ? – nejistá identifikace

231

Obr. 5. GC-MS analýza extraktu t kavých látek z omá ky ze vzorku komer n dodávané houbové omá ky, identifikace viz tab.V.

Tabulka V Identifikované látky analýzy extraktu ze vzorku komer n dodávané houbové omá ky,chromatogram viz obr.5.

Rt (min) Identifikovaná látka Poznámka 8,947 2-heptanon 12,174 1-okten-3-ol 16,492 sorbová kyselina 18,830 hexanová kyselina 21,718 alifatický uhlovodík 22,553 2-undekanon 23,919 sorbová kyselina 26,367 silikon kontaminant 28,347 2-undekanon

Záv ry

Ve všech laboratorn p ipravených vzorcích byly nalezeny deriváty methylketon ,pocházejících z ejm ze smetany. Sirné látky detegované ve všech vzorcích pocházely z cibule, což potvrdila i analýza omá kového základu bez p ídavku hub. Celkový obsah t kavých látek byl nízký a ve sm sném vzorku po ochucení kmínem p evažoval mezi t kavými látkami karvon a další látky terpenického charakteru.

V houbové omá ce z erstv sklizené houby Houževnatce jedlého byl detegován jako významná složka tzv. „houbový alkohol“ 1-okten-3-ol, který se ve významn jším množství v ostatních p ipravených omá kách neobjevil. Pro omá ku ze Žampionu krémového byl charakteristický výskyt 3-oktanonu, benzaldehydu a 2-fenylacetaldehydu. V omá ce ze sušeného H ibu dubového byl obsah t kavých látek extrémn nízký a p evažovaly složky p vodem ze smetany a cibule.

Mezi t kavými látkami komer n dodávané houbové omá ky p evažoval 1-okten-3-ol (pravd podobn syntetický) a kyselina sorbová.

P estože složení t kavých látek houbových omá ek z r zných surovin bylo významnrozdílné, všechny vzorky se vyzna ovaly typickým „houbovým“ charakterem aroma.

232

Literatura1. Zawirska-Wojtasiak, R.: Optical purity of (R)-(-)-1-octen-3-ol in the aroma of various species of edible

mushrooms, Food Chemistry 86, str. 113-118, (2004). 2. Lanzotti V.: The analysis of onion and garlic, Journal of Chromatography A 1112, str. 3-22, (2006). 3. Schulz H., Krüger H., Liebmann J., Peterka H.: Distribution of Volatile Sulfur Compounds in an

Interspecific Hybrid between Onion (Allium cepa L.) and Leek (Allium porrum L.), J. Agric. Food Chem. 46, str. 5220-5224, (1998).

4. Peterson D. G., Reineccius G. A.: Characterization of the volatile compounds that constitute fresh sweet cream butter aroma 18, 215-220, (2003).

5. Peterson D. G., Reineccius G. A.: Determination of the aroma impact compounds in heated sweet cream butter, Flavour and Fragrance Journal 18, 320-324, (2003).

6. Masada Y.: Analysis of Essentials Oils by Gas Chromatography and Mass Spectrometry, str. 83-87, (1976).

Kontaktní adresyJana Jenknerová, Ústav chemie a analýzy potravin, jana.jenknerova@vscht.cz Ing. František Pudil, CSc., Ústav chemie a analýzy potravin, pudilf@vscht.cz Prof. Ing. Václav Janda, CSc., Ústav technologie vody a prost edí, vaclav.janda@vscht.cz

Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6 Dejvice, 16628

233

STUPE POZNANIA TRHOVÝCH DRUHOV MLIEKA FREKVENTANTAMI ŠPECIALIZOVANÉHO SENZORICKÉHO LABORATÓRIA.

Ma a Pavel, Baranová Mária, Sabolová Gabriela *, Ma ová Jana Katedra hygieny a technológie potravín UVL,IVVL Košice

Level of knowladge of market types of milk by certificated participants of special sensorial laboratory

Summary:The quality of food products is very important to human health. All food products should be tested by professional workers. For this reason the special senzory laboratory was opened at UVM and SVS in Kosice. The basic of senzory analysis in the perception of food atributes with direct use of human senses. The selection and training of personal used for the assesment of senzory characteristics (assesors) has been standardised but it is necessary to check, refresh and up-date the performance of assessors.

ÚvodSpotreba mlieka a mlie nych výrobkov na Slovensku v posledných rokoch neustále klesá,

a to aj napriek jeho významnej úlohe, ktorú zohráva pri zdravom stravovaní. V priemere sa za minulý rok vypilo a skonzumovalo len cca 150 kg mlieka a mlie nych výrobkov na jedného obyvate a, o je najmenej za posledných 15 rokov. Spomedzi krajín EÚ je Slovensko v konzumácii mlieka na spodku tabu ky. Pre porovnanie predstavuje spotreba v krajinách únie cca 300 kg na osobu, pri om sa spotrebúva približne trojnásobné množstvo mlie nych nápojov a dvojnásobné množstvo syrov ako u nás. Pod a prieskumov uskuto nených medzi malými Slovákmi, však nekonzumuje mlieko ani produkty z neho asi 12 % školákov a takmer 50 % iba ob as. Mlieko má bohužia najmä medzi mladými u mi všeobecne ve mi nízky imidž a aj jeho spotreba je nízka.

Ak chce výrobca, alebo aj predajca potravín by u spotrebite ov úspešný, mal by vedieobjektívne ur i senzorické vlastnosti vyrábaných alebo ponúkaných výrobkov a takisto odhadnúich hedonické pôsobenie. asto sa stáva, že konzumenti odmietnu potraviny, ktoré by pre nich mohli by nutri ne prospešné, pretože nechutia dobre alebo preto, že s ich konzumáciou nemali skúsenosti. Skúsený senzorický analytik môže na základe posúdenia výsledkov skúšok vykonaných vyškoleným panelom hodnotite ov odhadnú možné technologické chyby, i prítomnos ur itýchnežiadaných deskriptorov a navrhnú prípadné chemické alebo mikrobiologické skúšky na ich odhalenie. A práve preto v tejto oblasti by mohli preukázate ne skúsené a erudované senzorické laboratóriá poskytova výrobcom a podnikate om užito né služby.

Výsledky

V našej štúdii boli porovnávané dve rozdielne skupiny hodnotite ov za ú elom zistenia úrovne poznania jednotlivých kvalít niektorých výrobkov a modelových substancií . Prvú skupinu reprezentovalo 40 študentov 3. ro níka študijného odboru Hygiena potravín UVL v Košiciach s minimálnymi znalos ami o systéme a spôsobe hodnotenia potravín, kým druhá skupina pozostávala zo 40 pracovníkov, ktorí vykonávajú profesionálne senzorické hodnotenie potravín na rôznych stup och kontroly. Testy boli vykonávané v Špecializovanom senzorickom laboratóriu na IVVL v Košiciach.

Prvá as prieskumného testu spo ívala v hodnotení jednotlivých trhových druhov mlieka s ich následným hodnotením vybranými senzorickými metódami v rôznych kombináciách a to nasledovne:

- párovou metódou (mlieko plnotu né/ nízkotu né, trvanlivé/ sá kové)

- duo-trio metódou (mliekoUHT Tami/mliekoUHT Rajo)

Úspešnos hodnotenia je uvedená v tabu ke I a II.

234

Tabu ka IPorovnanie úspešnosti hodnotenia jednotlivých trhových druhov mlieka študentmi (v %)

Výrobok Párová metóda Duo-trio metóda Mlieko

plnotu né / nízkotu né 87,5 66,4

Mliekotrvanlivé/sá kové 75,8 47,7

MliekoUHT Tami/UHT Rajo 32,3 26,8

Tabu ka II Porovnanie úspešnosti hodnotenia jednotlivých trhových druhov mlieka odbornými hodnotite mi(v %)

Výrobok Párová metóda Duo-trio metóda Mlieko

plnotu né / nízkotu né 96,7 71,9

Mliekotrvanlivé/sá kové 93,1 85,0

MliekoUHT Tami/UHT Rajo 79,2 77,6

V druhej asti práce sme overovali u hodnotite ov-študentov schopnosti ur enia pachových kvalít modelových substancií skupiny aróm ur ených pre aplikáciu do zmrzlín a mlie nych produktov a to: Lieskový orech, Brosky a I, Brosky a II, Karamel, okoláda, Vanilka I, Malina, ierne ríbezle

Tabu ka III Aplikácia do zmrzlín a mlie nych produktov

Vzorka arómy A%

B%

C%

D%

CH%

SPOLU%

Lieskový orech 66,7 25,0 87,5 65,0 40,0 60,0

Brosky a I 55,6 62,5 75,0 65,0 60,0 64,0

Brosky a II 11,1 75,0 87,5 55,0 60,0 56,0

Karamel 33,3 25,0 100,0 60,0 20,0 52,0

okoláda 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Vanilka I 77,8 75,0 87,5 85,0 60,0 80,0

Malina 77,8 50,0 37,5 55,0 60,0 56,0

ierne ríbezle 22,2 87,5 25,0 45,0 40,0 44,0

Baza 88,9 25,0 87,5 70,0 60,0 68,0

Vanilka II 88,9 87,5 87,5 85,0 100,0 88,0

235

Pri posudzovaní aróm boli dosiahnuté nasledujúce výsledky: vo všetkých paneloch bol dosiahnutý najvernejší výsledok pri okoládovej aróme, kde všetky skupiny dosiahli maximum, tj. 100 %. alšou najlepšie hodnotenou vzorkou bola aróma Vanilka I a II s 80 resp. 88% rozlíšite nos ou, pri om úrove hodnotenia sa pohybovala v rozsahu 85 až 100 % (Vanilka II). Najslabšie hodnotenou arómou bola aróma ierne ríbezle, ktorú správne ur ilo len 44 % hodnotite ov s frekvenciou správnosti od 22,2 % (skupina A) po 87,5 % (skup. B). Naopak hodnotitelia v tejto skupine mali zjavné problémy pri charaktere arómy Bazy a Lieskového orecha pri správnosti ur enia len u 25 % hodnotite ského panelu. Pri hodnotení v rámci skupín D (diev atá) a CH (chlapci) nedošlo k výraznejším rozdielom v hodnotení, s výnimkou arómy Karamel, ktorú správne ur ilo len 20 % chlapcov (diev atá 60 %).

ZáverV práci sme sledovali prostredníctvom základných skúšok úrovne poznania jednotlivých

chutí a substancií aróm. Dosiahnuté výsledky poukazujú na to, že úrove poznania jednotlivých kvalít aj u základných potravín je na nižšej úrovni ako sa o akávalo. Ve kým problémom sa javí aj problematika neznalosti senzorických pojmov, ako aj nepoznania širšej škály pachov. Na základe dosiahnutých výsledkov testu a celkového hodnotenia môžeme konštatova , že je potrebné neustále nielen vychováva nových posudzovate ov, ale formou udržiavacích testov na rôznych úrovniach zdokona ova okrem teoretických znalostí aj fyziologicko-psychologické parametre senzorických orgánov potenciálnych hodnotite ov posudzovate ov.

Práca bola riešená v rámci projektu Vega 1/ 4380/07

Kontaktná adresa: Doc. MVDr. Pavel Ma a, PhD., Ústav hygieny a technológie mlieka, UVL, Košice, Komenského 73, 040 81 Košice, e-mail: mala@uvm.sk

236

SENZORICKÉ HODNOCENÍ JOGURT A JOGURTOVÝCH DRINK S JAHODOVOU P ÍCHUTÍ

Šedivá Alena, Panovská Zde ka, Lukešová Dobromila Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha

Sensory evaluation of strawberry yogurts and yogurt drinks

Summary:Objectives of this study were to determine panel ratings for strawberry yogurts and yogurt drinks and to observe differences in specific hedonic and intensity parameters among eight strawberry yogurts and two yogurt drinks made by different producers. Ranking test was used for evaluation of yogurt samples, sensory profile were used for evaluation of both yogurts and yogurt drinks. The sensory evaluations of yogurts were done in cooperative with 20 trained assessors in age between 19-27 years. Differences in sensory perception of yogurts were not significant for most of tested samples. Most of assessors preferred sample appropriately thick, with pieces of fruit and lower strawberry aroma and nature strawberry taste. The sensory evaluations of yogurt drinks were done in cooperative with 115 assessors (32 assessors with age between 50-80 years and 83 assessors with age between 19-27 years). The assessors mostly preferred the sample with sweeter taste and more pronounced strawberry aroma.

Úvod: Na eském trhu je možné najít široký sortiment mlé ných výrobk . Laborato

senzorické analýzy se dlouhodob zabývá senzorickým hodnocením r zných druh mlé nýchvýrobk . Presentovali jsem již výsledky preferencí v kategorii bílých jogurt , kde se prokázalo, že obsah tuku má vliv na hodnocení p íjemnosti chuti a rovn ž, že hodnotitelé mají v tšinou zna néproblémy odhadnout správn obsah tuku u t chto výrobk . U kategorie ochucených jogurt byla zjiš ována preference jednotlivých p íchutí.

Také v tšina zahrani ních senzorických studií týkajících se mlé ných výrobk se hlavnv novala senzorickým vlastnostem a p ijatelnosti jogurt a jejich vhodným ochucením. Barnes et al. (1991a) ve své práci uvádí, že celková p ijatelnost výrobk koreluje s pom rem sladké a kyselé chuti. N kolik studií se v novalo p ijatelnosti jogurt pro r zné skupiny spot ebitel nap .Ward et al. (1999). Kalvianinen et al. (2003) zkoumal vztah textury, chuti a aroma na preference jogurt u starších a mladých lidí. Bogue and Ritson (2005) propojili znalosti marketingu se senzorickou metodologií, aby pochopili preference konzument pro výb r jahodového jogurtu s r zným obsahem tuku. Zjistili, že konzumenti preferují jahodový jogurt s nižším obsahem tuku a že využití senzorické analýzy propojené s marketingem dává komplexn jší pohled na tuto problematiku [1]. N které práce, ale není jich mnoho, se zabývají také senzorickým hodnocením jogurtových drink , které pat í k rychle se rozvíjející skupin nových výrobk v mlé ném pr myslu. Jogurtové nápoje se velice rychle staly vyhledávanými výrobky, protože si zachovávají výhody jogurt tj. mají p ínos pro zdraví lov ka, navíc se snadn ji konsumují a jednoduše se s nimi manipuluje [2, 3].

Potraviná ská vyhláška tyto výrobky p esn nedefinuje. U jogurtu, kefíru, acidofilní mléka atd. vypisuje požadavky, které musí tyto výrobky spl ovat, nap . jejich obsah tuku a sušiny, po et živých mikroorganism atd. Ostatní výrobky nejsou tak p esn definovány, platí však, že pokud je výrobek ozna ený jako "jogurtový", musí nejmén polovinu tvo it jogurt, u mlé néhomusí být víc než polovinou zastoupeno mléka nebo syrovátka. Výrobce je pak povinen ostatní složky popsat na etiket . Má-li mít nový výrobek úsp ch na trhu je vždy nutné zjistit, ím se ze senzorického hlediska odlišuje a také konzumentské preference. Thompson et al. (2007) se zabýval rozdíly v preferencích r zn ochucených drink mezi b lošskou, špan lskou, afro-americkou populací. P ijatelnost jogurtových drink , jejich specifická chu a fyzikální vlastnosti se pro každou skupiny lišily[1].

237

Cíl práce:Jedním z cíl naší dlouhodobé práce zam ené na sledování senzorických vlastností

mlé ných výrobk bylo sledovat rozdíly v p íjemnosti chuti a intenzit n kterých vybraných parametr u jogurt a jogurtových nápoj s jahodovou p íchutí. Zam ily jsme se na chu ovécharakteristiky jahodových jogurt b žn dostupných na našem trhu. Vzorky byly vybírány ve spolupráci se spot ebitelským 4asopisem Q magazín. V další ásti práce jsme podrobn jistudovali senzorické charakteristiky jogurtových nápoj s jahodovou p íchutí. Formou dotazníku jsme zjiš ovali preference hodnotitel k jogurtovým nápoj m a jim podobným výrobk m. Hodnotitelé se p i hodnoceních m li možnost seznámit s rozdíly mezi senzorickým posuzováním jogurt a jogurtových nápoj .

Vzorky:Popis jogurt

Tabulka I Popis testovaných jogurt s jahodovou p íchutí

Ozna ení Název Složení (opsáno z obalu výrobce)

1 Cremi jahoda-Yoplait mléko, ochucená složka 15 % hm., cukr, jahody,

jable né pyré, barvivo karmín, jahodové aroma, tuk 5,5 %, sušina 23,5 %

2 Jogurt plus - Ehrmann

2,5 % tuku, mléko, 18 % ovoc. složky (50 % jahody, cukr, zahuš ovadla, modifikovaný kuku i ný škrob,

pektin a guma guar, glukózo-fruktózový sirup, barvivo koncentrát š ávy ervené epy, aroma), cukr, sušené

odtu n né mléko, jogurtové kultury

3 Jogurt jahoda smetanový- PROMIL

smetana, jahod. složka 16 % (cukr, 22%, jahody, glukózo-fruktózový sirup, zahuš ovadla: modif.

kuku i ný škrob a pektin, jable ný koncentrát, aroma), živé jogurtové kultury

4Choce ský smetanový

jogurt – Surfá ekjahodový

smetana, jahod. složka 16 % (cukr, jahody, barvivo), ep. koncentrát, živé jogurtové kultury, p írodní a

p írodn identické aroma

5 Smetanový jogurt -Jah dka

tuk min. 8 %, smetana, jahod.složka 17 % (cukr, jahod. d e , aroma), jogurtová kultura

6 Dobrá máma krémová

tuk 4 % hm.,mléko, jahodová složka 8 % (jahody 60%, cukr,cukr,glukózo-fruktózový sirup), zahuš ovadla(karagenan, kuku . modif.škrob E1142), regulátory

kyselosti: sodné a vápenaté, barvivo: karmín, aroma, cukr, mlé . bílkoviny, zahuš ovadlo: želatina, jogurt.

kultura

7 Smetanový jogurt z Valašska - Jahoda

smetana, ovoc. složka 14 % (cukr, jahody, aroma), jogurt. kultura

Popis jogurtových nápojVzorek 1. – Activia nápoj - kysaný mlé ný výrobek s bifidokulturou, p íchu jahoda s kiwi, Danone a.s., Benešov a.s., RVzorek 2. - Revital active - probiotický kysaný nápoj se sníženým obsahem tuku a s aktivními složkami, p íchu jahoda, Olma a.s., Olomouc, R

238

Experimentální podmínky:Hodnocení probíhala v senzorické laborato i, která svým vybavením odpovídá norm

ISO 8589. Veškeré práce probíhaly v souladu s metodikami danými mezinárodní normami ISO. Senzorické hodnocení jahodových jogurt probíhalo za následujících podmínek: množství

testovaného vzorku bylo 100 ml, teplota p i podávání vzorku byla 5 °C, hodnocení se ú astnil panel 20 vyškolených hodnotitel . Krom po adové zkoušky (ISO8587), kterou byla hodnocena celková p íjemnost vzork , byl u všech vzork sledován senzorický profil, p i kterém byla mimo jiné porovnávána intenzita jahodové v n , intenzita kyselé a jahodové chuti, hustota a tu nost vzorku. Vzorky byly testovány pomocí grafických nestrukturovaných stupnic 100 mm dlouhých a orientovaných popisky na jejich koncích. P i hodnocení vzork byl využit rovn ž volný slovní popis.

