2008

Cesta k DNA

1869 němec Friedrich Miescher izoloval z buněčných jader látku, která byla bílá, slabě kyselá a obsahovala fosfor. Nazval ji proto nukleová (jaderná) kyselina.

1920 P.A. Levene objevil, že nukleová kyselina může být rozložena na jednotlivé nukleotidy. Nukleotid obsahuje pětiuhlíkatý cukr, fosfátovou skupinu, a jednu ze čtyř bází: adenin, guanin, cytosin, tymin.

Cesta k DNA

Levene učinil dva závěry, jeden správný, jeden nesprávný: každá dusíkatá báze se váže k molekule cukru,

který se dále váže k fosfátové skupině (správně) tyto nukleotidy jsou seskupeny po čtyřech v

pravidelném pořádku v útvaru, který nazval tetranukleotid. Tento nesprávný názor se udržel přes deset let.

Cesta k DNA

1928 Frederick Griffith hledal lék proti baktériím (Streptococcus pneumoniae), způsobujícím zápal plic:

Griffith měl k dispozici dvě varianty baktérií: patogení (způsobující nemoc)a neškodnou

Cesta k DNA Griffith byl překvapen, když v jedné variantě pokusu teplem

usmrtil patogenní formu a injikoval ji do myší spolu s neškodnou formou: myši zemřely a v jejich krvi byly živé patogení bakterie.

Závěr: „něco“ z mrtvých patogeních bakterií muselo přejít do neškodných a přeměnit je v škodlivé. Griffith tuto látku nazval jednoduše transforming factor

Cesta k DNA„Averyho bomba“

1944 Oswald Avery, Maclyn McCarthy a Colin MacLeod po pečlivých analýzách zjistili, že Griffithův transforming factor je DNA

Oswald Avery

Cesta k DNA

Bakteriofág = virus, který se živí bakteriemi

Na obrázku je bakterie Escherichia coli napadená fágy T4

Ve čtyřicátých letech začínají Max Delbrück a Salvador Luria experimenty s bakteriofágy.

Fág T4

Další objevy

Alfred Mirsky objevil, že všechny buňky daného organismu obsahují stejné množství DNA. Výjimkou jsou gamety, pohlavní buňky, které obsahují pouze polovinu DNA

Chargaffova pravidla

Erwin Chargaff 1947 anylzoval DNA různých organismů a objevil, že obsah jednotlivých dusíkatých bází se liší druh od druhu,

ale v rámci buněk jednoho druhu je stálý množství adeninu je stejné jako thyminu množství guaninu je stejné jako cytosinu

Alfred Hershey a Marta Chase, 1952

Bylo již známo, že fágy se sestávají z bílkovin a nukleových kyselin

rovněž bylo známo, že fágy dovedou nějak přeprogramovat bakterii v továrnu vyrábějící ve velkém množství kopie fágů

Alfred Hershey a Marta Chase, 1952

V experimentu byla použita radioaktivní síra 35S a radioaktivní fosfor 32P. Fosfor se nachází v DNA ale ne v bílkovinách, síra se naopak nachází v bílkovinách, ale ne v DNA

bakterie vykazovaly radioaktivitu, pokud byly napadeny fágem obsahujícím radioaktivní fosfor. Pokud byly napadeny fágy s radiaktivní sírou, bakterie nevykazovaly radioaktivitu

Závěr: do bakterií vstupuje DNA a ne bílkoviny

Hershey-Chase experiment

Hledání trojrozměrné struktury Začátkem 50.let již

bylo známo složení řetězce DNA

předpokládalo se, že cukrfosfátová kostra je uprostřed a báze směřují ven všemi směry

Hledání trojrozměrné struktury

Trojrozměrnou strukturu hledal Linus Pauling v USA (Kalifornie) a v Anglii Maurice Wilkins a Rosalinda Franklinová

Linus Pauling, objevitel α-helixu u bílkovin

Rosalinda Franklinová

Röentgen strukturní analýza neukazuje přímo tvar molekuly. Skvrny na obrázku jsou způsobeny tím, jak jsou röentgenové paprsky rozptýleny průchodem přes krystaly DNA. Matematicky lze z rozložní těchto skvrn odvodit trojrozměrnou strukturu molekuly

1953 James Watson a Francis Crick objevili strukturu DNA„The Double Helix!“

Watson a Crick, duben 1953

Užili výsledky röentgen srtukturní krystalografie Rosalindy Franklinové

odtud věděli šířku DNA: odhadli tak, že purin se musí párovat s pyrimidinem

užili drátěný model

Článek v Nature měl jen jednu stránku a jeden řádek...

