Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a Státním rozpočtem ČR InoBio – CZ.1.07/2.2.00/28.0018

Aplikace DNA markerů

v mykologii a molekulárni

taxonomii

Mendelova genetika v příkladech

doc. RNDr. Michal Tomšovský, Ph.D.,

Ústav ochrany lesů a myslivosti, LDF MENDELU, Brno

Co je taxonomie?

Dvě pojetí:

A) Taxonomie = popis, klasifikace, a kategorizace organizmů podle pravidel nomenklatury.

Systematika = taxonomie + evoluční vztahy mezi organizmy + biodiverzita

B) Taxonomie = Systematika

Nomenklatura = soubor pravidel, jak pojmenovávat a třídit organizmy – binomická nomenklatura (Linné, Systema Naturae 1758) obsažen v International Code of Nomenclature.

Existují kódy nomenklatury botanické, zoologické a n. prokaryot.

Proč molekulární taxonomie?

Základem klasifikace organizmu by měla být rekonstruovaná

fylogeneze dané vývojové linie – taxonomický systém by měl být

přirozený.

Podobnost ≠ Příbuznost

Vodní obratlovce s hydrodynamickým tělem lze rozlišit podle anatomických znaků. U některých skupin organizmů anatomii použít nelze.

Pojetí druhu

Dvě odlišné lidské kultury (domorodý národ a euroamerická

vědecká komunita) rozlišují přibližně stejný počet druhů ptáků na

Papue N. Guineji [Novotný V.: Papuánské (polo)pravdy 2004]

Intuitivní rozlišování druhů na základě vnější podobnosti.

Druh - základní taxonomická jednotka, ± přirozená

Jaká kritéria se používají pro rozlišování druhů?

Kritéria pro rozlišování druhů

Typologická definice druhu – druh vymezen nomenklatorickým

typem (typový exemplář) podle pravidel nomenklatury na

základě morfologických znaků (popis morfologických znaků).

Definice biologického druhu (Mayr 1982) – zástupci jednoho druhu

se mezi sebou pohlavně rozmnožují, zástupci jiných druhů se

nerozmnožují (špatně se to zjišťuje v praxi).

Představy o evoluční historii organizmů Pojetí druhu založené na historii

Původní představy byly analogické ke genealogickým Stromům šlechtických rodů.

Kladistika

Přirozený systém na základě genealogické příbuznosti = kladogeneze (Hennig 1966) Kladogeneze = postupné odvětvování vývojových linií v rámci linií existujících → hierarchické uspořádání taxonů do vzájemně vnořených skupin. Kladisté nepovažují přítomnost rozlišovacích znaků (anageneze – evoluční novinky specifické pro nové vývojové větve) za důležité. Nevycházejí ze standardních taxonomických kategorií Kladistický druh vzniká odštěpením (speciací) a zaniká vymřením (extinkcí)

Evoluční systematika Spojuje požadavek na vývojovou příbuznost taxonů

s požadavkem na přítomnost rozlišovacích znaků. Nepřípustné

polyfyletické taxony, parafyletické taxony ± přípustné (nepřípustné

v kladistice)

Polyfyletický taxon – potomci různých předků

Parafyletický taxon – někteří potomci jednoho

předka

Monofyletický taxon – všichni potomci jednoho

předka

Definice fylogenetického druhu

Požadavek na monofyletičnost daného druhu a přítomnost

diagnostického znaku (nebo kombinace více znaků) vhodného k

rozlišení od jiných druhů.

Fylogeneze = vznik a vývoj jednotlivých evolučních linií je

předmětem fylogenetiky

Nejčastější metodou fylogenetiky je analýza sekvencí DNA

Vznik nových druhů - speciace

Alopatrická speciace – genetické rozdíly (reprodukční izolace) mezi druhy vzniknou díky geografické bariéře. Peripatrická s. – část populace druhu osídlí nově vzniklou ekologickou niku (ostrov). Parapatrická s. – část populace málo pohyblivých druhů se nekříží se zbytkem populace a vzniknou genetické rozdíly - reprodukční izolace. Tento typ speciace bývá zpochybňován. Sympatrická s. – nový druh se formuje na stejném území. Polyploidizační speciace u rostlin.

Molekulární znaky v taxonomii

Výhody:

Velké množství znaků (sekvence velkého množství genů)

Sekvence různých genů bývají na sobě nezávislé.

Znaky jsou často selekčně neutrální = nehrozí nebezpečí vzniku

podobných znaků nepříbuzných taxonů na základě selekčního

tlaku.

Univerzální použitelnost a relativní dostupnost PCR a

sekvenování DNA.

Molekulární znaky v taxonomii

Příklady využití:

1) Testování morfologického pojetí druhu – vztahy mezi variabilitou morfologickou a molekulární.

2) Testování biologického pojetí druhu – míra genetické příbuznosti kryptických druhů (druhy morfologicky podobné, ale vzájemně se nerozmnožující).

3) Výzkum vzájemných vývojových vztahů dobře odlišitelných druhů podle tradičních kritérií.

Jak se pracuje s DNA?

Izolace DNA z houbových buněk –mechanické

drcení, extrakce DNA pomocí komerčních kitů

(cena cca 100 Kč = 4 Eura / vzorek).

