Replikace DNA- DNA replikace (kapitola 10)- Replikace chromozómu u bakterií (kapitola 10)- Replikace plasmidů (částečně kapitola 25 + 20)- Replikace lineárních chromozómů u Eukaryot (kapitola 10)- PCR (kapitola 6)
Buněčné dělení vs. reprodukce
Jednobuněčný organismus
• Buněčné dělení a reprodukce je simultální
• Prokaryota (baktérie)• Eukaryota (Protista)
Mnohobuněčný organismus• Buněčné dělení vede k
diferenciaci (zvětšení objemu jedince a jeho komplexity)
• Reprodukce• asexuální• sexuální (meióza)
• Horizontální přenos genů - přenos DNA bez reprodukce• Vertikální přenos genů - z generace na generaci
DNA struktura
DNA se skládá ze dvou antiparalelních řetězců tvořící většinou pravotočivou šroubovici. Báze jsou uvnitř, fosfo-diesterová kostra zvnějšku.
fosfodiesterová kostra
báze
malý žlábek
velkýžlábek
sense vlákno
antisensevlákno
DNA replikace• 50. léta
DNA replikace - Meselson-Stahl pokus• 1958• „ the most beautiful experiment in biology“
DNA replikace• DNA musí být rozdělena na 2 vlákna (enzymatický komplex
replisome)• Každé vlákno je replikováno (původní vlákno slouží jako
templát) – replikace je semikonzervativní
Obecný mechanismus replikace
• Počátek replikace (ori)• DNA polymeráza (DNAP)• Vždy ve směru 5‘ 3‘ • Leading strand vs lagging strand
Obecný mechanismus replikace
• DNA polymeráza potřebuje RNA primer• Okazakiho fragmenty (1000 – 2000bp)• Odstranění primerů exonuklázovou aktivitou
DNAP• Ligace niků
Obecný mechanismus replikace
• Nukleotidy jsou prekurzory pro DNA syntézu• dNTPs jsou vytvořeny z NTPs ribonucleotide
reduktázou, kromě dUTP
Obecný mechanismus replikace
• Polymerizace nukleotidů
Obecný mechanismus replikace
• DNA polymeráza (Objevena v roce 1956 A. Kornbergem (E.coli)• Syntetizuje ssDNA ve směru 5‘ - 3‘• Může mít exonukleázovou aktivitu ve směru 3‘- 5‘• Potřebuje primer • Neumí rozplétat dvouvlákno
• DNA polymeráza III – replikační enzym• DNA polymeráza I – odstraňuje primery• DNA polymeráza II – reparační enzym
DNA polymeráza III• Několik podjednotek• DnaE (-podjednotka, syntéza)• DnaQ (-podjednotka, proof-reading – korekturní aktivita)• HolE (-podjednotka, potřebná pro stabilitu)• DnaN (-podjednotka)• Přídatné podjednotky (, , , , ) – clamp loading complex
DNA polymeráza III• Korekturní aktivita – proofreading activity• 1 chyba na 109 bází
Syntéza lagging, opožďujícího se vlákna• Okazakiho fragmenty• Priming complex – primosom• PriA vyváže SSB• Naváže se primáza (DnaG)• Syntetizuje krátký RNA fragment
Syntéza lagging, opožďujícího se vlákna• Ukončení syntézy• Série fragmentů, které nejsou
spojeny• 3-krokové spojení daných
fragmentů: Ribonukleáza H, DNA polymeráza I a DNA ligáza
Topologické problémy při replikaci DNA• Rozpletení dvoušrobovice (800b/s) pomocí helikázy• Oba řetezce je nutno oddělit a prootočit (-100 na 1000b)• Chromozom nemůže jen tak rotovat • Vzniklé napětí je uvolněno topoisomerázami (DNA gyrázou)
• DNA gyráza zavádí negativní superspiralizace a tím uvolňuje pozitivní superspiralizaci způsobenou helikázou
Replikační proteiny v E.coli
DnaA Váže se na počátek replikace (ori)
Helicase Uvolňuje dsDNA
DnaC Pomáha helikáze při vazbě na DNA
SSB Udržuje ssDNA
