Isolace enzymů

transcript

Proč isolovat enzymy?

• Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu

• Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou

• Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory snížení aktivity cílových enzymů)

• V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové preparáty (např. medicina urokinasa, streptokinasa ...)

Zdroje enzymů

• Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny

• Selekce optimálních producentů (maximální produkce enzymu, optimální vlastnosti enzymu, snadné získání producenta, snadnost purifikačního postupu ...)

Selekce bakteriálních producentů amylas

Mikroorganismy

Bakterie, kvasinky, plísně, řasy

Výhody - lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru ...)

- selekce mutantů o požadovaných vlastnostech

- genetické inženýrství - termofilní organismy (produkce enzymů

s vyšší teplotní stabilitou)

Živočišné zdroje

• Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci

• Jateční zvířata – orgány, krev

• Člověk – tělní tekutiny (krev plasmin, thrombin ...; moč urokinasa ...)

• Bezobratlí (hmyz, plži, mlži málo se využívají)

Rostlinné tkáně

Špenát, řepa, hrách

Nevýhoda – problematický růst za

definovaných podmínek

Problémy se vzorkem

• Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných bílkovin a jiných látek)

• Malá množství cílového enzymu

• Labilita enzymu

Zásady pro práci s biologickým materiálem

1. Pokud možno zpracovat co nejdříve2. V případě potřeby zmrazit (– 60 – 80 oC)3. Rozmrazování – co nejrychleji4. Nízká teplota při isolaci5. Vhodné pH + iontová síla6. Vhodná koncentrace bílkoviny7. Zabránění pěnění8. Omezení nežádoucí proteolytické aktivity9. Přídavek specifických látek (např.

merkaptoethanol, EDTA ...)

Cíl izolace

• Získání homogenní bílkoviny

• Zachování biologické aktivity

Závěr : získat vzorek o patřičné

čistotě s vynaložením

patřičného (optimálního) úsilí

Distribuce enzymů

• Intracelulární

• V periplasmatickém prostoru

• Extracelulární

cytoplasma

periplasma

Membránově vázané bílkoviny

e lek tros ta ticky h yd ro fob n ě

in te rag u jíc í

zan ořen é tran sm em b rá n ové

in teg rá ln í

M em b rá n ové b ílkovin y

Úprava biologického materiálu

• Mletí (kulový mlýnek, masový strojek)

• Homogenizace (rozmělnění biologického materiálu v pufru)

- Elvehjem-Potterův homogenizátor

- třecí miska s pískem - výkonný mixer

Dezintegrace mikrobiálních buněk

• Narušení buněčné stěny

• Způsoby – fyzikální

- chemické

- enzymové

Fyzikální způsoby dezintegrace

• Třecí miska + balotina, písek ...• Střídavé zmražování a

roztávání• French press (protlačování

tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)

• X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)

• Ultrazvuk• Mlýnek se skleněnými

balotinamiX-press

Chemické způsoby dezintegrace

• Acetonová sušina (homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu)

• Osmotická lyse erytrocyty (suspenze v hypotonickém prostředí)

• Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány)

• Přídavek toluenu (toluen extrahuje při 35 – 40 oC fosfolipidy buněčné stěny osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu)

Enzymové způsoby dezintegrace

• Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem) rozrušení buněčné stěny bakterií (zejména G+), následné zředění destilovanou vodou

Metody isolace enzymů

• Srážení (precipitace)

• Membránové separační procesy

• Chromatografie

• Elektroforéza

Srážení

• Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu

• První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4

• Filtrace nahrazena centrifugací

Vysolování

vsolování vysolování

(NH4)2SO4

• Rozpustnost se málo mění s teplotou

• Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3)

• Levný

• Stabilizuje bílkoviny

• Relativně čistý

Srážení - dvojstupňově

% saturace

BílkovinaAktivita

Provedení

El. míchačka

ChlazeníMíchání 10-30’Centrifugace

pevný (NH4)2SO4

nebosaturovaný roztok

(NH4)2SO4

úprava pHNH4OH

Srážení organickými rozpouštědly

• Kompletně mísitelné s vodou• Nereagují s bílkovinou• Musí mít dobrý precipitační efekt • Srážení za nízké teploty (< 0 °C)!!! • Možné dvoustupňové srážení

EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan

Srážení organickými polymery a sloučeninami

Princip identický jako srážení s rozpouštědly

• DEAE dextran• PEG • Polyakrylová kyselina• Rivanol (2-ethoxy-6,9-diaminoakridinlaktát)• Kaprylová kyselina

Srážení selektivní denaturací

• Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina (enzym) musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu.

• Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla

• Balastní bílkovina musí nejen denaturovat, ale i precipitovat

Tepelná denaturace

• Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin

• pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno

• Při vyšší teplotě může více probíhat proteolýza

0102030405060708090

teplota

Bílkovina 1Bílkovina 2

Membránové separační metody

• Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul

• Membránová filrace (ultrafiltrace) rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí). Probíhá za vyššího tlaku

• Dialýza difuze nízkomolekulárních látek membránou; oddělením solí po vysolování bílkovin

Ultrafiltrace

Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit

Odstranění nízkomolekulárních složekDialýza

Chromatografické metody – základní rozdělení

• Distribuce složek mezi dvěma fázemi mobilní a stacionární fáze

• Mobilní fáze kapalina (kapalinová chromatografie); plyn (plynová chromatorafie)

• Stacionární fáze částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na pevných částicích, kapalina v pórech chromatografického nosiče, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry

• Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní

• Nejčastěji sloupcová chromatografie• Nízkotlaká, střednětlaká (FPLC) a vysokotlaká (HPLC)

chromatografie

Instrumentace pro LPC

• Pumpa – peristaltická nebo gravitace

• Gradient – mísič gradientu

• Dávkování – přímo pumpou na kolonu

• Kolony – skleněné

• Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm

• Vyhodnocování – zapisovač

• Sběrač frakcí – programovatelný

Částice sorbentu

Chromatografické metody pro separaci proteinů

• Gelová chromatografie

• Ionexová chromatografie

• Chromatografie s hydrofóbní interakcí

• Afinitní chromatografie

Gelová chromatografie

• Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru

• Rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina

• Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu nemísitelnost s mobilní fází

• Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později

• Isokratická eluce • Objem vzorku < 2 % objemu kolony• Chromatografické materiály zesítěný dextran

(Sephadex), agarosa, polyakrylamid• Možnost stanovení molekulových hmotností• Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

Gelová permeační chromatografie

Pořadí eluce :

největší>střední>nejmenší

molekula

Ionexová chromatografie

• Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj

• Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje

• V případě proteinů hraje zásadní roli pH !

• Celulosové a dextranové ionexy

Ionexy

• Katexy – záporný náboj vazba kationtů

silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3-

slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO-

• Anexy – kladný náboj vazba aniontůslabé – diethylaminoethyl (DEAE)silné – triethylaminoethyl (TEAE)

Ionexová chromatografie proteinů

• Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny

• pH < pI bílkovina nese kladný náboj separace na katexu

• pH > pI bílkovina nese záporný náboj separace na anexu

• pH = pI celkový náboj bílkoviny je nulový nelze provést ionexovou chromatografii

Ionexová chromatografie

• Nanášení vzorku – nízká iontová síla

• Eluce – gradientová• Zvyšováním iontové síly • Změnou pH

Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

Typická ionexová chromatografie

Loading starts

Loading ends,Low salt wash begins

Protein absorbance

Peak of unbound protein

Salt gradient

Salt gradient begins

Salt gradient ends

Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II)

and tightly bound (III) proteins

Chromatografie s hydrofobní interakcí

• Proteiny mají na svém povrchu hydrofóbní skupiny intreakce s chromatografickými nosiči, které nesou hydrofóbní skupiny (oktyl, fenyl)

• Nebezpečí denaturace proteinu (v případě silné vazby)

• Interakci podporuje vysoká iontová síla

Hydrofobní chromatografie

• Stacionární fáze – - C8, -fenyl

• Mobilní fáze – vodné roztoky s vysokou koncentrací solí (např. 1.7 M (NH4)2SO4)

• Eluce – snižováním iontové síly

Použití : purifikace a zakoncentrování bílkovin, možno použít přímo po vysolování síranem amonným

Afinitní chromatografie - princip

• Využití schopnosti biologicky aktivních látek specificky rozpoznat jinou molekulu látky mají k sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické)

