3D atom´ arn´ ı struktura proteinu Miriam Surˇ n´ akov´ a, Tom´ aˇ sSuch´anek,Tom´aˇ s Veleck´ y 20. kvˇ etna 2014 Abstrakt Znalost struktury protein˚ u je d˚ uleˇ zit´ a pro jejich pozorumˇ en´ ı a n´ asledn´ eho vyuˇ zit´ ı jejich vlastnost´ ı. Pouˇ z´ ıvanou metodou je proteinov´ a krystalografie. Byly vypˇ estov´ any krystaly lysozymu a byla namˇ eˇ rena difrakce rentgenov´ eho z´ aˇ ren´ ı na tˇ echto krysta- lech. Pouˇ zit´ ım matematick´ ych metod pak je vypoˇ ctena atomov´ a struktura molekul. Na z´ akladˇ e znalosti poloh jednotliv´ ych atom˚ u je moˇ zn´ e studovat mechanismus re- akce, kter´ a je enzymem katalyzov´ ana. 1 ´ Uvod Proteiny jsou z´ akladn´ ım stavebn´ ım kamenem vˇ sech ˇ ziv´ ych organism˚ u a vykon´ avaj´ ı mnoho pro ˇ zivot nepostradateln´ ych funkc´ ı. Abychom pochopili jejich vlastnosti, principy, jak funguj´ ı, a procesy, kter´ e v nich prob´ ıhaj´ ı, je tˇ reba zn´ at jejich strukturu. C´ ılem miniprojektu je sezn´amit se s postupem pˇ ri ˇ reˇ sen´ ı struktury makromolekuly, a to konkr´ etnˇ e s metodami krystalizace, s kryoprotekc´ ı a mraˇ zen´ ım krystal˚ u, sbˇ erem difrakˇ cn´ ıch dat na zdroji rentgenov´ ehoz´aˇ ren´ ı a zpracov´ an´ ım namˇ eˇ ren´ ych dat. Jako mo- delov´ y protein byl pouˇ zit lysozym. Jedn´ a se o enzym, kter´ y byl poprv´ e pops´an v roce 1922 Alexandrem Flemmingem. Vyskytuje se ve slin´ ach, slz´ach, vajeˇ cn´ em b´ ılku, nosn´ ım hlenu, krevn´ ı plazmˇ e a mateˇ rsk´ em ml´ ece. Je schopn´ y naruˇ sovatbakteri´aln´ ı stˇ enu, d´ ıky ˇ cemuˇ z m´ a siln´ e antibakteri´ aln´ ı´ uˇ cinky. Enzym se skl´ ad´ a ze 129 aminokyselin, jeho prostorov´a struktura je publikovan´ a v datab´ azi RCSB Protein Data Bank s PDB k´ odem 1LYS [4]. 2 Metody Z´ akladn´ ı metodou zjiˇ st ’ ov´ an´ ı struktury proteinu je difrakce rentgenov´ eho z´ aˇ ren´ ı na krys- talech a n´asledn´ e poˇ c´ ıtaˇ cov´ e zpracov´ an´ ı. 2.1 Krystalizace proteinu Nejpouˇ z´ ıvanˇ ejˇ s´ ı metody krystalizace proteinu jsou zaloˇ zeny na dif´ uzi. Vˇ etˇ sinou se pouˇ z´ ıv´ a bud ’ dif´ uze par, nebo dial´ yza, kter´ a se od dif´ uze par liˇ s´ ı pouˇ zit´ ım polopropustn´ e membr´ any. Metoda vyuˇ z´ ıvaj´ ıc´ ı jevu dif´ uze par lze prov´ est v uspoˇ r´ ad´ an´ ı vis´ ıc´ ı, sed´ ıc´ ı nebo sendviˇ cov´ e kapky. Pron´aˇ s experiment jsme pouˇ zili metodu vis´ ıc´ ı kapky (obr. 1). Experiment´aln´ ı uspoˇ r´ a- d´ an´ ı metodou vis´ ıc´ ı kapky se skl´ ad´a z rezervo´ aru (jamky) a v´ ıˇ cka. V rezervo´ aru je roztok pufru, sr´ aˇ zedla a aditiv. Pufr je napˇ r. octan sodn´ y. Sr´ aˇ zedlo (precipitant) tlaˇ c´ ı molekuly
Transcript
3D atomarnı struktura proteinu
Miriam Surnakova, Tomas Suchanek, Tomas Velecky
20. kvetna 2014
Abstrakt
Znalost struktury proteinu je dulezita pro jejich pozorumenı a nasledneho vyuzitıjejich vlastnostı. Pouzıvanou metodou je proteinova krystalografie. Byly vypestovanykrystaly lysozymu a byla namerena difrakce rentgenoveho zarenı na techto krysta-lech. Pouzitım matematickych metod pak je vypoctena atomova struktura molekul.Na zaklade znalosti poloh jednotlivych atomu je mozne studovat mechanismus re-akce, ktera je enzymem katalyzovana.