Erwin Chargaff: „Že za našich dnů mohou takoví trpaslíci vrhat tak dlouhé stíny, jen dokazuje, že se připozdívá…“

Struktura DNA

Vodíkové můstky drží dvoušroubovici pohromadě

Mezi thyminem a adeninem jsou dva vodíkové můstky

mezi guaninem a cytosinem jsou tři vodíkové můstky

toto párování je ve shodě s Chargaffovými pravidly

Model replikace DNA

Molekula DNA má dva komplementární řetězce. A se páruje s T a C se páruje s G. Prvním krokem replikace je oddělení obou řetězců. Každý z řetězců nyní může sloužit jako matrice pro nový řetězec. Nové nukleotidy jsou potom spojeny cukr-fosfátovou kostrou. „Dceřinná“ molekula tak má jeden „rodičovský“ řetězec a jeden nový.

Replikace

Poté co Watson a Crick navrhli dvoušroubovicový model DNA, byly navrženy tři modely pro replikaci: konzervativní, semikonzervativní a disperzivní. Semikonzervativní model se ukázal správný.

Matt Meselson a Franklin Stahl

Matthew Meselson a Franklin Stahl potvrdili koncem 50.let semikonzervativní model replikace DNA

V experimentu byl použit těžký izotop dusíku, 15N

Začátek replikace

Replikace začíná na místech DNA zvaných „origins of replication“ Bakteriální chromozom, který je kruhovitý má jedno místo ori, eukaryontní chromozomy mají počátků replikace mnoho.

Jádro somatické buňky člověka obsahuje 46 molekul DNA a více než 6 miliard pb (=párů bazí; angl. bp), jedno místo ori na chromosom by nestačilo. Zkopírovat toto obrovské množství pb trvá několik hodin (S-fáze) s přesností 1 chyba na cca miliardu pb.

Počátek replikace

Počátek replikace u prokaryot

Baktérie: proteiny, schopné rozeznat sekvenci ori se k ní naváží a tím započnou replikační proces. Replikace potom postupuje oběma směry.

Počátek replikace u eukaryot

u eukarot je na každém chromosomu několik stovek až několik tisíc počátků replikace

podobně jako u prokaryot postupuje replikace na každé „bublině“ oběma směry

Elongace replikace

u prokaryot napojuje enzym DNA polymeráza 500 nukleotidů za vteřinu

u člověka je to jen 50 nukleotidů za vteřinu

Replikace

Syntézu DNA katalyzuje enzym DNA polymeráza. Tento enzym používá jeden řetězec mateřské DNA jako templát.

U bakterií je rychlost elongace asi 500 nukleotidů za vteřinu, u buněk člověka asi 50 nukleotidů za vteřinu

Energii pro replikaci dodávají trifosfáty ATP, GTP, CTP a TTP

Řetězce DNA jsou antiparalelní

Abychom odlišili číslování bází od číslování deoxyribózy, píšeme čísla uhlíků cukru s čárkou.

Každý řetězec DNA má tedy 3´konec a 5´ konec

řetězce DNA jsou antiparalelní, 5´konci jednoho řetěce odpovídá 3´konec druhého řetězce

Replikace

Dva řetězce DNA jsou antiparalelní. DNA polymeráza ovšem může syntetizovat nový řetězec DNA pouze ve směru 5´ ke 3´. Nové nukleotidy jsou tedy přiřazovány pouze k 3´ konci. Tato vlastnost způsobuje problém pro replikaci dvouřetězcové DNA

Nový nukleotid se může připojit pouze ke 3´konci

Nový řetězec DNA tedy může růst pouze ve směru 5´ 3´

Replikační vidlička

Při replikaci DNA může DNA-polymeráza jednoduše přidávat k jednomu z řetězců nukleotidy ve směru 5´ 3´. Tomuto řetězci se říká vedoucí řetězec

Při elongaci druhého vlákna nové DNA se ale DNA-polymeráza musí pohybovat ve směru pryč od replikační vidličky. Řetězec takto syntetizované DNA se nazývá opožďující se řetězec

Vedoucí řetězec

Opožďující seřetězec

Opožďující se řetězec Tak jak se replikační vidlička otevírá, jsou

následně syntetizovány nové a nové části opožďujícího se řetězce. Opožďující se řetězec je tedy syntetizován jako serie segmentů

tyto segmenty se nazývají Okazakiho fragmenty a jsou u eukaryot dlouhé 100 -200 nukleotidů

enzym DNA-ligáza pak jednotlivé Okazakiho fragmenty spojuje do souvislého řetězce

Syntéza vedoucího a opožďujícího se řetězce DNA

Vedoucí řetězec

Opožďující se (váznoucí) řetězec

Primery

DNA-polymeráza má ještě jedno omezení: může přidávat nové nukleotidy pouze k již existujícímu řetězci. Při replikaci tedy musí být nějak zařízena syntéza několika prvních nukleotidů