Jogurtové nápoje s p evažující jahodovou p íchutí posuzovaly t i skupiny hodnotitel ,skupina B (studenti-1. ro ník bakalá ského studia), M (studenti-1. ro ník magisterského studia) a S (studenti University t etího v ku). Pomocí grafické nestrukturované stupnice (100 mm dlouhé) byly hodnoceny vybrané deskriptory u dvou jogurtových nápoj od dvou r zných výrobc . Všichni hodnotitelé p ed vlastním hodnocením vyplnili dotazník týkající se konzumace jogurtových drinka jejich preferencí.

Výsledky:Hodnocení jahodových jogurt :

U skupiny sedmi zakoupených jogurt bylo sledováno po adí výrobk dle celkové p íjemnosti a intenzity vybraných parametr .

a) Výsledky po adové zkouškyPo adovou zkouškou byly vzorky azeny podle p íjemnost chuti tj. od nejlepšího

k nejhoršímu. Výsledky byly statisticky zpracovány Friedmanovým testem na hladinpravd podobnosti 0,05. Po adí vzork od nejchutn jšího k nejmén chutnému vzorku bylo následující: za nejchutn jší byl v tšinou hodnotitel považován vzorek ozna ený 6 (Dobrá máma krémová), následovaly vzorky 3 a 7, dále skupina vzork 4, 5 a 2. Za nejmén chutný byl hodnotiteli považován vzorek s ozna ením 1 (Cremi Jahoda –Yoplait). P i porovnání rozdíl mezi vzorky byl významný rozdíl pouze mezi prvním a posledním vzorkem, ostatní vzorky se v chutnosti vzájemn významn nelišily. Ze statistiky vyplynulo, že v tšina testovaných vzorkse v p íjemnosti chuti lišila pouze minimáln .

b) Intenzity vybraných parametr u jogurt s jahodovou p íchutíPr m rné hodnoty intenzit parametr sledovaných u jahodových jogurt jsou uvedeny v tabulce II.

Tabulka II Hodnocení intenzit vybraných parametr u jogurt [%] Ozna ení vzorku 1 2 3 4 5 6 7 Intenzita jahodové v n 56 38 36 54 56 38 48 Intenzita kyselé chuti 52 32 52 56 44 56 68 Intenzita jahodové chuti 42 36 42 48 56 36 46 Hustota 52 34 44 40 42 48 48 Tu nost 52 42 62 64 58 36 52

Nejv tší rozdíly mezi vzorky byly nalezeny v intenzit jahodové chuti. Intenzita jahodové v n byla nejvyšší u vzork íslo1 a 5 a nejnižší u vzorku 3. Vzorek 2 byl hodnocen jako p ílišídký.

239

c) Slovní popis jogurt s jahodovou p íchutíV tabulce III jsou uvedeny nej ast ji zmín né termíny, kterými hodnotitelé popisovali jednotlivé testované vzorky.

Tabulka III Nej ast ji citované slovní popisy u jednotlivých výrobk

íslo vzorku Volný slovní popis testovaných vzork1 dobrá konzistence, sv tlý, málo jahod, um lá v n2 málo sladký, zvláštní kyselá chu , um lá p íchu , horší textura, 3 málo smetanový, um lá p íchu ,4 nevýrazný, hrudky v textu e,5 krupi kový, jemn nakyslý, 6 hustý, ovocné kousky, v n jahod 7 prázdná chu , našlehaný, um lá chu .

Hodnocení jogurtových nápoj :T i skupiny hodnotitel porovnávaly jogurtové nápoje, od dvou výrobc , s p evažující

jahodovou chutí. Cílem bylo zjistit, zda lze pro senzorické hodnocení jogurtových drink použít stejné deskriptory a zda se n který deskriptor výrazn liší (zda se jejich pr m rné intenzity n jak liší). Dále jsme cht li porovnat práce panel , pro porovnání byl vybrán deskriptor v n ,ale metodicky stejn by se porovnaly i ostatní deskriptory).

a) Dotazníkový pr zkum Dotazníkového pr zkumu se zú astnilo 115 dotazovaných (67% žen a 33% muž )

ve v ku od 19 do 80 let. Celkový soubor dotazovaných byl rozd len na dv skupiny. První skupina byla tvo ena studenty Fakulty potraviná ské a biochemické technologie, druhá skupina byla tvo enaseniory z University t etího v ku. V tšina dotazovaných student uvedla, že jogurtové nápoje konzumují a že preferují p evážn nápoje ochucené (76 %) p evážn s ovocnou p íchutí.

Panel senior byl tvo en 32 hodnotiteli (75 % žen a 19 % muž , 6 % hodnotitel pohlaví v dotazníku neuvedlo).

P i výb ru typu nápoje 31 % senior uvedlo, že preferuje jogurtové nápoje bez p íchuti, 50 % senior preferovalo jogurtové nápoje ochucené (p evážn ovocné). Zbytek hodnotitel(19 %) si nevybral ani jeden z typ jogurtových nápoj .

Dále bylo zjišt no, že p i výb ru jogurtového nápoje hrála nejv tší roli cena výrobku (42 % dotazovaných), a to jak u student , tak u senior . Za cenou následovaly faktory jako výrobce nebo obsah tuku ve výrobku.

b) Senzorický profil jogurtových nápojPanel hodnotitel byl rozd len na t i skupiny. Písmenem S byl ozna en panel senior ,

písmenem B panel student 1. ro níku bakalá ského studia a písmenem M studenti 1. ro níkumagisterského studia. Hodnotitelský panel S se skládal ze 32 hodnotitel , panel B byl složen z 60 hodnotitel a panel M m l 23 len .

Výsledky posouzení dvou jogurtových nápoj s p evažující jahodovou p íchutí jsou uvedeny v tabulce IV a na obrázku 1.

240

Tabulka IV Výsledky hodnocení jogurtových nápoj , pr m rné hodnoty v % Hodnotitelská skupina B M S Testované vzorky VZ 1 VZ 2 VZ 1 VZ 2 VZ 1 VZ 2 P íjemnost chuti 68 50 61 59 72 44 Konzistence 52 59 56 48 53 49 Intenzita sladké chuti 69 41 64 48 54 33 Intenzita kyselé chuti 23 53 32 54 29 44 Intenzita jahodové chuti 64 33 62 45 56 27 Intenzita v n 52 37 56 41 21 29 Tu nost 36 34 48 26 37 33

Výsledky hodnocení ukázaly, že všechny skupiny hodnotitel preferovaly vzorek více sladký, s výrazn jší jahodovou chutí (vzorek 1 - Activia). Ukázalo se, že kombinace p íchutí jahoda s kiwi byla kladn hodnocena kv li sv ží chuti a v ni exotického ovoce výrobku. Nejv tší rozdíly v hodnocení mezi skupinami hodnotitel byly pozorovány p i hodnocení intenzity v n . Vnímaná intenzita v n byla u senior výrazn nižší než u student . Pro tento parametr byly vypo tenyu jednotlivých skupin sm rodatné odchylky. Podle hodnot sm rodatných odchylek lze usoudit, jaká byla variabilita v hodnocení v každé testované skupin . Nejmenší sm rodatná odchylka byla vypo ítána pro skupinu hodnotitel typu S.

Hodnocení jogurtových nápoj - senio i

01020304050607080

p íjemnost chuti

konzistence vzorku

intenzita sladké chuti

intenzita kyselé chutiintenzita jahodové chuti

intenzita v n

tu ná chu

vzorek . 1 -Activia -Danonevzorek . 2 -Revital active

Obr. 1. Graf hodnocení jogurtových nápoj

241

Záv r:Senzoricky byly posuzovány vzorky jogurt s jahodovou p íchutí a vzorky jogurtových

nápoj s p evažující jahodovou chutí.Mezi testovanými vzorky jogurt nebyly obecn nalezeny veliké rozdíly. P i porovnání

celkové p íjemnosti chuti jogurt byl statisticky významný rozdíl zjišt n pouze mezi vzorkem nejlepším a vzorkem nejhorším, ostatní vzorky se v chutnosti vzájemn významn nelišily. Za nejchutn jší z testovaných byl považován vzorek Dobrá máma od firmy Danone. Tento jogurt byl hodnocen jako p im en hustý, s kousky ovoce, p íjemnou a p im enou (spíš nižší) intenzitou jahodové v n a chuti. Jogurt, který byl považován za nejmén chutný byl popisován jako hustý, p íliš sv tlý, s dosti vysokou intenzitou jahodové v n i chuti.

Ze senzorického hodnocení jogurtových nápoj vyplynulo, že hodnotitelé (všechny skupiny) preferovaly vzorek více sladký, s výrazn jší jahodovou chutí i v ní (vzorek 1 – Activia jahoda kiwi). P íchu kiwi dodávalo nápoji p íjemn nakyslou a osv žující chu .

Pod kování:Práce byla vytvo ena za podpory grantu MSM 6046137305.

Použitá literatura: 1. Thompson J. L., Lopetcharat K., Drake M. A. Preferences for Commercial Strawberry Yogurts among

Africa America, Caucasian, and Hispanic Consumers in the United States. Journal of Dairy Science(2007) 90:4974-4987.

2. Janhøj T. Sensory and Rheological Characterization of Acidified Milk Drinks. Food Hydrocolloids(2007), doi:10.1016/j.foodhyd.2007.03.006.

3. Barnes D.L., Harper S.J., Bodyfelt F.W., McDaniel M.R. Correlation of Descriptive and Consumer Panel Flavor Ratings for Commercial Prestirred Strawberry and Lemon Yogurts. Journal of Dairy Science(1991) 74:2089-2099.

Kontaktní adresa:Ing. Alena Šedivá, Ph.D., Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT v Praze, Technická 5, 166 28, Praha 6; alena.sediva@vscht.cz

242

SENZORICKÉ HODNOCENÍ SÝR A SÝROVÝCH ANALOGPanovská Zde ka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila

Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha

Sensory evaluation of cheeses and cheese analogues

Summary:The aim of the study was to compare sensory attributes of cheeses (with different fat content) with cheeses analogues. Cheeses analogues are made by using non dairy fats or proteins to produce a cheese like products. They are being used increasingly due to their cost effectiveness because milk ingredients are replaced by cheaper vegetable products. A panel of 35 assessors evaluated different sensory characteristics of these products. Sensory evaluation was performed by a Ranking Test and Sensory Profile Test which can explain the main differences in samples. Firstly four samples of processed cheeses were compared with cheeses analogue and then five samples of different processed cheese slices individually wrapped in plastic were evaluated. There were statistical significant differences among samples but there were not significant differences between the analogue Javor in term of pleasantness, sour or salty flavour and texture characteristics.

Úvod:Mezi oblíbené mlé né výrobky pat í v R tavené sýry, kterých se nap . v roce 2006

spot ebovalo zhruba 2,6 kilogramu na osobu ro n . Tavené sýry jsou oblíbené hlavn pro svou konzistenci, nebo se dají dob e roztírat, a dále také rozsáhlou škálou r zných p íchutí.

P i jejich výrob se za teploty 80-90°C zah ívá rozemletá sýrová hmota, k níž se p idávají tavicí soli, voda a p ípadn i chu ové p ísady. Pro výrobu je možné použít všechny druhy p írodních sýr a rozlišujeme zda se použije jenom jeden druh sýra pak vzniká tzv. tavený sýr druhový, nebo sm s tvrdých a m kkých sýr (p ípadn i tvarohu).

Na obalu výrobku je pak výrobce povinen seznámit spot ebitele se všemi užitými surovinami, jež jsou vyjmenovány sestupn podle jejich množství. Vždy je krom jiného uveden obsah sušiny (v %) a obsah tuku (v %) nebo obsah tuku v sušin (v %). Práv obsah tuku stále více zajímá i zákazníky. N kte í konzumenti se snaží vyhledávat výrobky s nižší energickou hodnotou, tzn. s nižším obsahem tuku. Na tyto požadavky reagovaly firmy tím, že se snaží vyráb t výrobky s r zným obsahem tuku a n které firmy tím, že vyvinuly výrobky, které by mohly sýry nahradit. Sýrové analogy, nebo také alternativní sýry neboli imitace sýr se nej ast ji vyráb jí z kasein(hlavní protein v kravském mléce), dále pak z rostlinného tuku, soli a vody. Mlé ná bílkovina m žebýt nahrazena rostlinnou (sója) anebo škroby. Technologie výroby analogových výrobk jsou r zné, n kdy velmi podobné technologiím výroby tradi ních mlé ných výrobk , jindy zcela odlišné. Nap . byla vyvinuta technologie výroby analog tj. výrobk vyráb ných rozpušt ním tuku, do kterého se p idá stabilizátor a voda, aby se vytvo ila emulze. Následn se p imíchává bílkovina, která pomáhá vytvo it texturu výrobku. Na záv r se p idává s l, aromatické látky a kyseliny. Prodej a výroba analog je celosv tovou záležitostí a sýrové analogy se velmi asto používají nap . u pizz a pizzových výrobk , jejichž nejdražší sou ástí je práv sýr. U t chto výrobk se také n kdyobjevují problémy s klamavým zna ením. Z platné potraviná ské legislativy jednozna n vyplývá, že v p ípad , kdy byla n která ze základních složek mléka (mlé ný tuk, mlé ná bílkovina, mlé nýcukr) nahrazena jinou nemlé nou složkou, nesmí být takovýto výrobek ozna ován za mlé nývýrobek, ale jedná se o náhražku/analog/imitaci. Výrobci to v tšinou eší tak, že slovo sýr na obalu vynechají a uvádí pouze jemný tavený atd. Spot ebitel, který není s touto problematikou seznámen, si v tšinou neuv domí, že nekupuje sýr.

Výzkum na analozích sýra vyrobených z r zných bílkovin a tuk ukázal, že celkové chemické složení je podobné plno- a nízko-tu ným pr myslov vyráb ným sýr m. Literatura uvádí, že sýrové analogy jsou snadno odlišitelné. Vzhledem k tomu, že mlé né výrobky mají charakteristickou mlé nou, smetanovou a sýrovou chu je pro výrobce analogu nejt žší zamaskovat p íchu po margarínech a zvýraznit jejich fádn jší chu . Problémy jsou v p ípad analog taky s texturními charakteristikami jako je konzistence, elasticita, drobivost apod.

243

Cíl práce: V senzorické laborato i p i Ústavu chemie a analýzy potravin byly skupinou zasv cených

posuzovatel porovnány organoleptické a texturní vlastnosti tavených sýr a tavených plátkových sýr s r zným obsahem tuku se sýrovými analogy. U všech výrobk byl porovnán senzorický profil, který zahrnoval hodnocení celkové p íjemnosti chuti a hodnocení díl ích chutí nap . slané, nasládlé, mlé né, máselné, smetanové, pal ivé, nakyslé, o íškové, žluklé a tu né. Výrobky byly také porovnány po adovou zkouškou.

Experiment:Panel 35 hodnotitel posuzoval organoleptické vlastnosti tavených a plátkových sýr

s r zným obsahem tuku se sýrovými analogy. Pro hodnocení celkové p íjemnosti chuti testovaných vzork byla použita po adová zkouška. Pro sledování díl ích smyslových vlastností vzork byl použit senzorický profil. Hodnocení bylo provedeno pomocí grafických nestrukturovaných stupnic 100 mm dlouhých orientovaných na obou koncích popisky a metodou volného slovního popisu.

P íprava senzorického hodnocení tavených sýr a sýrových analog

Tabulka I Testované vzorky tavených sýr a jejich analogu

Vorek Název Výrobce Složení Obsah tuku

1 Nízkotu nýtavený sýr

Pilos, vyrobeno v R pro LIDL

eská republika v.o.s.

voda, sýry, tvaroh, suš. syrovátka, máslo, tav. soli

(E450, E339), stabilizátor E407

tuk v sušin28 %, sušina 31 %, 645 kJ/ 155 kcal/100 g

2 Jemný tavený sýr

Pilos, vyrobeno v R pro LIDL

eská republika v.o.s.

voda, máslo, sýry, suš. mléko, mlé né bílkoviny, s l jedlá,

tavící soli (E452, E450, E331), stabilizátor E407, regulátor

kyselosti E330,

tuk v sušin53 %, sušina

41 %, 1080 kJ/ 260 kcal/

100 g

3

Maratonec Linie – tavený

nízkotu nýsýrový

výrobek,s vlákninou

TPK,spol. s r.o.

voda, sýry, tvaroh, suš. syrovátka, máslo, rozpustná

vláknina (3%), tavící soli (E331, E339, E450, E452),

stabilizátor karagenan

tuk v sušin26 %, 30 %

sušina, 568 kJ/ 137 kcal/

100 g

4 Javor jemný tavený

TPK,spol. s r.o.

voda, rostlinný tuk, sýry, suš. mléko, mlé né bílkoviny, tavicí soli (E452, E450), škrob, jedlá s l, stabilizátor E407, regulátor

kyselosti E330.,

tuk v sušin48 %, sušina

38 %, 960 kJ/230,8 k

cal/ 100 g

5

Nové Lipno smetanové smetanový roztíratelnátavený sýr

Madeta a.s.

sýry voda, smetana(10%), máslo tav.soli

(E339,E450,E452, suš. Syrovátka, suš. podmáslí,

kaseinát vápenatý

tuk v sušin45 %, sušina

38 %, 1130 kJ/270 k

cal/ 100 g

244

Tabulka II Testované vzorky tavených plátk a tavených plátkových sýr

Vzorek Zna ka Váha/cenaK Výrobce Obsah

tuku Složení

1 Apetitosingle 90 g/16,90

TPK,spol. s

r.o.

