Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 9 . Restrikční metody

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice

rostlin

9. Restrikční metody

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2011

Restrikční metody - úvod

Restrikční metody

využívají restrikční enzymy – endonukleázy (RE) variabilita tvořena štěpením DNA - vznikající fragmenty vykazují

délkový polymorfizmus = elektroforetický banding pattern

zejména před nástupem sekvenování DNA, nebo pro analýzu většího množství vzorků

RFLP, PCR-RFLP, T-RFLP – základem je Restriction Fragment Length Polymorphism


Restrikční endonukleázy (RE) skupina enzymů štěpící DNA - působí uvnitř dsDNA (× exonukleázy: štěpí

DNA od konců, např. Exonuclease I – odstraňování PCR primerů před sekvenací)

rozeznávají specifický sekvenční motiv (4-8 párů bází), často tzv. palindrom:

např. EcoRI:

délka motivu ovlivňuje pravděpodobnost výskytu daného restrikčního místa v genomu:

4-base cutters: 44 = restrikční místo v Ø na každých 256 bp

8-base cutters: 48 = restrikční místo v Ø na každých 65536 bp

5´- nnnnnnnnGAATTCnnnnnnnn - 3´

3´- nnnnnnnnCTTAAGnnnnnnnn - 5´


Restrikční endonukleázy (RE) restrikčně-modifikační systém bakterií - obrana proti virům

názvy odvozené od bakterií, ze kterých byly vyizolované

isoschizomery: enzym izolovaný z jiné bakterie, ale rozeznává stejnou cílovou sekvenci

např. XmnI: isoschizomery PdmI, Asp700I, MroxI


Restrikční endonukleázy (RE)

5´- nnnnnnGATCnnnnnn - 3´

3´- nnnnnnCTAGnnnnnn - 5´

▼

▲

5´- nnnnnn - 3´ 5´- GATCnnnnnn - 3´

3´- nnnnnnCTAG - 5´ 3´- nnnnnn - 5´

MboI+

kohezivní konce (sticky ends): 5´ overhangs

5´- nGACCGAnnnnnnnnnnnnn - 3´

3´- nCTGGCTnnnnnnnnnnnnn - 5´

▼

▲

TaqII

kohezivní konce (sticky ends): 3´ overhangs

5´- nGACCGAnnnnnnnnnnn - 3´ 5´- nn - 3´

3´- nCTGGCTnnnnnnnnn - 5´ 3´- nnnn - 5´+

5´- nnnnnnnnAGCTnnnnnnnn - 3´

3´- nnnnnnnnTCGAnnnnnnnn - 5´

5´- nnnnnnnnAG - 3´ 5´- CTnnnnnnnn - 3´

3´- nnnnnnnnTC - 5´ 3´- GAnnnnnnnn - 5´

▼

▲

AluI+

tupé konce (blunt ends)

štěpí mimo vlastní rozeznávanou sekvenci

Restrikční metody: PCR-RFLP

PCR-RFLP (CAPS = Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)

detekce sekvenční variability pomocí restrikčních enzymů + využívá výhody PCR - stačí málo startovací genomové DNA

např. rozlišení sekvenčně odlišných druhů (nebo haplotypů) na základě výsledného banding patternu restrikce

PCR amplifikace konkrétního úseku DNA (případně lze pro zvýšení variability v multiplexu naamplifikovat více úseků najednou)

restrikce jedním nebo více enzymy generuje délkovou variabilitu fragmentů

jak vybrat vhodný restrikční enzym?

• dříve naslepo zkoušeny dostupné RE, vybrány ty co generují variabilitu banding patternu

• nebo nejdříve osekvenovat, a pak přímo vybrat RE cílený na dané variabilní místo (místa) → někdy se zjistí, že pro dané variabilní místo neexistuje enzym...