Těchto několik prvních nukleotidů se nazývá primer a syntetizuje jej enzym primáza. Primer překvapivě není tvořen DNA, ale RNA

eukaryotické primery jsou 10-11 nukleotidů velké

Primery

Enzymy potřebné k replikaci

Helikáza - odvíjí dvoušroubovici DNA za vzniku dvou jednořetězcových vláken. Tato vlákna jsou chráněna SSB proteiny

Primáza - tvorba primerů DNA-polymeráza

elongace nového řetězce u opožďujícího se řetězce odstranění primeru a

jeho nahrazení deoxyribonukleotidovou sekvencí Ligáza - spojuje Okazakiho fragmenty Gyráza – uvolňuje nadšroubovicové vinutí

Replikace

Při syntéze DNA a při tvorbě replikační vidlice je třeba velkého množství enzymů a dalších proteinů.

SSB proteiny chrání jednořetězcové úseky DNA (SSB = Single Strand Binding Proteins)

Helikáza

SSB proteiny

DNA polymeráza

Ligáza Primáza

DNA replikace: enzymy (shrnutí)

Replikace DNA

Replikace DNAsoučasné představy

Replikace DNAsoučasné představy

Všechny enzymy potřebné k replikaci jsou zřejmě nějak spojeny a fungují jako jeden celek

tento enzymový komplex je zřejmě ukotven k nukleoskeletu a místo, aby se pohyboval po DNA, je spíše DNA komplexem protahována

Replikace DNA je velmi přesná

Včasné doručení zásilekv USA místní poštovníslužbou

13 zpožděných zásilek na 100balíčků

Letištní odbavovací systém 1 ztracené zavazadlo ze 200Profesionální písařka se 120úhozy za minutu

1 chyba na 250 znaků

Jízda autem v USA 1 mrtvý na 104 lidí za rokDNA replikace (bez opravychybného párování)

1 chyba na 107 zkopírovanýchnukleotidů

DNA replikace (po opravěchybného párování)

1 chyba na 109 zkopírovanýchnukleotidů

Oprava chybného párování bází(DNA mismatch repair)

Kdyby špatně nasyntetizovaný nukleotid nebyl odstraněn, došlo by v příštím kole replikace k zafixování chyby

Replikační aparát udělá cca 1 chybu na 107 nasyntetizovaných nukleotidů.

99% z nich je pak odstraněno opravou chybného párování bází

jak opravný systém rozpozná který řetězec má opravit, není přesně známo

Oprava chybného párování bází(excizní reparace)

DNA je stále ohrožena, radioaktivním zářením, UV zářením, chemickými látkami atd.

každá buňka neustále monitoruje a opravuje svou DNA

u E. coli je známo asi 100 enzymů opravujících DNA, u člověka zatím asi 130

30% procent úmrtí v Evropě a USA jsou zapříčiněny rakovinou, která je způsobena selháním mechanismů opravy DNA

Oprava chybného párování bází(excizní reparace)

Na obr. je vidět vznik tzv. tyminových dimerů

toto poškození je iniciováno UV světlem

tyto dimery znesnadňují replikaci

pokud selžou opravné mechanismy, výsledkem může být choroba xeroderma pigmentosum

Xeroderma pigmentosum

Lidem s touto dědičnou chorobou chybí enzym, provádějící excizní reparaci. Po osvitu sluncem je výsledkem rakovina kůže.

Problém nedoreplikovaných konců

Ve většině opravných procesů pracují DNA-polymerázy. Ty jsou ale omezeny vlastními limity:

mohou přidávat nukleotidy pouze k 3´konci

každé kolo replikace tak produkuje stále kratší a kratší molekuly DNA

problém nenastane u kruhové DNA prokaryot

Telomery chromosomální DNA eukaryot má na svých koncích

speciální sekvence, telomery telomery neobsahují geny, ale jsou tvořeny krátkými

sekvencemi, které se mnohonásobně opakují u lidských telomer se jedná o sekvenci TTAGGG,

která je opakována 100 - 1000 krát po mnoha buněčných cyklech může nastat potřeba

obnovit stále se zkracující telomery

Telomery

Telomery jsou obarveny žlutým barvivem

Telomeráza

Prodlužování telomer způsobuje enzym telomeráza

jak ale může telomeráza nahradit sekvence, které již byly ztraceny?