43 % tuku v sušin ,49 % sušina

odst ed né mléko, sýry, rostlinný tuk, suš. mléko, mlé né bílkoviny, tav. soli

(E331, E339, E452), modifikovaný bramborový škrob, ementálové aroma, stabilizátor E407, barvivo beta-karoten

2 Maratonec 144g /24,90 TPK,spol. s

r.o.

43 % tuku v sušin ,49 % sušina

voda, sýry ( edar 10%), rostlinný tuk, sušené mléko, mlé né bílkoviny, tavící soli (E452, E339, E331), škrob, sýrové aroma, stabilizátor E407, barvivo beta-

karoten

3Toast

tavený sýr plátkový

100 g/12,50 ACCOM

Czecha.s.

35 % tuku v sušin ,46 % sušina

p írodní sýry, voda, máslo, mlé nébílkoviny, sušená syrovátka,

bramborový škrob, tavící s l E331, jedlá s l, kys. citrónová E330, p írodní

aroma

4 Tavenéplátky 140 g

TPK,spol. s

r.o.

43 % tuk v

sušin ,48 % sušina

voda, sýry, rostlinný tuk, sušené mléko odtu n né, mlé né bílkoviny, tavící

soli (E331, E339, E452), škrob, stabilizátor E407

5 Apetitolinie 114 g/25,30

TPK,spol. s

r.o.

28 % tuk v

sušin ,44 % sušina

sýry, suš. mléko, máslo, odst ed né mléko, s l jedlá, tavící soli (E331,

E339, E452)

Výsledky: a) Senzorické hodnocení tavených sýr a sýrových analog

Panel 35 hodnotitel srovnával vlastnosti klasických tavených sýr s vlastnostmi sýrového analogu dostupného na našem trhu. P íjemnost chuti testovaných vzork byla zjiš ována jednak po adovou zkouškou a jednak pomocí grafické nestrukturované stupnice. Po adovou zkouškou bylo zjišt no, že mezi testovanými vzorky existují statisticky významné rozdíly v p íjemnosti chuti. Hodnotitel m nejvíce chutnaly vzorky 2 a 5. Nejh e byl hodnocen vzorek 3. Podobné výsledky byly získány i z hodnocení p íjemnosti chuti na grafické stupnici. Na grafických stupnicích byly hodnoceny rovn ž intenzity vybraných chutí a vybrané texturní parametry. Výsledky hodnocení jsou patrné na obrázku 1 a 2. Volným slovním popisem byly sledovány charakteristiky tavených sýr . Nej ast ji zmín né negativní charakteristiky jsou uvedeny v tabulce III.

245

Profil chuti tavených sýr

0102030405060nasládlá

slaná

mlé ná

máselná

pal ivá

smetanovánakysláo íšková

ho ká

žluklá

tu ná

tvarohovitá

cizí, netypická

vzorek 1vzorek 2vzorek 3vzorek 4vzorek 5

Obr. 1. Profil chuti tavených sýr a sýrových analog

Vybané vlastnosti hodnocené u tavených sýr

0

20

40

60

80celková p íjemnost chuti

krájení sýra

lepivost na n ž

roztíratelnost sýra

vzorek 1vzorek 2vzorek 3vzorek 4vzorek 5

Obr. 2. Vybrané vlastnosti tavených sýr a sýrových analog

246

Tabulka IIINegativní charakteristiky u testovaných vzork tavených sýr a sýrových analog

Ozna ení vzork Nej etn ji zmi ované charakteristiky

vzorek 1 velmi m kký a hrudkovitý

vzorek 2 lepivý, tužší

vzorek 3 nejtužší, mou natý, hrudkovitý

vzorek 4 lepivý, mazlavý, velmi m kký

vzorek 5 tužší, bez výrazných vad

b) Senzorické hodnocení tavených plátkových sýr a tavených plátkP íjemnost chuti tavených plátk byla hodnocena op t po adovou zkouškou. Bylo zjišt no,

že mezi testovanými vzorky 1 a 3 a 3 a 5 existují statisticky významné rozdíly v p íjemnosti chuti. Za velmi chutné byly považovány vzorky 1 a 5, za nejmén chutný vzorek 3. Díl í vlastnosti plátkbyly hodnoceny pomocí 100 mm grafických nestrukturovaných stupnic. Výsledky hodnocení jsou znázorn ny na obrázku 3. P i sledování smyslových vlastností tavených plátk byla využity rovn žmetoda volného slovního popisu. Nej ast ji zmín né negativní charakteristiky jednotlivých vzorkjsou uvedeny v tabulce IV. Vzorky 1 (Apetito single) a 5 (Apetito linie) byly hodnoceny jako vzorky se smetanovou chutí, p ipomínající chu sýru. Vzorek 3 (Toast tavený sýr plátkový) m lnevyhovující texturu a byla u n j rovn ž nalezena netypická chu .

Profil tavených plátk

0

10

20

30

40

50

60nasládlá

slaná

mlé ná

máselná

pal ivá

smetanová

nakysláo íšková

ho ká

žluklá

tu ná

tvarohovitá

cizí, netypická

vzorek 1vzorek 2vzorek 3vzorek 4vzorek 5

Obr. 3. Senzorický profil tavených plátk a tavených plátkových sýr

247

Tabulka IV Nej ast ji zmín né negativní charakteristiky u tavených plátk a tavených plátkových sýr

Ozna ení vzork Nej etn ji zmi ované charakteristiky

vzorek 1 lepivý, p íliš kyselý, mou natý, p íliš žlutá barva

vzorek 2 tuhý, tvarohovitý, kyselý

vzorek 3 lepivý, p íliš m kký, mou natý, cizí pachu

vzorek 4 nevýrazná chu

vzorek 5 tužší, gumovitý

Záv r:Zkoumaný vzorek analogu taveného sýru Javor se v celé ad testovaných parametr

významn nelišil od klasických tavených sýr . Ur ité rozdíly byly pozorovány v textu e tohoto výrobku. Za negativní byla považována jeho mazlavá, lepivá a velmi m kká konzistence. Za nejhorší ze skupiny tavených sýr byl považován vzorek 3. Nejedná se o klasický tavený sýr, nýbrž o tavený sýr s vlákninou. Jeho negativní hodnocení vyplývá pravd podobn z p ídavku vlákniny, která tomuto výrobku dodává specifickou netypickou chu i texturu.

V p ípad tavených plátk byly sýrové analogy hodnoceny pozitivn . Hodnotitelé jsou totiž v tomto p ípad zvyklí na chu a texturu sýrových analog , které jsou v tržní síti mnohem ast ji zastoupeny než tavené plátkové sýry. I když je v literatu e asto zmi ováno, že texturní

vlastnosti sýrových analog jsou horší než u sýr , naše studie to neprokázala.

Pod kování:Práce byla vytvo ena za podpory grantu MSM 6046137305.

Použitá literatura:1. Bachman, H.P. 2001. Cheese analogues: a review. International Dairy Journal 11: 505-515 2. Muir, D.D., Tamime, A.Y., Shenana, M.E., Dawood, A.H. 1999. Processed Cheese Analogues

Incorporating Fat-Substitutes 1. Composition, Microbiological Quality and Flavour Changes During Storage at 5°C. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 32: 41-49

3. http://www.viotros.gr/home.htm (internet, nalezeno 28.8.2007) 4. http://data.idnes.cz/soubory/test/A051104_PLZ_EIDAM.HTM (internet, nalezeno 28.8.2007) 5. http://www.szpi.gov.cz/cze/pristupy/stanoviska/article.asp?id=59917&cat=2488&ts=2ec3

(internet, nalezeno 29.8.2007) 6. http://www.tpk.cz/?menu_page=3&menu_parent=1&menu_lang=cz&menu_id=124 (internet,

nalezeno 29.8.2007)

Kontaktní adresa:Dr. Ing. Zde ka Panovská, Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT v Praze, Technická 5, 166 28, Praha 6; zdenka.panovska@vscht.cz

248

VYUŽITÍ SPEKTROMETRIE PRO HODNOCENÍ BARVY MLÉ NÝCH VÝROBKB enek Petr, J zl Miroslav ,Šustová Kv toslava

Ústav technologie potravin, MZLU v Brn

Spectrometric analysing of colour of some dairy products

Summary:Aim of this study was find out a new possibilities of spectrometric analysing of colour. In this part of study we compared a few groups of fats- butter, vegetable fats and butterine. At the beginning we had to create new methods to preparing samples. Subsequently it was analysed in L*a*b* colour system. Statistically, significant diferences were found beetwen each group of fat.

Úvod

Tak jako se otevírají hranice stát tak se prolínají sv tové trhy. Celý sv t je globalizován. Pr m rná potravina putuje ke svému pr m rnému konzumentu v pr m ru asi 2500 km. eho je nadbytek, pop ípad co umíme vyrobit levn exportujeme do zahrani í, naopak co schází na tuzemském trhu není problém dovést odjinud. Práv tato výhoda relativn volného trhu v sob skýta nejedno úskalí. Velmi se rozší il sortiment potravin. S nárustem sortimentu narostla i konkurence a mnozí producenti se uchylují k tzv. klamání spot ebitele, kdy potravina nebo její složení je v rozporu s legislativními požadavky na senzorickou, nutri ní a hygienickou kvalitu. Je proto v nována velká pozornost vývoji nových metod pro posouzení kvality potravin. Ideální metoda je rychlá, relativn levná a není k jejímu provedení zapot ebí specieln vyškolený personál. Jednou z t chto metod se jeví vyhodnocování vlastností potraviny na základ spektrofotometrického posouzení barvy. V rámci našeho projektu jsme se snažili vytvo it metodiky pro hodnocení barvy u vybraných mlé ných výrobk a následn potvrdit hypotézu, zda se dají na základ barevnosti od sebe rozpoznat jednotlivé skupiny výrobk jako jsou máslo erstvé, máslo stolní, sm sné tuky a rostlinné tuky.

M ení barvy

Výraz barva je pojmem velmi mnohozna ným, jeho význam je spojován nej ast jis psychosenzorickým vnímáním, který zprost edkovává lidské oko. Pojem barva se tak p enáší i na vlastnost sv tla. Ovšem barva není totéž co sv tlo. Sv tlo je sou ástí mnoha druh zá ení, která dohromady vytvá í elektromagnetické spektrum. Nelze p esn ur it hranice, kde ur itá oblast elektromagnetického zá ení za íná a kon í.

Viditelné zá ení zabírá oblast mezi 720-380 nm a d lí na sv tlo ervené barvy (720-627nm), oranžové barvy(627-589nm), zelené barvy (566-495nm), modré barvy (495-436nm) a fialové barvy (436-380nm). Barvu samotnou ur uje jas, odstín a sytost.

Všechny barvy lze rozd lit na chromatické a achromatické. K achromatickým pat í erná,šedá a bílá, jejich spektrální pr b h má podobu p ímky. Chromatické barvy mají naopak spektrum charakteru k ivky s jedním nebo více vrcholy a lze je dále rozd lit na jednoduché a složené. Jednoduché (monochromatické) jsou vyvolány zá ením jedné vlnové délky. Naopak složené chromatické barvy mají pr b h p es více vlnových délek. Spektrálním záznamem, který charakterizuje ur itou barvu, v našem p ípad p i sledování odrazu, je remisní k ivka (remisní spektrum).

Pokusy o numerické popsání barvy se datují již do dob Issaca Nevtona (1642-1727). Jako základ moderního m ení lze ale datovat až rok 1924, kdy byla CIE ustanovena pracovní skupina pro kolorimetrii. Základem objektivního m ení bylo definování t í základních faktor : zdroj sv tla, pozorovaný p edm t a pozorovatel. P i zm n jedné z t chto t í komponent se zm ní i celkový

249

barevný dojem. Jedním z ady výsledk bylo i vytvo ení jednotného barevného prostoru X,Y,Z jakožto základ systému CIELab (L*a*b*) Barevný prostor L*a*b* je jedním z ne ast ji používaných barevných prostor pro m ení barvy nap í všemi odv tvími..Hodnota L* ozna uje jas a hodnoty a*,b* jsou sou adnice barevnosti v chromatickém diagramu. V tomto diagramu hodnota +a* ozna uje sm r do ervena, -a* je sm rdo zelena,+b* je sm r do žluta a -b* je sm r do modra. St ed je achromatický, jestliže se hodnoty a*a b* vzdalují od st edu roste sytost barvy.

Materiál a metody

Prom eny byly krom dvou druh stolního a dvou druh erstvého másla také dva druhy ztužených rostlinných tuk a jeden druh sm sného tuku. Od každého druhu byly prom eny ty ivzorky v p ti opakováních.

Obr.2 Prostorové znázorn ní L*a*b* systému

Optický systém spektrofotometru využívá dif zní osv tlení a odražené sv tlo je m eno pod úhlem 8°(d/8) s využitím funkce SCE (Specular Component Excluded) sv telné pasti pro eliminaci zrcadlového lesku. Pr m r šterbiny je 30mm. P ístrojem je prom eno celé viditelné spektrum, tj. od 380-780nm a barva je pak definována vedle numerických dat i remisním spektrem v L*a*b* barevném prostoru.

M ení

Vzorky byly p ipraveny z materiálu vychlazeného na teplotu v rozmezí 4-8°C, zvláštz d vodu snadn jší manipulace. Samotné m ení pak probíhalo p i b žné laboratorní teplot .Velikost vzorku musí být dosta ující pro p ekrytí št rbiny spektrofotometru. Na p esné tlouš cevzorku nezáleží. Potvrdily to pokusné m ení v rámci hledání správného metodického postupu m ení a p ípravy vzork .

Tabulka I. Tabulka pr m r nam ených hodnot:

pr m ry

Vzorek L* a* b* 1 89,0415 5,6465 34,3715 2 90,3880 3,1025 26,5860 3 91,3295 3,0070 24,3175 4 91,1815 4,3750 28,4290 5 91,2165 4,2840 28,5295 6 91,3790 2,8550 25,1225 7 91,7300 2,4350 23,9750

Mnohonásobné porovnávání skupin produkt je statisticky vysoce pr kazné (P<0,01) pouze pro hodnoty a*. Nejvyššího pr m ru dosáhla skupina sm sných tuk (a*= 5,65 ± 0,05), naopak nejnižší vykazovala skupina stolních másel (a*= 2,77 ± 0,35) viz graf níže. Práv tato ástremisního spektra se tedy jeví jako zásadní pro posuzování p vodu tuku v produktech.

250

0,0000

1,0000

2,0000

3,0000

4,0000

5,0000

6,0000

1 2 3 4 5 6 7

skupiny výrobk

a (-)

Graf I. Graf a* hodnot (-) pro jednotlivé skupiny (sk.1- sm sné tuky, sk.2,3- erstvé máslo, sk.4,5-rostlinné tuky, sk.6,7- stolní máslo)

Záv r

M ení potvrdilo základní hypotézu, že tyto produkty s rozdílným p vodem tuku, pop . jeho skladováním lze od sebe rozeznat na základ hodnocení barvy. Ovšem na základ hodnocení barvy spektrofotometricky, nebo zde, na rozdíl od kolorimetrických metod, se jasn dokázala d ležitost m ení celého remisního spektra. A koli se produkty b žnému spot ebiteli jeví v r zné mí e a sytosti jako žluté, jejich charakteristická oblast zá ení, podle které je lze od sebe rozd lit,je oblast erveného sv tla. Toto zjišt ní by mohlo v budoucnu najít uplatn ní v kontrolních metodách

dozor ích orgán . Nakalibrovaný p enosný spektrofotometr by byl schopen ihned ur it p vod tuku v produktek ve spot ebitelské síti.

Dalším cíle zkoumání se sm ují dv ma sm ry: jednak je to rozší ení hodnocení t chto produkt a vlivy , které je ovliv ují - tj. zm na barvy v závislosti na dob skladování, sezónní zm ny v barevnosti mlé ného tuku v závislosti na krmení skotu aj. Druhým sm rem je pak ov itzda lze po p edchozím nakalibrování ur it z barvy i p ípadné složení produktu a to zejména pom rvody a mlé ného tuku u másla.

Použitá literatura:1. VIK, M.,Základy m ení barevnosti, I.díl, Skriptum TU Liberec 1995 2. VIK, M.,M ení barevnosti a vzhledu- barevnostní odchylky, TU Liberec 2002 3. DUFEK, J. Biometrika. VŠZ v Brn , 1992

Kontaktní adresa:Ing.Petr B enek,Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn ,Zem d lská 1, 613 00 Brno, xbrenek@seznam.cz

251

HODNOCENÍ REOLOGICKÝCH VLASTNOSTÍ EIDAMSKÝCH SÝRLužová Tá a, Šustová Kv toslava, Povolná Šárka, Nedomová Šárka, Blašková Veronika

Ústav technologie potravin, MZLU v Brn

The evaluation of rheological qualities of Edam cheeses

Summary:For analysis were used Edam cheeses (30% and 45% fat) during 6 months of ripening. The cheeses were made in two dairies (A, B) with two different started cultures (LL, YY). The compression test of instrument TIRA test 27025 were use for evaluation texture qualities. It was found that the most decrease of the force needed for compression of the sample was after three months of ripening in both cheeses with 30% and 45% w/w fat from producer A. Both cheeses from producer B were less firm after 6 months of ripening than after 3 months. The instrument TIRA test 27025 was able to intercept differences between started cultures (LL, YY) even sensory analyse could not.

ÚvodDoba zrání se pohybuje podle druhu a velikosti sýra a je rozhodujícím faktorem jakosti

sýr (ZIMÁK, 1998). Zatímco v eské republice jsou b žn distribuovány sýry staré jen n koliktýdn , pro plné rozvinutí požadovaných senzorických znak je nutné sýry eidamského typu nechat zrát alespo 40 dní (BERTOLA et al., 2000). Zrání eidamských sýr se p evážn zú ast ujíbakterie eledi Lactobacteriaceae, a asto jsou p ítomny bakterie eledi Bacillaceae, v n kterýchp ípadech eledi Bacteriaceae, ojedin le n které druhy kvasinek a plísní (OLŠANSKÝ, KN Z,1971). Nevýhodou delšího prozrávání pro výrobce je, že dlouhodob jším zráním se zvyšuje cena sýr , protože vzr stají náklady na temperaci zracích sklep a prodlužuje se také doba, za kterou se produkty dostanou do ob hu a vklady se navrátí výrobci. Na druhou stranu sýry získávají výrazn jšísenzorické vlastnosti a jejich textura je spot ebitelem lépe p ijímána (YATES a DRAKE, 2007).

