Molekulárně cytogenetické vyšetření

Metoda FISH

Pacient

Základní cytogenetické vyšetření chromozomů (karyotypizace)

Molekulárně cytogenetické vyšetření

Příbuzní pacienta

Molekulárněbiologické vyšetření

Molekulárně cytogenetická vyšetření

• Identifikují změny chromozomů molekulárně biologickými metodami

• Příklady metod– hybridizace in situ a její modifikace (CGH, M-FISH,

fiber FISH atd.)– Genové čipy, resp. array CGH, DNA microarray atd.– PRINS, PCR in situ– fluorescenční kvantitativní PCR– metody založené na dodatečné amplifikaci navázané

sondy (MLPA, MAPH)

• K vyšetření většinou postačí jádra interfázních buněk (s výjimkou M-FISH)

Hybridizace

cílová DNA

sonda

denaturace

hybridizace

Hybridizace

• Molekulární (na izolované DNA)

• In situ (v původních buněčných

strukturách – tj. interfázních jádrech,

metafázních chromozomech, popř. celých

buňkách)

Test• 10 minut

• Nezapomeňte uvést své jméno a verzi,

kterou píšete.

• Otázky zaměřené na výběr z více variant

mohou mít jednu i více správných

odpovědí.

Sonda (probe, „próba“)

• Úsek DNA, eventuálně RNA komplementární k určité sekvenci na vyšetřované DNA (target DNA, resp. cílové DNA)

• Plazmid (15 – 20 kbp), fágová DNA, kosmid (popř. jiné kombinace fágové a plazmidové DNA – PAC, BAC), YAC (až 1,5 Mbp)

• Též možno připravit jako PCR-produkt amplifikací vybraného úseku DNA

Značení sond

• Radioaktivní

• Enzymatické

• Fluorescenční

– Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)

• Neznačné sondy (značíme vyšetřovanou

DNA)

– např. u CGH, resp. array CGH (genové čipy)

Značení sond

• Přímé

• Nepřímé (biotin, antigenní látka)

– možnost amplifikace signálu

– zdlouhavá manipulace, větší fluorescenční (popř.

radioaktivní) pozadí

FITC - avidin FITC - avidinanti avidin biotin

cílo

vá D

NA

biotin

sond

a

Metody značení sond

• Přímá chemická adice

„reportérské“ molekuly

• PCR se značenými dNTP

• Nick-translace

FISH

Typy sond• Satelitní

– Centromerické

– Telomerické

• Lokus specifické

(„genové“)

• Malovací

(„painting probes“;

celochromozomové)

Satelitní sondy – chromozom 7

Satelitní sondy Centromerická sonda na X – DXZ1

Možný karyotyp 45,X nebo 46,XY

X- a Y-centromerická sonda

X-centromerická sonda – vyšetření marker chromozomu

marker = derivovaný chromozom X

Výsledek hybridizace s telomerickou sondou

Lokus specifická sonda – detekce regionu SRY

Lokus specifická sonda – detekce mikrodelece chromozomu 7q11.23

Jako kontrola byla použita centromerická sonda (D7Z1).

Lokus specifické sondy – vyšetření amplifikace onkogenu HER2/NEU

Normální nález

Amplifikace prokázána

Malovací sondy – současné vyšetření chromozomů 1, 4 a 8

Malovací sondy nelze použít při vyšetření interfázních jader!

Malovací sondyVýsledek hybridizace s malovací

sondou pro chromozom 19

Malovací sondy – detekce nebalancované translokace

chromozomů 11 a 21

t(11;21)

Kdy je třeba indikovat FISH?• V materiálu nejsou přítomny mitózy

– Neúspěšná kultivace– Odebranou tkáň nelze kultivovat (preimplantační vyšetření,

rychlá prenatální vyšetření, vyšetření solidních tumorů, popř. sekčního materiálu z jiných tkání)

• Verifikace složitějších chromozomových přestaveb, identifikace marker chromozomů

• Verifikace mozaiky (zejména nízkofrekvenční)• Diagnostika submikroskopických (kryptických)

chromozomových přestaveb– Mikrodeleční syndromy– Amplifikace onkogenů a mikrodelece tumor-supresorových genů

u malignit

Referáty

Referáty

• M-FISH – 7 min

• CGH – 7 min

• (fiber FISH – 5 min )

Praktické úkoly

viz „Praktická cvičení z klinické cytogenetiky“ – kapitola 9

9.4 Úkol 2 (str. 40)

• 46,XX nebo 47,XXY

• Indikujeme vyšetření

se sondou pro

chromozom Y.

9.5 Úkol 3 (str. 40)

• Pravděpodobně mozaika:

• 45,X/46,XX

• 46,XY/46,XX

• 47,XXY/46,XY

• 45,X/47,XXY

9.6 Úkol 4 (str. 41) – 1. část

9.6 Úkol 4 – 1. část

• 5 signálů svědčí o trizomii chromozomu 13

nebo chromozomu 21

• Signálem jsou označeny:

– 2 větší akrocentrické chromozomy (tj. 13)

– 3 menší akrocentrické chromozomy (tj. 21)

• Výsledek svědčí pro trizomii chromozomu

21 – tj. Downův syndrom.