Telomeráza je pozoruhodná tím, že v sobě obsahuje krátký RNA řetězec, který slouží jako templát, matrice pro prodlužování 3´konce telomery

Telomeráza

Telomeráza však překvapivě není přítomna ve většině buněk mnohobuněčných organismů

telomeráza naopak je přítomna v tzv. germ-line cells, ze kterých vznikají gamety

Telomeráza

Telomeráza je překvapivě přítomna rovněž u buněk rakovinných nádorů

pokud se prokáže její vliv na udržení nesmrtelnosti rakovinných buněk, mohla by se stát důležitým cílem pro diagnózu i terapii rakoviny

Telomeráza

Telomeráza

Telomeráza

Centrální dogma

Centrální dogma molekulární biologie popisuje dvoustupňový proces, kterým se dostává informace uložená v genech do proteinů:

DNA RNA protein

Jakmile se jednou informace dostane do bílkoviny, již se nemůže dostat zpět

Dějiny

Beadle a Tatum (pokusy s Neurospora crassa): one gene – one enzyme

později: jeden gen – jeden protein ještě později: jeden gen – jeden

polypeptidový řetězec

Transkripce a translace u prokaryot

U prokaryot je transkripce spojená s translací; translace začíná již ve chvíli, kdy je mRNA teprve syntetizována

(u eukaryot transkripce probíhá v jádře a translace v cytoplazmě)

Transkripce a translace u prokaryot

Protože u prokaryot chybí jádro, které by prostorově oddělovalo transkripci a translaci, translace nastává už během transkripce.

Transkripce a translace u eukaryot

U eukaryot je transkripce od translace oddělena v čase i prostoru. Transkripce probíhá v jádře a jejím výsledkem je

pre-mRNA (=hnRNA)

Transkripce a translace u eukaryot

Tato pre-mRNA je potom upravována až vznikne mRNA která opouští jádro a v cytoplazmě se účastní translace.

Transkripce a translace u prokaryot a eukaryot

Gen Strukturní gen = úsek DNA řetězce, jehož informace se

vyjadřuje v primární struktuře polypeptidu jako translačního produktu

Gen pro funkční RNA = úsek DNA řetězce přepisovaný do primární struktury tRNA nebo rRNA případně dalších druhů RNA, které nejsou určeny k translaci

Gen jako regulační oblast = úsek na DNA plnící regulační funkci, který je rozeznáván specifickým proteinem signalizujícím zahájení nebo zastavení transkripce

Gen Strukturní gen = úsek DNA řetězce, jehož informace se

vyjadřuje v primární struktuře polypeptidu jako translačního produktu vývojové geny – určují stavební plán těla, regulují jeho vývoj terminální cílové geny – jsou využívány jen v některých

diferencovaných typech buněk a jejich aktivita je spouštěna vývojovými geny

metabolické geny (housekeeping genes) řídí produkci látek nezbytných k zajištění základních životních funkcí

Gen pro funkční RNA = úsek DNA řetězce přepisovaný do primární struktury tRNA nebo rRNA případně dalších druhů RNA, které nejsou určeny k translaci

Gen jako regulační oblast = úsek na DNA plnící regulační funkci, který je rozeznáván specifickým proteinem signalizujícím zahájení nebo zastavení transkripce

Existují cca 4 typy RNA; každá je kódována svým vlastní typem genů.

Genomová DNA obsahuje všechny informace o struktuře a funkci organismu

V konkrétní buňce jsou ovšem pouze některé geny exprimovány (přepsány do mRNA a proteinů)

Jsou 4 typy RNA, každá kódována svým vlastním typem genu

mRNA (messengerová RNA): kóduje aminokyselinovou sekvenci polypeptidu

tRNA (transferová RNA) – přináší do ribozómu aminokyseliny během translace

•rRNA (ribosomální RNA) – spolu s ribozomálními proteiny vytváří ribozómy, organely, na kterých probíhá translace mRNA•snRNA (small nuclear RNA) spolu s proteiny tvoří komplexy které se uplatňují při sestřihu pre –mRNA u eukaryot (nikoli u prokaryot)

Strukturní gen (= gen který kóduje protein) se sestává z

promotoru – sekvence nukleotidů která určuje kde přesně začne transkripce

kódující sekvence určuje pořadí aminokyselin v polypeptidu terminátor – sekvence která určí konec transkriptu RNA

RNA je strukturálně podobná DNA

Transkripce v eukaryotické buňce…

…má tři fáze:1. iniciace2. elongace3. terminace

DNA řetězce

5´AGTACG 3´nebo 5´CGTACT 3´kódující/sense/+ řetězec3´TCATGC 5´ nebo 3´GCATGA 5´matrixový/antisense/ - řetězec

5´AGUACG 3´ nebo 5´CGUACU 3´ mRNA Ser Thr Arg Ser protein

kódující řetězec = sense řetězec = Watsonův řetězec = plus řetězec = RNA sekvence

matrixový řetězec = antisense řetězec = Crickův řetězec = minus řetězec = reversní řetězec

DNA řetězce

CpG = takto označujeme cytosin a guanin na jednom řetězci DNA

CG = takto označujeme cytosin a guanin na komplementárních řetězcích dvoušroubovice

DNA Escherichia coli

DNA eukaryotického chromosomu

tmavě je zbytek proteinového lešení

Syntéza RNA spočívá v rozpletení DNA řetězců a v tvorbě RNA molekuly v 5´ ke 3´směru. Reakci katalyzuje RNA- polymeráza, která používá řetězec DNA jako templát.