Cílem projektu bylo zhodnotit zm ny konzisten ních vlastností sýr Eidamského typu v pr b hu 6 m síc zrání vzhledem k typu použité startovací kultury a r znému obsahu tuku v sušin sýra na p ístroji Tira-test a ur it optimální délku zrání sýr Eidamského typu vzhledem k jejich konzistenci.

MateriálK analýze byly použity vzorky eidamských sýr s 30% a 45% tuku v sušin v pr b hu

5 m sí ního zrání. Hodnotily se dv skupiny sýr , které byly vyrobeny v mlékárnách A, B za použití dvou r zných startovacích kultur (LL, YY). Zvláš se hodnotil okraj a st ed sýr . Sýry zrály za standardních podmínek ve zracích sklepech mlékáren, p i emž testovány byly každý m síc v laborato ích ústavu technologie potravin MZLU.

MetodyK hodnocení texturních vlastností kompresním testem bylo použito p ístroje TIRA test

27025. Ze sýr byly p ipraveny válcovité vzorky (pr m r 20 mm, výška 11 mm) pomocí korkovrtu z 11 mm plátku sýra. Vzorek byl stla ován mezi dv ma deskami konstantní rychlostí p i m enípr b hu síly. Tento proces je napodobením skousnutí vzorku na stoli kách. P i m ení byla zaznamenána závislost síly pot ebné ke kompresi vzorku v ase.

Výsledky analýz byly hodnoceny programem Unistat 4.53 a Microsoft Excel 2000. Rozdíly mezi sledovanými parametry byly testovány Tukeovým HSD testem.

Výsledky a diskuseU eidamského sýra o 30 % tu nosti z mlékárny A obou startovacích kultur je v prvním

m síci zrání vysoký rozdíl mezi tvrdostí st edové a okrajové ásti sýra (vetší síla byla pot eba na stla ení okraje). V druhém m síci zrání již neexistoval statisticky pr kazný rozdíl mezi okrajem a st edem sýra, ani mezi kulturou YY a LL (tab. I a II).

252

Tabulka I Síla (N) pot ebná ke stla ení vzorku 30% sýr mlékárny A b hem zrání

Tabulka II Rozdíl mezi tvrdostí na okraji a ve st edu sýr u mlékárny A s 30% obsahem tuku v sušinvyrobených se zákysovou kulturou LL a YY (mnohonásobné porovnání Tukeovým HSD testem , * statisticky pr kazný rozdíl P 0,05, ** vysoce statisticky pr kazný rozdíl P 0,01) rozdíl okraj st ed

1 - sýr mlékárny A 30% YY st ed, 2 - sýr mlékárny A 30% YY okraj,3 - sýr mlékárny A 30% LL st ed, 4 - sýr mlékárny A 30% LL okraj

Nejlépe prozrálé z pohledu textury byly sýry p i m ení ve t etím m síci zrání, kdy hodnoty stla ování dosahovaly minimálních hodnot. Z hlediska textury byly v této fázi sýry nejvíce p ijatelné pro konzumenty. Po této dob se tvrdost op t zvyšuje, p i emž statisticky vysoce pr kazné diference byly zaznamenány v pátém m síci zrání (vzorek 3).

Obdobná situace je u sýr s 45 % tuku v sušin od mlékárny A. Textura se první dva m síce výrazn m ní, tvrdost sýra je prom nlivá. Nebyly prokázány rozdíly mezi okrajem a st edem,ale existují statisticky vysoce pr kazné rozdíly mezi prozráváním sýr se startovací kulturou YY a LL. Pevn jší texturu m l sýr vyráb ný startovací kulturou YY (tab. III). Výrazný pokles kompresní síly nastává mezi druhým a t etím m sícem zrání. Celá hmota obou sýr je homogenní, sýr tedy prozrál a má pro spot ebitele p ijatelné senzorické vlastnosti. V dalších fázích zrání je op tzaznamenáno zvýšení tvrdosti eidam . Po 4 m sících zrání se objevuje statisticky vysoce pr kazný rozdíl mezi sýry s odlišnou zákysovou kulturou, p i emž kultura YY je tvrdší než kultura LL, jak vyplývá z tab. III. Tento trend je zachován i v následujících m sících.

zrání v m sících 30% YY st ed 30% YY okraj 30% LL st ed 30% LL okraj0 39.04 62.73 30.53 57.231 32.37 68.03 40.71 75.592 50.56 49.08 52.95 59.053 30.96 34.88 37.70 34.684 37.23 37.95 44.68 36.795 32.62 29.73 43.14 33.546 43.73 39.68 50.37 40.77

1 m síc zrání 1 2 3 41 ** **2 ** **3 **4 ** **

2 m síce zrání 1 2 3 41234

5 m síc zrání 1 2 3 41 **2 **3 ** ** **4 **

253

Tabulka III Síla (N) pot ebná ke stla ení vzorku 45% sýr mlékárny A b hem zrání

Texturní vlastnosti odlišné od všech ostatních zkoušených sýr vykazovaly 30% eidamy mlékárny B (tab. IV) obou startovacích kultur. Jejich textura byla výrazn tvrdší, dokonce i po 3 m sících zrání. Ostatní sýry byly již dostate n prozrálé, avšak tyto sýry m ly tvrdost tém dvakrát vyšší s vysokou statistickou pr kazností. V rámci jednotlivých vzork t chto typ sýra bylo zjišt no, že se b hem prvních dvou m síc ustalovaly vlastnosti a za p ibližn 3 m síce již neexistoval statisticky pr kazný rozdíl mezi st edem a okrajem sýr a mezi sýry se startovací kulturou YY a LL. U t chto sýr ovšem dále nastávaly texturní zm ny, patrné obzvláštpo 6 m sících zrací doby, kdy m ly sýry statisticky pr kazn m k í konzistenci než ve t etím m síci zrání.

Tabulka IV Síla (N) pot ebná ke stla ení vzorku 30% sýr mlékárny B b hem zrání

Eidamy o obsahu 45% tuku v sušin vyrobené producentem B m ly velmi malou tvrdost od po átku do konce zrací doby (tab. V).

Tabulka V Síla (N) pot ebná ke stla ení vzorku 30% sýr mlékárny B b hem zrání

zrání v m sících 30% YY st ed 30% YY okraj 30% LL st ed 30% LL okraj0 32,89 56,72 21,29 42,091 43,46 66,81 30,63 45,492 63,23 59,73 48,00 42,693 36,51 33,39 33,83 26,924 44,58 40,60 33,61 25,005 42,22 35,99 33,84 26,806 47,36 37,81 34,20 27,01

zrání v m sících 30% YY st ed 30% YY okraj 30% LL st ed 30% LL okraj0 32.82 57.24 35.36 56.901 77.13 85.70 75.03 91.302 82.00 81.93 69.07 71.503 56.42 62.29 58.17 57.084 80.36 70.54 65.85 65.875 60.60 63.91 61.26 57.006 57.64 49.10 51.29 45.44

zrání v m sících 30% YY st ed 30% YY okraj 30% LL st ed 30% LL okraj0 29.43 42.36 25.16 33.231 38.65 61.79 33.62 48.332 42.87 41.19 42.18 39.793 32.51 29.49 35.49 32.274 40.57 35.2 35.15 32.765 36.83 34.49 30.95 33.566 25.71 19.16 27,12 23.95

254

Již v druhém m síci byly sýry texturn homogenní, nebyl tedy patrný statisticky pr kaznýrozdíl mezi st edem a okrajem sýra a také nebyl pozorovatelný vliv zákysové kultury na reologické vlastnosti (tab.VI). Sýry prozrály již za dva m síce. V šestém m síci zrací doby sýry dosáhly nejnižší úrovn tvrdosti ze všech m ení provedených b hem studie.

Tabulka VI Rozdíl mezi tvrdostí na okraji a ve st edu sýr u mlékárny B s 45% obsahem tuku v sušinvyrobených se zákysovou kulturou LL a YY (mnohonásobné porovnání Tukeovým HSD testem , * statisticky pr kazný rozdíl P 0,05, ** vysoce statisticky pr kazný rozdíl P 0,01)) rozdíl okraj st ed

13 - sýr mlékárny B 30% YY st ed, 14 - sýr mlékárny B 30% YY okraj, 15 - sýr mlékárny B 30% LL st ed, 16 - sýr mlékárny B 30% LL okraj

Naše výsledky jsou shodné s výsledky KUBIŠE et al. (2001), kte í uvádí p edevším u eidamu s 45% tuku v sušin se zvyšování elasticita a stla itelnost vzorku v pr b hu zrání.

Záv rV práci byly hodnoceny sýry eidamského typu o obsahu 30% a 45% tuku v sušin

vyrobených dv ma mlékárnami (A, B) za použití dvou r zných startovacích kultur YYa LL b hem šesti m síc zrání. Byl porovnáván vliv zrání na texturu eidamu k ur ení optimální doby zrání. Textura sýr byla analyzována kompresním testem za použití p ístroje TIRA test 27025.

Souhrnn výsledky potvrdily, že doba zrání m la výrazný vliv na reologické vlastnosti eidamských sýr . Zlepšení textury souviselo se zvyšující se dobou zrání. Bylo zjišt no, že nejv tšípokles síly pot ebné ke stla ení vzorku sýra nastal po 3 m sících zrání u sýr od producenta A u sýr s tu ností 30% i 45%. U obou sýr z mlékárny B byl zaznamenána nižší tvrdost po 6 m sících zrání než po 3 m sí ní dob . Statisticky pr kazné byly rozdíly mezi tvrdostí sýrs použitím rozdílných kultur, i když senzorická analýza tento rozdíl nezaznamenala. T mito výsledky se potvrdila vhodnost zvolené metodiky m ení tvrdosti sýr p ístrojem Tira-test 27025.

Z porovnání výsledk se záv ry jiných autor lze usoudit, že je nevhodné uvád t na trh eidamské sýry o tu nosti 30% i 45% d íve než t i m síce po výrob . Do této doby nejsou uniformní texturní vlastnosti výrobku a není možné zaru it stálou kvalitu. Teprve po cca 90 dnech zrání je textura z pohledu spot ebitele nejvhodn jší ke konzumaci.

1 m síc zrání 13 14 15 1613 **14 ** **15 **16

2 m síce zrání 13 14 15 1613141516

255

Použitá literatura:

1. ZIMÁK, E. Technologie pro 4. ro ník SPŠ studijního oboru zpracování mléka. Praha: SNTL, 1998, 363 2. BERTOLA, N. C., CALIFANO, A. N.,. BEVILACQUA, A. E, ZARITZKY, N. E.: Effects of ripening

conditions on the texture of Gouda Cheese, Journal of Food Science and Technology 2000, 35: 207–214. 3. OLŠANSKÝ, ., KN Z, V. Výroba tvrdých sýr eidamského a ementálského typu. AZ-VÚPP,

Praha, 1971, 289s. 4. YATES, M.D., DRAKE, M.A. Texture Properties of Gouda Cheese, Journal of Sensory Studies, 2007,

22, 493–506 5. DUFEK, J. Biometrika. VŠZ v Brn , 1992, 152s. 6. KUBIŠ I., K IVÁNEK I., GAJD ŠEK S. The relationships between the chemical, dielectric and

sensory properties of Edam cheese during ripening. Czech J. Food Sci., 2001a, 19, 3, p. 85-89 , ISSN 1212-1800

Kontaktní adresa:Ing. Tá a Lužová, Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno, Tana.Luzova@centrum.cz

256

MOŽNOSTI VYUŽITÍ NÍZKOESTERIFIKOVANÉHO PEKTINU JAKO SUBSTITUENTU FOSFÁTOVÝCH TAVICÍCH SOLÍ VE VÝROB TAVENÝCH SÝR

erníková Michaela 1), Bu ka František 1), Pospiech Matej 2), Tremlová Bohuslava 2),Pavlínek Vladimír 3), B ezina Pavel 1)

1) Ústav potraviná ského inženýrství, FT UTB ve Zlín , 2) Ústav vegetabilních potravin a rostlinné produkce, FVHE VFU Brno, 3) Centrum polymerních materiál FT UTB ve Zlín

Possibilities usage low-esterify pectin as a substituent phosphates emulsifying salts in production processed

Summary:Processed cheese with addition of phosphate emulsifying agents shows typical consistence properties, especially spreadability. Chelating ability of phosphate emulsifying agents causes low calcium bioavailability from processed cheeses in human diet. This work is focused on a possibility to replace phosphate emulsifying agent types by other substance in production of processed cheeses. Low-esterificated pectin was used at the first part of experiments. In next phase, lecithin was added as emulsifier to improve emulsification system. Main attention was paid to homogeneity of prepared process cheese samples investigation. The transverse cut of the product (cca 1.2 cm) was divided into layers (2 – 5), properties of which were further evaluated by dynamic oscillatory rheometry and image analysis. Results showed that it is possible to prepare processed cheese without addition of emulsifying agents, however homogeneity of products is still limited for industrial application.

ÚvodTavené sýry se svou spot ebou v eské republice adí k hojn konzumovaným potravinám.

Vyráb ny jsou z p írodních sýr , másla, pitné vody a tavicích solí. P i výrob se dále mohou používat i suroviny jako tvaroh, sušené odst ed né mléko, zelenina, masné výrobky, ko ení,p íchut apod. V procesu výroby se sm s surovin za mírného podtlaku zah ívá a míchá do vytvo ení homogenní hmoty, která se plní do obal 1,2. Legislativa eské republiky rozumí pod pojmem tavený sýr, sýr, který byl tepeln upraven za p ídavku tavicích solí3.

Literatura uvádí, že pokud by se tavicí soli p i výrob tavených sýr nepoužily, došlo by k rozd lení systému na t i nemísitelné fáze – vysráženou bílkovinu na dn nádoby, st ední vodnou fázi a povrchovou tukovou vrstvu. Tavicí soli jsou p i výrob tavených sýr d ležité pro odšt pení kalcia z proteinového systému p írodních sýr , dále pro peptizaci, hydrataci, botnání, rozpustnost a dispergaci protein . P i výrob se odd luje volný tuk, který je reemulgován práv prost ednictvímp idaných tavicích solí, které vlivem teploty zp sobují r st emulga ních vlastností mlé nýchprotein 4. Vápenaté ionty vázané na karboxylové skupiny kyselých aminokyselin anebo na fosfoserylové zbytky jsou p i tavení nahrazovány ionty sodnými, ímž se p vodn nerozpustný parakaseinan vápenatý p írodního sýru m ní na rozpustn jší parakaseinan sodný v sýru taveném. Nej ast ji se používají fosfátové a polyfosfátové eventueln citrátové tavicí soli. Fosfáty jsou soli obsahující (PO4)3-aniont, odvozují se od kyseliny trihydrogenfosfore né a existují ve formmonomer , dimer i polymer , p i emž s rostoucí délkou et zce fosfát roste jejich afinita k vápenatým iont m a tudíž peptizace kaseinu. Klesá však jejich pufra ní kapacita5,6. Na stabilitu a konzistenci výrobku mají vliv též emulga ní a stabiliza ní inidla7.

Sýry p edevším p írodní jsou pro lov ka bohatým zdrojem vápníku. Samotná p ítomnostvápníku je d ležitá, nemén d ležitý je ovšem pom r vápník:fosfor v p ijímané potravin .Optimální pom r Ca:P v potrav konzumované lov kem je 1:1. V tavených sýrech se díky p ítomnosti fosfátových a polyfosfátových tavicích solí m ní pom r Ca:P ve prosp ch fosforu a dosahuje hodnot 1:1,8-3,5. Vyšší obsah fosforu resp. fosfát , zp sobuje snížení využitelnosti vápníku z tavených sýr . Proto jsou lepším zdrojem vápníku nap . mléko a p írodní sýry. Pluta et al.8 uvádí možnost nahrazení fosfátových tavicích solí p i výrob tavených sýr hydrokoloidy - nízkometylovanými pektiny, modifikovanými škroby, xantanem, guarovou a lokustovou gumou.

Hydrokoloidy se v potraviná ství používají jako zahuš ovadla, stabilizátory, gelující inidla, dále pro zlepšení strukturních a texturních vlastností potravin. Hydrokoloidy používané

257

v potraviná ství se adí mezi dv skupiny biopolymer - polysacharidy a proteiny9. Jedním z b žnpoužívaných hydrokoloid je i pektin. Pektiny pat í mezi vysokomolekulární heteropolysacharidy, jejichž základní stavební jednotku tvo í nejmén z 65 % hmotnosti kyselina -D-galakturonová vázaná (1,4) glykosidickou vazbou. Karboxylová skupina kyseliny galakturonové se vyskytuje ve form volné (nebo jako s l sodná, draselná, vápenatá nebo amonná), ve form amidu nebo m žebýt v r zné mí e esterifikována metylovou skupinou10,11. Podle podílu metylových skupin lze pektiny d lit na vysoko- a nízkoesterifikované. Nedosahuje-li po et metylových skupin 50 % hovo íse o nízkometylovaném pektinu12. Reaktivita k vápníku je dána pom rem a uspo ádáním karboxylových skupin v pektinovém et zci, p i emž vzr stá se snižujícím se stupn m esterifikace. Tvorba gelu nízkometylovaným pektinem je dána p edevším interakcí pektinu s vápenatými ionty, p i emž velmi d ležitá je nejen koncentrace, ale také dostupnost kalciových iont 12. Nutnou p ítomnost vápenatých iont z technologického hlediska pro tvorbu stabilního gelu (interakce protein-polysacharid) potvrzuje i práce Matia-Merino et al.13.

Gelace je snazší se vzr stající rozpustností pektinu, ale snižována se vzr stajícím pH. Nízkometylované pektiny tvo í gel v kyselé nebo slab kyselé oblasti pH. Maroziene & de Kruif14

uvádí, že pektin neadsorbuje na kaseinové micely p i pH 6,7 p i experimentech provád nýchv odst ed ném mléce. P i velmi nízkém pH (pH < 2) se adsorpce pektinu na kaseinové micely také výrazn snižuje. Optimální pH pro adsorpci pektinu na kaseinové micely se obecn pohybuje v rozmezí 2,0 až 5,0.

Lecitin pat í mezi fosfolipidy, deriváty fosfatidylu jejichž základem je 1,2-diacylglycerol, v n mž je na t etím uhlíku vázána kyselina fosfore ná12. V potravinách se používá jako emulgátor, který je schopen díky svému negativn nabitému et zci tvo it b hem homogenizace malé olejové kapi ky15. Drobn jší tukové kuli ky pak z proteinové nebo protein-polysacharidové matrice vyvstávají pomaleji než v tší tukové kuli ky a výrobek se stává homogenn jší v celém svém objemu.

