110
Přehled rychlých metod stanovení mikroorganismů Sabina Purkrtová
Přehled rychlých metod stanovení mikroorganismů
Sabina Purkrtová
Mikrobiologické analytické metody
KONVENČNÍ KULTIVAČNÍ METODY
• relativně snadné k užití, ale náročné na čas (vyžadují několik dní), práci (mnoho
procedurálních kroků) a materiál
• mnoho z nich je odsouhlaseno jako ISO metody a jsou brány jako tzv. zlatý standard
• Metody stanovení počtu
• techniky roztěru
• techniky přelivu
• Membránová filtrace
• Metody stanovení nejvíce
pravděpodobného počtu (MPN)
RYCHLÉ METODY
• immunologické metody (založené na vazbě antigen/protilátka)
• molekulárně-biologické metody (založené na analýze DNA - PCR)
• ostatní (MALDI-TOF MS - proteiny, ATP fotometrie, přímé epifluorescenční techniky
DEFT, elektrické impedanční metody, průtoková cytometrie aj. – fyzikální metody
stanovení biochemických a fyziologických vlastností mikrobiálních buněk)
Konvenční kultivační metody
Membránová filtrace
MPN
Roztěr, přeliv
Stanovení počtu
Průkaz
Ředění - izolace -konfirmace –stanovení počtu
Ředění - kultivace –konfirmace – stanovení počtu
Pomnožení – izolace –konfirmace
Konfirmace (identifikace, příp. sérotypizace)
Biochemické reakce
Barvení a světelná mikroskopie
KONVENČNÍ KULTIVAČNÍ METODY = KULTIVAČNÍ METODY A KONFIRMACE + JEDNODUCHÁ BARVENÍ A ZÁKLADNÍ SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE
Konvenční kultivační metody
Výhody Omezení
Dobře charakterizované Pomalé : doba nutná k získání výsledku obvykle 2-10 dní
Obecně akceptované Náročné na materiál a práci
Omezení dobře známa Zdlouhavé
Relativně málo validačních výzev Nekonzistentní – výsledky se liší v závislosti na mikrobiální populaci, médiích a
podmínkách
Pro nás spolehlivé paradigma Spóry a stresované pomalu rostoucí mikroorganismy vyžadují prodloužení času
pro růst
Uznávány a požadovány národními a mezinárodními regulačními orgány pro
oficiální kontroly
Náchylné k chybě operátora
POMNOŽENÍ
IZOLACE
KONFIRMACE A IDENTIFIKACE
Konvenční kultivační metodyNové principy ? Vylepšit a zjednodušit
stávající metody ?Technické pomůcky Automatizace Minituarizace
Vývoj selektivních a specifických půd(chromogenní a fluorogenní půdy)
DNA (specifické sekvence)Antigeny (přítomnost)Proteiny (přítomnost)Fyzikální přístup ke studiu biochemických a fyziologických vlastností mikrobiálních buněk
Průkaz
Počet Nové metody (rychlé metody) ?PCRImunochemické metodyMALDI-TOF MSFluorescencePrůtoková cytometrieKonduktance aj.
Princip:biochemické a fyziologické vlastnosti
Metoda:Kultivace
Vzájemná kombinace: aplikace nových metod a/nebo principů navzájem samostatně či v kombinaci s konvečními metodami Kultivační metody – použity často pro potvrzení pozitivního výsledku
Konvenční metody - automatizaceTechnické pomůcky pro jednotlivé kroky konvenčních metod – automatizace- zrychlení, - vyšší míra standardizace výsledků, - snížení nároků na pracnost
Prvotní ředění vzorku – gravimetrické ředící jednotky
Automatické přidání ředícího média
Video:http://www.iul-inst.com/en/sample-preparation/gravimentric-diluter
Homogenizace vzorku – „pádlový“ typ, pulsifikační typ
http://www.iul-inst.com/images/masticator_cap.jpg https://weberscientific.com/product-resources/images/3068-57_opt.jpg
Odlišná konstrukce
Konvenční metody - automatizace
Očkování pomocí spirály – až tři ředění po sobě jsou ve spirále naneseny na plotnu, vyhodnocení pomocí software –obrazová analýza
Video:http://www.iul-inst.com/en/innoculation/spiral-platerhttp://www.youtube.com/watch?v=bOVLc4PXTgo
Inokulace vzorku
- Využití též pro testování kvality půd
Desítkové ředění vzorku
Video: http://www.iul-inst.com/en/innoculation/bio-dilutor
VIDEO: http://www.biomic.com/colony-counting1.html
Konvenční metody - automatizace
PC automatické počítačky kolonií –načtení obrazu plotny do PC -označení kolonií, které se počítají a) uživatelemb) Pomocí software
http://www.hpcimedia.com/images/website/ManChemNews/DIR_6/F_10443.jpg
Manuální počítačky kolonií – plotna umístěna na prosvětlený průzor, kolonie značeny fixem na víčko –snímání dotyku
Měření zón (ATB rezistence)
Video: http://www.iul-inst.com/en/colony-counting-zone-reading/zone-reader
Počítání kolonií
Konvenční metody - automatizaceBarvení
Barvící stanice – 4 nádobky na jednotlivá činidla, možnost se závěrečným ožehem či bez
Video: http://www.iulinst.com/images/poly_stainer_cap.jpg
Imunologické metody
http://www.microbiologyinfo.com/wp-content/uploads/2015/05/Antigen-Properties.jpg
Antigen – látka vyvolávající tvorbu protilátek (obvykle proteiny či polysacharidy), např. virové částice, struktury buněčné stěny mikroorganismů, bičíky, fimbrie, toxiny bakterií aj.
