Esenciální aminokyseliny

Prokaryotní a eukaryotní

mikroorganismy

Mluvíme-li o aminokyselinách z biologického materiálu, jedná se

většinou o -aminokyseliny. Každá aminokyselina má na svém -uhlíku

tyto substituenty :

Definice

Aminokyseliny

Obecně se aminokyseliny dělí většinou podle počtu uhlíkových atomů, které jsou mezi aminoskupinou a karboxylovou skupinou, a to na -aminokyseliny s jedním uhlíkem, -aminokyseliny se dvěma atomy atd.

Aminová skupina - NH2 Karboxylová skupina - COOH Specifická skupina - R (postranní řetězec) Vodíkový atom - H

Aminokyseliny jsou aminoderiváty karbonových kyselin.

Vlastnosti aminokyselin

Aminokyseliny

Specifické skupiny na -uhlíku aminokyselin určují jejich vlastnosti :

Optická aktivita, která je dána uspořádáním substituentů na -uhlíkovém

atomu. Je-li tento uhlíkový atom osazen asymetricky různými substituenty,

je chirální. Enantiomerní konfigurace je dána velikostí substituentů :

L-izomer má atomová čísla : 29 - 9 -1

doprava, ve směru

hodinových ručiček

L-isomer R

H

NH 2

C O O H

D-izomer má atomová čísla : 1 - 9 -29

doleva, proti směru

hodinových ručiček

R

H

NH 2

C O O H

D-isomer

Optická aktivita

Aminokyseliny

Optická otáčivost se vyskytuje v molekule s nedostatečnou souměr-ností.

Z tohoto důvodu jediná aminokyselina - glycin - není opticky aktivní, proto-že její -C má dva stejné substituenty (H) = není chirální.

D- a L-izoméry jsou svými neztotožnitelnými zrcadlovými obrazy. Ani

vnitřní rotací jednotlivých substituentů jsou vzájemně neztotožnitelnými.

V bílkovinách se vyskytují většinou pouze L-enantiomery.

Poznámka :

Některé mikroorganismy mohou vytvářet D-stereoizomery pro tvorbu peptidů,

které jsou pro jiné organismy toxické, na př.. tvorba antibiotik.

D-aminokyseliny se vyskytují také jako součást buněčných stěn bakterií jejich

homopolymérů.

Aminokyseliny Citrátový cyklus

vysvětlení dělení aminokyselin :

C itrá tový

cyk lus c itrá t

sukc inylC oA

fumarát

ketoglutarát

oxa lacetát

acetylC oA acetoacetylC oA

ala cys

gly ser

tyr trp

pyruvát

ketogenese

ile

leu

trp

leu lys

phe trp

tyr

fos foenolpyruvát

glukosa

asn

asp

asp

phe

tyrarg gln

glu his

proile met

thr va l

Aminokyseliny

Esenciální a neesenciální aminokyseliny

Esenciální AK

fenylalanin

histidin

isoleucin

leucin

lysin

methionin

threonin

tryptofan

valin

Neesenciální AK

alanin

arginin aspargarin

aspartát

cystein

glutamát

glutamin

glycin

prolin

serin

tyrosin

Rozdíl mezi esenciálními a

neesenciálními aminokyselinami

Uvedené esenciální aminokyseliny jsou takto

vyčleněné pouze s hlediska metabolismu

člověka a vyších primátů. Lidský metabolismus

nemá schopnost syntézy těchto aminokyselin a

musí být přijímány výživou.

U býložravců pomáhají tyto aminokyseliny

syntetizovat bakterie osidlující bachor.

Monogastrická zvířata (vepř, drůbež) musí

rovněž dostávat esenciální aminokyseliny v

potravě.

Biosyntéza aminokyselin

1. Glutamátová nebo α-ketoglutarátová skupina

glutamát, glutamin, glutathion, prolin, arginin, putrescin, spermin, u hub lysin

2. Aspartátová skupina aspartát, asparagin, threonin, methionin, isoleucin, u bakterií lysin

3. Pyruvátová skupina alanin, valin, leucin, isoleucin

4. Serin-glycinová nebo triosová skupina serin, glycin, cystein

5. Aromatické aminokyseliny fenylalanin, tyrosin, tryptofan

6. Histidin

Tvorba tyrosinu a fenylalaninu 1 Dráhy pro biosyntesu tyrosinu a fenylalaninu jsou ve svém

počátku totožné, pouze záleží na druhu mikroorganismu. Jejich

tvorba je značně komplikovaná. Výchozí substráty jsou fosfo-

enolpyruvát a erythrosa-4-fosfát.