Primase Syntéza RNA primerů
RNaseH Odstranění RNA primerů
PolI Vyplňuje mezery mezi Okazakiho fragmenty
Polymerase III ,,,,,,, ‘,,
DNA ligase Liguje niky, zvlášte pak v lagging vláknu
DNA gyrase a podjednotka, zavádí negativní supercoily
Topoisomerase IV Štípe a liguje dsDNA, uvolňuje pozitivní otáčky
Komplex replikační vidličky• Proteiny, které se účastní replikace• DNA gyráza• Helikáza• Single-strand binding protein• DNA polymerase
Replikace kruhové molekuly• Baktérie• 2 replikační vidličky (-replikace)• DNA replikace a buněčné dělení je synchronizováno• iniciace replikace v ori (oriC)• Iniciační komplex obsahuje 5 proteinů: DnaA, DnaB, DnaC, DNA gyrázu,
SSB• oriC obsahuje repetice 3x GATCTNTTNTTTT a 4x TTATNCANA • Vazba DnaA proteinu• Na rozvolněnou DNA se naváže DnaB a DnaC – začátek replikační vidličky• Helikáza aktivuje primázu a tím pádem syntézu primeru
Replikace kruhové molekuly• Ukončení replikace – Ter místa• Replikace probíha v obou
směrech (po směru a proti směru hodinových ručiček)• TerC, TerB, TerF • TerA, TerD, Ter E• Vážou Tus proteiny • Jejich delece jsou slučitelné se
životem, replikační vidlička je nepotřebuje k ukončení replikace
• Separace spojených molekul toposiomerázou IV
Buněčné dělení a replikace • Generační čas E. coli od
20-ti minut po několik hodin
• Replikace chromozómu vždy 40minut
• Kompletace buněčného dělení 20 minut
Replikon• Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace (kruhová s ori, nebo
linearní)• Genomy virů, viroids• Chromozómy - kruhové• Chromozómy - lineární (konce musí být chráněné před
exonukleázovou aktivitou – smyčky, nebo proteiny)• Genomy mitochondrií a chloroplastů• Plasmidy – prokaryotické (kruhové a lineární)• Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek)• Mitochondrie• Plastidy (primární a sekundární)
Plasmidy• Kruhové molekuly DNA samostatně se množící• Vyjímka jsou lineární plasmidy a RNA plasmidy (zjednodušené RNA viry)
• Parazitují na buněčném aparátu pro svou replikaci• Přinášejí buňce určitou selekční výhodu• Nemohou být bez buňky• Vyskytují se v různém počtu (obvykle 1-2 plasmidy/chromozóm, ale až
50)• Velikost plasmidu je velmi různá• Plasmidy mohou nést gen zajišťující resistenci na antibiotikum• Kryptické plasmidy (bez očividné funkce)• F-plasmidy – specificke pro E.coli a baktérie rodu Shigella a Salmonela• P-plasmidy – promiskuitní• Transferability vs mobility• Některé plasmidy mohou být lineární (z Borrelia a Streptomyces)
Lineární plasmidy - vyjímka• Nalezeny u některých baktériích a hub• Nemají telomery• Vlásenková struktura chrání konce DNA u Borrelia (plasmid je
velmi důležitý pro virulenci borélií)• dsDNA vazebné proteiny chrání konce DNA u Streptomyces
Replikace plasmidu• Obousměrná replikace • Replikace valivou kružnicí
Replikace valivou kružnicí je také používána viry• Stejný mechanismus replikace ukazuje na příbuzný vztah mezi
plasmidy a viry
Mechanismus replikace plasmidu F - konjugace• Nejstarší známý plasmid (byl náhodou přítomne v izolátu E.coli
K12, Stanford, 1928)• Nízké copy number, 100kb• Konjugativní vlastnosti• Tra+ transfer positive plasmidy • tra geny (nejméně 30 genů)• F+ (donor) and F- (recipient)• Bakteriální sex
