Imunitní odpověď při infekci

virem hepatitidy B

J. Uhlíř

Základní body

1. Časná odpověď přirozené a adaptivní imunní odpovědi v

závislosti na kinetice virové replikace – akutní fáze

2. Charakteristika HBV-specifické T-buněčné odpovědi v

chronickém stádiu infekce

3. Je možné navození účinné protektivní anti-virové

odpovědi u pacientů v chronickém stadiu

onemocnění??

Základní body

1. Časná odpověď přirozené a adaptivní imunní odpovědi v

závislosti na kinetice virové replikace – akutní fáze

2. Charakteristika HBV-specifické T-buněčné odpovědi

v chronickém stádiu infekce

3. Je možné navození účinné protektivní anti-virové

odpovědi u pacientů v chronickém stadiu

onemocnění??

Infikovaná buňka Virus

1. Typ I IFN (a-b)

exprese

2. NK aktivace

DC maturace NK cells

iDC

mDC

CTL

Přímé rozpoznání virem

infikovanýchbuněk

Helper T cells

Rozvoj

imunní odpovědi

B cells

Blokace rozšiřování

viru

- Ab produkce

Th1

Th2

B

CTL

mDC

Přirozená odpověď:

Časná kontrola virové

infekce

maturace adaptivní imunity

Adaptivní odpověď:

finální a perzistentní

kontrola infekce

3. T- a B- cell

aktivace

Kinetika virové replikace a HBV-imunitní odpovědi

časně po infekci

Bertoleti and Gehring, J General Virol 87, 1439-1449 (2006)

FENOTYP

FUNKCE

HBV DNA

KINETIKA PŘIROZENÉ IMUNNÍ ODEZVY – NK buňky

0

0 2 5 7 10

%N

KG

2D

%C

D6

9

NKG2D

CD69

0 2 5 7 10 0

0.1

0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

NKT

NK

%IF

Ng

IFNg

Normalized 51Cr release 0 13 10 2 5 7

0

1

2

3

4

0

5

10

15

2 5 7 0 10 13

NK

NKT

0

50000

100000

150000

200000

250000

HBV DNA

copies/ml

0 2 5 7 10

Týdny od HBsAg detekce

%C

D6

9

%N

KG

2D

%IF

Ng

0

5

10

15

1

2

3

4

2

6

10

14

51C

r re

lea

se

(Fisicaro P. et al submitted)

MoA

interferonů

typu I

Antivirový efekt interferonu a Široký antivirový efekt je vysvětlován expresí více než 20 proteinů indukovaných

interferonem alfa, které inhibují různé biochemické cesty využívané viry při reprodukci

• Mx protein (blokuje syntézu mRNA)

• PKR (Protein kináza R )

fosforylace ElF2-inhibice translace)

apoptóza

• 2´,5´,-oligoadenylát syntetása

aktivace RNAázy L (latentní endonukléáza)→

degradace virové mRNA

indukce genové exprese - HBV- vs HCV

0 4 6 12 16 20 27 0 2 4 6 14 18 22 26 0 2 4 6 10 14 18 281627 5835 1615

0.8

1.8

2.8

0 4 6 12 16 20 27 0 2 4 6 14 18 22 26 0 2 4 6 10 14 18 281627 5835 1615

0.8

1.8

2.8

HBV

0.1

1

10

100

No

rma

lize

d E

xp

res

sio

n

Vire

mia

(% m

ax

)

Chimp

HBV indukuje slabou genovou

aktivitu („stealth virus“)

0 6 9 14 18 23 0 5 8 11 14 27 32 0 8 14 18 24 2896A 1581 1590

0.8

1.8

2.8

0 6 9 14 18 23 0 5 8 11 14 27 32 0 8 14 18 24 2896A 1581 1590

0.8

1.8

2.8

HCV

0.01

0.1

1

10

100

No

rma

lize

d E

xp

res

sio

n

Vire

mia

(% m

ax

)

Chimp

HCV indukuje výraznou genovou

aktivitu a silnou odpověď

PNAS 101:6669, 2004.

