Cytogenetika

jádro

buňka

chromosom

centomera

telomera

telomera

histony páry bazí

dvoušroubovice

DNA

Typy chromosomů

Karyotyp člověka

• 46 chromosomů

• 22 párů autosomů (1-22

od největšího po nejmenší)

• 1 pár gonosomů (X a Y)

7 skupin - dle velikosti a morfologie (A-G)

46,XX nebo 46,XY

Cytogenetické vyšetření

• Preimplantační - vyšetření embrya před implantací do těla matky (při umělém oplodnění)

• Prenatální – vyšetření plodu

• Postnatální

Materiál pro cytogenetické vyšetření

• Periferní krev

• Fibroblasty z kožní biopsie

• Kostní dřeň

• Nádor

• Sekční materiál (v případě úmrtí pacienta)

Kultivace periferní krve• Fytohemaglutinin – vysoce imunogenní látka –

působí proliferaci lymfocytů

Kultivace Hypotonizace FixaceVzorek krve

kolcemid

Barvení chromosomů

• Klasické barvení (Giemsovo barvivo)

G - pruhování

46,XX 46,XY

Základní morfologické skupiny chromozomů

6 – 12

13 – 15

19 – 20 21 – 22

4 – 5

A BC

D EF G

Karyotyp člověkaSkupina Chromosomy Tvar a velikost

A 1 – 3 veliký

metacentrický

B 4 – 5 veliký

submetacentrický

C 6 – 12 (+X) stř.

submetacentrický

D 13 – 15 stř. akrocentrický

E 16 – 18 malý

submetacentrický

F 19 – 20 malý

metacentrický

G 21, 22, Y malý akrocentický

velké metacentry

malé metacentry

velké akrocentry

malé akrocentry

zbytek -

submetacentry

Každý G-pruh má své číslo

Xq27.3

Chromozom X s očíslovanými G-pruhy

Syndrom fragilního X

Další metody barvení chromozomů

• R-pruhování – reverse banding

• C-pruhování – constitutive heterochromatin

• Ag-NOR – nucleolar organizers (barvení stříbrem)

• Q-pruhování – quinacrine (chinakrin)

Chromosomální aberace

• numerické (změny v počtu chromosomů)

polyploidie - změna v počtu celých chromosomových sad – triploidie

– tetraploidie

aneuploidie - změna v počtu jednotlivých chromosomů

– monosomie

– trisomie

• strukturální (přestavby částí chromosomů)

nebalancované

balancované

Chromosomální aberace

• strukturální (přestavby částí chromosomů)

nebalancované

balancované

DELECE - delINTERSTICIÁLNÍ

DELECETERMINÁLNÍ

RING CHROMOSOM

ISOCHROMOSOM

INVERZE

paracentrická pericentrická

Inverze paracentrická

Nosiči - snížená plodnost- riziko narození postiženého dítěte nízká

Inverze pericentrická

Nosiči – riziko narození postiženého dítěte 1-10% v závislosti na velikosti inverze

TRANSLOKACERECIPROKÁ

TRANSLOKACEROBERTSONOVA

Metoda FISH (fluoresceční in situ hybridizace)

FISH

(fluorescenční in situ hybridizace )

● kombinace cytogenetické a molekulární metody

● bez nutnosti izolace DNA

● pomocí značených DNA sond umožňuje vizualizaci úseků DNA v chromozomech, buňkách nebo tkáních přímo na mikroskopickém preparátu (= in situ)

● cíl DNA sondy - gen, celý chromozom či jeho část

Metoda FISH - spojení postupů klasické cytogenetiky atechnologie molekulární genetiky

Založena na schopnosti jednovláknové (denaturované) sondy DNA vázat sek cílové sekvenci (princip komplementarity)

Použití pro vyšetření chromosomů v mitóze nebo v interfázi

DNA sonda je předem označena některým fluorochromem (př. Texas Red, FITC,atd.)

Je možné použít několik typů sond – centromerické, lokus-specifické, malovací,konkrétní sondu volíme podle indikace vyšetření

Centromerické sondy: tvořeny -satelitními sekvencemi repetitivní DNA přítomné v oblasti centromery rychlá detekce numerických aberací, zejména v nedělících se buňkách

Lokus-specifické sondy: váží se specificky na vybrané místo (lokus) na chromosomu stanovení některých strukturálních změn (mikrodelečnísyndromy, specifické translokace u některých malignit atp.)

Hybridizace

cílová DNA

sonda

denaturace

hybridizace

FISH

Délka sondy pro FISH

• cca 300 – 600 bp.

• pokud je cílový úsek delší, musí být sonda před použitím naštěpena.

NE !

Mnohobarevná malovací sonda– karyotyp nádor hyperdiploidní počet chromosomů + přestavby

Typy sondcentromerická

telomerickácentromerická

X- a Y-centromerická

malovací – 1, 4 a 8

lokus - specifická

Typy sond

Mnohobarevné pruhování (M-BAND) nejnovější modifikace metody mnohobarevné FISH (M-FISHzpřesnění cytogenetické diagnostiky CAv jedné reakci analyzuje celý genom použitím mixu 24 rozdílných DNA sond každý chromosomový pár jinou barvatzv. parciálních malovacích sond specifické pro určitou oblast vyšetřovaného chromozomu 5 spektrálně odlišnými fluorochromy a jejich vzájemnou kombinací.

parciální karyotyp:

duplikace krátkého ramena chromosomu 9 ● výsledný obraz ● nasnímané jednotlivé fluorochromy● intenzity jednotlivých fluorochromů● ideogram chromosomu● pseudo G-pruhy

G-pruhy FISH M-BAND

Barvení chromosomů

Lokus specifické sondy

Normální nález

Amplifikace prokázána

vyšetření amplifikace onkogenu HER2/NEU