Vybrané imunologické metody

Ing. Petra Šandová

Klinická imunologie a alergologie – laboratořÚKBLD a 1. LF UK VFN

Laboratorní imunologická vyšet ření

� Humorální imunita� proteiny krevního séra (Ig, C, CRP), IK� paraproteiny, kryoglobuliny� specifické IgE, ECP� autoprotilátky

� Buněčná imunita� subpopulace lymfocytů - imunofenotypizace� intracelulární cytokiny� fagocytóza� HLA B27

Laboratorní imunologická vyšet ření

� Periferní krev� Humorální imunita - sérum, plazma

� Buněčná imunita - plná krev s antikoagulačním

činidlem

� Tělní tekutiny - likvor, BAL, punktáty, výpotky

Indikace laboratorních vyšet řenív klinické imunologii

� Určení diagnózy

� Diferenciální diagnostika

� Potvrzení diagnózy

� Monitorování terapie

� Screening rodin

Imunologické laboratornímetody 1. volby

� Hladiny imunoglobulinů - IgG, IgA, IgM event. IgE

� Cirkulující imunokomplexy metodou PEG

� C3, C4 složka komplementu

� Antinukleární protilátky (ANAb) metodou NIF ENA screening

� Stanovení povrchových znaků lymfocytů (CD3, CD4, CD8), B lymfocytů (CD19, CD20), NK buněk (CD3-CD16+56+)

� U dětí vyšetření fagocytózy

Imunologické laboratornímetody 1. volby

� Součástí kompletního imunologického vyšetření je vždy:

� kompletní krevní obraz t.j. včetnědiferenciálního rozpočtu leukocytů

� FW (ev. CRP zejména u dětí)

Imunologické laboratornímetody 2. volby� Autoprotilátky orgánově nespecifické (dsDNA, ENA

typizace, ANCA, APLA, SMAb, AMAb a další)

� Orgánově specifické protilátky (anti-tTG, ASCA, anti-TG, anti-TPO, LKM a další)

� Další ukazatele buněčné imunity např. znaky aktivaceT lymfocytů, adhezívní molekuly

� Funkční testy T a B lymfocytů (blastická transformace)

� Vyšetření fagocytárních funkcí včetně oxidativníhovzplanutí granulocytů

Imunologické laboratornímetody 2. volby

� Stanovení specifických IgE

� ECP

� C1 inhibitor, C1inh funkční test

� Stanovení sekrečního IgA

� Stanovení podtříd IgG1, IgG2, IgG3, IgG4

Principy laboratorních imunochemických metod

� Antigen + protilátka imunitní komplex

� detekce protilátky pomocí antigenu� detekce antigenu pomocí protilátky

� Principy detekce

� přímá detekce � nepřímá detekce� detekce založená na značení antigenu nebo

protilátky

Přímá detekce Ag nebo Ab

� Imunonefelometrie� Imunoturbidimetrie� Radiální imunodifúze� Imunoelektroforéza� Protisměrná imunoelektroforéza� Imunofixační elektroforéza

Imunonefelometrie

� Ig, složky komplementu, CRP, CIK-C1q� Měření světla rozptýleného na komlexech Ag-Ab

Imunonefelometrie

� Dade Behring – BN II

Radiální imunodifúze

� C1q� Kruhová difúze roztoku Ag z kruhové jamky do

vrstvy gelu s obsahem protilátky

CH100

� Funkční test stanovení celkové hemolytickéaktivity komplementu

� V gelu ovčí ery s navázanou Ab proti ovčím ery. � Séra se pipetují do aplikačních jamek� Komplement se aktivuje při 37 0C (klasická cesta)� Lýza ery - projasnění

Protism ěrná imunoelektroforéza

� ENA screen� Migrace antigenu a protilátky při elektroforéze

proti sobě

Imunofixa ční elektroforéza� Gamapatie� Elektroforetická separace proteinů na gelu� Imunoprecipitace s monospecifickými antiséry