9.6 Úkol 4 – 2. část – a)

a) Pacient s t(14;21) ... 5 signálů

2 x 21, 1 x der(21;14), 2 x 13

13 13 14 der(14;21)

21 21

Pacient s robertsonskou translokací der(14;21)

9.6 Úkol 4 – 2. část – b)

b) Pacient s t(21;21) ... 4 signály (1 fúzní)

1 x 21, 1 x der(21;21), 2 x 13

13 13 14 14

21 der(21;21)

Pacient s robertsonskou translokací der(21;21)

9.6 Úkol 4 – 2. část – c)

c) Pacient s t(13;21) ... 4 signály (1 fúzní)

2 x 21, 1 x der(13;21) – fúzní, 1 x 13

13 der(13;21) 14 14

21 21

Pacient s robertsonskou translokací der(13;21)

9.6 Úkol 4 – 2. část – d), e), f)

d) Přenašeč s t(14;21) ... 4 signály

1 x 21, 1 x der(14;21), 2 x 13

e) Přenašeč s t(21;21) ... 3 signály (1 fúzní)

1 x der(21;21) – fúzní, 2 x 13

f) Přenašeč s t(13;21) ... 3 signály (1 fúzní)

1 x 21, 1 x der(13;21) – fúzní, 1 x 13

9.6 Úkol 4 – 2. část – g), h)

g) Pacient s t(13;13) ... 4 signály (1 fúzní) 2 x 21, 1 x der(13;13) – fúzní, 1 x 13

h) Přenašeč s t(13;13) ... 3 signály (1 fúzní) 2 x 21, 1 x der(13;13) - fúzní

13 der(13;13)

21 21

der(13;13)

21 21

Pacient Přenašeč

Nejednoznačné výsledky při hybridizaci centromerických

sond pro chromozomy 13 a 21 (resp. 14 a 22) jsou důvodem, že při prenatálním vyšetření

aneuploidií těchto chromozomů požíváme lokus specifické

sondy.

9.7 Úkol 5 (str. 42)

• Plod je postižen Downovým syndromem (viz obr. 9.4B)

• V případě chromozomu 13 je nález normální.

• Zdvojené signály se vyskytují u jader v G2 fázi.

Prenatální vyšetření aneuploidií chromozomů 13, 21 a 18 pomocí

centromerických a lokus specifických sond

Interpretujte molekulárně cytogenetický nález.

Prenatální vyšetření aneuploidií chromozomů 13, 21 a 18 pomocí

centromerických a lokus specifických sond

Trizomie chromozomu 18

Edwardsův syndrom

9.8 Úkol 6 (str. 42 – 43)

• Marker chromozom vznikl z chromozomu 13 nebo 21 (viz obr. 9.5A).

• Další možnosti vyšetření – malovací nebo lokus specifické sondy; popř. připravit z markeru sondu a sledovat, se kterými chromozomy hybridizuje.

• Zjistit, zda zdravá matka nebo zdravý otec mají ve svém karyotypu stejný chromozom.

9.9 Úkol 7 (str. 43)

PACIENT 1 PACIENT 2

delece 7q11.23

9.9 Úkol 7 (str. 43)

• U pacienta 1 je mikrodelece 7q11.23

prokazatelná – chybí signál lokus

specifické sondy na kritickém regionu

• Lze potvrdit diagnózu Williams-Beuren

syndrom.

Syndrom Williams-Beuren• irides stellatae

• hypertelorismus

• otevřená ústa, silné rty

• abnormální dentice

• supravalvulární aortální

stenóza

• hyperkalcémie,

hypoparathyreoidismus

• psychomotorická retardace

• mikrodelece chromozomu

7q11.23„elfin face“

Supravalvulární aortální stenóza

9.9 Úkol 7 (str. 43)

• U pacienta 2 mikrodelece není

prokazatelná. Možné důvody:

– Delece nebo jiná mutace malého rozsahu v

kritickém regionu.

– Postižení v jiném lokusu

– Afekce na negenetické bázi (vliv teratogenů

během těhotenství?)

9.10 Úkol 8 (str. 44)

Syndrom DiGeorge

• vrozená srdeční vada – nejčastěji Fallotova tetralogie

• nízká hladina ionizovaného vápníku v krvi (hypokalcémie)

• aplázie, popř. hypoplázie thymu – v některých případech vede k defektu imunity

• rozštěp patra, popř. gotické patro• abnormální obličejové rysy

Syndrom DiGeorge - facies

Syndrom DiGeorge – typické znaky

Nejčastějším cytogenetickým nálezem je mikrodelece dlouhých ramének chromozomu 22 (22q11.2).

hypertelorismus

mikromandibulaníže nasedající dysplastický ušní boltec

„antimongoloidní“ směr očních

štěrbin

9.10 Úkol 8 (str. 44)

Sonda pro kritický region – lokus HIRA na 22q11.2 (červeně značena)

Kontrolní sonda – lokus ARSA v subtelomerické části 22q (zeleně značena)

9.10 Úkol 8 (str. 44)

• Mikrodelece chromozomu 22q11

prokázána – diagnózu syndrom DiGeorge

lze potvrdit.

• Vyšetřit familiární výskyt, zejména u matky

(vzhledem k nápadné stigmatizaci)

– 50% pravděpodobnost přenosu mikrodelece

na každého potomka.

Na shledanou!

M-FISHMulticolor FISH

Zpět k referátům

Značení sond pro M-FISH

M-FISH – normální chromozomy

M-FISH – translokace t(9;22)

Multicolor banding

Zpět k referátům

CGHKomparativní genomová

hybridizace

Zpět k referátům

CGH

CGH chromozomy po hybridizaci

CGH – uspořádané chromozomy

CGH – normální nález

CGH – abnormální nález

Genový čip (DNA-microarray)

normální DNA

vyšetřovaná DNA

Genový čip (DNA-microarray)

Zpět k referátům