RNA polymeráza

prokaryota mají jediný typ RNA polymerázy

eukaryota: RNA polymeráza I. RNA polymeráza II. – jen ta vytváří mRNA RNA polymeráza III.

Transkripce začíná na promotoru, pokračuje přes kódující sekvenci a končí na terminátoru.

Transkripce

Promotor: místo na DNA, obvykle několik desítek bp před začátkem přepisovaného úseku. Důležité místo je TATA box, asi 25 bp „proti proudu“

Na promotor se naváže proteiny zvané transkripční faktory

Na tento útvar se naváže RNA polymeráza.Transkripční iniciační komplex = promotor + transkripční faktory + RNA polymeráza

celých 6 % genomu eukaryot jsou geny kódující transkripční faktory!

Promotorypro hlubší zájemce

• TATA box = asi -25pb proti proudu– jedná se o variace na sekvenci TATAAA– mutace v TATA elementu neovlivní iniciaci

transkripce, ale transkripce začne na nesprávném nukleotidu

• GC box– jedná se o variace na sekvenci GGGCGG– nachází se v mnoha genech, i v těch, kterým chybí

TATA box

• CAAT box = asi – 80pb proti proudu– velmi silně ovlivňuje sílu promotoru

Promotorypro hlubší zájemce

• enhancery = posilovače transkripce (o kterých ještě bude řeč) = sekvence DNA nalézaných často i ve velkých vzdálenostech od promotoru– váží se na ně regulační proteiny, dojde k ohybu DNA

a enhancery se dostanou do těsné blízkosti promotoru

– proteiny vážící se k enhancerům interagují s transkripčními faktory na promotoru nebo i s RNA polymerázou

• silencery = regulační sekvence se stejnými vlastnostmi jako mají enhancery, ovšem tentokráte inhibují transkripci

mRNA u prokaryot

mRNA u eukaryotTranskript eukaryotického genu je molekula, která musí být ještě upravena; jsou z ní vystřiženy některésekvence (introny)

Elongace

RNA polymeráza rozplétá asi 10-20 nukleotidový úsek DNA.RNA polymeráza vytváří u eukaryot premRNA rychlostí asi 60 nukleotidů za vteřinupo průchodu RNA polymerázy se obnovuje dvoušroubovice DNA

Terminace transkripce elongace pokračuje, dokud RNA polymeráza nenarazí na

terminační sekvenci na DNA existuje zřejmě několik typů terminace transkripce, detaily

stále nejsou známy u prokaryot terminace končí přesně v místě terminačního

signálu u eukaryot porbíhá transkripce ještě několik stovek

nukleotidů za terminačním signálem, kterým je sekvence AAUAAA na pre-mRNA

ovšem několik desítek nukleotidů za touto sekvencí je pre-mRNA odstřižena od RNA polymerázy

na pre-mRNA je potom navázán tzv. poly(A) tail

Transkripce - opakování

Eukaryotické buňky po transkripci

modifikují pre-mRNA oba konce pre-mRNA jsou změněny:

5´konec nese tzv. čepičku (=modifikovaný guanin)

na 3´konec je nasyntetizováno 50 – 250 adeninových nukleotidů

5´ konec: čepička

čepičku tvoří 7-methylguanosin vázaný na další nukleotid trifosfátem

čepička má dva úkoly: chrání pre-mRNA před

účinkem hydrolytických enzymů

je signálem pro navázání se k malé ribozomální podjednotce, čímž začíná translace

Sestřih pre-mRNA

Většina eukaryotických genů obsahuje segmenty zvané introny, které přerušují sekvence kódující aminokyseliny (exony)

Transkriptem těchto genů je pre-mRNA (precursor – mRNA)

Pre-mRNA je upravena v jádře tak že jsou vystřiženy introny a exony jsou spojeny do mRNA. Tato mRNA opouští jádro a v cytoplazmě podléhá translaci.

Sestřih

průměrná pre-mRNA je asi 8 000 pb dlouhá

průměrná mRNA je asi 1200 pb dlouhá a dává vznik proteinu tvořenému asi 400 aminokyselinami

tato čísla jsou pouze průměrná, výjimky existují na obě strany

člověk: čím delší gen, tím více intronů

Sestřih

Introny a exony

intron = část pre-mRNA, která bude vystřižena

exon = část pre-mRNA, která bude exprimována do proteinového řetězce

do cytoplazmy se dostává již sestřižená mRNA

Intergenic DNA = nekódující sekvence DNA nacházející se mezi geny

Sestřih pre-mRNA obrázek znázorňuje pre-mRNA pro ß-globin,

jeden z polypeptidů hemoglobinu čísla označují kódóny, ß-globin má délku 146

aminokyselin

Eukaryotická pre-mRNA obvykle obsahuje introny. Pomocí částic snRNP jsou introny vystřiženy a exony připojeny k sobě