Mechanismus replikace plasmidu F - conjugation• Replikace valivou kružnicí• ssDNA se pohybuje skrz konjugační most do druhé buňky• Některé malé plasmidy jsou tra-, ale mob+ (mohou být mobilizovány
za přítomnosti Tra+ plasmidu)
Přenos chromozomální DNA díky F-plasmidu • Integrace plasmid do chromozomu přes IS místa (insertion
sequence)• baktérie, které mají F plasmid v chromozómu - Hfr strains• Celý chromozóm může být přenesen za 90 minut• F plasmid se umí vyštípnout z chromozómu, nese část
chromozómu – F‘ plasmid
Přenos chromozomální DNA díky F-plasmidu • Integrace plasmid do chromozomu přes IS místa (insertion
sequence)
Kontrola počtu plasmidů v buňce pomocí anti-sense RNA• High copy plasmid regulují svůj počet pomocí limitace startu
replikace• Low copy plasmid – striktní regulace, replikují se s replikací buňky• Regulace studovaná pro plasmid ColE1 • Iniciace replikace ColE1• Syntéze pre-primeru (555bp) – RNA_II• Je štípnut ribonukleázou H (volný 3‘-OH)
• Tento enzyme je specifický pro DNA:RNA • DNA polymeráza pokračuje • NEBO• Syntéza RNA_I – 108bp, váže se na RNA_II• Ribunukleáze nemůže štípnout RNA_II • DNA polymeráza nemá volný 3‘-OH konecx• Replikace nemůže začít
Závislost buňky na plasmidu• Buňka přežije pouze v případě, že si udrží plasmid• 2 komponenty produkované plasmidem: toxin (více stabilní) and
protijed (méně stabilní)• Protein-based operon F-plasmidu: CcdA (protijed) a Ccd B (toxin,
inhibuje DNA gyrázu)• RNA-based systém: protijed je antisense RNA, která neumožňuje
translaci toxinu (Hos-killing protein – Hok and Sok antisense RNA)
• Benefiční plasmidy• Resistence na antibiotika• Resistence na těžké kovy• Resistence vůči UV atd. (Table 20.01)
Plasmidy s resistencí na antibiotika• R plasmidy• Objeveny během 2.svět. války v
Japonsku• Bacteria Shigella resistentní vůči
sulfonamidům• R plasmidy jsou transferu schopné• Resistentní kmeny baktérií jsou velmi
problematické• Zákaz používaní lidských antibiotik na
prevenci nákazy u zvířat• Použití v genovém inženýrství
Resistance vůči -laktam antibiotikům• Nejrozšířenější skupina antibiotik (penicilín, ampicilín,
cephalosporin)• Působí na buněčnou stěnu baktérií• Obsahují -laktam kruh• Resistence díky enzymu -laktamázy (bla gen) • Modifikace antibiotické struktury – více odolná na štěpení enzymem• Administrace antibiotika + lactam analogu (clavulanic kyselina), který
se váže na enzym
Resistence to chloramphenicol• Chloramphenicol, streptomycin a kanamycin• Působí na bakteriální translaci (vážou se na 23S rRNA)• Resistence:• Chromozomální mutace ribosomálních proteinů – nedojde k
inhibici pomocí antibiotika, ale sníží se efikace translace• Plasmidová – chloramphenicol acetyl transferáza (CAT)
Rezistence na aminoglykosidy• Streptomycin, kanamycin, neomycin• Obvykle 3 cukerné kruhy, z nichž alespoň jeden nese aminokyselinu• Vážou se na SSU ribozómu a inhibují translaci• Inaktivace jejich aktivit pomocí modifikací (fosforylace, acetylace,
adenylace)• Resistence: neomycin phosphotransferase (npt gen)• Derivát kanamycinu U – Amikacin – jeho acetylace schopný cukerný