Cílem práce bylo využití nízkometylovaného pektinu jako možné náhrady tavicích solí p i výrob tavených sýr . Pro zvýšení emulga ní schopnosti systému se pektin používal v kombinaci s lecitinem. U modelových vzork byla r znými metodami studována p edevším homogenita výrobku.

Materiál a metodikaTavené sýry s obsahem 40 % (w/w) sušiny a 45 % (w/w) tuku v sušin byly vyráb ny

na p ístroji Vorwerk Thermomix TM 31-1 blender cooker (Vorwerk & Co. Thermomix; N mecko). Obdobné za ízení již bylo námi pro výrobu tavených sýr použito16. K výrob modelových tavených sýr se používaly následující suroviny: eidamská cihla (30 % w/w tuku v sušin ), máslo, deionizovaná voda a p ídatné látky - pektin (Sigma Aldrich, USA) v koncentraci 0,1 % w/w a lecitin (Lucas Mayer, USA) v koncentracích 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 a 1,0 % w/w. Koncentrace pektinu 0,1 % w/w byla stanovena na základ p edcházejících experiment 17. Kontrolní vzorek byl vyroben standardn tj. s p ídavkem 2 % (w/w) fosfátových tavicích solí. Do modelových vzork se místo tavicích solí p idávaly kombinace pektinu a lecitinu ve výše zn ných koncentracích. Modelové vzorky se tavily p i 90°C s výdrží jedné minuty, p i emž celková doba tavení byla 10-13 minut. Vyrobeno tak bylo šest šarží modelových vzork ve dvou opakováních. Po výrob byly modelové vzorky zchlazeny a skladovány p i teplot 6±2 °C. Sloupec (p í ný ez) výrobku (cca 1,2 cm) byl rozd len na n kolik vrstev - 2 pro reometrii a 5 pro obrazovou analýzu. Jednotlivé vrstvy byly následn analyzovány a srovnávány pomocí senzorické analýzy, analýzy obrazu a dynamické oscila ní reometrie, p i emž sledována byla p edevším homogenita.

Senzorická analýza byla provedena skupinou t í expert školených podle ISO 8586-2. Hodnocen byl vzhled, konzistence a homogennost výrobku. Vzorky pro analýzu obrazu byly p ipravovány na p ístroji Microm HM 550, síla ezu byla nastavena na 7 m. ezy byly p ichycenyna podložní skla a po uschnutí byly barveny dle metodiky Gistingrové18 selektivním barvením pro zvýrazn ní tukových kuli ek olejovou ervení. Pro vlastní analýzu obrazu byl použit mikroskop Jenaval 250-CF (zv tšení 10x12,5), fotoaparát Canon PowerShot A620, software na snímání obrazu

258

PSRemote Version 1.5.2. a program pro analýzu obrazu ACC scientific image analyzer Version 6.0 (SOFO, CZ). Sledován byl po et a pr m rná velikost (plocha) tukových kuli ek v jednotlivých vrstvách modelových vzork . Výsledky obrazové analýzy byly vyhodnocovány pomocí programu Unistat Version 5.5 Mann-Whitneyovým U testem. Hladina statistické významnosti byla stanovena na P < 0,01. Oscila ní dynamická reometrie byla provád na na p ístroji Bohlin Gemini (Malvern Instruments, UK) v geometrii deska-deska, o pr m ru 40 mm a ší ce št rbiny 1 mm. Experiment byl provád n v oblasti lineární viskoelasticity s amplitudou smykového nap tí 20 Pa, v rozsahu frekvencí 0,1 - 50 Hz a p i teplot m ení 20°C. Sledovány byly parametry elastický (G´) a ztrátový (G´´) modul pružnosti. Oscila ní dynamická reometrie byla zam ena na detekci r zné síly gelu vrstev výrobku, jejichž odlišnost by indikovala nehomogenitu materiálu.

Výsledky a diskuzeSenzorickým hodnocením se zjistilo, že modelové vzorky vyrobené bez p ídavku tavicích

solí nebily v celém svém objemu homogenní. Docházelo p edevším k odd lování horní vrstvi ky,která byla idší, m k í a zpravidla sv tlejší než vrstva spodní. P i koncentracích lecitinu 0,2-0,8 % w/w vykazovala spodní vrstva ve své konzistenci ur itý stupe krupi kovitosti. Rostoucí obsah lecitinu zlepšoval emulgaci tuku. Výška horní pravd podobn tukové fáze se p i zvyšující se koncentraci lecitinu snižovala a spodní vrstva se stávala mén krupi kovitou. Vzorky s obsahem 1 % (w/w) lecitinu byly p i senzorickém hodnocení homogenní. Výše zmín ný teoretický p edpoklad, že horní odd lená vrstvi ka je tvo ena p edevším tukem, byl ov en provedením dalších analýz.

Analýza obrazu, jakožto objektivní nedestruktivní metoda, zaujímá v analýze potravin významnou roli19, nebo kvantitativní charakteristiky získané touto metodou pro jednotlivé sou ásti potravin je možné využít p i posuzování jejich kvality resp. n kterých zp sob jejich falšování. U modelových vzork bez tavicích solí s nižším obsahem lecitinu, bylo na ezech barvených olejovou ervení, která barví tukové kuli ky pomeran ov , makroskopicky patrné nahromad nítuku v horní vrstvi ce výrobku. S rostoucí koncentrací lecitinu se tato vrstvi ka snižovala. Výsledky obrazové analýzy uvádí tabulky I a II. Tabulka I uvádí po et tukových kuli ek v jednotlivých vrstvách jednotlivých šarží modelových vzork a tabulka II zahrnuje pr m rnou velikost tukových kuli ek v jednotlivých vrstvách modelových vzork . Výsledky v tabulkách jsou uvád ny jako pr m r ± sm rodatná chyba. Po et tukových kuli ek se v jednotlivých vrstvách vzorku kontroly statisticky významn neliší, p esto dochází k mírnému poklesu po tu tukových kuli ek. U modelových vzork bez tavicích solí pouze s pektinem a lecitinem dochází k postupné zm n .Zatímco u vzorku s obsahem lecitinu 0,2 % w/w dochází ješt k mírnému poklesu po tu tukových kuli ek (obdobn jako u kontroly), u vzorku s obsahem lecitinu 0,4 % w/w se nejvíce tukových kuli ek nachází ve st ední t etí vrstv výrobku. Od koncentrace lecitinu 0,6 % w/w dochází k postupnému zvyšování po tu tukových kuli ek od vrstvy první k páté. Tento trend je vysv tlitelný emulgací tuku a koreluje s výsledky druhé tabulky. Námi získané výsledky pr m rné velikosti tukových kuli ek ve vzorku kontroly byly srovnatelné se záv ry práce Awad et al.4, kte í studovali texturu a mikrostrukturu resp. po et a velikost tukových kuli ek v tavených sýrech vyrobených s r znými tavicími solemi. Zatím co u vzorku kontroly byla pr m rná velikost tukových kuli ekv jednotlivých vrstvách tém stejná a dosahovala hodnot 54 ± 2 až 65 ± 2 m2, u ostatních vzorkdocházelo v rámci jednotlivých vrstev k postupnému zmenšování pr m rné plochy tukových kuli ek. Nejv tší tukové kuli ky se nacházely v první vrstv (nejblíže ví ku) a nejmenší ve vrstvpáté (u dna výrobku). Tento trend byl patrný u všech modelových vzork bez obsahu tavicích solí. Z uvedeného vyplývá, že ím v tší jsou tukové kuli ky, tím mén jsou vazebnými interakcemi drženy v matrici sýra a dochází k jejich vyvstávání na povrch, kterému nezabrání ani 1% obsah lecitinu. Obrazová analýza tedy prokázala, že vzorky kontroly se ve sloupci výrobku statisticky významn neliší a to v žádném ze zkoumaných parametr , což znamená, že vzorek je homogenní, na rozdíl od ostatních šarží modelových vzork , které se více i mén v jednotlivých parametrech ve sloupci výrobku liší a nejsou tedy pln homogenní.

259

Tabulka I Po et tukových kuli ek v jednotlivých vrstvách jednotlivých šarží tavených sýr ;(pr m r ± sm rodatná chyba) vzorek/ vrstva 1.vrstva 2.vrstva 3.vrstva 4.vrstva 5.vrstva

kontrola 722 ± 100a 465 ± 69a 452 ± 29a 426 ± 52a 572 ± 57a

pektin 0,1% (w/w) + lecitin 0,2 % (w/w) 821 ± 75a,c 799 ± 32a 651 ± 28c,d 549 ± 34b,d 586 ± 51b,c

pektin 0,1% (w/w) + lecitin 0,4 % (w/w) 721 ± 105a,b 657 ± 50a 836 ± 65a,b 768 ± 32b 692 ± 38a,b

pektin 0,1% (w/w) + lecitin 0,6 % (w/w) 700 ± 39a 748 ± 28a,b 755 ± 28a,b 895 ± 47b,c 1038 ± 69c

pektin 0,1% (w/w) + lecitin 0,8 % (w/w) 645 ± 41a 728 ± 40a 723 ± 40a 672 ± 30a 846 ± 67a

pektin 0,1% (w/w) + lecitin 1,0 % (w/w) 377 ± 23a 374 ± 28a 434 ± 30a 440 ± 27a 507 ± 43a

Tabulka IIPlocha tukové kuli ky [ m2] v jednotlivých vrstvách jednotlivých šarží tavených sýr ;(pr m r ± sm rodatná chyba) vzorek/ vrstva 1.vrstva 2.vrstva 3.vrstva 4.vrstva 5.vrstva

kontrola 65 ± 2a 54 ± 2a 55 ± 2a 58 ± 2a 64 ± 2a

pektin 0,1% (w/w) + lecitin 0,2 % (w/w) 525 ± 20a 207 ± 7b 150 ± 5b,c 124 ± 3c 114 ± 2c

pektin 0,1% (w/w) + lecitin 0,4 % (w/w) 441 ± 64a,c 531 ± 19a 393 ± 16a,c 314 ± 8c 200 ± 4b

pektin 0,1% (w/w) + lecitin 0,6 % (w/w) 462 ± 13a 364 ± 10a,b 303 ± 7b 179 ± 4c 141 ± 2c

pektin 0,1% (w/w) + lecitin 0,8 % (w/w) 371 ± 12a 278 ± 8b 267 ± 7b 246 ± 7b 136 ± 2c

pektin 0,1% (w/w) + lecitin 1,0 % (w/w) 468 ± 16a 290 ± 10b 267 ± 8b 211 ± 6b 107 ± 2c

Oscila ní dynamická reometrie byla vzhledem k charakteru modelových vzork provád napouze u kontroly a u šarže vzorku s obsahem pektinu 0,1 % w/w a 1,0 % w/w lecitinu. U ostatních vzork s nižším obsahem lecitinu, nebylo možno ádn od sebe jednotlivé vrstvy odd lit. Horní vrstvy byly p íliš ídké a bez podstatného narušení struktury by nebylo možné je p enést do m ící geometrie. Nadm rnou manipulací s matricí totiž dochází k zm nám jejich viskoelastických vlastností. Obr. 1. znázor uje u modelových vzork (kontroly a vzorku s obsahem pektinu 0,1 % w/w a 1,0 % w/w lecitinu) závislost elastického (G´) a ztrátového (G´´) modulu pružnosti na frekvenci. Z grafu je patrno, že elastický modul pružnosti je vždy vyšší než ztrátový modul pružnosti, což sv d í o gelovitém charakteru vzorku. U vzorku kontroly se moduly jednotlivých vrstev nelišily a je tedy možno konstatovat, že vzorek je homogenní. Pro p ehlednost obr. 1 byla použita pouze jedna pr m rná k ivka pro elastický a jedna pro ztrátový modul pružnosti. Oba moduly pružnosti dosahují nejvyšších hodnot u kontroly, z ehož vyplývá, že kontrola je ze zkoumaných vzork nejtužší. Elastický i ztrátový modul pružnosti se v jednotlivých vrstvách modelového vzorku s pektinem a lecitinem lišil. Hodnoty modul spodní vrstvy se pohybovaly ve vyšších hodnotách než moduly horní vrstvy. Spodní vrstva vzorku s pektinem a lecitinem je pak mnohem tužší než vrstva horní. Vzorek s obsahem pektinu 0,1 % w/w a lecitinu 1,0 % w/w se v tuhosti jednotlivých vrstev lišil a vzorek tedy není homogenní.

260

Obr. 1. Závislost elastického G´ (plné symboly) a ztrátového G´´ (prázdné symboly) modulu pružnosti na frekvenci ( – kontrola; – spodní vrstva (modelový vzorek s obsahem 0,1 % w/w pektinu a 1% w/w lecitinu); – horní vrstva (modelový vzorek s obsahem 0,1 % w/w pektinu a 1% w/w lecitinu)

Záv rV práci byl použit nízkometylovaný pektin (0,1 % w/w) v kombinaci s lecitinem

(0,2-1,0 % w/w) jako možná náhrada fosfátových tavicích solí p i výrob tavených sýr .U vyrobených modelových vzork byla sledována jejich homogennost. Z výsledk vyplývá, že uvedenými kombinacemi pektinu a lecitinu je možno vyrobit roztíratelný sýrový výrobek, který se stává homogenn jší s rostoucí koncentrací lecitinu. Bez použití tavicích solí však nebylo možno žádnou z výše uvedených kombinací vyrobit pln homogenní produkt. Další experimenty však ukazují, že p i použití jiných p ídatných látek z ady hydrokoloid je možno dosáhnout lepších výsledk a vyrobit produkt akceptovatelný spot ebitelem.

Pod kování:Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: 6215712402

Použitá literatura:1. GUINEE, T.P., CARI , M. KALÁB, M. Pasteurized processed cheese and substitute/imitation cheese

products. In Fox, P.H. (Ed.) Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. vol. 2, Major Cheese Groups, 3.ed. Elsevier Applied Science, London and New York, 2004, p. 349-394.

2. LUKÁŠOVÁ, J. Hygiena a technologie mlé ných výrobk . VFU Brno, 2001, 181 s. 3. VYHLÁŠKA . 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mlé né výrobky, mražené krémy

a jedlé tuky a oleje, v platném zn ní.4. AWAD, R.A., ABDEL-HAMID, L.B., EL-SHABRAWY, S.A., SINGH, R.K. Texture and microtexture

of block type processed cheese with formulated emulsifying salt mixtures. Lebensmittel - Wissenschaft und Technologie, 2002, vol. 35, no. 1, p. 54-61.

5. FOX, P.F., GUINEE, T.P., COGAN, T.M., McSWEENEY, P.L.H. Fundamentals of Cheese Science.Aspen Publication, 2000, 559 p.

0,1 1 10

103

104El

astic

ký G

` a z

tráto

vý G

`` m

odul

pru

znos

ti [P

a]

Frekvence f [Hz]

261

6. MOLINS, R.A. Phosphates in food. Boca Raton: CRC Press, 1991, 261 p. 7. AWAD, R.A., ABDEL-HAMIC, L.B., EL-SHABRAWY, S.A., SINGH, R.K. Physical and sensory

properties of block processed cheese with formulated emulsifying salt mixtures. International Journal of Food Properties, 2004, vol. 7, p. 429-448.

8. PLUTA, A., ZIARNO, M., SMOLI SKA, A. Mo liwo ci zastosowania hydrokoloidów w produkcji serów topionych. Przemysl Spo ywczy, 2000, vol. 5, p. 42-44.

9. SMEWING, J. Hydrocolloids. In Food texture: measurement and perception. Eds. Rosenthal, A.J., Aspen Publishers, 1999, p. 282-303.

10. MAY, C.D. Pectins. In Handbook of hydrocoloids. Eds. Phillips, G.O.& Williams, P.A., Woodhead Publishing Limited and CRC Press: Boca Raton, 2000, p. 169-188.

11. TUINIER, R., ROLIN, C., de KRUIF, C.G. Electrosorption of pectin onto casein micelles, Biomacromolecules, 2002, vol. 3, p. 632-638.

12. VELÍŠEK, J., Chemie potravin, OSSIS, 1999, 352 s. 13. MATIA-MERINO, L., LAU, K., DICKINSON, E. Effects of low-methoxyl amidated pectin and ionic

calcium on rheology and microstructure of acid-induced sodium caseinate gels. Food Hydrocolloids,2004, vol. 18, p. 271-281.

14. MARAZIONE, A., de KRUIF, C.G. Interaction of pectin and casein micelles. Food Hydrocolloids,2000, vol. 14, p. 391-394.

15. OGAVA, S., DECKER, E. A., McCLEMENTS D.J. Production and characterization of O/W emulsions containing droplets stabilized by lecithin-chitosan-pectin multilayered membranes. Journal of agricultural and food chemistry, 2004, vol. 52, p. 3595-3600.

16. ERNÍKOVÁ, M., BU KA, F., PAVLÍNEK, V., B EZINA, P. , HRAB , J., VALÁŠEK, P. Effect of carrageenan type on viscoelastic properties of processed cheese. Food Hydrocolloids (2007), doi:10.1016/j.foodhyd.2007.05.020

17. ERNÍKOVÁ, M., BU KA, F., HLADKÁ, K., B EZINA, P. , HRAB , J. Pectin in emulsifiyng agents replacing during processed cheese production, In Sborník konference: Bezpe nost a kontrola potravín, II diel, Slovenská po nohospodárska univerzita v Nitre, 2007, p. 267-270.

18. GISTINGROVÁ, Z. Vytvo ení postupu pro stanovení velikosti tukových kuli ek ve vzorcích taveného sýry pomocí analýzy obrazu. Bakalá ská práce, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2005, 47 p.

19. DU, CH.J., SUN, D.W. Recent developments in the applications of image processing techniques for food quality evaluation. Trends in Food Science and Technology, 2004, vol. 15, p.230-249.