•snRNP, jak již název napovídá, se nachází v jádře a jsou tvořeny z tzv. snRNA a proteinů•snRNA = small nuclear RNA, snRNA je cca 150 nukleotidů dlouhá•několik různých snRNA se spojují s proteiny za vzniku snRNP (small nuclear ribonucleoproteins)•snRNP se spojují ještě s dalšími proteiny za vzniku spliceosomu

Introny

většina intronů začíná sekvencí GT a končí sekvencí AG (GT-AG, respektive GU-AG)

kromě GT a AG je třetím důležitým místem tzv. branch site, které je většinou situováno asi 40 nukleotidů před koncovou sekvencí AG

jen mál intronů začíná AU a končí AC (AU-AC) a jsou zvané AT-AC introny

Fáze sestřihu

štěpení primárního transkriptu (=pre-mRNA) na 5´ začátku intronu

nukleofiliní atak koncového G nukleotidu na A nukleotid na branch site za vzniku lasovité formy

štěpení intronu na 3´konci a uvolnění lasovité RNA (lariat RNA)

Fáze sestřihu

Sestřih pre-mRNA

snRNP (= malé jaderné ribonukleoproteinové částice = small nuclear ribonucleoprotein particles; jedná se o komplex snRNA a proteinů) se navážou k intronu a vytvoří spliceosom

Intron je vystřižen a exony jsou připojeny k sobě

Výsledná mRNA může opustit jádro a v cytoplazmě podléhá translaci

Spliceosom

se sestává z pěti typů snRNA a z více než 50 proteinů vazbou proteinů k snRNA vznikne snRNP

snRNA se váže k RNA, která má být sestřižena za vzniku RNA-RNA párování bází

Ribozym

někdy může pouze snRNA způsobit sestřih bez pomoci proteinů (pozorováno u prvoka Tetrahymena)

objev učinil v 80. letech Thomas Cech v USA padlo tím dogma, že enzymem může být

pouze protein… … a napovídá to představě, že při vzniku

života byla prvotní RNA před proteiny

Ribozym

v této souvislosti stojí za to uvést, že i ribozóm je de facto ribozym – vlastní syntézu proteinu – tvorbu peptidické vazby - katalyzuje rRNA a nikoli ribosomální proteiny, které mají zřejmě jen podpůrnou funkci

ribozóm je možno chápat jako ribozym stabilizovaný proteiny

dříve snad existovaly ribozómy tvořený pouze z rRNA bez proteinů

Polyadenylace

Odstřižení primárního transkriptu (=pre-mRNA) se děje asi 15-30 nukleotidů za terminačním signálem AAUAAA

Evoluční důležitost intronů: alternativní sestřih

introny snad plní v buňce regulační funkci samotný proces sestřihu jistě reguluje průchod

mRNA ven z jádra introny ale s určitostí umožňují tzv. alternativní

sestřih např. u drosofily zřejmě alternativní sestřih jedné

pre-mRNA určuje výsledné pohlaví! u člověka se alternativním sestřihem vysvětluje

relativně malý počet genů (možná jen kolem 20 000)

Alternativní sestřih

u člověka odhadováno snad až 40 % genů má alternativní sestřih

Evoluční důležitost intronů

proteiny obsahují rovněž často úseky nazývané domény

např. jedna doména může tvořit aktivní místo enzymu, zatímco druhá může enzym kotvit k membráně

introny pak umožňují crossing-over v místech, kde „neškodí“ a způsobí pak přeskupení jednotlivých exonů a tím i vznik proteinů nových vlastností

Domény

Centrální dogma molekulární biologie

Základním stavebním kamenem bílkoviny je aminokyselina

V živých organismech je známo 20 aminokyselinkteré se odlišují svojí R- skupinou

Zde jsou čtyři z nich

Peptidová vazbaAminokyseliny jsou spolu spojeny prostřednictvím peptidové vazby.Peptidová vazba je tvořena mezi karboxylovou skupinou jedné aminokyseliny (na obrázku Amino acid 1) a aminoskupinou druhé aminokyseliny (Amino acid 2)

Genetický kód: od RNA k proteinu Jazyk RNA se překládá do jazyka proteinů.

Genetický kód nazýváme tripletový, protože tři nukleotidy v RNA specifikují jednu aminokyselinu v proteinu

RNA se sestává ze čtyř „písmen“: A,U,G,C

Tripletový kód

Genetický kódGenetický kód byl rozluštěn na počátku šedesátých let XX. století

Rozluštění genetického kódu

1961: Marshall Nirenberg vytvořil umělou mRNA, která se sestával ze samých uracilů: UUUUUUUUUUUUUUUU atd.

výsledkem translace byla bílkovina, sestávající ze samých fenylalaninů: phe-phe-phe-phe atd.

