Zrození moderního modelu BC

(a co předcházelo)

Edgar and Epstein 1965

Buněčný cyklus Saccharomyces

... CDC geny a cdc mutanti

cdc25cdc28 cdc24

cdc4

cdc9

cdc15

cdc5

cdc3, 10, 11, 12

Pořadí funkce CDC genů

transition pointexecution point

  

A

B

A B

AB

A

B

A

B

Ci ii

iii

iv v

cdc4 cdc4 cdc24

„Double shift“ experiment

0HU HU

pm- pm+

HU 0HU

pm+ pm-

replikace cdc

cdc replikace

replikace cdc

replikace

cdc

„Double shift“ experiment

0HU HU

pm- pm+

HU 0HU

pm+ pm-

replikace cdc + -cdc replikace - +replikace cdc - -replikace

cdc+ +

Mapa funkcí CDC genů

(Hartwell 1974)

CDC28

Má BC přirozený začátek?

„probabilistická fáze“

„deterministická fáze“

Definice startu

„We assume ... that the CDC28 gene product and the factor sensitive step mediate some early event or events in the cell cycle that are necessary prerequisites for both [budding and DNA replication] ... We shall term this event „start“. ... Completion of the „start“ event can be monitored by the acquisition of insensitivity to factor ... or ... to temperature in a cdc28 mutant, although this is not possible in all experimental situations.

Hartwell et al. 1974

2 alternativní pohledy na BC

(Hartwell 1974)

(domino)

(hodiny)

Cykly bez cytokineze jsou synchronní!

(Sul

livan

et a

l., w

ww

)

Fúze buněk dokládí centrální regulaci

(Rao and Johnson)

(D. Dudits)

Modely typu „hodiny“ (T. Hunt, M. Kirschner, A. Murray)

MPF - maturation promoting factor

(blok replikace)

(Shamu and Murray 1992)

MPF = p34 + „cyklin“

prof. Paul Maxime Nurse (Velká Británie)generální ředitel Imperial Cancer Research Fund, Londýn; nositel Nobelovy ceny ... nyní Rockefeller University18. 10. 2001 - doktor honoris causa přírodních věd „za zásadní příspěvky k poznání regulace buněčného dělení, které významně posouvají poznání v biologii a lékařství“(na návrh PřF UK)

cdc2 S. pombe

wt cdc2 t.s.

wtcdc2-w

CDC28 S.cer. komplementuje cdc2 (ale ne naopak)!

(Beach et al. 1982)

G1 nebo G2? A co to znamená??

Ale co když jsou kvasinky jiné?

... The simplest explanation ... is that the mechanisms regulating cell cycle progression are different in yeast (or Neurospora) and in animal cells. This is not a wild idea, since other aspects of the cell cycle are different (mating, growth factors, budding etc.). ... Alternative explanations are possible but more complicated.

R. Baserga, 1985

(Lee a Nurse 1987)

Simanis a Nurse, 1986: cdc2 protilátky rozpoznávají p34 z MPF

(Lee a Nurse 1987)

CDC28 kóduje p34!

„cyclin-dependent kinase“, CDK

Sjednocený model BC (1988)

„cell cycle engine“

vstupy výstupy

velikostsignálypoškození ...

gen. expresemorfogeneze...

Komplex CDK - cyklin - CKI

+ p13Suc1: CDC kinase subunit – CKS family (modulace substrátové specifity/Pace/stability?)

Kvasinky (S. cerevisiae) mají CDK ... mají i cykliny?

• Žádný CDC gen zatím nekóduje cyklin.

• Cdc28 se účastní G1/S a G2/M.• G1/S („start“) je místem sepětí růstu a

velikosti (jak to může fungovat? ... povrch/objem, objem/jádro, akumulace aktivátoru, ředění represoru).

• A co mutace ovlivňující velikost buněk?

Mutace ovlivňující průchod startem

• DAF1: dominantní rezistent k alfa-faktoru

(Cross 1988)

Mutace ovlivňující průchod startem

• WHI1-1: semidominantní malé b.

• whi2: malé b. ... ne vše je to pravé

(Nash et al. 1988)

Coulter counter, sestřičky z tetrády

WHI1 = DAF1 = cyklin!!

Komplementace mutací, „multicopy suppression“, syntetická letalita

• cdc28-4: klonováno CDC28, CLN1 a CLN2!

• cln1-, cln2- a cln1-cln2- naživu!!

• cln1-cln2-daf1- NE!!! ... jako cdc28 v pm-

WHI1/DAF1 → CLN3

Redundance v genomech – obecný jev!

Kvasinkové cykliny a anomální alela CDC28

• Suprese: CLB1, CLB2, CLB4 ... B-cykliny!