Aminokyseliny

CH2=C(OPO2-3)COOH

CHOCH(OH)CH(OH)CH2OPO2-3

fosfoenolpyruvát

erythrosa-4-fosfát

COOHCO

HOCH

CH2

HCOH

HCOH

CH2

OPO32-

oxo-3-deoxyarabinoheptuloso-

nát-7-fosfát (DAHP) COOH

OH

OH

HO

O5-dehydrochinát

oxo-3-deoxyarabinoheptulosonátfosfát syntasa

dehydrochinát syntasa COOH

OH

OHO

5-dehydrošikimát dehydrochinát dehydratasa

Tvorba tyrosinu a fenylalaninu 2 Oxidaci a dehydrataci vzniklý dehydrošikimát je redukován na

šikimát, který je fosforylován na šikimát-5-fosfát. Na ten působí

fosfoenolpyruvát a defosforylací vznikne chorismát.

Aminokyseliny

COOH

OH

OHO

COOH

HO OH

OH

5-dehydrošikimát šikimát

šikimát

kinasa

+ CH2=C(OPO2-3)COOH

fosfoenolpyruvát

COOH

OH

OH

O2-3PO

šikimát

dehydrogenasa

šikimát-5-fosfát

COOH

OH

O2-3PO OCCOOH

CH2

3-enolpyruvylšikimátfosfát

enoylpyruvylšikimát

syntasa

OCCOOH

CH2

COOH

OH

chorismát

chorismát syntasa

Mutací chorismátu se tvoří prefenát, který je výchozí pro

tyrosin a fenylalanin.

Tvorba tyrosinu a fenylalaninu 3

Aminokyseliny

OCCOOH

CH2

COOH

OH

chorismát

OH

HOCO CH2COCOOH

prefenát

chorismát mutasa

Tvorba fenylalaninu

Výchozí substrát pro tvorbu fenylalaninu je prefenát. Dehydratací

a dekarboxylací prefenátu vzniká fenylpyruvát a jeho

aminotransferací se tvoří fenylalanin.

Aminokyseliny

esenciální

OH

HOCO CH2COCOOH

prefenát

CH2COCOOH CH2CHCOOH

NH2

fenylpyruvát fenylalanin

prefenát

dehydratasa

tyrosin

transaminasa

Fenylalanin

Symbol : Phe ≈ F

hmotnost : 147,1Da bod tání : 283o C

Disoc.konst.COOH 1,83 Disoc.konst.NH2 9,13 Isoelektr.bod 5,48

Rozpustnost v 100g H2O při 25o 2,965g

CH2CH COO_NH3

+

Při degradaci fenylalaninu vzniká hydroxylací tyrosin, který je

přeměněn na fumarát a acetoacetát :

CH2CH COO_NH3

+

CH2CH COO_NH3

+

HOCOO

_CH-

_O CO-CH

fenylalanin tyrosin acetoacetát + fumarát

vzorec :

CH3.CO.CH2.COO_

+

Aminokyseliny

esenciální

V běžných bakteriích (na př.Escherichia coli, Salmonella typhimu-

rium, Bacillus subtilis aj.) preferují uvedené postupy dekarboxyla-

ce a transaminace, avšak u korynebakterií (Corynebacterium glu-

tamicum, Brevibacterium flavum, Bacterium ammoniogenes) je

pořadí přehozené - napřed transaminace a pak dekarboxylace.

Z prefenátu vznikne transaminací arogenát, společný prekursor tyrosinu a fenylalaninu, které vznikají dekarboxylací :

Tvorba tyrosinu a fenylalaninu 4

Aminokyseliny

OH

HOCO CH2COCOOH

prefenát

OH

HOCO CH2CH(NH2)COOH

arogenát

prefenát aminotransferasa

CH2CHCOOH

NH2

fenylalanin

arogenát dehydrogenasa

OH

CH2CHCOOH

NH2

tyrosin

arogenát dehydratasa

Arginin

Symbol : Arg ≈ R

hmotnost : 157,2 Da bod tání : 238o C

Disoc.konst.COOH 2,17 Disoc.konst.NH2 9,04 Isoelektr.bod 10,76

Disoc.konst.-NH 12,48

NH2CNH(CH2)3CH_

COO_

NH3+NH2

+

vzorec :

NH2CNH(CH2)3CH_

COO_

NH3+NH2

+

Arginin je nejprve přeměněn na glutamát, který je

oxidován na 2-oxoglutarát :

NH2COO_

COO_

CH

CH2

CH2 CH2

COO_

COO_

CH2

CO

arginin glutamát 2-oxoglutarát

Tvorba argininu 1

Mikrobiální biosynthesa argininu vychází z glutamátu a má osm

kroků přes několik A-acetyl derivátů a ornitin.