zbytek je blokován hydroxybutyratovou skupinu – i přes to již došlo k evoluci nové N-Acetyl transferázy, která je schopna acetylovat tuto molekulu
Resistence vůči tetracyklinu• Tetracyklin se váže na 16S rRNA a inhibuje translaci• Inhibuje prokaryotickou i eukaryotickou translaci (eukaryota
ho aktivně neimportují, spíše naopak, efektivně ho exportují)• Resistence:• Plasmid R kódující transporter, který umožnuje efektivní export
tetracycklinu zpět do prostředí
Ti plasmids• Tumor-inducing (Ti)• Přenos mezi baktérií a rostlinou• Ti plasmid se nachází v baktérii
Agrobacterium• Část plasmidu je přenesena do
rostlinné buňky pomocí procesu připomínající konjugaci
• Dojde k začlenění (náhodnému) do chromozómu a k expresi růstových hormonů – nádor a místo pro množení baktérie
Ti plasmid• T oblast plasmidu obsahuje
geny pro auxin (zvětšuje objem buňky), cytokin (indukuje replikaci buňky) a opin (zdroj energie pro bakéterii)
• Ti plasmid může vstoupit také du kvasinkové a savčí buňky (v laboratoři)
• Použití v genovém inženýrství• Arabidopsis thalianna – 27 000
genů přerušeno pomocí Ti plasmidu – inaktivace genu – studium fenotypu
2 plasmid kvasinek• Kruhová molekula 6318bp (dsDNA)• 50-100 kopií/haploidní genom• Nachází se v jádře!, váže histony a formuje
nukleozóm• Použítí v genovém inženýrství –
eukaryotický klonovací vektor• Skladba: • 2 obrácené repetice (rozdělují plasmid na
2774 a 2346bp)• Flp rekombináza (flippase) katalyzuje
rekombinace, rozeznáva Frt místo• Může dojít k inzercím, či delecím daných
segmentů pokud jsou ohraničeny Frt místy• Flp/Frt systém je podobný Cre/loxP
systému
Replikace lineárních chromozómů - telomery• Problém při replikace lineárních
chromozómů• DNA polymeráza potřebuje primer• Po odstranění RNA primeru dojde ke
zkrácení DNA• Buněčné hodiny• Telomery
• OPAKOVANÉ KRÁTKÉ SEKVENCE (20-STOVKY), OBVYKLE 6 BÁZÍ
• TTAGGG – OBRATLOVCI• TELOMERASE – PRODLOUŽÍ KONCE
DNA O JEDEN TANDEM• PROTEKCE PROTI EXONUKLEAZOVÉ
AKTIVITĚ• EXTRÉMNĚ KONZERVOVANÉ
• Protein primery• DNA polymeráza může použít
volnou –OH skupinu z proteinu• Systém používán některými viry a
bakterií rodu Streptomyces (lineární chromozóm)
Replikace lineárních chromozómů
• Mnoho počátků replikace (10 000 až 100 000 u dělící se somatické buňky)
• Obousměrná• Replikační bublina• Synchronizace
• každý chromozóm je replikován pouze jednou• každý počátek prochází iniciací pouze jednou
Replikace lineárních chromozómů
Počátek replikace• Nejlépe studován u kvasinek• ORC komplex (origin recognition
complex) se váže na na počátek replikace a spouští řadu reakcí:• Cdc6, Cdt1 a ORC a MCM (helicase)
= pre-replicative complex (pre-RC)• Tento komplex se formuje pouze v
G1 fázi• Pre-RC je aktivován kinázou S-CDK
a aktivuje Sld2 a Sld3• Sld2 a Sld3 se váže na Dpb11 a ten
přináší cdc45a DNAP • Pre-loading complex, pre-LC
Syntéza eukaroytické DNA• Stejný princip jak u baktérií• Komplikovanější• MCM – minichromosome maintenance• DNAP , ,
• DNAP - primase – iniciace replikace, syntetizuje primer, který pak prodlužuje pomocí dNTPs – 20nt – iDNA
• RPA A – replication protein A – chrání ss• RFC – replication factor C – váže se na iDNA, přibírá do