http://www.nanomedicine.com/NMIIA/Figures/15.8.JPG
Imunoglobuliny Ig (též protilátky) glykoproteiny produkované B-lymfocyty schopné vazby na antigen –označení antigenu pro destrukci (např. fagocytóza). Imunitní odpověď tvorbou protilátek je vysoce komplexní a specifická. Epitop – antigenní determinanta - část antigenu, na kterou se váže protilátka (každý antigen jich může mít několik).
Imunologické metody
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a9/Antibody_IgG2.png
IgG2
http://www.highlands.edu/academics/divisions/scipe/biology/faculty/harnden/2122/images/abstructure.jpg
http://4.bp.blogspot.com/-Qrm1tS__g6M/T56tMi5jmJI/AAAAAAAAGas/rgLQgP-DfXo/s320/immunoglobulins.jpg
Monomer
Dimer Pentamer
Jednotlivé isotypy imunoglobulinů se liší v jejich biologických vlastnostech, struktuře, cílové specifitě a distribuci.
Imunologické metody
http://contents.edu-i.org/CDROM/tongko2/bio/4.files/VIEW0031.JPG
Polyklonální protilátkyJsou produktem mnoha aktivovaných klonů B lymfocytů a proto jsou namířeny proti více epitopům určitého antigenu nebo směsi antigenů. Je produkováno spektrum protilátek proti různým epitopům příslušné bílkoviny s různou schopností se na ni vázat. Specifita polyklonálních protilátek velice závisí na imunizačním protokolu, resp. na tom, v jaké fázi imunitní odpovědi zvířete jsou z něj protilátky získávány.
http://www.kyowa-kirin.com/antibody/about_antibody/images/production_illust.jpg
Monoklonální protilátky jsou produktem jednoho klonu B lymfocytů, jsou specifické proti jediné antigenní determinantě. Fúzí normálních B lymfocytů pocházejících z imunizovaného živočicha a neoplastických myelomových buněk lze připravit tzv. hybridomy, což jsou klony buněk schopné produkce monoklonálních protilátek.
13
Imunologické metody
•Imunologické metody
(založené na vazbě
antigen/protilátka)
Izolace na selektivní agarové plotnyMacConkey agar se sorbitolem (místo laktózy) (SMAC)E. coli O157 nefermentuje sorbitol – bezbarvé kolonieFluorocult® E. coli O157 AgarChromogenní médium – chromogenní substrát pro β-D-glucuronidasu – E. coli O157 tento enzym netvoří – bezbarvé kolonie 37±°C, 24± 3h
Selektivní pomnožení1. day: 25 g vzorku + 225 ml modifikovaného trypton-sójového bujónu (mTSB) s novobiocinem;
homogenizaceInkubace 41.5 °C
Konfirmace4.Den Izolace charakteristických kolonií na živném agaru, inkubace
37±°C, 24± 3h 5.Day: test na tvrobu indolu
(E. coli O157 pozitivní)
Imunomagnetická separaceISO 16654:2001 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157
Imunomagnetická separace
Po 8 a 16 hodinách (2. den)
• 1 ml homogenátu po pomnožení + 100 µl paramagnetických kuliček pokrytých protilátkou E. coli O157
• Přítomné buňky E. coli O157 jsou zachyceny na paramagnetické kuličky, které jsou následně odděleny použitím magnetu.