Z celkové DNA je třeba namnožit požadovaný úsek

genomu.

metoda PCR – Polymerase Chain Reaction

(= Polymerázová řetězová reakce)

Sekvenace DNA: Zjištění pořadí nukleotidů v daném úseku DNA

DNA sekvence je užitečná pro identifikaci neznámého

organizmu = DNA barcoding.

Pro identifikaci organizmu na úrovni biologického druhu je třeba

zvolit tzv. konzervativní oblast DNA

U hub často sekvenována tzv. ITS oblast ribozomální DNA

(rDNA). Neznámou sekvenci DNA lze srovnat s údaji

v internetové databázi GenBank pomocí webové aplikace BLAST

www. ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html

Rozvíjí se databáze UNITE (http://unite.ut.ee/)

… ATATATAGGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATT…

Sekvenace DNA

18S 28S 5.8S

Ribozomální DNA

Různé podjednotky rDNA (18S, 28S), resp. úsek mezi nimi - tzv. ITS oblast

– bývají často sekvenovány.

Sekvence pro srovnání jsou volně přístupné na internetu www.

ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html .

ITS oblast

18S (SSU) a 28S (LSU) – malá a velká podjednotka jsou konzervativnější

než ITS1 a ITS2.

V taxonomii hub hlavně jaderná LSU (D1/D2 doména) a mitochondriální SSU

Aplikace BLAST – online identifikace sekvencí

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov

Aplikace BLAST – online identifikace sekvencí

Sekvence určena jako Heterobasidion annosum

Kódující sekvence

Zpravidla se používají paralelně s ITS.

Úseky obsahují exony i introny

• translační elongační faktor 1-alfa (EF1a;tefa)

• beta tubulin (tub)

• RNA polymeráza II, podjednotky 1 a 2 (RPB1, RPB2)

• glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza (GDH)

• mitochondriální ATP syntáza, 6 podjednotka (ATP6)

Fylogenetické stromy

Diagramy znázorňující podobnost sekvencí =

příbuznost zkoumaných jedinců.

Různé metody zpracování stromů:

Distanční metody – převod sekvencí

na koeficienty podobnost (např. Neighbor-joining)

Znakové metody – pracují s jednotlivými bázemi

jako se samostatnými znaky

a) Maximální parsimonie (PAUP -

placený software; MEGA, PhyML - freeware).

Metodicky jde o hledání nejjednoduššího řešení a preferování

jednodušších hypotéz před složitějšími.

b) Maximální věrohodnost - Maximum Likelihood (PAUP;

PhyML – freeware)

c) Bayesovská analýza (Mr.Bayes - freeware)

Různé druhy fylogenetických stromů:

• Kladogram (z řec. klados = větev) je základní typ stromu, který popisuje příslušnou hypotézu o příbuznosti, aniž by řešil, kdy došlo k štěpení jednotlivých linií a do jaké míry se jednotlivé evoluční linie liší.

• Fylogram podává dodatečné (aditivní) informace ve formě délky větví. Délka větve tak odpovídá množství prodělaných evolučních změn. Rychlost mutací a vzniku evolučních novinek totiž není konstantní . Záleží na prostředí, délce trvání generačního intervalu a jiných faktorech.

• Dendrogram představuje další formu grafického znázornění kdy koncové uzly představující recentní druhy jsou ve stejné rovině (představující současnost), stejně vzdálené od společného předka. Dendrogram ( z řec. dendron = strom) popisuje průběh evolučních změn v čase, z polohy uzlů lze odečíst kdy došlo ke štěpení jednotlivých evolučních linií.

Dendrogramy se pužívají při populačních studiích na vnitrodruhové úrovni

Fylogenetické stromy

Upraveno podle:

http://www.zoologie.frasma.cz/fylogeneze

Spongipellis – příkladová studie

http://mykoweb.prf.jcu.cz/polypores/photos/spongipellis_lits

chaueri1.jpg

V Evropě 4 druhy. Někteří autoři nerozlišují S. litschaueri od S. delectans – ITS a LSU sekvence obou druhů se liší = jsou to odlišné druhy. Vztahy mezi S. litschaueri a S. unicolor ze Severní Ameriky: V USA 2 druhy – západní druh má shodnou ITS sekvenci s S. litschaueri (možná totožný druh). Východní druh = S. unicolor. Oba druhy se liší i velikostí výtrusů.

Fylogram ITS

Spongipellis

LSU fylogram – založený na sekvencích velké podjednotky genu pro ribozomální RNA

S. spumeus – typový druh rodu je evolučně vzdálený od ostatních druhů rodu.

Úskalí molekulární taxonomie

Molekulární metody umožňují zkoumat problematiku i biologům

bez osobní zkušenosti s danou skupinou organizmů:

Práce s herbářovými položkami a jiným archivovaným

biologickým materiálem.

Může dojít k chybné interpretaci výsledků,

pokud chybí detailní znalost problematiky.

Řešení: spolupráce mezi „klasickými“ taxonomy

a molekulárními fylogenetiky.

Motto na konec

..Skutečnost, že sýkora koňadra má v pozici 30 cytochrom C-oxidasy aminokyselinu valin, zatímco sýkora modřinka má ve stejné pozici leucin, může pomocí vhodného technického vybavení zjistit a publikovat i člověk, který se jinak v rybách vůbec nevyzná….

J. Flegr, Evoluční biologie 2005

Děkuji Vám za pozornost