HOCOCH2CH2CH(NH2)COOH + CH3CO-CoA

glutamát

HOCOCH2CH2CH(NHCOCH3)COOH + ATP

N-acetylglutamát

acetylglutamát syntetasa

acetylglutamát kinasa

H2O3POCOCH2CH2CH(NHCOCH3)COOH + NADPH

OHCOCH2CH2CH(NHCOCH3)COOH + glutamát

N-acetylglutamát-5-fosfát acetylglutamát-semialdehyd dehydrogenasa

NH2CH2CH2CH2CH(NHCOCH3)COOH

N-acetylglutamát--semialdehyd

N-acetyl-L-ornitin

acetylornitin--transaminasa

Tvorba argininu 2/I Mikrobiální biosynthesa pokračuje v kvasinkách, plísních, v E. coli, v Protheus mirabilis,v Serratia marcescens a v jiných

enterobakteriích jak je uvedeno :

NH2CH2CH2CH2CH(NHCOCH3)COOH

N-acetyl-L-ornitin

NH2CH2CH2CH2CH(NH2)COOH + H2NCOOPO3H2

Acetyl ornithinasa

karbamylfosfát L-ornitin

H2NCONH(CH2)3CH(NH2)COOH + aspartát + ATP

L-citrulin

Ornithin transkarbomylasa

HOCOCH2CH(COOH)NHC(=NH)NH(CH2)3CH(NH2)COOH L-argininosukcinát

Argininosukcinát syntetasa

NH=C(NH2)NH(CH2)3CH(NH2)COOH +

L-arginin

Arginino sukcinasa

HC

CH

COO_

CO_

O

fumarát

Tvorba argininu 3/II V bakteriích Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens,

Micrococcus glutamicus, Anabaena variabilis pátý krok z acetyl-

ornitinu je uskutečněn transacetylasou pomocí glutamátu :

NH2CH2CH2CH2CH(NHCOCH3)COOH +

+ HOCOCH2CH2CH(NH2)COOH

NH2CH2CH2CH2CH(NH2)COOH +

+ HOCOCH2CH2CH(NHCOCH3)COOH

N-acetyl-L-ornitin

glutamát

L-ornitin

N-acetylglutamát

transacetylasa

NH=C(NH2)NH(CH2)3CH(NH2)COOH

pokračují enzymy

podle 2/I

L-arginin

Threonin

Symbol : Thr ≈ T

hmotnost : 101,1 Da bod tání : 227o C

Disoc.konst.COOH 2,15 Disoc.konst.NH2 9,12 Isoelektr.bod 5,64

Rozpustnost v 100g H2O při 25o 20,5g (hydrochlorid)

NH3+HO

_COO

_CH3CHCH

vzorec :

Metabolismus threoninu poskytuje acetyl-CoA a glycin, který

je přeměněn na pyruvát :

NH3+HO

_COO

_CH3CHCH +CH3-CO-SCoA

NH3+

HOCH2-CH_

COO_ COO

_CH3-CO-

threonin acetyl-CoA + serin pyruvát

Aminokyseliny

esenciální

Tvorba threoninu Tvorba threoninu vychází z aspartátu. V běžných bakteriích

jsou tři aspartátkinasy, které fosforylují výchozí substrát.

Pak vznikne semialdehyd. V E.coli jsou dvě dehydrogenasy.

Redukcí vznikne homoserin, jenž kinasa přemění na fosfo-

serin, ze kterého vznikne threonin.

Aminokyseliny

esenciální

COOH

CH2

HCNH2

COOH

CH2

HCNH2

COOH

COOPO2-3

aspartylfosfát aspartát

aspartokinasa I

CH2

HCNH2

COOH

CHO

aspartsemialdehyd dehydrogenasa

aspartátsemialdehyd

CH2

HCNH2

COOH

CH2OH

homoserin

homoserin dehydrogenasa A

CH2

HCNH2

COOH

CH2OPO2-3

homoserinfosfát

HCNH2

COOH

CH3

HCOH

threonin

homoserin kinasa

threonin

synthasa

Isoleucin

vzorec : CH2

NH3+

COO_CH

CH3

CH3

CH Symbol : Ile ≈ I

hmotnost : 113,1 Da bod tání : 280o C

Disoc.konst.COOH 2,26 Disoc.konst.NH2 9,62 Isoelektr.bod 5,94

Rozpustnost v 100g H2O při 25o 4,117g

Degradace isoleucinu vede k tiglyl-CoA, který je přeměňován řadou reakcí na propionyl-CoA jako prekursoru sukcinyl-CoA :

NH3+

COO_CH

CH3

CHCH2CH3

CH3-CH=C-CO-SCoA

CH3 -OCO-CH2-CH2-CO-SCoACH3-CH2-CO-SCoA

isoleucin tiglyl-CoA propionyl-CoA sukcinyl-CoA

Aminokyseliny

esenciální

Tvorba isoleucinu I

Jednou z výchozích látek je threonin, ze kterého vzniká -keto-butyrát, jenž s acetal-DPT vytváří acetohydroxybutyrát.