• Zbylý homogenát je odsát a paramagnetické kuličky s navázanou E. coli O157 jsou následně promyty (přídavek promývacího pufru – odstranění magnetického pole – promíchání – aplikace magnetického pole)
• Výsev 50 µl paramagentických kuliček se zachycenou E. coli O157resuspendovaných v pufru na dvě selektivní média (SMAC, Fluorocult)
SMAC agarEscherichia coli O157:H7 (bezbarvé)
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
http://image.slidesharecdn.com/elisaonlineversion-110602035913-phpapp02/95/elisa-test-enzymelinked-immunosorbent-assay-27-728.jpg?cb=1306989526
Detekce tvorby komplexu antigen-protilátka• Různé systémy, které využívají
metodu značení (navázání) protilátky enzymem (např. alkalická fosfatasa)
• Po přidání substrátu dochází k jeho transformaci na produkt –množství produktu je měřeno pomocí absorbance a je úměrné množství přítomného enzymu a tedy též protilátky
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
http://thefutureofthings.com/upload/image/articles/2006/biopen/biopen-elisa-schematic.jpg
• Pokud je vytvořen komplex protilátka-antigen, druhá protilátka konjugovaná s enzymem se naváže na antigen a není odmyta.
• Po přidání substrátu je substrát transformován enzymem a měřen signál odpovídající množství produktu (např. absorbance)
Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)
• mikrotitrační destička s navázanými monoklonálními či polyklonálními protilátkami proti
cílovému antigenu
•Navázaný antigen je detekován za použití druhé protilátky konjugované s enzymem.
•Přídavkem substrátu pro enzym lze vizualizovat přítomný zachycený antigen uvažované
specifity
• může být automatizováno; komerčně dostupné pro různé mikroorganismy (Salmonella,
L. monocytogenes, Campylobacter, …etc.)
target antigen
washing
product
second antibody
enzyme substrate
substratesolid phase
with antibody
incubation washing
VIDAS nebo mini-VIDAS Analyzers
• automatizovaný multiparametrický imunoanalyzátor
• založený na enzymové imunoeseji při použití fluorogenního susbstrátu ELFA
(Enzyme Linked Fluorescent Assay)
• 4-methyl-umbelliferon (fluorescentní molekula) je uvolněna alkalickou fosfatázou –fluorescence fluorescence
VIDAS nebo mini-VIDAS Analyzers
Každý test je složen ze dvou částí:
1. SPR® (Solid Phase Receptacle), pokryté na povrchu protilátkami proti
testovanému, umožňuje zachycení antigenu a jeho postupný transfer mezi
jednotlivými fázemi reakce
2. Strip obsahuje všechny reagencie potřebné pro další testování: promývací pufr,
sekundární protilátky značené alkalickou fosfatasou a fluorogenní substrát pro
alkalickou fosfatasu
VIDAS systém : ELISA + fluorescenční vizualizace - ELFA
DetekcePřidání fluorescenčního substrátu (4-methyl umbeliferyl fosfát) – v přítomnosti alkalické fosfatázy dochází k jeho štěpení – intenzita fluorescence odpovídá množství zachyceného antigenu
Zachycení cílového patogenu přes antigen na primární protilátku
Průběh stanovení: pomnožení vzorku v doporučených pomnožovacích médiíchnanesení vzorku do vzorkovací jamky stripu vložení do přístroje – reagencie pro jednotlivé kroky imunochemické reakce jsou v ostatních jamkách stripu a imunoreakce probíhá automaticky včetně vyhodnocení
Video: http://www.biomerieux-industry.com/food/vidas-listeria-monocytogenes-detection#VIDAS LMO2
VIDAS nebo mini-VIDAS Analyzers
Navázání sekundární protilátky značené alkalickou fosfatázou
Video: http://www.biomerieux-industry.com/food/vidas-listeria-monocytogenes-detection#VIDAS LMO2
http://www.biomerieux.com/
bioMérieux
VIDAS or mini-VIDAS Analyzers
Validace dle ISO 16140 oproti ISO 6579 (AFNOR, N°BIO 12/16-09/05)
Salmonella spp.
