Apoptóza
Veronika Žižková Ústav klinické a molekulární patologie a
Laboratoř molekulární patologie
Apoptóza
Úvod
Apoptóza vs nekróza
Role apoptózy v organismu
Mechanismus apoptózy
Metody detekce
Úvod - apoptóza
Aktivní proces sebedestrukce, který je závislý na energii a vyžadující čas (12-24 h), byl definovaný morfologicky v roce 1972, geneticky v 80. letech
Charakterizována:
morfologicky jako karyorhexe, karyopyknóza
degradací cytoskeletu + následnou změnou tvaru cytoplasmatické membrány (tzv. blebbing)
kondenzací chromatinu
fragmentací DNA (na 180 bp úseky)
rozpadem buňky na apoptotická tělíska
Úvod - apoptóza
Apoptotická tělíska jsou fagocytována (okolními buňkami a makrofágy) a nedochází k zánětlivé reakci
Geneticky regulovaný proces, při kterém dochází k aktivaci specifických proteas a nukleas
Signály pro indukci apoptózy mohou být:
• vnější (hormonální impuls, nutriční deficience)
• vnitřní (fyzikální nebo chemické poškození DNA či endoplasmatického retikula – UV, volné radikály, cytostatika, hypoxie,…)
Nekróza
Patologický a spontánní proces, který vyvolává zánětlivé odpovědi a je významný během mikrobiálních infekcí
Příčiny vzniku mohou být např. mechanické, termické, elektrické, rentgenové, chemické,…
Chakterizována:
jako rychlý proces (několik hodin), který je nezávislý na energii
není geneticky regulována
rychlým praskáním buněčné membrány
atypickým tvarem jádra
Apoptóza vs nekróza
Kerr JF, Winterford CM, Harmon BV (1994): Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 73(12): 3108
Apoptóza vs nekróza
Apoptóza Nekróza
Děj fyziologický i patologický Děj vždy patologický
Aktivní proces vyžadující E Děj nezavislý na E
Nástup je pomalý (hodiny) Nástup je rychlý (sekundy, minuty)
Nevyvolává zánět Způsobuje zánět okolí
Aktivace kaspas Bez aktivace kaspas
Buňka se smršťuje Zvětšování objemu buněk
Apoptóza vs nekróza
Normální buňka (a); Nekrotická buňka (b); Apoptotická buňka (c)
Apoptóza vs nekróza
www.wikipedie.org
Syndaktylie – porucha apoptózy
Nekróza
Role apoptózy v organismu
Ontogeneze, tvorba orgánů (a); kontrola počtu buněk (c); odstraňování některých orgánů (ztráta ocásku u žab, slinné žlázy u housenek) (b) a poškozených buněk (d)
1. Fyziologická funkce
Baehrecke EH (2002): How death shapes life during development. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3; 779-787
Role apoptózy v organismu
Nadměrná apoptóza
•Degenerativní neurologické choroby (Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba)
•ischemické poruchy (infarkt myokardu)
•Toxické poškození jater
•AIDS
•Některé vývojové vady
Nedostatečná apoptóza
•Nádorová onemocnění (karcinomy s mutací p53)
•Imunitní abnormality (alergie)
•Autoimunitní choroby (revmatoidní
artritida)
•Infekce – bakterie –TBC, poxviry,
herpesviry
•Některé vývojové vady
2. Patologická funkce
Mechanismus apoptózy
Cytochrom C Receptory smrti modulátory
efektory Kaspasa 9
Kaspasa 8
Smrt buňky Smrt buňky
Proteiny, DNA Proteiny, DNA
VNITŘNÍ (mitochondriální)
VNĚJŠÍ (receptorová)
substrát
výsledek
Mechanismus apoptózy
• Kaspasy (Cysteinyl aspartate-specific protease)
• Neaktivní prekurzory jsou prokaspázy
• Aktivní forma vzniká proteolytickým štěpením prokaspas (v místě Asp)
• Prokaspasy se aktivují návzájem - kaskáda
• Mají specifické substráty
Pro
kaspasa 8
Pro
kaspasa 8
Kaspasa 8
Mechanismus apoptózy
• Proteiny rodiny Bcl-2 (klíčové regulátory apoptózy)
• Klasifikace dle počtu společných domén s Bcl-2 (BH: Bcl-2 homology)
• Podle aktivity se člení na antiapoptotické a proapoptotické
• Bcl-2 – první nalezený člen této rodiny, antiapoptotický efekt
• Bax – objeven na základě asociace s Bcl-2, proapoptotický efekt
Mechanismus apoptózy
• Proteiny rodiny Bcl-2 (klíčové regulátory apoptózy)
Metody detekce apoptózy
• Světelná, fluorescenční a elektronová mikroskopie
• Zaměřená na detekci morfologických změn - apoptotická tělíska, kondenzace chromatinu, puchýřkování membrány
Metody detekce apoptózy
• Využití substrátů kaspas
• Detekce štěpení např. keratinu 18 (protilátka M30 proti štěpenému fragmentu), laminu B
(inverzní průkazy) a transglutaminasy
www.roche-applied-science.com
Metody detekce apoptózy
• Změny DNA a změny na cytoplasmatické membráně