1 Uvod
Proteiny jsou zakladnım stavebnım kamenem vsech zivych organismu a vykonavajımnoho pro zivot nepostradatelnych funkcı. Abychom pochopili jejich vlastnosti, principy,jak fungujı, a procesy, ktere v nich probıhajı, je treba znat jejich strukturu.
Cılem miniprojektu je seznamit se s postupem pri resenı struktury makromolekuly,a to konkretne s metodami krystalizace, s kryoprotekcı a mrazenım krystalu, sberemdifrakcnıch dat na zdroji rentgenoveho zarenı a zpracovanım namerenych dat. Jako mo-delovy protein byl pouzit lysozym. Jedna se o enzym, ktery byl poprve popsan v roce 1922Alexandrem Flemmingem. Vyskytuje se ve slinach, slzach, vajecnem bılku, nosnım hlenu,krevnı plazme a materskem mlece. Je schopny narusovat bakterialnı stenu, dıky cemuzma silne antibakterialnı ucinky. Enzym se sklada ze 129 aminokyselin, jeho prostorovastruktura je publikovana v databazi RCSB Protein Data Bank s PDB kodem 1LYS [4].
2 Metody
Zakladnı metodou zjist’ovanı struktury proteinu je difrakce rentgenoveho zarenı na krys-talech a nasledne pocıtacove zpracovanı.
2.1 Krystalizace proteinu
Nejpouzıvanejsı metody krystalizace proteinu jsou zalozeny na difuzi. Vetsinou sepouzıva bud’ difuze par, nebo dialyza, ktera se od difuze par lisı pouzitım polopropustnemembrany. Metoda vyuzıvajıcı jevu difuze par lze provest v usporadanı visıcı, sedıcı nebosendvicove kapky.
Pro nas experiment jsme pouzili metodu visıcı kapky (obr. 1). Experimentalnı uspora-danı metodou visıcı kapky se sklada z rezervoaru (jamky) a vıcka. V rezervoaru je roztokpufru, srazedla a aditiv. Pufr je napr. octan sodny. Srazedlo (precipitant) tlacı molekuly
Obrazek 1: Znazornenı usporadanıvisıcı kapky: A – vıcko, B – kapka,C – rezervoar, D – matecny roztok
proteinu k sobe, jako srazedla se pouzıvajı soli. Kapka se umist’uje na vıcko a obsahujeprotein a roztok z rezervoaru.
Roztok v rezervoaru je koncentrovanejsı nez roztok v kapce (obr. 2). Z tohoto duvodudochazı k vyparovanı vody z kapky jako jedine tekave latky. Tım se zvysuje koncentraceroztoku v kapce a dıky srazedlu se molekuly proteinu dostanou blıze k sobe. V kapcezacınajı vznikat nukleacnı jadra (nukleace) nebo precipitaty (srazeniny).
K jadrum se zacnou nabalovat dalsı molekuly proteinu. Tım se snızı globalnı koncent-race proteinu a prestanou vznikat nukleacnı jadra. Krystaly vsak mohou rust dale – tatofaze se nazyva rust krystalu.
System musı byt nepropustne uzavren, aby se z nej nemohly odparovat zadne latky.(Mohlo by dojıt k vysusenı kapky s proteinem, mohly by se zmenit podmınky krystalizace,. . . ) K tomuto ucelu se pouzıva silikonovy tuk nebo jednoduche gumove tesnenı.
2.2 Prıprava krystalu pro difrakcnı experiment
Biologicke makromolekuly podlehajı radiacnımu poskozenı, proto je treba krystalyzmrazit v tekutem dusıku (cca 77 K).