VIDAS nebo mini-VIDAS Analyzers
Vzorek = vzorek testované potraviny resuspendovaný a následně kultivovaný v pomnožovacím bujónu Xpress 2 broth (odlišné od ISO 6579)Použitý bujón je zvolen tak, aby byl kompatibilní vhodný pro danou metodu.
Detekce a konfirmace Listeria monocytogenesvalidováno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostředí) a validováno AOAC (vzorky potravin) dle Method no. 2004.02)
http://www.biomerieux.com/
bioMérieux
VIDAS nebo mini-VIDAS Analyzers
VIDAS kity
• E. coli O157 - VIDAS® UP E. coli O157 (including H7)
• E. coli O157 - VIDAS® ECO
• E. coli O157 (confirmation) - VIDAS® ICE
• Salmonella spp. - VIDAS® SLM
• VIDAS® ICS
• Salmonella spp. - VIDAS® Easy SLM
• Listeria spp. - VIDAS® LIS
• Listeria spp. - VIDAS® LSX
• Listeria monocytogenes VIDAS® LMO2
• Staphylococcal enterotoxins - VIDAS® SET2
• Campylobacter spp. - VIDAS® CAM
GLISA-Rapid Test (Gold Labelled ImmunoSorbent Assay) – Lateral Flow Test
Detekční limit: 105 KTJ/ml ve vzorku(homogenát selektivního pomnožení nebo resuspenze čisté kultuy)(někdy vyžadováno tepelné ošetření - 20 min při 80 °C = lýze buněk = lepší pohyblivost samotných buněčných stěn s antigenem)
http://www.meridianbioscience.eu/media/home_3columns_images/751630.jpg
GLISA-Rapid Test
Reakční zóna150 µl vzorku
Testovací zóna Kontrolní zóna
+ Pos. - Neg.
Singlepath© pro detekci Listeria monocytogenes (Merck)
Konvenční (standardní) vs. alternativní (rychlé) metody
VERIFIKACE – ověření fungování dané metody (konvenční či alternativní) za podmínek dané laboratoře
VALIDACE – ověření alternativní metody vůči dané referenční metodě (obvykle mezinárodní normy ISO - standardní konvenční metody) – náročný proces, alternativní metoda musí poskytovat stejné nebo lepší výsledky než referenční metoda
ISO 16140:2003 – Mikrobiologie potravin a krmiv – Protokol pro validaci alternativních metod2 části : srovnávací studie obou metod (aplikace na různé typy vzorků s různými kmeny sledovaného patogenu při různých koncentracích apod.)mezilaboratorní srovnání (provedení dané metody na stejných vzorcích paralelně ve více laboratořích)Velice nákladný a zdlouhavý proces – validaci alternativních metod obvykle provádějí specializované organizace na náklady výrobce alternativní metodyReferenční metoda – obvykle mezinárodní normy (ISO)
http://www.aoac.org/http://www.afnor.org/enhttp://www.nmkl.org/NordVal/NordVal.htm
Validace alternativních metod
Kvalitativní metody – kritéria validace
1. Selektivita (inkluzivita: schopnost detekovat cílový mikroorganismu z
velkého množství kmenů/ exkluzivita: zanedbatelná interference relevantního
rozsahu necílových mikroorganismů)
2. Relativní přesnost (stupeň shody mezi výsledky získanými oběma metodami
na stejných vzorcích)
3. Mez detekce
4. Relativní sensitivita (schopnost alt. metody detekovat shodně s referenční
metodou) /Relativní specifita (schopnost alt. metody nedetekovat, pokud není
detekováno referenční metodou) shodně s referenční metodou
5. Shoda mezi metodami
Validace alternativních metod
Kvantitativní metody – příklady kritérií pro validaci
linearita
relativní přesnost
limit detekce a limit kvantifikace
specifita a sensitivita
selektivita
Robustnost (odolnost vůči vyhnutelným i nevyhnutelným okolnostem – jiný
pracovník, jiná šarže apod.)
Přesnost a správnost
Opakovatelnost (stejný vzorek – stejné podmínky – stejná laboratoř) a
reprodukovatelnost (stejný vzorek – stejné podmínky – různá laboratoř)
Validační certifikáty - BAXAOAC-RI Performance Tested MethodSalmonella #100201; L. monocytogenes #070202; L. spp #030502, S.aureus # 120701; Campylobacter coli/lari/jejuni
AFNOR CertificationSalmonella #QUA 18/3-11/02
NordVal CertificationSalmonella #2006-30-5408
Certificates from AFNOR and AOAC are equal
Vzorek A – pozitivní reakce, vzorek B- negativní reakce
A B
http://www.ssi.dk/~/media/Admin/Diagnostica%20Downloads/Downloads%20UK/Brochures/BrochureSalmonella%20antisera%20ver%202%20high14112011145552.ashx
Sérologická konfirmace Salmonella spp.