• Využití DNA žebříku nebo expozice fosfatidylserinu a vazby annexinu V
www.abcam.com
Aditivní materiály
• http://www.youtube.com/watch?v=J0u_PS2JqSY
• http://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death
• Patobiochemie buňky – J. Masopust a kol., 2003 UK Praha
• Molekulární patologie – Zdeněk Kolář a kol., Epava 2003
• Článek Vesmír - http://vesmir.cz/clanky/clanek/id/3704
Genová terapie
Genová terapie
• Genová terapie somatická – genom nemocného je pozměněn, ale změna není přenášená do další generace
• Genová terapie zárodečná – genom je změněn přímo ve vajíčku nebo spermii a změna je přenášená do dalších generací, zatím neprobíhá u vyšších obratlovců ani u člověka (celosvětové moratorium)
Genová terapie
• V současné době se většina úsilí orientuje na získané choroby, především na zhoubné nádory
Genová terapie v léčbě nádorů:
je jednodušší buňku zničit, než ji opravit (př. vyvoláním apoptózy)
vzhledem k povaze onemocnění jsou pacienti ochotni podstoupit i nové postupy
Genová terapie
• Změna v jednom genu – jednobodové mutace, např. srpkovitá anémie
• Multigenové poruchy – mutace ve více genech, často se uplatňuje i vliv prostředí, např. cukrovka, rakovina
• Mitochondriální poruchy – mutace v mitochondriální DNA je letální, např. poruchy řady orgánů
• Chromozomální abnormality – ztráta či zmnožení celých či částí chromosomů, např. Downův syndrom
Metody doručení genu do tkáně
Virální vektory Nevirální systémy
Adenoviry Injekce čisté DNA přímo
do nádoru
Retroviry Elektroporace
Lentiviry Heat-shock
Herpes simplex virus Lipofekce
Hybridní systémy
Metody doručení genu do tkáně
www.willey.co.uk/genmed/clinical
Nemoci léčené genovou terapií
Onemocnění Defekt Cílové buňky Četnost
Těžká imunodeficience
(SCID)
adenin deaminasa buňky kostní dřeně 1:1 000 000
Hemofilie krevní faktor VIII
a IX
játra, svaly ♂ 1:1 000 000
Cystická fibrosa transmembránový
regulátor CF
plicní alveoly 1:2 500
Deficience na alfa
antitrypsin
rozedma plic plicní alveoly 1:3 500
Rakovina nespecifický mnoho 1:4
Neurologické nemoci degradace neuronů neurony v mozku 1:250
Kardiovaskulární
onemocnění
arterosklerosa cévní endotel 1:2
Těžká imunodeficience (SCID)
• SCID (severe combined immunodeficiency)
• Jedna z forem se projevuje nedostatkem aktivního enzymu adenosin deaminasy (ADA) a to vede ke zpomalení dělení rychle proliferujících buněk (např. T-lymfocyty)
• U pacientů je omezena funkce imunitního systému
• „Bubble boy“ – David Vetter
(1971-1984)
www.wired.com
Těžká imunodeficience (SCID)
• Od 80.let se léčí transplantací kostní dřeně
• 1986 – injekce hovězí ADA stabilizované PEG intramaskulárně (PEG-ADA, nutno opakovat každé 2 týdny), často končí hemofilií
• 1990 – první pokus genové terapie na člověku – 4 letá Ashanti DeSilva, její
T-lymfocyty byly upraveny
ex-vivo normálním ADA
s využitím vektoru
bio3400.nicerweb.com
Těžká imunodeficience (SCID)
• 2002 – dalších 6 chlapců podstoupilo genovou terapii ex-vivo, u 4 z nich se stav výrazně zlepšil, u 2 z nich však propukla leukémie
• Pokusy jsou dnes pozastaveny a zdokonaluje se metodika, kdy transgen se zabudovává do genomu T-lymfocytu do blízkosti onkogenu
Hemofilie
• Je geneticky podmíněná choroba projevující se poruchou srážlivostí krve
• Existují 2 typy – A (absence faktoru srážlivosti VIII; ♂ 1:10 000) a B (absence faktoru srážlivosti IX; ♂ 1:70 000)
• 2011 – šesti mužům trpícím hemofilií typu B byl injikován adeno-asociovaný virus nesoucí transgen F9. Čtyři z nich mohli injekce se srážecími faktory vysadit úplně, u 2 došlo alespoň k prodloužení aplikace injekcí
Cystická fibróza
• 1989 – objeven gen CFTR, jehož poškození vyvolává CF + objevena i 1. konkrétní mutace (dnes je známo asi 1 500 různých typů)
• Chorobu vyvolává porucha iontového kanálu, který zajišťuje transport chloridových iontů přes epitely
• U lidí se zavedla jako pomocná léčba sprejování adenoviru nesoucího trangen CFTR do nosu
Rizika genové terapie
• 1999 – první případ úmrtí po genové terapii – Jesse Gelsinger (1981-1999) trpěl deficiencí ornitin transkarbamylasy (OTC)
• 50 % dětí s OTC umírá do 1 měsíce po porodu
• J.G. měl lehčí formu OTC,
kterou lze léčit medikamenty
a dietou
www.jesse-gelsinger.com
Děkuji za pozornost!