HBV-DNA

%tet.+

HBV-DNA

CD4+ T cells

Kinetika virové replikace a HBV-specifické adaptivní

odpovědi časně po infekci Webster G, R. et al, Hepatology 32, 1395-406 (2000)

CD8+ T cells

nd

nd

1

10

100

0.4

0.8

1

10

100

Týdny infekce

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

20

40

0

HBsAg - - - - + + + + + + + +

Webster G, R. et al, Hepatology 32, 1395-406 (2000)

HBV DNA copies/ml

CD8 IFNg

CD4 IFNg

CD8 IL2

CD4 IL2

KINETIKA ADAPTIVNÍ IMUNNÍ ODETVY (Fisicaro P. et al submitted)

IL2

0

50000

100000

150000

200000

250000

IFNg

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 5 7 10 13 16

HB

V D

NA

%IF

Ng+

0 5 7 10 13 16

%IL

2+

NK IFNg

CD8 IFNg

CD4 IFNg

%C

D5

6+

CD

3-I

FN

g+

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 5 7 10 13

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

%C

D8

/4+

IFN

g+

Týdny od HBsAg detekce

CD8+ buňky představují hlavní efektorový mechanismus zodpovědný za

odstranění viru a za patogenézi onemocnění během akutní fáze

sA

LT

(U/l)

0

100

200

300

400

500

Ch. 1627

sALT

Liver HBV DNA

Liv

er

HB

V D

NA

(%

)

100

10

1

0

bez deplece

kontrol Ab

sA

LT

(U/l)

0

100

200

300

400

500

Ch. 1615 sALT

Liver HBV DNA

Liv

er

HB

V D

NA

(%

) 100

10

1

0

CD4 deplece

CD4 Ab

Týdny infekce 24 20 8 0 4 6 10 12 18 22 14 16 2

sA

LT

(U/l)

0

100

200

300

400

500

Ch. 1620

sALT

Liver HBV DNA

Liv

er

HB

V D

NA

(%

) 100

10

1

0

CD8 deplece

CD8 Ab

(Thimme R. et al J. Virol. 77, 68-76, 2003)

Charakterizace specifických CD4 (Th) lymfocytů

CD4 (pomocné T-lymfocyty)

• několik epitopů indukuje aktivaci Th

infekční proces – imunodominantní sekvence 50-69 core epitope (stimulace Th

asi u 90% testovaných pacientů).

vakcinace – „envelope“-specifické Th

Diference v imunogenicitě e-ag při vakcinaci a během přirozené infekce naznačuje jinou

cestu aktivace imunity během přirozeho procesu infekce a při vakcinaci (prezentace

antigenu, syntetické/“přírodní“ adjuvans...)

• Zdá se, že dominantní odpověď na nukleokapsidový antigen koreluje se schopností

eradikovat vir;

• doposud není moc známo o efektu Th odezvy na epitopy přítomné na polymeráze či X

proteinu...

Charakterizace specifických CD8 (cytotoxických) T-lymfocytů

CD8(cytotoxické T-lymfocyty)

• Vyšší CD8 odpověď u spontánně mizející formy

• Perzistuje desítky let po vyléčení akutní formy onemocnění

• Existuje i po „vyléčení“ chronické fáze

• Sekvence 18-27 core epitope reprezentuje imunodominantní epitop CD8 lymfocytů

Mutace v této oblasti je spojena s inhibicí CD8 lymfocytů se specifitou k tomuto

epitopu a vyskytuje se u pacientů s chronickou hepatitidou B.

Specifické CD8 proti core 18-27 epitopu nebyly nalezeny u pacientů v chronické fázi

bez ohledu na profil onemocnění , a to v případě, že HBV DNA≥107kopií/ml

(v tomto případě jsou přítomny pouze CD8 se specifitou proti polymeráze a e-

epitopům; vykazují minimální antivirový efekt)

Hepatocytes

BLOOD VESSEL

Role Cytotoxických lymfocytů a trombocytů Pracovní model

Iannacone M et al. Nature Medicine 2005, PNAS 2008

Hepatocytes

BLOOD VESSEL

Role Cytotoxických lymfocytů a trombocytů Pracovní model

Iannacone M et al. Nature Medicine 2005, PNAS 2008

Hepatocytes

BLOOD VESSEL

Role Cytotoxických lymfocytů a trombocytů Pracovní model

Iannacone M et al. Nature Medicine 2005, PNAS 2008

Hepatocytes

BLOOD VESSEL

Role Cytotoxických lymfocytů a trombocytů Pracovní model

Iannacone M et al. Nature Medicine 2005, PNAS 2008

Hepatocytes

BLOOD VESSEL

Role Cytotoxických lymfocytů a trombocytů Pracovní model

Iannacone M et al. Nature Medicine 2005, PNAS 2008

Hepatocytes

BLOOD VESSEL

Role Cytotoxických lymfocytů a trombocytů Pracovní model

Iannacone M et al. Nature Medicine 2005, PNAS 2008

Hepatocytes

BLOOD VESSEL

Role Cytotoxických lymfocytů a trombocytů Pracovní model

Iannacone M et al. Nature Medicine 2005, PNAS 2008

Hepatocytes

BLOOD VESSEL

Role Cytotoxických lymfocytů a trombocytů Pracovní model

Iannacone M et al. Nature Medicine 2005, PNAS 2008

Hepatocytes

BLOOD VESSEL

Role Cytotoxických lymfocytů a trombocytů Pracovní model

Iannacone M et al. Nature Medicine 2005, PNAS 2008

0

800

1,600

2,400

3,200

sA

LT

(U

/l)