Aminokyseliny

esenciální

HCNH2

COOH

CH3

HCOH

threonin

COOH

CH3

CH2

CO

,-dihydroxy--

methylvalerátrát

threonindeaminasa

OH

N

NN

N

NH2

O

HH H H

OH

CH2OP

O

O

OH

P

O

O_

OCH2CH3

+

acetal- DPT

-ketobutyrát

acetohydroxybutyrát

isomeroreduktasa

COOH

CH3

CH2

CH3CH2COH

COOH

CH3

CH3CH2COH

HCOH

acetohydroxybutyrát

synthasa

-acetohydroxybutyrát

Acetohydroxybutyrát je pře-měněn na dihydroxymethyl-valerát, z něhož vzniká isoleucin přes -keto--methylvalerát.

COOH

CH3

CH3CH2CH

CO

-keto--methyl

valerátrát

dihydroxyvalerátdehydratasa

COOH

CH3

CH3CH2CH

HCNH2

isoleucin

glutamin

aminotransferasa

Dalším výchozím substrátem je v bakteriích Leptospira pyruvát.

Tato dráha začíná synthesou s acetyl-CoA a poskytuje citramalát,

a to jak v konfiguraci L(+), tak i D(-). Z těchto isomerů vzniká de-

hydratací mesakonát, případně citrakonát. Z obou těchto derivátů

vzniká -methyloxalacetát, z něhož dekarboxylací se tvoří ketobu-

tyrát a pokračuje tvorba isoleucinu po dráze I.

Aminokyseliny

esenciální Tvorba isoleucinu II

COOH

CH2

CO + acetal- DPT

citramalát

synthasa

COOH

CH2

HOCCH3

COOH

COOH

CH2

COOH

CH3COHpyruvát

L-citramalát

D-citramalát

CHOOC CH3

CHCOOH

C

CHCOOH

COOHH3C

Mesakonátát

Citrakonát

citramalát

dehydratasa C

COOH

COOHH3C

CO

-methyloxal

acetát

COOH

CH3

CH2

CO

-ketobuty-

rát

ketobutyrát dekarboxylasa 1)

2)

Vysvětlení : 1) adice NH3 a jeho vyloučení 3) pokračování

2) adice H2O a dehydratace po dráze I

3)

Tvorba lysinu v kvasinkách a v plísních 1 Biosynthesa lysinu v kvasinkách a v plísních vychází z -keto-

glutarátu, který s acetyl-CoA vytváří homocitrát. Z něho dehy-dratací vzniká homoakonitát a následnou hydratací je tvořen homoisocitrát.Ten dehydrogenací poskytuje oxaloglutarát.

Aminokyseliny

esenciální

COOH

CO

CH2

COOH

CH2

+ acetyl-CoA HOCCOOH

COOH

CH2

COOH

CH2

CH2

-ketoglutarát homocitrát

homocitrát synthasa

CH2

CCOOH

COOH

CH2

COOH

CH

homoakonitát

homoisocitrát

dehydrogenasa

HOCH

CH2

HCCOOH

COOH

CH2

COOH

homoisocitrát

homoakonitát hydratasa

CO

CH2

HCCOOH

COOH

CH2

COOH oxaloglutarát

homocitrát dehydratasa

Výchozí látkou je pyruvát, který s acetal-DPT dává -aceto-

laktát, který je přeměněn na dihydroxyisovalerát. Dehydra-

tací poskytuje ketoisovalerát, který transaminací dává valin.

Aminokyseliny

esenciální Tvorba valinu

COOH

CH2

CO + acetal- DPT

COOH

CH3COH

CO

CH3

acetolaktát synthasa

pyruvát

-acetolaktát

COOH

CH3COH

CH3

HCOH

acetolaktát isomeroreduktasa

,-dihydroxyisovalerát

COOH

CH3

CH3CH

CO

-ketoisovalerát

dihydroxyisovale-rát dehydratasa

COOH

CH3

CH3CH

HCNH2

valin

glutamin

aminotransferasa

Valin

vzorec : NH3

+

COO_CH

CH3

CH3

CH Symbol : Val ≈ V

hmotnost : 99,1 Da bod tání : 315o C

Disoc.konst.COOH 2,29 Disoc.konst.NH2 9,74 Isoelektr.bod 5,97

Rozpustnost v 100g H2O při 25o 8,85g

Degradace valinu vede k isobutyryl-CoA, který je přeměňo-ván řadou reakcí na propionyl-CoA jako prekursoru sukcinyl-CoA :

NH3+

COO_CH

CH3

CH3

CH -OCO-CH2-CH2-CO-SCoACH3-CH2-CO-SCoA

valin isobutyryl-CoA propionyl-CoA sukcinyl-CoA

CH3

CH3

CH-CO-SCoA

Aminokyseliny

esenciální

Tvorba leucinu Výchozím substrátem při biosynthese leucinu je -ketoiso-

valerát. který se tvoří při tvorbě valinu. -ketoisovalerát spolu s acetyl-CoA vytváří -isopropylmalát, který je isomerizován na -isomer, jenž poskytuje -ketokapronát, z něhož vzniká leucin.