• Typ adsorpční chromatografie využívající specifické interakce

• Látka navázaná na nosič afinitní ligand

• Vazba ligandu přes raménko (spacer)

Předpoklady pro vznik komplexu

• Sterické – použití raménka (spacer)

• Optimální pH, iontová síla

Předpoklady pro vznik komplexu

• Vazebné

• Konformační

Afinitní páry

Interakce mezi DNA a endonukleasou

Afinitní chromatografie

Nosič Raménko

Afinitní ligand

Enzym vázaný v aktivním místě

1. Analog substrátu

Nosič Raménko

Protilátka

Enzym vázaný na protilátku

2. Imunoafinitní chromatografie

Proteinový epitop

Provedení

• Nanesení vzorku – nízká iontová síla

• Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové

síly, polarity

Použítí : purifikace a zakoncentrování proteinů (i jednostupňová)

Chromatografie na imobilizovaných barvivech

• Dye-binding chromatografie

• Reaktivní barviva vázaná na chromatografických nosičích

• Barviva částěčně podobná některým kofaktorům

• Isolace enzymů i neenzymových bílkovin (např. albumin)

Metal chelate chromatografie

• Chelatující skupiny navázané na chromatografické nosiče vazba iontů těžkých kovů (např. Ni2+)

• Interakce kovových iontů s exponovanými histidylovými zbytky na povrchu molekuly proteinu

• Isolace rekombinantních proteinů s His6 částí

Chromatofokusace

• Použití ionexových chromatografických materiálů pro separaci podle isoelektrických bodů

• Kolona s vhodným ionexem je ekvilibrována v pufru o vysokém pH (vyšší než IEB cílové bílkoviny), vzorek je nanesen v témže pufru, poté je kolona promývána pufrem o nízkém pH obsahujícím amfolyty. Při průchodu pufru s amfolyty kolonou se vytváří pohybující se gradient pH. Proteiny se v koloně rozdělují podle hodnot isoelektrického bodu.

Magnetické separační techniky

• Imobilizace afinitních ligandů nebo iontově výměnných skupin na magnetické nosiče

• Magnetické sorbenty připravené z biopolymerů vykazujících specifitu k cílovému proteinu

• Vsádková separace cílových proteinů• Výhoda – možnost práce v obtížně manipulovatelných

systémech (např. suspenze kultivační média, homogenáty buněk ...)

• Možnost isolace cenných biologicky aktivních látek ze sekundárních surovin (odpadů)

BioMagn. Res. Technol. 2 (2004) 7 http://www.biomagres.com/content/pdf/1477-044X-2-7.pdf

Základní zásady

• Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením velké množství levného vstupního materiálu

• Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná

ve vzorku již investovaná práce, množství cílového proteinu je menší

• Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace možné snížení výtěžku)

• Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat• Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu

Základní zásady (typické příklady)

• Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí

• Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou) chromatografie s hydrofóbní interakcí

• Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů)

Nevhodné kombinace

• Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok dialýza, ultrafiltrace)

Sledování průběhu separace

Metoda Celková bílkovina

Celková aktivita

Specifická aktivita

Přečištění Výtěžek

extrakt 100 100 1 - 100 %

HIC 50 99 1.99 1.99 99 %

IEX 25 75 3 3.0 75 %

Elektroforesa

• Proteiny se pohybují v nosiči (obvykle polyakrylamidový gel) vlivem elektrického pole

• Pohyb proteinu závisí na – Náboji proteinu a jeho molekulové hmotnosti– Intenzitě elektrického pole– Typu a porozitě gelu

• Různé typy (PAGE, SDS-PAGE)• Význam: kontrola čistoty separovaného proteinu

PAGE elektroforesa

• Polyakrylamid o různé velikosti pórů použit jako nosič

• Proteiny jsou rozpuštěny v zásaditém pufru

• V elektrickém poli se proteiny pohybují směrem k anodě

SDS elektroforesa

• SDS denaturuje všechny typy proteinů

• Váže se na proteiny v konstantním poměru (1 molekula SDS na 2 aminokyselinové zbytky) všechny proteiny získají vysoký záporný náboj separace probíhá pouze podle velikosti molekulové hmotnosti

Sledování čistoty proteinů

• Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu

• Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou hmotnost isolovaného proteinu (SDS elektroforesou)

Isolace enzymů

Documents