•Sklíčková aglutinace•Testování na přítomnost vybraného O-antigenu•Část kolonie je resuspendována v kapce vybranéhoO-antiséra na sklíčku tak, aby byla získána homogennízakalená suspenze.•Sklíčko se opatrně naklání po 30-60 s. Výsledek se sledujiproti tmavému pozadí, pokud možno s lupou.•Pokud se bakteriální buňky shlukují do více či méněoddělených shluků, je to považována za průkaz přítomnostitestovaných O-antigenů.
•Před testováním nutno vyloučit autoaglutinující kmeny (vzácné) - část kolonie je resuspendována vefyziologickém roztoku. Sklíčko se opatrně naklání po 30-60 s. Výsledek se sleduji proti tmavému pozadí, pokudmožno s lupou. Pokud se bakteriální buňky shlukují do více či méně oddělených shluků, kmen je považován zaautoaglutinující a detekce antigenů je tak nemožná.
Fluorescence - princip
Princip fluorescenceLátka absorbuje energii záření o určité vlnové délce, přejde do excitovaného stavu a při návratu do základního stavu emituje záření o nižší vlnové délcePro látku schopnou fluorescence je vlnová délka excitačního a emisního záření specifickáEpifluorescenceZáření dopadá na vzorek (epi=na), neprochází jím
http://www.perceptive.co.uk/img/applications/applications_deft1.jpg
http://www.online-tensiometer.com/produkte/cleanospector/bilder/fluorescence_jabolinski_diagram.jpg
LIVE BacLight™ Bacterial Gram
Stain Kit
LIVE/DEAD® BacLight™
Bacterial Viability Kit
LIVE/DEAD® Reduced
Biohazard Cell Viability Kit #1
LIVE/DEAD® Yeast Viability Kit
Cíl Bakterie Kvasinky
Výsledek Živé G-+ se barví zeleně a živé G-se barví červeně
Odlišné zbarvení je založeno na propustnosti membrán. Živé buňky se
barví hlavně zeleně a mrvé buňky převážně červeně (proniknou obě
barviva)
Aktivní buněčné vakuoly se barví oranžově, živé i mrvé buněčné stěny modře
Fluorescenční látky
SYTO® 9 SYTO® 9 SYTO® 10 FUN® 1
Hexidium iodid Propidium iodid Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardní filtry FITC FITC FITC FITC
Texas Red® Texas Red® Texas Red® DAPI
Ex/Em (nm) 480/500 480/500 484/505 488/560–610
480/625 536/617 535/624 365/440
Barvení – možné aplikace:Odlišení živé a mrtvé buňky, G+ a G-
http://lib.jiangnan.edu.cn/asm/254-Introduce.htm
Fluorescence - aplikace
SYTO®9 – zelené fluorescenční barvivo vážící se na nukleové kyseliny – proniká do všech buněk, propidium iodid – červené fluoresceční barvivo – proniká pouze do poškozených buněk
DEFT - direct epifluorescent filter technique – přímá epifluorescenční technika spojená s filtrací
http://www.pharmtech.com/pharmtech/data/articlestandard//pharmtech/182012/771886/i1.gif
Bakteriální buňky jsou filtrací zachyceny na membránuPo krátké inkubaci je membrána obarvena akridinovou červení –vizualizace a spočtení zatím okem neviditelných kolonií. Re-inkubace membrány –možná izolace a identifikace vykultivovaných mikroorganismů.