Aminokyseliny

esenciální

COOH

CH3

CH3CH

CO

-ketoisovalerát

H3C.CO.S.(CH2)2.NH.CO.(CH2)2.NH.CO.CH.C.CH2.

OH

CH3

CH3

OPO.P

O O

O_

O_

H

O

OH

OCH2

HHH

O

PO32-

N N

NN

NH2

+ acetyl-koenzym A

COOH

CH2

HOCCOOH

CH3

CH3CH

COOH

HCCOOH

CH3

CH3CH

HOCH

-isopropylmalát -isopropylmalát

isopropylsynthasa

isopropylmalát

isomerasa

COOH

CH3

CH3CH

CO

CH2

-ketoisokapronát

isopropylmalát

dehydrogenasa

COOH

CH3

CH3CH

CH2

H2NCH

leucin

tyrosin

aminotransferasa

Leucin vzorec : NH3

+

COO_

CH3

CH3

CH CH2 CH Symbol : Leu ≈ L

hmotnost : 113,1 Da bod tání : 294o C

Disoc.konst.COOH 2,33 Disoc.konst.NH2 9,74 Isoelektr.bod 5,98

Rozpustnost v 100g H2O při 25o 2,33g

Leucin je oxidován reakcemi -oxidace. Jeho degradace vede ke tvorbě acetyl-CoA a acetacetátu. Jeho metabolismus je katalysován enzy-mem, který je biotin-dependentní 3-methyl-krotonyl-CoA-karboxylasa .

NH3+

COO_

CH3

CH3

CH CH2 CH CH3-CO-SCoA + O-CO-CH2-CO-CH3

leucin acetyl-CoA acetoacetát

Aminokyseliny

esenciální

Lysin

Symbol : Lys ≈ K

mol.hmota : 129,1 Da bod tání : 225o C

Disoc.konst.COOH 2,20 Disoc.konst.NH2 8,90 Isoelektr.bod 9,59

Disoc.konst.-NH2 10,28

NH3+(CH2)4CH

_COO

_NH3+

vzorec :

Pro degradaci lysinu existuje několik různých metabolických cest.

Nejznámější je dráha přes glutaryl-CoA vedoucí na acetoacetyl-CoA :

_O CO-CH2-CH2-CH2-CO-SCoA CH3-CO-CH2-CO-SCoA

lysin glutaryl-CoA acetoacetyl-CoA

NH3+(CH2)4CH

_COO

_NH3+

Aminokyseliny

esenciální

V bakteriích biosyntesa lysinu vychází z pyruvátu a semial-

dehydu aspartátu a vytváří se dihydrodipikolinát, ze které-

ho vznikne tetrahydrodipikolinát. Pomocí sukcinyl-CoA se

změní na N-sukcinyl- -ketoaminopimelát.

Aminokyseliny

esenciální Tvorba lysinu v bakteriích 1

CH2

HCNH2

COOH

CHO COOH

CH2

CO+

aspartátsemialdehyd

+ pyruvát

CH

N

CH

COOH COOHNCOOH COOH

dihydrodipikolino-

vá kyselina

tetrahydrodipikolino-

vá kyselina

dihydrodipikolinát

syntasa

dihydrodipikolinát

reduktasa

N-sukcinyl--

ketoamino-

pimelát

tetrahydrodipikolinát

sukcinylasa

COOH

CO

(CH2)3

HCNHCOCH2

CH2

COOH

COOH

Tvorba lysinu v kvasinkách a v plísních 2

Oxalglutarát je dekarboxylován na -ketoadipát, který je trans-aminován na -aminoadipát a ten je spolu s ATP přeměněn na -adenylo-aminoadipát.

Aminokyseliny

esenciální

CO

CH2

HCCOOH

COOH

CH2

COOH

oxaloglutarát

CO

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

oxaloglutarát

dekarboxylasa

-ketoadipát

COOH

CH2

CH2

COOH

CH2

HCNH2

transaminása

-aminoadipát

+ATP

syntása

-adenylo--aminoadipát

H

O

OH

OCH2

OH

HHH

P

O

OH

O_

N N

NN

N

COOH

CH2

CH2

HCNH2

OCO_

HC H

Tvorba lysinu v bakteriích 2 Z N-sukcinyl- -ketoaminopimelátu transaminací vznikne

N-sukcinyl- -diaminopimelát, který desukcinylací dává diaminopimelát, z nějž se tvoří meso-diaminopimelát. Ten dává dekarboxylací lysin.

