Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR)

KBO/125

Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012

Kurz byl financován z projektu FRVŠ 1904/2012

► stále obvykle není reálné osekvenovat a projít celý eukar. genom a najít (relativně vzácné) SSR lokusy

Jak najít v genomu SSR?

► účinnější je sekvenovat úseky kde se dá předpokládat vyšší výskyt SSR → snaha o vytvoření ´SSR-enriched genomic library´

► sekvenací fragmentů DNA genom. library

1. štěpení genom. DNA na fragmenty, jejich úprava aby šly použít pro běžné molek. metody - PCR amplifikace a sekvenace (~300-1000 bp)

Vytvoření SSR-enriched genomic library

3. výsledné fragmenty jsou sekvenovány, na základě získaných sekvencí navrženy primery pro daný SSR lokus

2. SSR enrichment: pomocí sondy komplementární k určitému SSR motivu se vytáhnou fragmenty obsahující daný SSR motiv

1. štěpení genom. DNA► blunt-ends; 16 h inkubace, pak purifikace (PCR Clean-up kit)

+ restr. enzym

+ T4 ligáza, linkery

Vytvoření SSR-enriched genomic library

dimery linkerů →

← OK

► ligace: na konce fragmentů navázány ligací krátké dsDNA fragmenty (linkery) s arbitrární sekvencí - umožní pozdější PCR amplifikaci a sekvenaci; 20 h inkubace

► ověření úspěšnosti ligace: PCR, linker použit jako primer, mělo by naamplifikovat smear bez proužku dimerů linkerů

2. SSR-enrichment - hybridizace:► na fragmenty se annealuje sonda (primer) se SSR motivem,

která je na 5´ konci značená biotinem; ca 60° - 15 h

teplotní denaturace

+ sonda

Vytvoření SSR-enriched genomic library

2. SSR-enrichment – streptavidin capture, wash:► ke směsi se přidají streptavidin-coated magnetic beads: vážou

biotin a navázáním na sondu z roztoku vychytají fragmenty které nesou daný SSR motiv

separace magnetem

+ roztok streptavidin-coated

beadsodsátí roztoku

Vytvoření SSR-enriched genomic library

► magnetické kuličky s cílovými fragmenty se separují pomocí magnet. stojánku, promývají a supernatant se odstraní

► cílové DNA fragmenty se uvolní TE pufrem (95°), pomnoží pomocí PCR: linker použit jako primer, mělo

by naamplifikovat smear fragmentů 300-800 bp → a zpurifikují PCR Clean-Up kitem

a) klasická sekvenace (Sanger): umožňuje sekvenaci pouze u směsi homogenních molekul

knihovnu nutné nejdříve amplifikovat pomocí PCR – primery nasedají na linkery naligované na koncích fragmentů

PCR produkt klonován, aby se separovaly jednotlivé molekuly PCR produktu, a klony potom sekvenovány – finančně extrémně náročné!

obvykle pouze 5-10% fragmentů opravdu nese SSR!!!

př.: nutné sekvenovat ca 100-200 klonů pro získání 10 SSR lokusů = 14-28 tis. Kč

možná úspora: selekce klonů pomocí Southern blottu – jako sonda použitý opět daný SSR motiv; sekvenovány pouze klony u nichž blotting opravdu prokáže přítomnost SSR

Co dál s SSR-enriched genomic library?

b) 454 pyrosequencing umožňuje i sekvenaci směsi heterogenních

molekul (není nutné klonování)

1 molecule → 1 sequencing read

1 sample: min. 5,000-8,000 seq. reads / 2500 Kč (vlastní cena chemikálií, u komerčních firem několikrát víc)

nevýhody:

kratší délka 454 sekvencí (<550 bp) → riziko že se nepodaří najít vhodná místa pro primery → redukuje počet reálných SSR lokusů

minimální cena 1 runu je ca 30 tis. Kč (= vyplatí se multiplexovat víc vzorků, v jednom runu možné kombinovat až 12 vz., tj. náklady na 1 vzorek ca 2500 Kč)

Co dál s SSR-enriched genomic library?

Mikrosat. praktika, 16.-20.4. + 14.-18.5. restrikce genomové DNA

ligace adaptorů

hybridizace daného SSR motivu (motivů)

amplifikace a purifikace enriched SSR library

Praktika

454 sekvenování na GS Junior (Roche/454), ~ konec května:

sekvenace vytvořené SSR library, 2 dny pipetování (+ 3. den stažení dat z přístroje)