Kontaktní adresa:Michaela erníková, MVDr., Ústav potraviná ského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , nám. T.G.Masaryka 275, 762 72 Zlín, tel. 576 031 511, e-mail: cernikova@ft.utb.cz

262

VLIV P ÍDAVKU PEKTINU A VYBRANÝCH CUKR NA VISKOELASTICKÉA SENZORICKÉ VLASTNOSTI TAVENÝCH SÝR

Mack Ivana 1, Bu ka František 1, Pavlínek Vladimír 2, Hrab Jan 11 Ústav potraviná ského inženýrství, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín ,

2 Centrum polymerních materiál , Univerzita Tomáše Bati ve Zlín

The effect of pectin and selected low molecular saccharides on viscoelastic and sensory properties of model processed cheese

Summary:The scope of this study was to examine the effect of selected low molecular solid cosolutes (D-glucose, D-fructose, D-galactose and lactose) combined with pectin addition (0.2% w/w, 0.4 % w/w) on the consistency of model processed cheese with 40% w/w dry matter and 50% w/w fat in dry matter. The samples were evaluated by dynamic oscillation rheometry with plate-plate geometry (gap 1 mm, diameter 40 mm) and by sensory analysis. Rheological measurements were performed after 14 days of storage at 6±2°C in the linear viscoelastic region of samples in the frequency sweep mode (0.1 – 50.0 Hz). The values of the storage modulus (G´), loss modulus (G´´), complex modulus (G*) and loss tangent (tan ) were used for evaluation of rigidity of model processed cheese. In the present work it was found that all applied low molecular saccharides caused the decrease in the firmness of model processed cheese with or without pectin. The rigidity of three-dimensional network in processed cheese was declined by these cosolutes mostly to the similar level regardless of their steric arrangement (two epimers D-glucose and D-galactose) and chemical structure (mono- and disaccharide, aldose and ketose). Flavour of model processed cheese was not worse by pectin or low molecular saccharide addition.

ÚvodTavené sýry pat í mezi mlékárenské výrobky p ipravované tepelnou úpravou p írodních

sýr (nap . Eidamská cihla, Eidamský blok) za p ídavku tavicích solí1,2. Jako tavicí soli se obvykle používají sodné soli fosfát , polyfosfát i citrát . Krom t chto základních složek se mohou do tavené sm si p idávat další suroviny, jako nap . voda, máslo, tvaroh, krém (sýr již utavený), p ísady ovliv ující chu a barvu, konzerva ní látky, hydrokoloidy aj. Velice d ležitým organoleptickým znakem tavených sýr krom chuti a v n , na který kladou výrobci i spot ebitelé velký d raz, je jejich konzistence. Konzistence m že být ovlivn na adou r zných faktornap . obsahem sušiny, tuku bílkovin, zralostí p írodního sýra, hodnotou pH, p ítomností iont (Ca2+,Na+, K+), zp sobem zpracování taveniny apod.2–5.

V dnešní dob se objevuje snaha vyráb t tavené výrobky s nižšími náklady na suroviny, tzv. analogy, se sníženým obsahem nákladn jších mlé ných složek (bílkovin i mlé ného tuku), které jsou nahrazovány levn jšími rostlinnými zdroji (sojová bílkovina, palmový olej, sojový olej, p írodní i modifikované škroby)3,6. Pojem „analog tavených sýr “ se v eské legislativnevyskytuje, avšak na trhu jsou dostupné produkty ozna ené nap . jako tavený výrobek i tavené plátky (nap . Vintí tavený výrobek, Javor jemný tavený). Náhrada mlé ných komponent r znými hydrokoloidy i rostlinnými tuky m že mít velký vliv na konzistenci výsledného výrobku3,7.P ídavek hydrokoloid m že p isp t k tvorb požadované struktury výrobku (nap . zvyšováním vazby vody), a tím ke zvýšení jeho atraktivity pro zákazníka. Hydrokoloidy lze tedy využít nap . jako stabilizátory v tavených sýrech s vysokým obsahem vlhkosti7,8.

Mezi hydrokoloidy b žn používané v potraviná ském pr myslu pat í polysacharid pektin (želírující inidlo, emulgátor, stabilizátor). Základní struktura pektinu je tvo ena lineárním et zcem, který je složen z 25-100 jednotek kyseliny D-galakturonové spojených vazbami -(1 4).

Hlavní et zec bývá p erušován ramnozylovými zbytky, k nimž jsou asto p ipojeny neutrální cukry (nap . arabinóza, galaktóza) tvo ící postranní et zce. D ležitou charakteristikou ovliv ujícítechnologické vlastnosti pektinu, zejména mechanizmus tvorby gelu, je tzv. stupe esterifikace (DE). Ten udává pom r mezi jednotkami kyseliny polygalakturonové ve form methylesteru a celkovým po tem jednotek kyseliny galakturonové v et zci. Podle DE se pektiny d lína vysokoesterifikované (HMP; DE > 50 %) a nízkoesterifikované (LMP; DE < 50 %). Zatímco HMP tvo í gely v p ítomnosti vysokého obsahu nízkomolekulárních cukr (> 55%) a p i pH 3,5,

263

LMP vyžaduje k tvorb gelu pouze p ítomnost Ca2+ iont 9,10. Studiem vlivu nízkomolekulárníchsacharid na tvorbu gelu LMP v definovaných t ísložkových systémech (pektin+voda+monosacharid) se zabývá velké množství autor nap . Tsoga a kol.11,12, Evageliou a kol.13. V dostupné literatu e není však dostatek informací o vlivu nízkomolekulárních sacharidna pevnost gelu LMP v reálných potravinách (nap . tavených sýrech). Monosacharidy i disacharidy se mohou do taveného sýra i do tavených výrobk dostat prost ednictvím r zných

ingrediencí (p ísady ovliv ující chu , p írodní nebo modifikované škroby, sušená syrovátka, sušené mléko), kterých mohou být sou ástí3.

Cílem této studie bylo pomocí dynamické oscila ní reometrie posoudit vliv vybraných nízkomolekulárních sacharid (D-fruktóza, D-glukóza, D-galaktóza, laktóza) na konzistenci a senzorické vlastnosti tavených sýr s p ídavkem neesterifikovaného pektinu. Bylo sledováno, zda je konzistence vzork ovlivn na všemi vybranými nízkomolekulárními sacharidy (p i stejné koncentraci) stejnou m rou i zda se r zné nízkomolekulární sacharidy (rozdílné prostorové uspo ádání, p ítomnost r zné funk ní skupiny v molekule) liší ve velikosti jejich ú inku. Srovnáván byl také ú inek p ídavku monosacharidu a disacharidu na konzistenci modelových tavených sýr .

Materiál a metodyJako základní suroviny pro výrobu modelových tavených sýr byly použity následující

suroviny: (i) Eidamská cihla (30 % tuk v sušin , 50 % sušina), (ii) erstvé máslo (iii) deionizovaná voda, (iv) komer ní tavicí soli. Dále byly použity nízkomolekulární sacharidy, tj. D-glukóza (Glc), D-fruktóza (Fru), D-galaktóza (Gal) a laktóza (Lak), a nízkoesterifikovaný pektin (CP). Modelové tavené sýry (40 % w/w sušina, 50 % w/w tuku v sušin ) byly vyrobeny pomocí za ízení Vorwerk Thermomix TM 31 blender cooker (Vorwerk & Co. Thermomix; GmbH, Wuppertal, Germany). Nízkoesterifikovaný pektin v práškové form byl nejprve hydratován ve vod zah áté na 60 °C (10 minut). Nízkomolekulární sacharidy byly p ed p idáním do sm si surovin rozpušt ny ve vod .Tavení p ipravené sm si surovin se provád lo p i tavicí teplot 90 °C po dobu 1 min. Vzorky byly až do analýz uchovávány v lednici p i teplot 6 ± 2 °C. Výše uvedeným zp sobem byly p ipraveny4 skupiny modelových tavených sýr (skupina I, II, III a IV). První dv skupiny obsahovaly 15 následujících šarží: (i) kontrolní vzorek, (ii) vzorek obsahující 0,2 % w/w pektinu, (iii) vzorek obsahující 0,4 % w/w pektinu, (iv) vzorky obsahující 1 % w/w nízkomolekulárního sacharidu (4 šarže s p ídavkem Glc, Fru, Gal, Lak), (v) vzorky obsahující 0,2 % w/w pektinu a 1 % w/w nízkomolekulárního sacharidu (4 šarže s p ídavkem Glc, Fru, Gal, Lak), (vi) vzorky obsahující 0,4 % w/w pektinu a 1 % w/w nízkomolekulárního sacharidu (4 šarže s p ídavkem Glc, Fru, Gal, Lak). U skupin III a IV nebyly vyrobeny vzorky obsahující laktózu; každá z t chto skupin obsahovala tedy pouze 12 šarží.

Eidamská cihla byla charakterizována prost ednictvím pH, obsahu sušiny, tuku, hrubé bílkoviny. Vyrobené tavené sýry byly charakterizovány pomocí obsahu sušiny, tuku, popela a pH. Obsah sušiny byl ur en gravimetricky podle SN EN ISO 553414, obsah tuku byl stanoven acidobutyrometricky podle van Gulika, pH bylo zjišt no pomocí pH-metru se sklen nou elektrodou, popel byl stanoven žíháním vzorku v muflové peci p i teplot 650±5 °C po dobu minimáln 4 hodin a množství hrubé bílkoviny (N × 6,38) bylo ur eno Kjeldahlovou metodou.

Konzistence tavených sýr byla hodnocena pomocí dynamické oscila ní reometrie (reometr Bohlin GEMINI, Malvern Instruments Ltd., Velká Británie) s m ící geometrií deska-deska (pr m r 40 mm, št rbina 1 mm). Ze získaných hodnot elastického (G´) a ztrátového (G´´) modulu byly pro referen ní frekvenci 1 Hz byly vypo teny hodnoty tangentu úhlu fázového posunu (tan = G´´/G´) a hodnoty komplexního modulu pružnosti G* = [(G´)2 + (G´´)2]0,5. Reologická m ení vzork byla provád na p i konstantní teplot 20 °C v rozsahu frekvencí 0,1–50,0 Hz v oblasti lineární viskoelasticity (amplituda smykového nap tí 40 Pa). Všechny vzorky byly analyzovány po 14 dnech skladování p i teplot 6±2 °C. Získaná reologická data byla podrobena statistické analýze pomocí parametrického Studentova t-testu (Unistat 5.5, hladina významnosti 5%). Dále byla provedena senzorická analýza modelových tavených sýr s využitím stupnicových test , kterými byly hodnoceny chu a v n vzorku. Výsledky senzorického hodnocení

264

byly statisticky zpracovány pomocí neparametrického Kruskall-Wallisova testu (Unistat 5.5, hladina významnosti 5%).

Výsledky a diskuzeJednotlivé skupiny tavených sýr (I, II, III a IV) byly p ipravené v r zné dny stejným

technologickým postupem a na stejném za ízení. Základní surovinou pro jejich výrobu byla Eidamská cihla, jejíž základní chemické parametry (sušina, tuk, pH, hrubá bílkovina) jsou uvedeny v Tabulce I. R zná surovina byla použita z d vodu vyšší vypovídací schopnosti výsledkpro pr myslovou praxi, kde je velmi obtížné zajistit surovinu konstantních vlastností v delším asovém období, zejména surovinu s konstantním stupn m zralosti. Výsledky základní chemické

analýzy modelových tavených sýr se v rámci ur ité skupiny signifikantn nelišily, a proto mohly být jejich reologické a senzorické vlastnosti vzájemn porovnány. Agregované výsledky chemické analýzy pro jednotlivé skupiny tavených sýr jsou uvedeny v Tabulce II.

Tabulka I Výsledky chemických analýz Eidamských cihel použitých pro výrobu modelových tavených sýrskupin I, II, III a IV (pr m r ± sm rodatná odchylka).

Eidamská cihla Sušina (% w/w) Tuk (% w/w) Hrubá bílkovina (% w/w) pH

I 51,14 ± 0,22 18,1 ± 0,5 29,6 ± 0,5 5,80 ± 0,01 II 51,09 ± 0,39 17,0 ± 0,0 30,3 ± 0,0 5,91 ± 0,01 III 53,33 ± 0,30 15,6 ± 0,5 32,8 ± 0,3 5,63 ± 0,01 IV 53,41 ± 0,96 16,5 ± 0,4 32,5 ± 0,0 5,76 ± 0,01

Tabulka II Výsledky chemické analýzy pro jednotlivé skupiny tavených sýr (pr m r ± sm rodatná odchylka). Skupinatavených sýr Sušina (% w/w) Tuk (% w/w) Popel (% w/w) pH

I 42,60 ± 0,48 22,4 ± 0,5 4,2 ± 0,2 5,94 ± 0,02 II 41,17 ± 0,55 22,9 ± 0,3 4,3 ± 0,2 6,17 ± 0,03 III 42,25 ± 0,57 22,5 ± 0,4 4,2 ± 0,2 5,87 ± 0,08 IV 42,38 ± 0,50 21,6 ± 0,3 4,2 ± 0,1 5,94 ± 0,02

V následujících tabulkách III a IV jsou znázorn ny hodnoty elastického a ztrátového modulu a hodnoty tangentu úhlu fázového posunu pro referen ní frekvenci 1 Hz pro ty i sledované skupiny modelových tavených sýr . Zvyšující se hodnoty elastického, resp. ztrátového modulu pružnosti indikují rostoucí elastickou, resp. viskozitní složku vzorku. Tangens úhlu fázového posunu znázor uje podíl viskózní a elastické složky, kdy s jeho klesající hodnotou roste elasticita vzorku. Z výsledk uvedených v Tabulkách III a IV vyplývá, že p ídavek 0,2 a 0,4 % w/w pektinu zp sobil zvýšení hodnot elastického a ztrátového modulu u v tšiny sledovaných tavených sýrve srovnání s kontrolním vzorkem (P < 0.05). Ve všech p ípadech došlo vlivem p ídavku 0,2 i 0,4 % w/w pektinu k poklesu tangentu úhlu ztrátového posunu, což zna í zvýšení elasticity

vzork ve srovnání s kontrolou téže skupiny tavených sýr .P ídavek nízkomolekulárního sacharidu (1 % w/w) do taveného sýru bez pektinu zp sobil

vždy pokles elastického modulu ve srovnání s kontrolou. U vzork s p ídavkem pektinu byl rovn žpozorován pokles elastického modulu v p ípad , že byl aplikován nízkomolekulární sacharid. U ztrátového modulu byl zjišt n obdobný trend; pouze u skupiny I a II nebyl pokles hodnot ztrátového modulu vlivem p ídavku nízkomolekulárního sacharidu vždy statisticky významný (viz Tabulka III). Hodnoty elastického a ztrátového modulu poklesly p ídavkem nízkomolekulárního sacharidu ve v tšin p ípad na stejnou hodnotu (P 0,05). D-glukóza (aldohexóza) snížila tuhost sýra stejn jako D-fruktóza (ketohexóza), D-glukóza zp sobila stejný pokles tuhosti vzork jako její

265

C-4 epimer D-galaktóza. Také testované monosacharidy (D-glukóza, D-fruktóza, D-galaktóza) snížily tuhost taveného sýra obdobn jako disacharid (laktóza).

Tabulka III Hodnoty elastického (G´) a ztrátového (G´´) modulu pružnosti a hodnoty tangentu úhlu fázového posunu (tan ) pro referen ní frekvenci 1 Hz pro I. a II. skupinu tavených sýr (pr m r ± sm rodatná odchylka). Rozdílné písmenné indexy zna í signifikantní rozdíl (P < 0,05) mezi hodnotami v rámci jednoho sloupce.

Skupina tavených sýrI II VzorekG´ [Pa] G´´ [Pa] tan

[-]G´ [Pa] G´´ [Pa] tan

[-]Kontrola 6084 314 a,f 3723 314 a 0,612 4381 470 a,e 3071 370 a,d 0,701 Lak 3691 173 b 2853 173 b 0,773 1779 293 b 1558 293 b 0,876 Gal 3623 218 b 2844 218 b 0,785 1854 115 b 1577 115 b 0,851 Fru 3491 204 b 2674 204 b 0,766 1870 74 b 1666 74 b 0,891 Glc 3568 451 b 2776 351 b 0,778 1894 41 b 1684 41 b 0,889 0,2CP 8896 ± 453 c 4537 ± 253 a,c 0,510 6118 ± 318 c 3738 ± 218 a,d 0,611 0,2CP;Lak 5957 ± 166 a 4044 ± 166 a 0,679 4528 ± 166 a,g 3210 ± 166 a 0,709 0,2CP;Gal 5812 ± 526 a,e,g,h 3964 ± 326 a 0,682 4333 ± 475 a,e 3167 ± 375 a,d 0,731 0,2CP;Fru 5955 ± 166 a 4115 ± 166 a 0,691 4570 ± 156 a,g 3281 ± 156 a 0,718 0,2CP;Glc 5864 ± 397 a,g 4022 ± 297 a 0,686 4344 ± 132 a 3154 ± 132 a 0,726 0,4CP 10353 631 c 4969 331 c 0,480 8570 354 d 4482 234 c 0,523 0,4CP;Lak 6878 177 d,e 4361 177 a,c 0,634 5003 108 e 3407 108 a,d 0,681 0,4CP;Gal 6689 258 d,f,g 4341 258 a,c 0,649 5428 42 f 3637 42 d 0,670 0,4CP;Fru 6983 186 d 4385 186 a,c 0,628 5101 143 e 3377 143 a,d 0,662 0,4CP;Glc 6826 211 d,f,h 4348 211 a,c 0,637 5354 453c,e,f,g 3651 253 a,d 0,682

Tabulka IV Hodnoty elastického (G´) a ztrátového (G´´) modulu pružnosti a hodnoty tangentu úhlu fázového posunu (tan ) pro referen ní frekvenci 1 Hz pro III. a IV. skupinu tavených sýr (pr m r ± sm rodatná odchylka). Rozdílné písmenné indexy zna í signifikantní rozdíl (P < 0,05) mezi hodnotami v rámci jednoho sloupce.

Skupina tavených sýrIII IV VzorekG´ [Pa] G´´ [Pa] tan [-] G´ [Pa] G´´ [Pa] tan [-]

Kontrola 4850 255 a 3404 155 a 0,702 6353 568 a 4149 217 a 0,653 Gal 2947 237 b 2296 237 b 0,779 4229 186 b,d 3202 115 b 0,757 Fru 2984 253 b 2471 253 b 0,828 4085 89 b 3269 141 b 0,800 Glc 3017 357 b 2456 357 b 0,814 4291 0 c,d 3312 0 b 0,772 0,2CP 7574 ± 3 c 4703 ± 13 c 0,621 8949 ± 132 e 4765 ± 146 c 0,532 0,2CP;Gal 5481 ± 260 d 3968 ± 170 d,f 0,724 5369 ± 397 f 3644 ± 183 d 0,679 0,2CP;Fru 5066 ± 245 a,e 3617 ± 245a 0,714 5605 ± 372 f 3694 ± 154 d 0,659 0,2CP;Glc 5188 ± 208 d,e 3953 ± 208 d 0,762 5439 ± 347 f 3717 ± 147 d 0,683 0,4CP 8612 60 f 5055 160 e 0,587 11760 382 g 5424 216 e 0,461 0,4CP;Gal 6560 211 g 4192 181 d,f 0,639 8984 139 e 4600 157 c 0,512 0,4CP;Fru 6635 735 g 4107 235 d,f 0,619 8430 559 e 4612 254 c 0,547 0,4CP;Glc 6748 188 g 4251 188 f 0,630 8724 471 e 4643 235 c 0,532

266

Obr. 1. Závislost komplexního modulu pružnosti (G*) na frekvenci (f) pro r zné skupiny modelových tavených sýr . Skupina I (A), skupina II (B), skupina III (C), skupina IV (D); kontrolní vzorek ( ), p ídavek 1 % w/w D-galaktózy ( ), p ídavek 0,2 % w/w pektinu ( ), p ídavek 1 % w/w D-galaktózy a 0,2 % w/w pektinu ( ), p ídavek 0,4 % w/w pektinu ( ), p ídavek 1 % w/w D-galaktózy a 0,4 % w/w pektinu ( ).