http://www.perceptive.co.uk/img/applications/applications_deft1.jpg
Fluorescence – rychlé metody
Escherichia coli s probou
Enterococcus faecium s probouhttp://www.biovisible.com/photopage.shtml
Fluorescence – rychlé metody
FISH – fluorescenční hybridizace in situIdentifikace bakterií – vazbA specifické fluorescenčně značené DNA próby na gen pro 16S rRNA
Chromogenní půdyCOLILERTKoliformní bakterie:Odštěpení žlutě zbarveného o-nitrofenolu ze substrátu ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galaktosid) pomocí β-D-galaktosidázy
Rychlá metoda: zvýšení selektivity biochemické reakce, zjednodušení a zrychlení detekce
Fluorogenní půdy
Přítomnost MUG (4-methylumbelliferyl-β-D-glukuronid ) v médiu β-D-glukuronidáza pozitivní kmeny E. coli jsou schopny odštěpit z tohoto substrátu pomocí β-D-glukuronidázy fluoreskující sloučeninu 4-methyl umbelliferon (4MU), který po osvětlení UV světlem při 360 nm fluoreskuje
Rychlá metoda: zvýšení selektivity biochemické reakce, zjednodušení a zrychlení detekce
Colilertβ-D- glukuronidázová aktivita E. coli UV → λ = 360 nmfluorescence
COLILERT: fluorescence + MPN
Žluté jamky = koliformní bakterieŽluté jamky s fluorescencí= E. coli (ISO/DIS 9308-2)Paralelní kvantifikace koliformních bakterií a E. coliIzolace kultury z destičky na pevné médium může být případně provedena pomocí sterilní jehly.
Vzorek (100 ml) + sáček dehydratovaného média
Promísení a nalití do destičky (Quanti-Tray® nebo 97-Well Quanti-Tray®-2000 ) + uzavření (Quanti-Tray® Sealer)-objemy jamek desetkrát menší – simulace použití desítkových ředění (stejný celkový objem suspenze)
Inkubace 36 ± 2 °C po dobu 18 h - 22 h
TEMPO: Fluorescence + MPNMiniaturizace a automatizace stanovení
TEMPO© (výr. bioMérieux)Automatizovaný systém na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN
2.25 µl
22.5 µl
225 µl(objem vzorku)
Patentovaná karta s jamkami různých velikostí (jednotlivé desetinásobky objemu vzorku)Jednotlivé jamky obsahují příslušné dehydratované médium
Nanesení vzorku –Automaticky se rozplní do všech jamek a současně desítkově zředí
Následně kultivace a detekce
Metody detekce – dvou fázová1) Speciálně navržená média umožňují cílovým mikroorganismům růst2) Detekce růstu prováděna fluorescenčněa) fluorescenční pH indikátor pro stanovení koliformních bakterií (samostatně,
nikoliv paralelně s koliformními bakteriemi)
Celkový počet koliformů: definice koliformů dle ISO: koliformní bakterie zkvašující laktózu –dochází ke změně pHfluorescentní pH indikátor : 4-methylumbelliferon (4MU) 4MU
fluorescence při
pH
4MU
bez fluorescence při
pH 6
TEMPO: Fluorescence + MPN
Negativní jamka: fluorescence
Pozitivní jamka: bez fluorescence
b) Fluorescenční substrát pro specifický enzym – detekce specifické enzymatické aktivity –stanovení E. coli (samostatně, nikoliv paralelně s koliformními bakteriemi)
MUG
β-D-glukuronidáza
(95 % E. coli)
glukuronát 4-methylumbelliferon
+
E. coli medium : přítomnost β-D-glukuronidázySpecifický substrát:4-methylumbelliferyl-β-D-glukuronid (MUG) (viz využití v agarových půdách)
nefluorescenční mol. fluorescenční mol.
Pozitivní jamka : fluorescence
Negativní jamka: bez fluorescence
TEMPO: Fluorescence + MPN
UV
světlo
Kód (počet pozitivních jamek):
KTJ/gMPN tabulky
+
Úroveň ředění
TEMPO – PŘÍPRAVNÁ STANICE
TEMPO-ODEČÍTACÍ STANICE
TEMPO: Fluorescence + MPN
16 / 15 / 4
Průtoková cytometrie (průtokové měření buněk) – od 80. let používána v medicíně pro počítání relativně velkých krevních buněk Modifikace pro účely mikrobiologie: buňky obarveny fluorescenčními barvivy. Buňky dále po jedné procházejí úzkou skleněnou kapilárou, kde jsou prosvěcovány laserem - dochází k fluorescenci a rozptylu. Každé prošlé buňce tak náleží hodnoty sledovaných fluorescencí a rozptylu světla (závisí na velikosti a složitosti povrchu). LZE URČIT POČET PROŠLÝCH BUNĚK (až 1000 buněk/sekunda) A TÉŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZÁVISLOSTI NA POUŽITÝCH BARVIVECH.