0

5 X 104

1 X 105

1.5 X 105

2 X 105

CT

L n

um

be

r (l

ive

r)

„Anti-platelet“ terapie redukuje jaterní poškození inhibicí

usídlování CTL v játrech

NaCl Diluent +

CTL

Asp/Clo +

CTL

Asp/Clo

Aspirin 5 mg/kg/day i.p.

Clopidogrel 2 mg/kg/day i.p.

NaCl Diluent +

CTL

Asp/Clo +

CTL

Asp/Clo

Clin. Vaccine Immunol. 14:1532, 2007.

Virus-specific CD8+ T cells Liver disease

2 4 6 8 10 12 14 16 18

1

10

100

HBV

1,000

2,000

ALT

0

Časná indukce přirozené imunity

1

Účinná a včasná indukce adaptivní imunity

2

Začíná HBV-

DNA clearance

prostřednictvím

imunitních

mechanismů

3

Objevuje se jaterní poškození

způsobené eliminací

infikovaných buněk

cytopatickým mechanismem

4

HBV INFECTION

Akutní fáze

Intenzivní, T1

orientované,

multispecifická

odpověď akutní fáze

Dlouhotrvající

protektivní

odpověď

%

Lysis

0

10

20

30

0

10

20

30

40

POLIMERASE X CORE ENVELOPE

AKUTNÍ FÁZE

REGENERAČNÍ FÁZE

(20 let od uzdravení)

Základní body

1. Časná odpověď přirozené a adaptivní imunní odpovědi v

závislosti na kinetice virové replikace – akutní fáze

2. Charakteristika HBV-specifické T-buněčné odpovědi v

chronickém stádiu infekce

3. Je možné navození účinné protektivní anti-virové

odpovědi u pacientů v chronickém stadiu

onemocnění??

Kinetika virové replikace a HBV-specifické odpovědi

eradikace - chronicita

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1

Chronická

CD4-ZPROSTŘEDKOVANÁ ODEZVA NA HBV ANTIGENY U

PACIENTŮ V AKUTNÍ A CHRONICKÉ FÁZI HBV INFEKCE

1 2 3 4 5 6

Spontánně mizející

Evoluce infekce

Sti

mu

lačn

í In

dex

Urbani S et al., Hepatology 2005

S1

0

25

50

75

100

125

150

Acute phase

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

S1

S5 0

25

50

75

100

125

150

6 months follow-up

Specifická CD8 odpověď v akutní a chronické fázi HBV infekci (ELISPOT analysis with 56 synthetic 8-10 mer peptides)

D S

fc /

1 x

6 P

BM

C

Urbani S et al., Hepatology 2005

S1

S5 0

25

50

75

100

125

150

11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S1

S5 0

25

50

75

100

125

150

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

S1

S5 0

25

50

75

100

125

150

Dlouhotrvající chronická HBV infekce

Patient 1 Patient 2 Patient 3

D S

fc /

1 x

6 P

BM

C

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

S1

S5 0

25

50

75

100

125

150

28 months follow-up

ENV 183-191

POL 816-824

POL 575-583

ENV 348-357

ENV 335-343

CORE 18-27

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

% H

BV

te

tram

er

+ c

ells

/CD

8+

Chronická fáze

Ex-vivo

In vitro

Time points

0

250

500

750

1000

GP

T

HBV-SPECIFICKÁ CD8 AKTIVITA

„Self-limited“

Patients

0

0,5

1

1,5

2%

1 2 3 4

ND

0

10

20

30

40%

1 2 3 4

Ex-vivo

In vitro

ND

Boni C. et al. Hepatology 40, 289, 2004

and Urbani S et al., Hepatology 2005

Vysoká virová

replikace

(HBeAg-HBsAg)