Aminokyseliny

esenciální

N-sukcinyl--

ketoamino-

pimelová

kyselina

H2NCH

COOH

(CH2)3

HCNHCOCH2

CH2

COOH

COOH

N-sukcinyl-

,-diamino-

pimelová

kyselina

transaminace COOH

CO

(CH2)3

HCNHCOCH2

CH2

COOH

COOH COOH

H2NCH

COOH

(CH2)3

HCNH2

desukcinylace

COOH

COOH

(CH2)3

HCNH2

HCNH2

,-diamino-

pimelová kys.

meso-diamino-

pimelová kys.

epimerace

COOH

(CH2)3

HCNH2

H2CNH2

lysin

dekarboxylace

Tvorba lysinu v kvasinkách a v plísních 3

Z -adenylo--aminoadipátu vznikne -aminoadipik--semialdehyd.

Na tento semialdehyd se aduje glutamát a poskytne sakcharopin,

ze kterého vzniká L-lysin.

Aminokyseliny

esenciální

H

O

OH

OCH2

OH

HHH

P

O

OH

O_

N N

NN

N

COOH

CH2

CH2

HCNH2

OCO_

HC H

-adenylo--aminoadipát

COOH

CH2

CH2

HCNH2

CH2

CHO

-aminoadipát reduktasa

-aminoadipik-

--semialdehyd

COOH

CH2

CH2

HCNH2

CH2

CH2NHCHCOOH

COOH

CH2

CH2

sakcharopin

synthasa

+glutamát

COOH

CH2

CH2

HCNH2

CH2

CH2NH2

L-lysin

sacharopin

reduktasa

Tryptofan

Symbol : Trp ≈ W

hmotnost : 186,2 Da bod tání : 289o C

Disoc.konst.COOH 2,38 Disoc.konst.NH2 9,39 Isoelektr.bod 5,89

Rozpustnost v 100g H2O při 25o 1,14g

NH

CH2CH COO_

NH3+

vzorec :

Katabolické dráhy tryptofanu jsou velmi složité, které přes

kynurenin dávají vzniknout alaninu a acetyl-CoA :

NH

CH2CH COO_

NH3+

NH2

NH3+

CO-CH2-CH-COO_

COO_

CH3-CH-

NH3+ +

CH3-CO-SCoA

tryptofan kynurenin alanin + acetyl-CoA

Aminokyseliny

esenciální

Tvorba tryptofanu 1 Tvorba tryptofanu vychází z chorismátu (obr.32a33), který je přemě-

něn pomocí glutaminu a polyenzymatického systému na anthranilát,

ze kterého se vytvoří fosforibosylanthranilát, jenž je změněn na enol-

karboxyfenylaminodeoxyribulosafosfát.

Aminokyseliny

esenciální

OCCOOH

CH2

COOH

OH

chorismát

COOH

NH2

COOH

NH O

HO OH

CH2O PO32-

anthranilát fosforibosylanthranilát

COOH

NH CH

CHC

HO

CH

OH OHCH2 PO3

2-

anthranilát synthasa anthranilátfosforibosyl

transferasa

anthranilátfosforibosyl

isomerasa

enolkarboxyfenylaminodeoxyribulosafosfát

(CDRP)

Z CDRP dekarboxylací a dehydratací vznikne indolglycerolfosfát. Od-

štěpením glyceralfosfátu získá se indol a adicí serinu a další

dehydratací vytvoří se tryptofan.

Aminokyseliny

esenciální Tvorba tryptofanu 2

COOH

NH CH

CHC

HO

CH

OH OHCH2 PO3

2-

NH

CH

OHOH

CH CH2 PO32-

enolkarboxyfenylaminodeoxyribulosafosfát

(CDRP) indolglycerolfosfát

NH

indol NH

CH2CHCOOH

NH2

tryptofan

indolglycerolfosfát synthasa

-tryptofan synthasa -tryptofan synthasa

Methionin

Symbol : Met ≈ M

hmotnost : 149,21 Da bod tání : 283o C

Disoc.konst.COOH 2,28 Disoc.konst.NH2 9,21 Isoelektr.bod 5,74

Rozpustnost v 100g H2O při 25o 3,38g (racemát DL)

COO_

CH3S(CH2)2CH

NH3+

Degradace methioninu vede ke vzniku cysteinu a dalším

enzymovým systémem k sukcinyl-CoA :

COO_

CH3S(CH2)2CH

NH3+

HS-CH2-CH-COO-

NH3+

O --CO-CH2-CH2CO-SCoA

methionin cystein sukcinyl-CoA

vzorec :

Aminokyseliny

esenciální

Biosynthesa methioninu vychází z homoserinu a dává sukcinylhomo-

serin. Z tohoto sukcinylhomoserinu vzniká jednak cystathionin, jednak

homocystein přímo. Cystatthionin je postupně přeměňován na homo-

cystein.