Nepřímá detekce Ag nebo Ab

� Latex fixační test

� Nepřímá (pasivní) hemaglutinace

� Aglutinační inhibiční test

� Komplement fixační reakce

Latex fixa ční test

� RF� Latexová částice – Ab + Ag aglutinace

Nepřímá hemaglutinace

� Protilátky proti zona pellucida� Antigen je adsorbován na erytrocytech� Protilátka je přítomna ve vzorku� V případě nepřítomnosti hledané protilátky nedojde

k hemaglutinaci

Detekce založená na zna čeníantigenu nebo protilátky

� Enzymy – EIA

� Flurochromy – FIA

� Chemiluminiscenční látky – CLIA

� Radionuklidy - RIA

Enzymová imunoanalýza

� Stanovení autoprotilátek� ELISA – enzymová imunoanalýza na pevné fázi

Enzymová imunoanalýza

� Imunoblotting� WB� Dot blot

� ENA typizace� Anti-gangliosidy� AMAb II� Jaterní blot

Protilátky proti extrahovatelnémunukleárnímu antigenu

� Anti-SSA/Ro SLE, Sjögrenův syndrom� Anti-SSB/La SLE, Sjögrenův syndrom� Anti-Sm (B´B) SLE� Anti-Sm (D) SLE� Anti-Scl 70 systémová sklerodermie� Anti-RNP smíšená choroba pojiva SLE� Anti-Pm-Scl polymyositida, dermatomyositida� Anti-NuMA Sjögrenův syndrom, SLE, RA� Anti-Ku sklerodermie� Anti-Jo dermatomyositida, polymyositida� Anti-histon léky indukovaný SLE, SLE, RA� ACA CREST syndrom, sklerodermie

Fluorescen ční imunoanalýza

� Stanoveníautoprotilátek

� Nepřímáimunofluorescence

Fluorescen ční imunoanalýza

� Typy substrát ů

� Tkáňové řezy krysí - LKS� Tkáňové řezy opičí - ovaria, ledviny,

mozeček, nadledvinky, endomýzium� Suspenze - prvok Crithidia luciliae

- lidské granulocyty� Tkáňové kultury - HEp-2, HUVEC

AMAb GPCAb SMAb

Tkáňové řezy krysí

Protilátky proti bazální membráně glomerulů(GBM)

Tkáňové řezy opičí

cANCA pANCA

Suspenze: lidské granulocyty

Protilátky proti dsDNA

Suspenze: prvok Crithidia lucilae

Antinukleární protilátky (ANAb)

Tkáňové kultury: HEp-2 buňky

Jaderné autoantigenypolynukleotidyhistonyribonukleoproteinyantigeny jadérekcentroméradalší antigeny

Orgánov ě nespecifické antigeny cytoplazmy

buněčné organelyantigeny cytoskeletudalší antigeny

Antigeny asociované s d ělením buňky

centrioladělící vřeténkoseparační zóna buňky

Antigenní cíle v bu ňce

Jaderná membrána s póry

Antigenní cíle v bu ňce

Průtoková cytometrie

� Technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množstvíčástic (např. buněk) v suspenzi

� Buňky lze rozlišit dle jejich velikosti (FSC), granularity (SSC), obsahu DNA, značením monoklonálními Ab,…

Průtoková cytometrie

SSC

FSC

020

040

060

010

00

0 200 400 600 800 1000

800

Lymfocyty a

Bazofily

Monocyty

Neutrofily

Eosinofily

Trombocyty,erytrocyty adebris

Průtoková cytometrie

CD19 PE

CD3 FITC

Průtoková cytometrie

� Průtokový cytometr BD FACS Canto

Chemiluminiscen ční imunoanalýza

� Stanovení specifických IgE, ECP� Immulite 2000

Alkalická fosfatáza - detekce tímto enzymem vyvolaného

luminiscenčního záření

Chemiluminiscen ční imunoanalýza

� Stanovení specifických IgE� Advia Centaur

Acridium ester – emitacesvětla při oxidaci H2O2

v alkalickém prostředí

Kryoglobuliny

� Imunoglobuliny precipitující v chladu� Speciální odběr� 3 typy:� Typ I. – monoklonální kryoglobuliny,

paraproteiny IgG, IgM, IgA

� Typ II. – smíšené kryoglobuliny, kombinace paraproteinus polyklonálním Ig

� Typ III. – polyklonální imunoglobuliny

Děkuji za pozornost!