PCR-RFLP – jak vybrat restrikční enzym:

např. v programu BioEdit: vybrat konkrétní sekvenci → Sequence → Nucleic Acid → Restriction Map

druh A

druh B


PCR-RFLP - vlastní provedení:

restrikční reakce: s enzymy pracovat na ledu, respektovat manuál od výrobce! u některých enzymů lze štípat přímo PCR produkt, u jiných je potřeba

PCR produkt před restrikcí purifikovat PCR clean-up kitem ~0.1-1 µg PCR produktu + 5-20 U restr. enzymu + příslušný reakční

pufr daného enzymu enzymy se liší optimální teplotou restrikce: 37° nebo 65° inkubace (1-)4 h (-přes noc) některé enzymy poté možné tepelně inaktivovat (80-85° - 15 min) pozor na star activity - nespecifické štěpení i mimo cílové oblasti RE:

• míru SA lze zjistit v např. materiálech od výrobce, způsobena např. nevodným reakčním pufrem

• někdy problém, když se produkt v 1 reakci štěpí více enzymy, které se liší optimálním reakčním pufrem


PCR-RFLP - vlastní provedení:

vizualizace na PAA nebo agarozovém gelu (1.5-3% agaróza, post-staining)

• agaróza - designovat tak, aby nejmenší fragmenty byly alespoň (50-)100 bp, menší fragmenty jsou obtížně detekovatelné, případně

splývají s dimery PCR primerů

• PAA - daleko větší senzitivita, teoreticky rozliší 1bp rozdíly v délce

PCR-RFLP agarozový gel: cpDNA úsek (rpoC1), enzym PdmI, Spergularia echinosperma a S. rubra – Pavel Kúr

nedoštípaný původní PCR produkt

kratší fragmenty jsou vždy méně intenzivní (protože mají méně bází které můžou svítit na gelu)

s čím počítat při interpretaci:

S. echinosperma S. rubra

nespecif. PCR produkty (ne produkty restrikce!)

dimery primerů (ne produkty restrikce!)


Lihová J., Kochjarová J., Marhold K. (2007): Hybridization between polyploids Cardamine enneaphyllos and C. glanduligera in the West Carpathians: evidence from morphology, pollen fertility and PCR-RFLP patterns. – Preslia 79: 101-125.

jaderná rDNA (ITS): aditivní pattern u hybridů (kombinuje bandy z obou rodičů)

cpDNA: hybridi s patterny obou druhů = obousměrná hybridizace(jako ♀ rostliny při hybridizaci C. enneaphylos i C. glandulifera)

Hybridizace Cardamine enneaphyllos a C. glandulifera


Výhody PCR-RFLP ušetření peněz za sekvenaci → umožňuje analyzovat relativně velký

počet vzorků kodominantní (u biparentálně děděných markerů – tj. neplatí u cpDNA)

Nevýhody PCR-RFLP nemusí existovat vhodný enzym menší detekční schopnost:

• nemusí odhalit jinou sekvenční variabilitu než cílová místa použitého enzymu

• odlišné sekvence vygenerují identický banding pattern (pokud se liší v oblastech mimo cílové místo enzymu)

Restrikční metody – studie společenstev

Využití restrikčních enzymů při studiu společenstev

např. pro molekulární studie složení společenstev mikroorganismů

mykorrhizní společenstvacyanobacterial mats



1. Izolace celkové DNA vzorku

↓

2. PCR amplifikace úseku, který slouží jako marker

(= umožňuje rozlišit taxony společenstva, primery specificky amplifikují pouze zkoumanou tax. skupinu; prokaryota – 16S, eukaryota – LSU, SSU

nrDNA)

klonování PCR produktu:

1 klon = 1 molekula PCR prod. = informace z 1 jedince společenstva

sekvenace klonů, nebo jejich PCR-RFLP analýza PCR-RFLP jednotlivých klonů: každý unikátní banding

pattern hodnocen jako samostatný ´druh´, případně možné klony dodatečně ověřit/analyzovat sekvenací

↓

3. Analýza směsi molekul PCR produktu

× stále urč. liminace rozsahu analýzy: na 1 vzorek reálné analyzovat desítky až stovky klonů



klonování PCR produktu:

1 klon = 1 molekula PCR prod. = informace z 1 jedince společenstva

sekvenace klonů, nebo jejich PCR-RFLP analýza

T-RFLP:PCR produkt fluorescenčně značen, štěpen exonukleázami a vizualizován fragmentační analýzou