Aminokyseliny

esenciální Tvorba methioninu

CH2OH

CH2

HCNH2

COOH

CH2

CH2

HCNH2

COOH

CH2O CO

CH2

COOH

homoserin sukcinyl

transferasa

sukcinyl-

homoserin

homoserin

CH2

HCNH2

COOH

CH2S CH2

COOH

HCNH2

homocystein

CH2

HCNH2

COOH

CH2S H

cystathionin

cystathionin synthasa

CH2

HCNH2

COOH

CH2S CH3

homocystein

methyltransferasa

methionin

cystathioninasa

Histidin

Symbol : His ≈ H

hmotnost : 137,1 Da bod tání : 287o C

Disoc.konst.COOH 1,37 Disoc.konst.NH2 9,17 Isoelektr.bod 7,59

Disoc.konst.NH(Imid) 6,0

Rozpustnost v 100g H2O při 25o 4,29g

NH

N

CH2CH COO_NH3

+

vzorec :

NH

N

CH2CH COO_NH3

+

Histidin je nejprve přeměněn na glutamát, který je

oxidován na 2-oxoglutarát :

NH2COO_

COO_

CH

CH2

CH2 CH2

COO_

COO_

CH2

CO

histidin glutamát 2-oxoglutarát

Aminokyseliny

esenciální

his operon

• E. coli / lokalizace v cca 44 min

chromosomu,obsahuje 9 strukturních genů

• hisGDCBHAFIE

• Transkripce je nepřímo úměrná hladině

histidyl-tRNA v buňce

• Regulace pomocí atenuace

his operon

• Energie 41 molekul ATP je nutná pro syntézu jedné

molekuly histidinu. Tato vysoká spotřeba biosyntézy

histidinu vznikla v evoluci, kdy byly používány různé

strategie k regulaci rychlosti syntézy aminokyselin

vzhledem ke změnám prostředí. Kontrolní body regulují

tok intermediátů mezi biosyntetickými drahami a

množstvím of histidin-biosyntetických enzymů.

Exprese genů pro tyto enzymy je regulovaná

mechanismy, které jsou jak obecné (metabolická regulace,

elongační kontrola) tak specifické (atenuační kontrola,

stabilizace segmentů distálních částí mRNA).

Vlastnosti his-mRNA

Primární 7300-nukleotidů his-mRNA má poločas cca 3 min.

Je v buňkách rostoucích na minimálním mediu s glukosou

a je degradovaná od 5′ ^ 3′ .

Tři hlavní tvořené druhy, 6300, 5000, a 3900 nukleotidů

dlouhé, vznikající z posledního sedmého, šestého, a pátého

cistronu, procesy odbourávání.

6300- a 5000-nukleotidové RNA, které mají poločas 5 a 6

min , mají heterogenní 5′ konce tvořené štěpením

ribonukleasou E.

3900-nukleotidů vytvořené druhy RNA mají jedinečný 5′

konec a neznámou stabilitu, mají poločas asi 15 min.

Salmonella typhimurium his operon

• 9 strukturních genů

• Hlavní regulační faktor atenuace

• Celá řada testovacích kmenů – auxotrofní

mutanty na histidin

• Počty revertantů po působení testované

látky.

• Ames test

Tvorba histidinu 1

Biosynthesa histidinu vychází z 5-fosforibosyl--difosfátu, který

pomocí ATP je změněn na 5-fosforibosyl-ATP, ze kterého vzni-

ká 5-fosforibosyl-AMP.

Aminokyseliny esenciální

OH

OCH2

2-O3PO

HO

OPO2-3PO2-

3

HN

O

NN

N

N

OCH2

2-O3PO

HO OH

2-O3P2-O3P2-O3P OCH2

HN

O

NN

N

N

OCH2

2-O3PO

HO OH

OCH22-O3P

ATP-fosforibosyl transferasa

5-fosforibosyl--difosfát N-5-fosforibosyl-ATP N-5-fosforibosyl-AMP

difosfohydrolasa

Z N-5-fosforibosyl-AMP se vytvoří N-5-fosforibosylformimino-5-

-aminoimidazol-4-karboxamidribonukleotid, tento je otevřen iso-meraci (otevřený derivát ribonukleotidu ).