komplexu posuvnou svorku (PCNA protein) + 2 DNAP• DNAP - přepisuje opožďující se vlákno• DNAP - přepisuje vedoucí vlákno• PCNA protein je trimer• Regulatory proteiny – Cdc45, GINS complex – neznámá
funkce• Primery jsou odstraněny pomocí exonukleázy Fen1
a/nebo Dna2 (rozdíl oproti baktériím)• Mezery jsou dosyntetizovány DNAP a spojeny pomocí
DNA ligázy
Rodiny DNA polymeráz
Family Příklad Funkce
A Bakteriální DNAP I Odstraňuje RNA primer z opožďujícího se vlákna
B Eukaryotní DNAP ,, Hlavni polymerázy pro replikaci
C Bakteriální DNAP III Hlavni polymeráza pro replikaci
D PolD polymerase Replikace u Archeií
X Eukaroytní DNAP β Reparační enzym
Y Bakteriální polymerase V Reparační enzym v SOS systému
RT Reverzní transkriptáza a telomeráza
Vytváří DNA z RNA templátu
PCR• Polymerázova řetezcová reakce• Umožňuje namnožení DNA z velmi malého množství
PCR• Polymerázova řetezcová reakce• Komponenty PCR reakce jsou:
• PCR primery• DNA polymerase (from Thermus aquaticus)• dNTPs• PCR instrument
PCR• Polymerázová řetězová reakce• Cyklus:
• 90°C – denaturace• 50°C – 60°C – nasedání primerů• 72°C – elongace• 90°C – denaturace
30x
PCR• Polymerázová řetězová reakce• 2. cyklus
PCR• Polymerázová řetězová reakce• 3. cyklus
PCR• PCR primers• Primer design• Degenerativní primery• Přidání restrikčních míst
Inverzní PCR• Sekvenování neznáme sekvence
kolem známé• Štípnutí DNA restrikčním enzymem
(nesmí štípat ve známé sekvenci) • Vytvoření kruhovité molekuly• PCR• Sekvence
RT PCR• Složitá manipulace s geny obsahující
exony• mRNA již obsahuje sekvenci, která je
translatovatelná• Pomocí reverzní transkriptázy (enzym z
retrovirů) vytvoření DNA z mRNA• Vytvoření jednoho vlákna cDNA –
templátová DNA• Studium exprese genů
RACE – rapid amplification of cDNA ends• Celou délku cDNA jednoho
genu je občas složité získat• Nedostatečné množství
cDNA pro další experimenty• Na 5‘ konci bývají
sekundární struktury• RACE generuje kompletní
konce 5‘ a 3‘ ve dvou produktech
• Na rozdíl od RT PCR, primer obsahuje ukotvující sekvenci
Directed mutagenesis• Umožňuje změnu sekvence• Substitute, delece či inzerce
aminokyselin• Původní plasmidová DNA
izolovaná z baktérií je methylována
• Nová pomocí PCR vytvořená plasmidová DNA není methylována
• Restrikce za použití enzymu, který štípe pouze methylovanou sekvenci
• Transformace pouze nově vytvořeného plasmidu
Pojmy, které jsou důležité k zapamatování
• Horizontální a vertikální přenos genů• Replikace• Vedoucí a opožďující se vlákno• Replikační vidlička• Replisom• Semi-konzervativní replikace• Obousměrná replikace• DNA gyráza• Topoisomeráza IV• DNA polymeráza vs. RNA polymeráza• RNA primer vs iDNA• SSB proteiny• NTP vs dNTP• replikace• Primáza• Syntéza dNPTs a enzymy účastnící se • DNA polymeráza I, II, III• DNA polymeráza ,,• Proofreading, mismatch• Okazakiho fragmenty• DNA ligáza• Počátek replikace
• Ter místa, terminus• Telomera, telomeráza• Eukaryotická replikace vs. Prokaryoticá• MCM, PCNA protein, pre-RC a pre-LC komplexy• Plasmid• Copy number• Replikace valivou kružnicí• Mobilita vs transferabilita• Antibiotika a resistence • CoEl plasmid• R plasmid• Ti plasmid• 2 plasmid• Flipáza a frt místo• PCR• RT PCR• RACE• Inverzní PCR• mutageneze