Neadekvátní funkce

Dendritických buněk

T reg

suprese

Mikroprostředí

jater

Dysfunkce

HBV-T buněk

Dysfunkce HBV-T buněk možné příčiny

10

12

14

16

% I

FN

-g

+ c

ells

/CD

4

0

2

4

6

8

6-02-2003 6-06-2003 18-02-2004

0

200,000

400,000

600,000

800,000

1,000,000

1,200,000

1,400,000

1,600,000

0

50

100

150

200

250

AL

T

HB

V-D

NA

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

17-01-2003 25-03-2003 12-05-2003

0

1,000,000

2,000,000

3,000,000

4,000,000

5,000,000

6,000,000

50

100

150

200

250

AL

T

HB

V-D

NA

% I

FN

-g

+ c

ells

/CD

4

Negativní korelace mezi T-buněčnou imunitou a

virovou náloží/aktivitou onemocnění

IFN

g +

T c

ells

/tota

lT c

ells

0

5

10

15

20

25

30

P 0.03

0-1x106 1-10x106 >10x106

HBV-DNA copies/ml

R 2 = 0.2226

0

10

20

30

40

50

60

0 2 4 6 8 10

Log10 HBV-DNA UI/ml

% I

FN

-gam

ma p

os

T c

ells

p = 0.02

(Boni C at al. J. Virol. 2007)

Vysoká antigenní nálož

Chronická HBV infekce

Vyčerpání

T-buněčné odpovědi

T buněčná Snížená odpovídavost

ZTRÁTA IMUNOLOGICKÉ

KONTROLY NAD VIREM

Effector T

APC

Regulatory T cells:

suppreseion antigen-reaktivních T-lymfocytů

T reg

Effector T

IL-10

TGF-b

CD4

CD25

Fox P3

GITR

TCR

TCR

CTL-4

MHC

MHC

CD80/86

TCR

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

1 6 32

0

1,000,000

2,000,000

3,000,000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

1 8 1 7 1 9 1 8

Týdny

„Self-limited“

akutní fáze

% C

D25F

OX

P3+

/

CD

4+

% C

D25F

OX

P3+

/

CD

4+

HB

V D

NA

Cop

ies/ml

Týdny

Treg (CD25+/CD4+) – vztah ke stavu CHB

Vývoj do chronicity

Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4

Efekt dendritických buněk (PD-1/PD-L1 Pathway)

PD-1 PD-L1

Dendritická buňka

Liver cells T lymphocyt

Up-regulace

během HBV

infekce

T cell inaktivace a

Barber DL et al. Nature 2006; 439 :682-7

Mikroprostředí jater

Mikroprostředí jater má některé specifické rysy, které

„favorizují indukci tolerance“

•proliferace a aktivace CD8 T-lymfocytů je snížena po aktivaci jaterními APC

ve srovnání s jinými APC

•hepatocyty exprimují až 100x méně MHC-třídyI,

•zvýšená apoptóza aktivovaných T-lymfocytů přes FasL exprimovaném

hepatocyty;

•hepatocyty jsou velice odolné proti perforin/granzym likvidaci)

Progresivní a perzistentní

kolaps adaptivní imunity

Nedostatečná

odpověď

přirozené imunity

Chronická

infekce

HBV

„Self-limited“

infekce

Dlouhotrvající

protektivní

odpověď

Intenzivní,

Th1 multispecifická

odezva akutní fáze

Základní body

1. Časná odpověď přirozené a adaptivní imunní odpovědi v

závislosti na kinetice virové replikace – akutní fáze

2. Charakteristika HBV-specifické T-buněčné odpovědi

v chronickém stádiu infekce

3. Je možné navození účinné protektivní anti-virové

odpovědi u pacientů v chronickém stadiu

onemocnění??

1

10

100

1000

10000

WEEKS

20 26 28 36 0 4 12 32 40

10000

1000

100

10

1:50,000

1:100,000

1:150,000

1:200,000

1:250,000

1:100,000

1:150,000

1:200,000

1:250,000

< 1:300,000

1:50,000

< 1:300,000

T c

ell

fre

qu

en

cy

Start of treatment

Obnovení HBV-Specifické CD4 odpovědi po snížení virové nálože u

HBeAg+ pacientů

Boni et al. J.Clin.Invest.1998;102:968

Je možné

navození účinné

protektivní anti

-virové odpovědi

snížením virové

nálože

antivirotiky??

POTENTIÁLNÍ TERAPIE

CHRONICKÉ HEPATITIDY B

Snížení virové nálože antivirotiky

+ Transfer plně funkčních,

specifických T-lymfocytů.

Terapeutická vakcinace

Aplikace vybraných cytokinů

Modulace apoptózy

Modulace funkce

dendritických buněk

PD-1/PD-L1 blokáda

ELIMINACE HBV