Krystaly se nejprve vyjmou z krystalizacnı kapky pomocı nylonove smycky (o prumeru100–500 µm), pote se macı v roztoku s kryoprotektantem (napr. methanol, glycerol, . . . )branıcım v rustu hexagonalnıch krystalu ledu, ktere by mohly roztrhat krystal proteinunebo by snızily kvalitu difrakcnıho obrazu. Teprve potom se krystaly mrazı.
2.3 Difrakcnı experiment
Krystal je opakovane vystaven monochromatickemu svazku rentgenoveho zarenı, pri-cemz se menı orientace krystalu. Zmeny orientace je dosazeno tak, ze je krystal behemexperimentu otacı na goniostatu. Difraktovany rentgenove zarenı je zachycen detekto-rem. Vysledkem je soubor difrakcnıch snımku, ktere se menı podle rotujıcıho krystaluna hlavicce goniometru.
Struktura bılkoviny se dale urcuje pomocı specializovanych programu zalozenych na Fou-rierove transformaci.
Obrazek 3: Experimentalnı overenı fazoveho diagramu koncentrace proteinu a srazedla
3 Experiment
Cılem prace bylo vypestovat krystaly lysozymu, zıskat difrakcnı data a na zakladenich vytvorit prostorovou strukturu proteinu. Dalsı pracı bylo overenı fazoveho diagramukrystalizace proteinu.
3.1 Krystalizace
Celkem bylo vytvoreno 30 krystalizacnıch podmınek s ruznymi koncentracemi proteinua srazedla, cılem bylo zjistit vliv techto parametru na krystalizaci. Vysledek korespondujes fazovym diagramem.
Pro praci byl pouzit vzorek lysozymu o koncentraci 120 mg/ml, ktery pochazel z vajec-neho bılku. Pro krystalizaci byla zvolena metoda visıcı kapky s objemem rezervoaru 500 µla s krystalizacnımi kapkami slozenymi z 0,5 µl roztoku proteinu a 0,5 µl roztoku z re-zervoaru.
Jako pufr jsme pouzili octan sodny pri pH 4,6 a jako srazedlo NaCl.
4 Vysledky a diskuze
Overili jsme fazovy diagram krystalizace proteinu (obr. 3). Podle ocekavanı v prvnızone (leva cast diagramu) nevyrostly zadne krystaly, protoze zde byla koncentrace pro-teinu nebo srazedla prılis nızka a system se nedostal do zony nukleace. V prostrednı zone(mezi cervenymi krivkami) se ve vetsine kapek objevily krystaly a u zbytku kapek jsme sedopustili nedokonaleho zavrenı vıcka, takze kapky vysychaly a nebylo dosazeno rovnovahyv systemu. Napravo byla koncentrace proteinu nebo srazedla prılis vysoka, coz zpusobilovznik srazenin.
U par vetsıch krystalu jsme zıskali jejich difrakcnı obraz (obr. 4). Na nem jsou patrnevodnı kruhy – reflexe rozmıstene na soustrednych kruznicıch se stredem uprostred snımku
Obrazek 4: DifraktogramObrazek 5: Hotovy model proteinu
zpusobene ledem. Bıly stın vedoucı do stredu snımku predstavuje stın lapace primarnıhosvazku, ktery chranı detektor.
Struktura lysozymu byla vyresena pomocı metod makromolekularnı krystalografie(model viz obr. 5).
5 Shrnutı
Cılem nası prace bylo vytvorit krystaly lysozymu a zopakovat Laueho experiment.Krystalizace proteinu byla provedena metodou visıcı kapky. Na vypestovanych protei-novych krystalech byla namerena difrakce rentgenoveho zarenı. Z namerenych dat bylavypoctena struktura molekul lysozymu.
Podekovanı
Chteli bychom podekovat svym supervisorum, Ing. Janu Stranskemu a Bc. LeoneSvecove, za ochotu a trpelivost pri vysvetlovanı teorie a praxe a za cenne rady a pripomınkypri psanı clanku. Stejne tak bychom chteli podekovat vsem organizatorum Tydne vedyna Jaderce, kterı nam umoznili zucastnit se teto akce.