Nirenberg uzavřel: kodón UUU kóduje fenylalanin

do 1965 byl znám celý genetický kód

Genetický kód se musel vyvinout velmi dávno

Genetický kód je (téměř) univerzální, sdílí jej celá živá příroda, od nejjednodušších bakterií po savce

příjemným důsledkem je, že díky technikám genových manipulací jž dnes baktérie vyrábí látky důležité pro člověka (např. insulin, STH)

Rostlinka tabáku, do které byl vložen gen pro luciferázu od světlušek.

Genetický kód se musel vyvinout velmi dávno

Do těchto prasat byl vložen gen z medúzy a prasata ve tmě světélkují

Genetický kód je tripletový

AUG je startovní kodón, kóduje metionin

UAA, UAG, UGA jsou stop kódony

Genetický kód je degenerovaný: ve většině případů je jedna aminokyselina kódována víc než jedním tripletem (max. 6)

Mitochondriální kód se v pěti trojicích liší

Čtecí rámec

kódony mezi sebou nemají mezery, ale přesto jsou čteny jako třípísmenková „slova“. Čtecí rámec specifikuje první písmeno, od kterého začínáme číst a dává nám smysl věty:

děd jed med ědj edm ed anglická verse:

The red dog ate the cat her edd oga tet hec at nebo Why did the red bat eat the fat rat? W hyd idt her edb ate att hef atr at

Translace v eukaryotické buňce

Strukturní gen je přepsán do pre-mRNA

Pre-mRNA je upravena do mRNA

mRNA opouští jádro Na ribozómech

podléhá mRNA translaci a vzniká polypeptidový řetězec

V prokaryotické buňce je transkripce spojena s translací

mRNA se sestává z vedoucí sekvence,(leader)transkripční jednotky a koncové sekvence (trailer)

Jednotlivé mRNA se odlišují ve složení nukleotidů, kterýmijsou kódovány jednotlivé aminokyseliny, ve čtecím rámci a rovněž odlišným složením vedoucí a koncové sekvence

Eukaryotická mRNA

Ribozómy

Ribosómy jsou organely na kterých probíhá translace mRNA.

Ribozóm se sestává ze dvou podjednotek, které obsahují rRNA a proteiny

na ribosomu jsou tři místa:ExitPeptidylovéAminoacyové

Současné představy o stavbě ribozómu

Prokaryotická buňka obsahuje 10 000 i více ribosomů

Současné představy o stavbě ribosomu

Ribozóm se skládá z větší a menší podjednotky

A = aminoacylové místoP = peptidylové místoE = exit

Prokaryotický a eukaryotický ribozóm

30S16S rRNA (1 542 nukleotidů )

21 proteinů

50S5S rRNA (120 nukleotidů)

23S rRNA (2 904 nukleotidů)34 proteinů

60S5S rRNA

5,8S rRNA28S rRNA40 proteinů

40S18S rRNA 30 proteinů

80S70S

Prokaryota Eukaryota

Při translaci prochází mRNA skrze ribozóm. Zde jsou rozpoznány kódony mRNA pomocí transferové RNA, která přinese příslušnou aminokyselinu

Každá ribozomální podjednotka se sestává z rRNA (=ribozomální RNA, kterou kodují rRNA geny) a z ribozomálních proteinů

U eukaryot má větší podjednotka sedimentační konstantu 60S (pojmenovanou podle toho, jak rychle sedimentuje při centrifugaci) a obsahuje 28S; 5,8S a 5S rRNA a asi 50 ribozomálních proteinů

Malá podjednotka má konstantu 40S a obsahuje 18S rRNA a asi 30 proteinů

tRNA 75 – 80 nukleotidů

tRNA přináší během translace aminokyseliny do ribozómu a tyto aminokyseliny jsou včleněny do polypeptidového řetězce

tRNA

tRNA

tRNA jsou kódovány tRNA geny

Všechny tRNA mají podobný tvar a velikost

Všechny tRNA končí na 3´konci sekvencí CCA; zde se k nim váže příslušná aminokyselina

Na opačném „konci“ tRNA molekuly je antikodon, který během translace „čte“ kodony na mRNA

Ala - tRNA

Pokud z 64 kodónů jsou tři terminační, mělo by existovat 61 druhů tRNA.Existuje ale jen 45 druhů tRNA. Toto množství stačí, neboť tRNA mají antikodóny, které jsou schopny rozeznat i více než jeden kodón.například U na 5´konci antikodónu se může vázat jak s A tak i s G na antikodónu. Jevu se říká „Pravidlo o kolísání párů bazí“

Aminoacyl-tRNA syntetázy

Enzym zvaný aminoacyl-tRNA syntetáza navazuje správné aminokyseliny k správným tRNA