Pro názornost byly vytvo eny grafy závislosti komplexního modulu na frekvenci pro všechny skupiny modelových tavených sýr , které jsou znázorn ny na Obr. 1. Protože všechny nízkomolekulární sacharidy zp sobily obdobné snížení tuhosti vzork oproti kontrole, pro p ehlednost byla do graf vybrána pouze D-galaktóza jako jejich zástupce. I tyto grafy potvrzují, že p ídavek pektinu ke vzorku zp sobil zvýšení jeho tuhosti, zatímco p ídaveknízkomolekulárního sacharidu do taveného sýra se projevil opa ným ú inkem. Záv ry této práce korespondují se studií Nilsson a kol.15, který zkoumal r zné možnosti snížení tuhosti systému prost ednictvím oslabení vzájemných interakcí biopolymer . Zjistil, že interakce mezi nízkomolekulárním sacharidem a polymerem mohou konkurovat vzájemným interakcím biopolymer , které jsou pro tvorbu a tuhost gelu d ležité. Rovn ž zvýšení tuhosti systému vlivem p ídavku pektinu je v souladu s dostupnou literaturou9,10,16.

Výsledky získané senzorickou analýzou modelových tavených sýr byly statisticky zpracovány a bylo zjišt no, že jejich chu a v n nebyly p ídavkem pektinu i nízkomolekulárního sacharidu negativn ovlivn ny.

Záv rCílem této práce bylo zhodnotit vliv p ídavk nízkoesterifikovaného pektinu (0,2 a 0,4 %

w/w) v kombinaci s 1 % (w/w) p ídavkem vybraných monosacharid (D-glukóza, D-fruktóza, D-galaktóza) a laktózy na konzistenci modelových tavených sýr . Tavené sýry s p ídavkem pektinu byly tužší než kontrolní vzorky. Pokles tuhosti vzorku vlivem p ídavku nízkomolekulárního

267

sacharidu nebyl závislý na prostorovém uspo ádání nízkomolekulárního sacharidu ani na p ítomnosti aldo- i ketoskupiny v molekule sledovaných mono- i disacharid . Taktéž použité monosacharidy i disacharid zp sobily shodné snížení tuhosti taveného sýra.

Pod kování:Práce vznikla za podpory projektu MŠMT (MSM 7088352101).

Použitá literatura:1. Vyhláška . 77/2003, kterou se stanoví požadavky pro mléko a mlé né výrobky, mražené krémy a jedlé

tuky a oleje (v platném zn ní).2. BU KA, F. Vliv sterila ního záh evu na jakost tavených sýr ur ených pro krizové situace. 2004. 111 s.

Dizerta ní práce. 3. GUINEE, T.P.; CARI , M.; KALÁB, M. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2:

Major cheese groups. 2004, ISBN 0-1226-3653-8. 4. BOWLAND, E.L.; FOEGEDING, E.A. Small strain oscillatory shear and microstructural analyses of a

model processed cheese. Journal of Dairy Science. 2001, vol. 84, no. 11, s. 2372 – 2380. 5. DIMITRELI, G.; THOMAREIS, A.S. Texture evaluation of block-type processed cheese as a function of

chemical composition and in relation to its apparent viscosity. Journal of Food Engineering. 2007, vol. 79, no. 4, s. 1364 – 1373.

6. BACHMANN, H.P. Cheese analogues: a review. International Dairy Journal. 2001, vol. 11, s. 505 – 515.

7. BENNETT, R.J.; TRIVEDI, D.; HEMAR, Y.; REID, D.C.W.; ILLINGWORTH, D.; LEE, S.K. The effect of starch addition on the rheological and microstructural properties of model processed cheese. The Australian Journal of Dairy Technology. 2006, vol. 61, no. 2, s. 157 –159.

8. LU, Y.; SHIRASHOJI, N.; LUCEY, J.A. Rheological, textural and melting properties of commercial samples of some of the different types of pasteurized processed cheese. International Journal of Dairy Technology. 2007, vol. 60, no. 2, s. 74–80.

9. EL-NAWAWI, S.A.; HEIKAL, Y.A. Factors affecting the production of low-ester pectin gels.Carbohydrate Polymers, 1995, vol. 26, no. 3, s. 189–193.

10. LOOTENS, D.; CAPEL, F.; DURAND, D.; NICOLAI, T.; BOULENGUER, P.; LANGENDORFF, V. Influence of pH, Ca concentration, temperature and amidation on the gelation of low methoxyl pectin. Food Hydrocolloids. 2003, vol. 17, no. 3, s. 237–244.

11. TSOGA, A.; RICHARDSON, R.K.; MORRIS, E.R. Role of cosolutes in gelation of high-methoxy pectin. Part 1. Comparison of sugars and polyols. Food Hydrocolloids. 2004a, vol. 18, no. 6, s. 907–919.

12. TSOGA, A.; RICHARDSON, R.K.; MORRIS, E.R. Role of cosolutes in gelation of high-methoxy pectin. Part 2. Anomalous behaviour of fructose: Calorimetric evidence of site-binding. Food Hydrocolloids. 2004b, vol. 18, no. 6, s. 921–932.

13. EVAGELIOU, V.; RICHARDSON, R.K.; MORRIS, E.R. Effect of pH, sugar type and thermal annealing on high-methoxy pectin gels. Carbohydrate Polymers. 2000, vol. 42, no. 3, s. 245-259.

14. SN EN ISO 5534. Sýry a tavené sýry – stanovení obsahu celkové sušiny (referen ní metoda). eský normaliza ní institut, 2005.

15. NILSSON, S.; PICULELL, L.; MALMSTEN, M. Nature of macromolecular denaturation by urea and other cosolutes: experiments on agarose interpreted within a lattice model for adsorption from a mixed solvent. Journal of Physical Chemistry. 1990, vol. 94, no. 12, s.5149-5154.

16. MACK , I.; BU KA, F.; PAVLÍNEK, V.; KRÁ MAR, S.; HRAB , J. Viscoelastic properties of processed cheese as a function of pectin concentration. In Risk factors of food chain VII. Nitra: SPU, October 11, 2007, s. 25. ISBN 978-80-8069-948-2.

Kontaktní adresa:Ing. Ivana Mack , Ústav potraviná ského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , nám. T.G.Masaryka 275, 762 72 Zlín, email: imacku@ft.utb.cz

268

VLIV KARAGENAN NA FYZIKÁLNÍ VLASTNOSTI MLÉKA A SMETANY Ková ová Renáta, Št tina Ji í, Loužecký Tomáš

Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

The influence of carrageenans on physical properties of milk and cream

Summary:The influence of kappa-, iota- and lambda-carrageenan on viscosity and particle size distribution of reconstituted skimmed milk was determinated. It was shown by determining of size distribution measured by laser diffraction that aggregates with size distribution in range 10 – 100 m were formed when adding kappa-carrageenan. Less intensive production of aggregates was observed when adding iota- or lambda-carrageenan. The influence of carrageenans on viscosity of milk was characterised under temperatures ranging from 10 to 60 °C. The biggest influence on viscosity was observed for kappa-carrageenan at lower temperature whereas at higher temperature was this influence comparable to iota-carrageenan (for content of carrageenan 0.04 % w/w the viscosity was increased 6.5; 2.2 or 1.5 times by adding kappa-, iota- or lambda-carrageenan at temperature 10 °C, whereas at temperature 60 °C only 1.4; 1.5 or 1.2 times). Furthermore the influence of 0.04 % w/w additive of kappa-carrageenan on rheological properties and particle size distribution of milk and cream with fat content 0.3; 2; 10; 20 a 30 % w/w was observed. The additive of kappa-carrageenan to samples was resulted in both increasing of the viscosity and formation of evidential dependence on shear rate (flow behaviour index 0.51 - 0.62) and thixotropy (relative viscosity was decreased in 10 - 30 % upon shear rate 100 s-1). When adding carrageenan the final apparent viscosity at shear rate 100 s-1 increased more for samples of milk and cream with lower fat content. It was confirmed by determining of size distribution both with and without dissolution of casein micelles that aggregates with size distribution in range 10 – 100 μm were formed, which are taken the responsibility for a formation of both thixotropy and viscoplastical behaviour of milk and cream when adding kappa-carrageenan.

ÚVODKaragenany jsou p írodní vysokomolekulární sulfatované polysacharidy extrahované

z ervených mo ských as t ídy Rhodophycae. Lineární et zec je tvo en pravideln se opakujícími molekulami D-galaktosy a 3,6-anhydro-D-galaktosy spojenými st ídav (1 3) a (1 4)glykosidickou vazbou. Existují t i základní typy karagenan (kappa, iota a lambda), které se liší po tem a umíst ním sulfátových skupin na jednotce galaktosy [1].

Karagenany si pro své pozitivní ú inky zejména na texturu výrobku již našly široké uplatn ní v mlékárenské technologii. Zvyšují viskozitu výrobku, vážou vodu a kappa- a iota-karagenan tvo í gel, ímž p ispívají k zlepšení stability koloidního systému mléka. Vlivem elektrostatických interakcí karagenanu s kaseinem vznikají v mléce agregáty s velikostí úm rnoukoncentraci p idaného karagenanu [2] a jeho schopností tvo it gel [3]. Nízké koncentrace karagenan jsou vhodné pro aplikaci do tekutých mlé ných výrobk , protože vytvá í velice jemný m kký gel [4].

Cílem práce bylo stanovit vliv konkrétních vzork karagenan na viskozitu mléka a smetan o r zné tu nosti a porovnat tvorbu agregát t chto karagenan s kaseinem.

MATERIÁL A METODYSušené odtu n né mléko Laktino (tuk 1,3 hm.%) - Promil a.s., Nový Bydžov Syrové mléko - Pragolaktos a.s., Praha Karagenany kappa, iota, lambda (komer ní preparáty) - TRUMF International s.r.o., Dolní Újezd

P íprava obnoveného mléka Obnovené mléko je 10% roztok sušeného odst ed ného mléka v destilované vod . Bylo

p ipraveno rozpušt ním sušeného mléka v destilované vod v hmotnostním pom ru 1:9. Rozpoušt ní probíhalo ve vodním termostatu za míchání 30 minut p i otá kách 1500 rpm (míchadlo Silversonem L4RT, Silverson Machines Ltd., UK) a teplot vzorku 60 °C. Poté bylo mléko p elitodo zásobní láhve, ochlazeno pod proudem vody a uloženo do lednice.

269

P íprava odst ed ného mléka a smetany Syrové mléko bylo p edeh áto na trubkovém modulu pastera ního za ízení FT74

(Armfield, UK) na teplotu 65 °C a odst ed no na laboratorní odst edivce Disc Bowl Centrifuge (Armfield UK). Teplota odst e ovaného mléka byla 50 °C. Získaná smetana a odst ed né mléko byly zchlazeny ve vodní lázni a uschovány v lednici.

P íprava vzork s karagenany Obnovené nebo odst ed né mléko bylo naváženo do kádinky a oh áto na 70°C a

za intenzivního míchání Silversonem L4RT (p es 3000 rpm) bylo p i této teplot p idáno navážené množství karagenanu. Pak byly otá ky sníženy (pro 0,5 l vzorku na 1500 rpm a pro 1 l vzorku na 2000 rpm) a karagenan ponechán k dalšímu rozpoušt ní 30 minut p i teplot mléka 70 °C. Poté byl vzorek p elit do sklen né zásobní láhve, ochlazen pod proudem vody (na 16-18°C do 15 minut) a uložen do lednice. U vzork s obsahem tuku 2 - 30 %hm. byl p ed ochlazením upraven obsah tuku p ídavkem smetany, která prošla stejnou tepelnou zát ží jako odst ed né mléko (70 °C, 30min).

M ení distribuce velikosti ásticM ení velikosti ástic bylo provedeno metodou laserové difrakce na p ístroji MasterSizer

2000 s disperga ní jednotkou Hydro 2000G (Malvern Instuments, UK). P i m ení byla rychlost míchadla 350 rpm a rychlost erpadla 950 rpm. Vlastní m ení probíhalo 12 s a bylo p i n mprovedeno 12000 ode t . Na jedno dávkování vzorku byly provedeny t i m ení a každý vzorek byl dávkován dvakrát. Hodnota refrak ního indexu pro mlé ný tuk byla zvolena 1,46 s absorp ním koeficientem 0,01 a pro vodu byl refrak ní index 1,33 [5]. Pro vyhodnocení výsledk v softwaru Mastersizer 2000 verze 5.13 (Malvern Instuments, UK) byl vybrán obecný model rozd lení(General purpose). M ením byla získána distribuce velikosti ástic podle jejich objemu. Pro m ení jednotlivých vzork byly použity dva zp soby m ení [6]: a. velikost agregát kaseinových micel - m eno v prost edí destilované vody b. velikost tukových kuli ek - vzorek smíchán s pufrem EDTA (35 mM, pH 7) v objemovém

pom ru 1:1 (rozpušt ní kaseinových micel) a m en v prost edí 0,1 % SDS (desintegrace shluk )

Stanovení viskozity kapilárním viskozimetrem Pro vzorky s nízkou viskozitou (v rozmezí 0,8 - 5 mm2/s) byla viskozita stanovena

kapilárním viskozimetrem Ubbelohde podle normy DIN 55 350 s kapilárou typu 0a s pr m rem 0,53 ± 0,01 mm (SCHOTT-Instruments, N mecko). Viskozimetr byl vložen do sklen néhotempera ního válce (SCHOTT-Instruments, N mecko), ve kterém cirkulovala chladící kapalina Fridex G Plus (Velana, R) vytemperována na požadovanou teplotu v termostatu DC5 (Haake, N mecko) s p esností na 0,1 °C.

Stanovení viskozity rota ním viskozimetrem Vzorky s vyšší kinematickou viskozitou (nad 5 mm2/s) byly hodnoceny rota ním

viskozimetrem RS 80 v systému dvou souosých válc Z40 se softwarem Rheowin 3.30 (Haake, N mecko). Ke chlazení viskozimetru byl použit termostat DC 30 (Haake, N mecko).Vzorky byly m eny p i teplot 10 °C v CR-modu (controled rate). Byla sledována závislost smykového nap tí,na smykové rychlosti, resp. zdánlivé viskozity na dob p sobení smykové rychlosti 100 s-1, podle následujícího programu:

1) vzestupná v tev tokové k ivky - zvyšování smykové rychlosti z 0,1 na 100 s-1 za 30 s2) asová závislost - p sobení konstantní smykové rychlosti 100 s-1 po dobu 10 min 3) sestupná v tev tokové k ivky - snižování smykové rychlosti ze 100 na 0,1 s-1 za 300 s

Sestupná v tev byla vyhodnocena Herschel-Bulkleyovým modelem ( n0 K ),

kde 0 je mez toku, K viskozitní koeficient, n index tokového chování a smyková rychlost.

270

VÝSLEDKY A DISKUSEViskozita obnoveného odst ed ného mléka byla sledována kapilárním viskozimetrem

v rozmezí teplot 10 až 60 °C pro všechny t i typy karagenan . V práci Marcotte et al. byla prokázána významná závislost viskozity na teplot pro vzorky s 1, 2, a 3 % karagenanu [7]. Pro tekuté mlé né výrobky jsou vhodné spíše nižší koncentrace karagenanu [8]. Závislost viskozity na teplot byla pozorována i pro vzorky s nízkým p ídavkem karagenanu (0,02 - 0,06 %hm.) (obr. 1). Viskozita vzork mléka p i nižší teplot byla nejvíce ovlivn na kappa-karagenanem, zatímco p i vysoké teplot byl jeho vliv srovnatelný s iota-karagenanem (p i obsahu 0,04 % karagenanu se viskozita p i teplot 10 °C zvýšila vlivem kappa, iota resp. lambda karagenanu 6,5; 2,2 resp. 1,5 krát, zatímco p i teplot 60 °C jen 1,4; 1,5 resp. 1,2 krát) (obr. 2).

A B

02468

1012141618

0 10 20 30 40 50 60

teplota (°C)

dyna

mic

ká v

isko

zita

(mPa

.s)

SOM

02468

1012141618

0 10 20 30 40 50 60

teplota (°C)

dyna

mic

ká v

isko

zita

(mPa

.s)

Kappa 0,02%

Kappa 0,04%

C D

02468

1012141618

0 10 20 30 40 50 60

teplota (°C)

dyna

mic

ká v

isko

zita

(mPa

.s)

Iota 0,02%

Iota 0,04%

02468

1012141618

0 10 20 30 40 50 60

teplota (°C)

dyna

mic

ká v

isko

zita

(mPa

.s)

Lambda 0,04%

Lambda 0,06%

Obr. 1. Viskozita obnoveného odst ed ného mléka bez karagenanu (A) a s karagenanem (B-D) v závislosti na teplot vzorku

01234567

0 10 20 30 40 50 60teplota (°C)

rela

tivní

vis

kozi

ta (-

)

Kappa 0,04%Iota 0,04%Lambda 0,04%

Obr. 2. Viskozita mléka s r znými karagenany vztažená na viskozitu mléka bez karagenanu

271

SOM Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 1000 3000 Particle Size (μm)

0

2

4

6

8

10

12

14

Vol

ume

(%)

Kappa 0,02 % Iota 0,02 % Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 1000 3000 Particle Size (μm)

0

2

4

6

8

10

12

14

Vol

ume

(%)

Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 1000 3000 Particle Size (μm)

0

2

4

6

8

10

12

14

Vol

ume

(%)

Kappa 0,04 % Lambda 0,04 % Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 1000 3000 Particle Size (μm)

0

2

4

6

8

10

12

14

Vol

ume

(%)

Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 1000 3000 Particle Size (μm)

0

2

4

6

8

10

12

14

Vol

ume

(%)

Obr. 3. Distribuce velikostí ástic v obnoveném odst ed ném mléce bez p ídavku karagenanu (SOM) a s r zným p ídavkem 3 typ karagenanu

V obnoveném odst ed ném mléce byl dále stanoven vliv kappa, iota a lambda karagenanu na velikost ástic metodou laserové difrakce. V p vodním mléce lze pozorovat pouze kaseinové micely o malé velikosti. Všechny vzorky s p ídavkem karagenanu m li v tší st ední velikost ástic oproti p vodnímu mléku, ímž byl potvrzen vznik agregát s kaseinem. Nejvýrazn jší vliv vykazoval kappa-karagenan, zatímco iota a lambda vykazovaly tvorbu agregát v podstatn menší mí e. Je patrné, že koncentrace 0,02 % pro kappa-karagenan oproti koncentraci 0,04 % p i obsahu kaseinu 3,08 %hm. ješt není dostate ná k tomu, aby do agregát byly zahrnuty všechny p ítomné kaseinové micely (obr. 3). Mechanismus vzniku agregát karagenanu s kaseinem závisí na koncentraci p idaného karagenanu, protože agregáty m žou vzniknout bu pouze interakcemi mezi kaseinem a karagenanem, nebo i utvo ením gelu [2]. Z t chto poznatk lze usoudit, že právvznik agregát p ídavkem karagenanu zp sobuje výše uvád ný nár st viskozity vzork .