1. Izolace celkové DNA vzorku

↓

2. PCR amplifikace úseku, který slouží jako marker

(= umožňuje rozlišit taxony společenstva, primery specificky amplifikují pouze zkoumanou tax. skupinu; prokaryota – 16S, eukaryota – LSU, SSU

nrDNA)↓

3. Analýza směsi molekul PCR produktu


fragmenty denaturovány zahřátím a formamidem → vznik ssDNA fragmentů → separace a vizualizace T-RFs fragmentační analýzou (FA) v kapilárním sekvenátoru

Princip T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)

1. PCR s fluorescenčně značenými primery – ideálně oba primery a každý jinou barvou

štěpení restrikčními endonukleázami - když se použijí oba primery značené, z 1 molekuly templátu vznikají 2 různě obarvené terminální fragmenty – T-RFs

(píky – produkty primerů značených modrou a zelenou barvou)

RE

FA

(´vnitřní´ fragmenty nenesou fluor. barvivo → nebudou detekovány)


Optimalizace a úskalí T-RFLP

nejdříve nutné zvolit vhodně variabilní marker (úsek pro PCR amplifikaci):

• optimální je otestovat více různých úseků, klonovat a sekvenovat produkty jejich amplifikace na vlastních cílových vzorcích

• případně použít sekvence z databází jak vybrat vhodný RE?

• opět na základě klonovaných sekvencí, in silico testovat více enzymů

ideální je převzít již publikovanou metodiku (primery + RE atd.) fungující pro dané studované společenstvo... (např. 16S pro bakterie)


Optimalizace a úskalí T-RFLP PCR bias: některé molekuly se snadněji (preferenčně) amplifikují, pro

omezení bias se doporučuje minimalizovat počet PCR cyklů (pozn.: platí i pro analýzu klonováním)

pseudo-T-RFs: artefaktní jednovláknové molekuly, tvoří píky při fragment. analýze

• někdo pro jejich odstranění před fragment. analýzou prosazuje ošetření vzorku Mung Bean exonukleázou (selektivně rozštěpí ssDNA)

radši nepoužívat endonukleázy které tvoří 5´ overhangs – fragmenty mohou být nekonzistentně ovlivněné zbytkovou aktivitou PCR polymerázy → víc artefaktních píků:

5´- nnnnnn - 3´3´- nnnnnnGA - 5´

5´- nnnnnnCT - 3´3´- nnnnnnGA - 5´

5´- nnnnnnC - 3´3´- nnnnnnGA - 5´




+C´ +CT

Taq polymerase


Hodnocení T-RFLP dat

nutné stanovit tzv. bins – rozmezí velikosti fragmentu (bp), píky v daném intervalu hodnoceny jako T-RF - ´druh´

• názory na optimální šířku binů různé

• ideálně ověřit konzistenci píků - replikáty

př.: bin width ±1 bp

vytvoření binární matice přítomnosti/absence každého konkrétního T-RF (0/1 data)

některé studie využívají i kvantitativní přístup - odhad četnosti T-RFs z výšky píku

´druhová´ data – ordinační metody, indexy diverzity apod.


Výhody T-RFLP detekuje i nízce abundantní ´druhy´ (ale problém thresholdem – co

ještě považovat za pík) citlivější než běžná RFLP – rozliší délkový polymorfizmus v počtu

jednotl. bází levnější a časově úspornější než klonování pravděpodobně přináší více informace

Neýhody T-RFLP detekované píky - ´druhy´ jsou anonymní, prakticky je nelze dále

sekvenovat podobně jako u ostatních RFLP metod může odlišná sekvence

generovat stejný pattern + metoda nemusí rozlišit všechny sekvenční typy

předpokladem je, že analyzované patterny skutečně pochází ze studované skupiny (značné požadavky na specifitu primerů)

Studie společenstev - DGGE

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, nerestrikční metoda)

PCR produkt přímo analyzován na denaturačním PAA gelu s gradientem močoviny nebo formamidu

jednotlivé sekvenční typy separovány na základě odlišnosti vlastní sekvence - GC obsah ovlivňuje rychlost denaturace

bandy lze z gelu vyříznout a přímo sekvenovat

Date post:	08-Jan-2016
Category:	Documents
Upload:	naiara
View:	27 times
Download:	0 times

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 9 . Restrikční metody

Documents