• CLB3: PCR – strukturní homolog

cdc28-1N mutant (Surana et al. 1991)

„redundance“CLB1-4

A to ještě není vše: CLB5 a 6!

... cloned by accident (Schwob a Nasmyth 1993)

Kvasinkový BC jakožto posloupnost „vln“ cyklinů

  

G1 S G2 M"start"

Cln3

Cln1,2

Clb5,6

Clb3,4

Clb1,2

• Vlny– CDK– cyklinů– CDK inhibitorů

• Regulace:– transkripce– proteolýza

• Modulace aktivity CDK– fosforylace

PHO80(cyklin)

A to není vše ... Regulace příjmu fosfátu kvasinkou

PHO5 mRNA

permeáza P

PHO2PHO4

PHO85(CDK)

P

CLB

CLN

cykliny asociované s Pho85(ale částečná redundance s CLN!)

(Measday et al. 1997)

... cykliny mimo cyklus?

(Measday et al. 1997, Carroll and O'Shea, 2003)

wt diploid

pho85

pcl1,2 clg1,9Amino acid metabolism

Cykliny poltivé kvasinky: jednodušší?

Živočišné buňky: CDK a cyklinů je víc

• CDK: rozlišení G1 a S/G2/M funkcí „Klasické“ cykliny: A a B – S a M fáze

• C,D,E: komplemetace G1 cdc28 (D je onkogen)

• nyní až po S, T (!)

Evoluce cyklinů

Robbens et al. 2004

unicellular green alga Ostreococcus tauri vs. Arabidopsis

Cykliny z Arabidopsis – Wang et al. 2004

Cykliny - dělba práce

• „Mitotické“ - klasické:– A - S fáze– B - mitosa

• „G1“ - heterogenní skupina; cell cycle commitment a ???

Cykliny jsou spřízněné s TFIIB a pRb!

Nucleic Acids Res. 1994 March 25; 22(6): 946–952.

Co dělají „příbuzní“ cyklinů?

viz též Pho80/85

Cykliny jakožto derivát transkripčních regulátorů?

A co CDK??(Noble et al. 1997)

Není CDK jako CDK

Cdc2MsA vs. Cdc2MsB

(Hirt et al. 1993)

(Doerner lab 2005)

exocytosis via NSF(PCTAIRE! – Liu et al. 2006)

CDK1

CDK2

CDK3

CDK4

CDK5

CDK6

CDK7

CDK8

CDK9

?

cyclinA

cyclinB

cyclinC

cyclinD

cyclinE

cyclinF

cyclinG

cyclinH

cyclinK

cyclinT

?

Evoluce CDK (a co rostliny?)

Regulátor A. thaliana S. cerevisiae H. sapiens

CDK1

CDK2

CDKA

CDKB

CDK4/6

CDKC

CDK7

CDKD

CDK8

CDKE

Cyclin

?

Evoluce CDK-cyklinových komplexů:rekapitulace postavení rostlin

(Simpson and Roger, Curr. Biol. 14:R693, 2005)

Evoluce C

DK

Robbens et al. 2004genom řasy Ostrecoccus

CDK: rozmanitost se dala očekávat!

• Kromě „ústřední“ funkce i další (CLN, meiotické ...)

• Spřízněnost s transkripčním aparátem (TFIIH, CTD kinázy)

• ALE rodina CCC (cell cycle control) kináz stará, CDK jsou mladá větev, divergence až v eukaryotech ... a velké větve dosti slušně konzervovány.

(Guo a Stiller 2004; Krylov et al., Curr. Biol. 13:173-177, 2004)

Regulátor A. thaliana S. cerevisiae H. sapiens

CDK1

CDK2

CDKA

CDKB

CDK4/6

CDKC

CDK7

CDKD

CDK8

CDKE

Regulátor A. thaliana S. cerevisiae H. sapiens

CDK1/2/4/5/6/A/B

CDK7/D/F

CDK8/E

CDK9/C

CDK10/11

CDK/cykliny a fenotyp: organismus vládne svým buňkám!

16 Arabidopsis CDK dosud zmeškáno, 2 CDK10/11 a 14 recentně duplik. CDK9

Guo and Stiller 2004

CdkC

CdkB

CdkA

CdkD

CdkF

CdkE

CAK + TFIIH

CTD kinase

P-TEFb

RNA proc.?G2M?

CDK-like kinázy a transkripce• TFIIH• CTD kinase (S.cer.:

KIN28)• P-TEFb (Positive-

Transcription Elongation Factor) ... + cyclin T (referát)

Příště: transkripce

(nejen cyklinů)