Pro sledování vlivu karagenan na erstvé odst ed né mléko byl podle výraznosti vlivu na obnovené mléko vybrán kappa-karagenan a koncentrace 0,04 %hm. (nejvyšší koncentrace vhodná do tekutých mlé ných výrobk ). Byly posuzovány vzorky mléka a smetan o tu nosti 0,3; 2; 10; 20 a 30 %hm. V odst ed ném mléce byl pozorován vznik agregát o velikosti 10 - 100 μm, kterých se ú astnily všechny p ítomné kaseinové micely (Obr. 4). Stanovení distribuce velikosti ástic p ed a po rozpušt ní kaseinových micel potvrdilo vznik agregát i pro vzorky s vyšším

obsahem tuku (Obr.5). Tyto agregáty jsou v tší než p ítomné tukové kuli ky a m žou tak bránit jejích vyvstávání. Výsledky z m ení distribuce velikostí ástic jsou ovlivn ny množstvím obsažených tukových kuli ek (metodou laserové difrakce nelze m it samostatn jeden typ ástic v p ítomnosti jiných).

Dále byl pozorován vliv p ídavku 0,04 %hm. kappa-karagenanu na reologické vlastnosti mléka a smetan o tu nosti 0,3; 2; 10; 20 a 30 %hm. m ením vzork na rota ním viskozimetru. Z hodnot koeficient , získaných vyhodnocením dat pomocí Herschel-Bulkleyového modelu, uvedených v tabulce I a hodnot viskozit na za átku a po 10 minutách p sobení smykové rychlosti 100 s-1 (obr. 6) lze íct, že p ídavek kappa-karagenanu m l za následek zvýšení viskozity spolu se vznikem pr kazné závislosti na smykové rychlosti (index toku 0,51 až 0,62) a tixotropie (vlivem p sobení smykové rychlosti 100 s-1 došlo ke snížení zdánlivé viskozity o 10 až 30 %). Zvýšení

272

kone né zdánlivé viskozity p i smykové rychlosti 100 s-1 oproti viskozit mléka a smetan bez karagenanu bylo v tší p i nižší tu nosti vzork (obr. 7), tixotropie naopak s tu ností mléka stoupá a na tokovou k ivku má r zný obsah tuku v mléce s karagenanem jen nepatrný vliv (Obr.8).

Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 1000 3000 Particle Size (μm)

0 2 4 6 8

10 12 14 16

Vol

ume

(%)

Obr. 4. Distribuce velikostí ástic odst ed. mléka (vlevo) a její zm na p ídavkem 0,04 %hm. kappa-karagenanu (vpravo).

A Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 1000 3000 Particle Size (μm)

0 2 4 6 8

10 12 14 16

Vol

ume

(%)

B C Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 1000 3000 Particle Size (μm)

0 2 4 6 8

10 12 14 16

Vol

ume

(%)

Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 1000 3000 Particle Size (μm)

0 2 4 6 8

10 12 14 16

Vol

ume

(%)

Obr. 5. Distribuce velikostí ástic mléka s kappa-karagenanem (0,04 %hm. v plazm ) s obsahem tuku 2 (A), 20 (B) a 30 (C) %hm. Distribuce vlevo – velikost tukových kuli ek m enapo rozpušt ní kaseinových micel; distribuce vpravo – velikost agregát kaseinových micel.

0

20

40

60

80

100

120

140

0,3 2 10 20 30obsah tuku (%)

zdán

livá

visk

ozita

(mPa

.s)

zm na viskozity

kone ná viskozita

0

2

4

6

8

10

10 20 30obsah tuku (%)

rela

tivní

vis

kozi

ta (-

)

Obr. 6. Viskozita mléka (tuk 0,3 - 30 %hm.) s kappa-karagenanem (0,04 %hm.). Kone ná viskozita – zdánlivá viskozita po 10 min p sobení smykové rychlosti 100 s-1, zm na viskozity – rozdíl mezi viskozitou na za átku p sobení smykové rychlosti a kone nou viskozitou.

Obr. 7. Vliv obsahu tuku na zvýšení viskozity smetany vlivem p ídavku kappa-karagenanu (0,04 % v mlé né plazm )

273

Tabulka IVliv p ídavku kappa-karagenanu na reologické vlastnosti mléka s obsahem tuku 2 - 30 %hm.

0-mez toku, n-index tokového chování, K-viskozitní koeficient, N-nestanoveno (nízká viskozita). bez karagenanu kappa 0,04%

Tuk (%) 0 (mPa) n (-) K (mPa.sn) 0 (mPa) n (-) K (mPa.sn)

2 N N N 483 ± 176 0,51 ± 0,02 418 ± 108

10 0,4 ± 0,3 1,07 ± 0,00 3,8 ± 1,3 542 ± 152 0,51 ± 0,03 473 ± 100

20 8,2 ± 4,1 1,13 ± 0,02 5,0 ± 2,0 717 ± 155 0,54 ± 0,00 536 ± 144

30 7,5 ± 7,3 1,02 ± 0,01 15,4 ± 5,4 583 ± 240 0,62 ± 0,01 465 ± 160

0,001

0,01

0,1

1

10

0,1 1 10 100

smyková rychlost (s-1)

nap

tí (P

a)

Obr. 8. Tokové k ivky odst ed ného mléka ( ) a smetany (tuk 30 %hm.) ( ) s kappa-karagenanem (0,04 % v mlé né plazm ) a stejné smetany bez karagenanu ( ). Vzestupná ást k ivky (plná zna ka) a sestupná ást k ivky (prázdná zna ka).

ZÁV RByl hodnocen vliv t í komer ních vzork karagenan (kappa, iota a lambda) na vlastnosti

obnoveného odst ed ného mléka a erstvého mléka a smetan o tu nosti 0,3; 2; 10; 20 a 30 %hm. V t chto systémech byl stanoven vliv karagenan na distribuci velikosti ástic, viskozitu a reologické vlastnosti. Byl prokázán vznik agregát karagenanu s kaseinem obnoveného odst ed ného mléka u všech t í komer ních vzork karagenan , p i emž nejv tší vliv na velikost agregát m l kappa-karagenan. V erstvém odst ed ném mléce vytvá el p i koncentraci 0,04 % agregáty o velikosti 10 - 100 μm. P i vyšším obsahu tuku byly zaznamenány agregáty s velikostí v tší n ž byla velikost p ítomných tukových kuli ek. Karagenany prokazateln zvyšují viskozitu mléka, r zn dle typu karagenanu, p i emž nejv tší vliv m l kappa-karagenan p i 10 °C. P i 60 °C je vliv všech 3 typ srovnatelný. Zvýšení viskozity p ídavkem 0,04 % kappa-karagenanu je spojené se vznikem tixotropie a viskoplastického chování. Nár st viskozity mléka vlivem karagenanu klesá s rostoucím obsahem tuku, tixotropie naopak stoupá a na tokovou k ivku má r zný obsah tuku v mléce s karagenanem jen nepatrný vliv.

274

Pod kování:Tato práce byla finan n podpo ena z projektu Ministerstva pr myslu a obchodu R: MPO .FT-TA/069 Standardizace hydrokoloid a jejich aplikace pro potraviná ský pr mysl. Projekt je ešen ve spolupráci se spole ností TRUMF International s.r.o., Dolní Újezd.

Použitá literatura:1. Imeson A.P.: Carrageenan. V knize: Handbook of hydrocolloids (ed. Philips G.O., Wiliams P.A., ed.),

kap.5, s. 87-102. Cambrige 2000. 2. Ji S., Corredig M., Goff H.D.: Aggregation of casein micelles and -carrageenan in reconstituted skim

milk. Food Hydrocolloids 22, 56-64 (2008). 3. Martin A.H., Goff H.D., Smith A., Dalgleish D.G.: Immobilization of casein micelles for probing their

structure and interactions with polysaccharides using scanning electron microscopy SEM. Food Hydrocolloids 20, 817–824 (2006).

4. Chen Y., Liao M. L., Dunstan D. E.: The reology of K+-kappa-carrageenan as a weak gel. Carbohydrate polymer 50, 109-116 (2002).

5. Michalski M.C., Briard V., Michel F.: Optical parameters of milk fat globules for laser light scattering measurements. Lait 81, 787-796 (2001).

6. Michalski M.C. et al.: Appearance of submicronic particles in the milk fat globule size distribution upon mechanical treatments. Lait 82, 193-208 (2002).

7. Marcottea M., Hoshahilia A. R. T., Ramaswamy H.S.: Rheological properties of selected hydrocolloids as a function of concentration and temperature. Food Research International 34, 695–703 (2001).

8. Bixler H.J., Johndro K., Falshaw R.: Kappa-2 carrageenan: structure and performance of commercial extracts: II. Performance in two simulated dairy applications. Food Hydrocolloids 15, 619-630 (2001).

Kontaktní adresa:Ing. Renáta Ková ová,Ústav Technologie mléka a tuk , VŠCHT, Technická 5, 166 28, Praha 6 - Dejvice e-mail: renata.kovacova@vscht.cz

275

REJST ÍK AUTOR

Abrlová Magdaléna .............................. 53, 177 Adam Vojt ch ............................................ 221 Baranová Mária .......................................... 233 Belušíková Zora .......................................... 123 Bertaová Gabriela .............................. 152, 156 Blašková Veronika ..................................... 251 B enek Petr ................................................. 248B ezina Pavel ............................................. 256 Bu ka František ................... 64, 142, 256, 262 Bu ková Leona .................................... 64, 142Burdychová Radka ............................. 115, 168Cupáková Šárka .......................................... 123

ejna Vladimír.............................................. 33 erníková Michaela ................................... 256erný Vladimír .............................................49urda Ladislav .....................................13, 207

Doležal Petr ................................................ 221 Dráb Vladimír ............................................. 137 Dra ková Michaela .................................... 212Dubná So a ................................................. 107 Dušková Marta.................................... 123, 127 Dvo ák J. . ................................................... 193 Dvo áková Blanka......................................... 71 Falta Daniel ................................................ 187 Filip Vladimír.......................................... 85, 89 Flajšmanová Kate ina ................................. 100 Foltys Vladimír .....................................39, 119 Greif Gabriel .................................. 75, 81, 171 Greifová Mária ............................... 75, 81, 171Grosová Stanislava........................................ 21Havlíková Šárka............................................ 49 Hellerová Klára .......................................... 207Hlavsová Barbora ................................. 53, 177 Hofericová Margita ....................................... 43 Hoferková Petra ..........................................115Holá Felix.................................................... 64 Homutová Iva.............................................. 107 Horna Aleš .................................................221Hoza Ignác ................................................. 217 Hrab Jan ........................................ 58, 64, 262 Hudecová Anna.....................................94, 131 Chebe ová Viera ........................................ 152Chládek Gustav .................................... 33, 187 Chumchalová Jana ............................. 148, 160 Janda Václav .............................................. 227 Janov íková Lenka...................................... 131 Janštová Bohumíra ............................. 123, 212 Jenknerová Jana ......................................... 227 J zl Miroslav ............................................. 248 Karlová Tereza........................................ 85, 89

Karovi ová Jolana......................................... 75 Karpíšková Renáta.............................. 123, 127Keresteš Ján .................................................. 27Kirchnerová Katarína............................ 39, 119Kizek René ................................................. 221 Kle acká Jana ............................................. 137 Kološta Miroslav........................................... 43 Kore ová Janka .......................................... 156 Kostolníková Mária ................................... 156Košinová Marcela ....................................... 115 Kou imská Lenka ......................... 71, 163, 200 Ková ová Renáta ....................................... 268Krá mar Stanislav......................................... 64 Kraj ová Eva .................................. 75, 81, 171 Kramá ová Daniela .................................... 217 Ku erová Kate ina ............................. 160, 183 Kuchta Tomáš ............................................ 152 Kutnohorská Olga ......................................... 21 Kvasni ková Eva .......................................... 49 Lazárková Zuzana ................................ 64, 217 Legarová Veronika ...................... 71, 163, 200 Liptáková Denisa .................................. 94, 131 Loužecký Tomáš ........................................ 268 Lukešová Dobromila .......................... 236, 242 Lužová Tá a .............................................. 251Mack Ivana .............................................. 262Ma a Pavel ................................................. 233Ma ová Jana ............................................... 233 Manga I. . .................................................... 193 Medve ová Alžbeta ............................. 94, 131Míková Kamila .......................................... 160 Miller Petr .................................................. 160Navrátilová Pavlína .................................... 212 Necidová Lenka .................................. 123, 127 Nedomová Šárka ........................................ 251 N me ková Irena ........................................ 137Nevoral Ji í ................................................. 100 Nohálová Zuzana ....................................... 217Ondrá ková Iva .................................. 148, 183Pagurko Anton ........................................... 171 Pangallo Domenico ............................ 152, 156 Panovská Zde ka ............................... 236, 242Patrovský Ji í ................................................ 58 Pavlínek Vladimír .............................. 256, 262 Pleva Pavel ................................................. 142 Plocková Milada ........................ 148, 177, 183 Poláková Lenka............................................. 89 Pospiech Matej ........................................... 256 Pospíšilová Markéta............................ 123, 127 Povolná Šárka ............................................ 251

276

P ibyla Lubomír ............................................33P idalová Hana ........................................... 212 Pudil František ...........................................227Pufrová Eva................................................... 49 Rada Vojt ch .............................. 107, 100, 103 Ro ková Šárka .................................... 100, 103 Rohacká Hana ............................................ 137 Ros lek Martin ........................................... 200Roubal Petr.................................................. 137

íha J. . ....................................................... 193 Sabolová Gabriela ...................................... 233 Schmidt Štefan ..................................... 81, 171 Skýpala Martin ........................................... 187Sojková K. .................................................. 193Staruch Ladislav ......................................... 171 Šantinová Eva ....................................148, 183 Šedivá Alena ...................................... 236, 242Šmehilová Martina...................... 100, 103, 107

Šmidrkal Jan ........................................... 85, 89 Š ástková-Belušíková Zora ........................ 127 Št tina Ji í ............................................ 13, 268 Šustová Kv toslava .................... 203, 248, 251 Švandrlík Zden k ......................................... 49 Šviráková Eva ...................................... 53, 177Tománková Eva .......................... 100, 103, 107Tomáška Martin............................................ 43Tremlová Bohuslava .................................. 256 T ma Št pán .............................................. 200 Tykvartová Dagmar ...................................... 58Valík ubomír....................................... 94, 131 Vilímková Miroslava ................................. 137 Vorlová Lenka ........................................... 212 Vozková Lenka .......................................... 212 Zárubová Markéta......................................... 85 Zeman Ladislav .......................................... 221 Zítka Ond ej ............................................... 221

ANAMET, s. r.o.Kováků 26

150 00 Praha 5tel. 257328175, 606737749 fax 257323278

sales @anamet.czwww.anamet.cz

Analytické přístroje ALLIANCE INSTRUMENTS pro potravináře( především pro mlékárenský průmysl )

OPTIGRAPH - sledování časového vývoje koagulacemléka prostřednictvím měření transmitance NIR signálusoučasně v deseti vzorcích mléka. Důležité informacepro optimalizaci výrobního procesu sýrů (doba koagulace,vývoj tuhosti ).

CINAC - současné sledování až 32hodnot ( teplota, pH, vodivost, redox)charakterizujících průběh acidifikace připrocesech v mlékárenském průmyslu.

INFRASCAN - NIR spektrofotometr proširoké použití v potravinářském průmyslunapř. měření vlhkosti, obsahu tuků, proteinů atd.

LUMiSizer, LUMiFuge, LUMiReader -velikost částic a stabilita disperzí, určovánískladovatelnosti emulzí ( shelf life ), sledováníkoalescence a flokulace, rozpad emulzí.

NICOLET CZ s. r. o. Specialisté v oboru molekulové

spektroskopie

TThheerrmmooSScciieennttiiffiiccFFTTIIRR,, FFTTNNIIRR,, RRaammaann,, MMiiccrroossccooppyy

FT-NIR analyzátory potraviná ských výrobkStanovení b žných parametr potraviná ských výrobk za n kolik minut, bez destrukce vzorku a pot eby chemikálií.

Zakázkový vývoj metod, v etn automatizace stanovení, bezplatné p edvedení p ístroj s možností m ení vlastních vzork .

Servisní práce zdarma.

Kvalita spektrometr Nicolet ov ena více než 250 uživateli v R a SR.

Aplika ní, servisní a obchodní st edisko:

Nicolet CZ s.r.o. Nad Trnkovem 11 106 00 Praha 10

T/F: 272 760 432, 272 768 569

Mobil: 602325829, 603554788, 603725812

CELOSTÁTNÍ P EHLÍDKY SÝR 2008

Výsledky p ehlídek a sborník p ednášek konference „Mléko a sýry“

Vydavatel: Vysoká škola chemicko technologická v Praze Technická 5, 166 28 Praha 6

Editor: Št tina J., urda L.

Tisk: KANAG – TISK, s.r.o. Technická 5, 166 28 Praha 6

Rok vydání: 2008

Po et stran: 286

ISBN 978-80-7080-695-1

Publikace neprošla jazykovou ani odbornou úpravou. Za obsah p ísp vk odpovídají auto i.