Aminokyseliny esenciální

Tvorba histidinu 2

HN

O

NN

N

N

OCH2

2-O3PO

HO OH

OCH22-O3P

H2N

2-O3PO

HO OH

CH2O

HN

O

O

NN

N

OCH22-O3P

H2N

HN

O

O

NN

N

OCH22-O3P

CH2

COCH CH

OH OH

CH2OPO32-

N-5-fosforibosyl-AMP N-5-fosforibosylformimino-5-aminoimidazol-4-

karboxamid-ribonukleotid

fosforibosyl-AMP-

cyklohydrolasa isomerasa

Z otevřeného ribonukleotidu se oddělí část z ATP, která není do histidinu začleněna a která se používá při biosynthese purinů

(5-aminoimidazol-4-karboxamidribonukleotid).

Zbylý imidazolglycerolfosfát se dehydratuje a aminizací vzniká histidinolfosfát, ze kterého histidinol a posléze histidin.

imidazol-glycerol-

fosfát

Aminokyseliny esenciální Tvorba histidinu 3

H2N

HN

O

O

NN

N

OCH22-O3P

CH2

COCH CH

OH OH

CH2OPO32-

O

NN

OCH22-O3P

H2NCO NH2

5-aminoimidazol-

4-karboxamid-

ribonukleotid

N

NH

HCOH

HCOH

CH2OPO32-

glutaminamidotransferasa

N

NH

CH2OPO32-

CH2

CO

imidazol-acetal-fosfát

N

NH

CH2OPO32-

CH2

HCNH2

histidinol-fosfát

N

NH

CH2OH

CH2

HCNH2

histidinol

N

NH

CH2

HCNH2

COOH

histidin

dehydratasa aminotrans-

ferasa fosfatasa

dehydro-

genasa

Amesův test

Amesův test je biologický test ke zjištění mutagenního potenciálu chemických

látek.

Pozitivní test ukazuje, že chemická látka může působit jako karcinogen,

i když je známá řada falešně pozitivních a nebo falešně negativních výsledků.

Jelikož rakovina je často spojena s poškozením DNA, test také slouží jako rychlá

zkouška karcinogenního potenciálu různých látek, neboť někdy je těžké stanovit, zda

standardní testy na hlodavcích byly úspěšné.

Protokol je k dispozici od roku 1970 kdy Bruce Ames a jeho skupina

práci publikovali.

his operon

• Salmonella – syntézu řídí 10 genů v operonu

• Uspořádání genů v operonu neodpovídá pořadí

reakcí v biosysntetické dráze

• Velké množství mutant s poškozením na různých

genech operonu

• Několik desítek mutantních kmenů, některé mají

mutaci uvrB a rfa (deficience LPS)

Amesův test

• Testovací kmeny často nesou mutaci v genech odpovědných za syntézu lipopolysacharidů, a tak působí, že stěna bakterie je více propustná a opravný systém pomocí vystřižení test ještě sensibiluje.

Extrakt z krysích jater se přidává k napodobení účinku metabolismu, neboť některé sloučeniny, jako benzopyren, nejsou mutagení samy o sobě, ale jejich metabolické produkty ano.

• Aroclor TM 1254 ošetřená krysí játra (dospělí samci)

spolu s dalšími kofaktory (glukosa-6-fosfát, NADP-Na2)

jsou přidávány do konečné koncentrace proteinu 2 mg/ml v

inkubační směsi.

Amesův test • Bakterie jsou aplikovány na agarovou půdu na

Petri misce s minimálním obsahem histidinu. Toto malé množství histidinu v růstovém mediu dovolí bakteriím počáteční nárůst a dá jim možnost mutovat.

• Když je histidin vyčerpán, pouze bakterie, které zpětně mutovaly a získaly schopnost produkce vlastního histidinu přežijí a vytvoří kolonie.

• Misky se inkubují 48 hodin. Mutagenicita sledované látky je úměrná počtu pozorovaných kolonií.

Ames test

Ames test

Přehled aminokyselin vyráběných pomocí

mikroorganismů

• L-Aspartic Acid, Alanine, L-Arginine,

• L-Ornithine, L-Citrulline, L-Glutamic Acid,

• L-Glutamine, N-Acetyl-L-Glutamine,

• L-Histidine, L-Threonine, L-Lysine,

• L-Isoleucine, L-Valine,

• L-Leucine, L-Phenylalanine, L-Tyrosine,

• L-Tryptophan, L-Serine, L-Cysteine (L-Cystine) L-Proline, L-Hydroxyproline,

• L-3,4-Dihydroxyfenylalanin, D-p-Hydroxyfenylglycin,

Corynebacterium glutamicum

Schéma sekrece L-lysinu z buňky

Schéma fermentační výroby L-glutaminu

Fermentační příprava glutamátu