Správná aminokyselina se naváže na správnou tRNA pomocí enzymu zvaného aminoacyl-tRNA syntetáza. Proces se nazývá aminoacylace

Protože se do bílkovin začleňuje 20 druhů aminokyselin, existuje 20 druhů aminoacyl-tRNA syntetáz

Všechny tRNA nesoucí stejnou aminokyselinu jsou „nabity“ pomocí stejného enzymem, ačkoli se antikodony příslušné tRNA mohou odlišovat

Iniciace translaceIniciační komplex translace se sestává z obou

ribozomálních podjednotek a iniciátorové tRNA(met-tRNA) která se přičlení na startovní kodon na mRNA

Iniciace translace

Elongace polypeptidového řetězceElongace začíná přičleněním aminoacyl-tRNA

ke správnému kodonu na A místě ribozomu

Elongace translace

Terminace translaceNa stop kodon se navazuje bílkovina zvaná „release factor“

a syntéza polypeptidu je ukončena. Nově vzniklý polypeptid se uvolní od tRNA; tRNA se uvolní z ribozómu a dvě

ribozomální podjednotky se uvolní od mRNA

Syntéza polypeptidu pokračuje dokud není dosaženo stop kodonu

Terminace translace

PolysomyV daném čase může tutéž mRNA číst několik ribozómů

Celému útvaru se říká polyribozóm nebo polyzóm

Polysomy

Danou mRNA může v daném čase číst více ribozómů

Tímto způsobem je možné vytvořit současně mnoho polypeptidů z jediné mRNA

Iniciace Elongace Terminace

Polyribozómy

Ribosomy

v eukaryotické buňce existují ribosomy dvojího typu: volné v cytoplasmě vázané na endoplasmatické retikulum (drsné ER)

na volných ribosomech jsou syntetizovány proteiny potřebné pro buněčný provoz

na ribosomech vázaných k ER se syntetizují proteiny potřebné pro endomembránový systém a proteiny „na export“)

ribosomy obou skupin jsou identické a mohou svou pozici v buňce měnit

Ribosomy

jak je ale možné, že některé ribosomy jsou volné a jiné vázané?

syntéza všech proteinů začíná na volných ribosomech v cytoplasmě, kde se mRNA napojuje na volný ribosom

takto syntéza pokračuje dál, pokud sám vznikající protein neobsahuje signál, aby se ribosom připojil k ER

proteiny pro endomembránový systém a na export obsahují signální peptid, který poutá protein k ER

Signální peptidy určují právě vzniklým proteinům jejich buněčnou destinaci

Signální peptid

signální peptid je tvořen sekvencí cca 20 aminokyselin na nebo poblíž N-konci vznikajícího peptidu

signální peptid je rozeznán tzv. SRP částicí (signal-recognition particle). Tato částice poutá peptid a ribosom k receptorovému proteinu v membráně ER.

receptorový protein v sobě obsahuje pór, kterým peptid pronikne do ER. Enzymy potom signální peptid obyvkle odstraní

Spojení transkripce a translace v prokaryotické buňce

Protože v prokaryotické buňce chybí jádro, transkripce je spojena s translací a nově vzniklý protein se může rychle přesunout na své místo v buňce

Transkripce a translace v eukaryotické buňcepřehled

Mutace

Bodové mutace = změna jediného nukleotidu Inzerce Delece substituce

Srpkovitá anémie

Substituce

= Nahrazení nukleotidu (a jeho komplementárního partnera) jiným nukleotidem

Některé substituce jsou tzv. tiché mutace. Díky redundanci genetického kódu je totiž kódována stejná aminokyselina. Kdyby např, v DNA proběhla mutace z CCG na CCA, mRNA by měla změněný kodón z GGC na GGU. Oba kodóny však znamenají“glycin“, takže na struktuře proteinu se mutace neprojeví

Substituce

Jiné substituce se sice projeví tak, že dojde ke změně aminokyseliny; pokud ale má nová aminokyselina podobné vlastnosti a není v aktivním centru či jiné důležité oblasti proteinu, změna se téměř nemusí projevit

„missense muattions“ – záměna jedné aminokyseliny za jinou

„nonsense mutations“ – záměna aminokyseliny za stop kodón

Kategorie bodových mutací

Mutageny

Spontánní mutace = mutace, u kterých neznáme přčinu

Mutagen = fyzikální či chemická agens, která způsobí mutaci Rentgenové paprsky UV záření (tyminové dimery) Řada chemických látek

Inzerce a delece

Inzerce = přidání jednoho nukleotidu (nebo bp)

Delece = ztráta nukleotidu (či bp) Obě tyto mutace mají devastující efekt,

neboť mění čtecí rámec. Vznikne tedy úplně jiný polypeptid

Kategorie bodových mutací