http://www.eawag.ch/medien/bulletin/20130124/prinzip_flowzyto2_e.gif?hires
Průtoková cytometrie
Průtoková cytometrieJednotlivé v čase získané signály (jeden bod odpovídá jedné buňce) jsou složeny a zobrazeny v grafu na základě fluorescence při dvou sledovaných vlnových délkách (zelená – 520 nm, červená – 630 nm) – slouží k odlišení buněk (znám poměr obou fluorescencí) od jiných částic.Dole: Zelená fluorescence vynesená proti vedlejšímu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s nízkým a vysokým obsahem nukleových kyselin
http://www.bdbiosciences.com/eu/wcmimages/Eawag_bacteria.jpg
Počítání živých a mrtvých buněk – např. BacLight®. Živé buňky fluoreskují zeleně (FL1), mrvé červeně (FL3), po excitaci 488 nm argonovým laserem.
Průtoková cytometrie
ATP bioluminiscence
http://www.promega.co.uk/~/media/images/resources/figures/enotes/fe0027_fig1.jpg?la=en
http://www.biotek.pt/assets/tech_resources/143/clarity_atp_conc_fig2.gif
Princip: detekce úrovně přítomnosti ATP (úměrná přítomnosti mikroorganismů či produktových residuí)V přítomnosti ATP a kyslíku katalyzuje enzym luciferáza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzáření světla o vlnové délce 560 nm
ATP bioluminiscence
http://www.bioxys.com/images2/figure-B11.gif
http://www.micromatic.com/draft-keg-beer/line-cleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviews.html
ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II
Chorianopoulos N G et al. Appl. Environ. Microbiol.
2010;76:2018-2022
Malthus – v průběhukultivace v selektivnímmédiu (příp. se specifickýmsubstrátem) pro danýmikroorganismus dochází kezměně konduktance
Změna konduktance
(vodivosti) živného bujónu
(μS) v průběhu času (h)
Konduktance
Biosenzor = analytický nástroj, který převádí biologickou odpověď do elektrického signálu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivní element (rozeznává cílový analyt) - celá buňka/mikroorganismus nebo její specifická část (buněčné systémy, enzymy, neenzymatické proteiny) schopná se specificky vázat na mikroorganismy určitých druhů - tkáň, mikroorganismus, buňka, enzym, protilátka, nukleová kyselina apod.+ převaděč (transducer), převádí událost rozpoznání do měřitelného elektrického signálu – optický, elektrochemický, thermometrický, piezoelektický, magnetický a mikromechanický nebo jejich kombinace
Biosenzory
Biosenzor =celá buňka/mikroorganismus (CBS – cell-based sensors)
Buněčné biosensory
Cell-Based Sensor (CBS):
Patogenní mikroorganismy interagují během infekce se savčími
buňkami - využití příslušných savčích tkáňových buněk k detekci
patogenů či jejich toxinů. Systém je vhodný pro živé bakterie a aktivní toxiny. Poškození tkáňových buněk je měřeno opticky či elektricky.
Chromatofor: pigmentové buňky ryby
bojovnice pestrá (Betta splendens) –
důsledkem kontaktu se specifickými
biologickými agens (např. bakteriálními
toxiny) dochází k jejich agregaci
- Vývoj aplikací pro detekci patogenních
bakterií
- Detekce: optický detekční systém pro
měření změn v optických vlastnostech
chromatoforů
http://patentimages.storage.googleapis.com/US6913877B1/US06913877-20050705-D00007.png
Buněčné biosensory
Bakteriofágové biosensory
Cell-Based Sensor (CBS):
http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2014/an/c3an01989f
Bakteriofágové jsou schopni rozeznat specifické receptory na povrchu buněk, na které se vážíVazba buněk na pro ně specifické bakteriofágyDetekce vazby: optická/elektrická (vazbou se mění procházející proud)
PCR principDENATURACE dsDNA záhřevem
• cca 94- 95 °C
• počáteční denaturace 5 minut
• poté v každém kroku 2-3 minuty
NASEDNUTÍ (annealing, hybridizace) primerů na ssDNA• forward primer na 3´-5´ řetězec,
reverse primer na 5´-3´ řetězec• Ta = teplota nasedání• Ta 50-65 °C – záleží na sekvenci
primerů• t=30 s-60 s• Ta blízká tzv.teplotě tání primerů (Tm)• Tm =teplota 50% disociace duplexu
primer/templát • Tm – výpočet: různé vzorce, záleží na
obsahu CG a TA• Jeden z nejdůležitějších faktorů –
nutný pro specifitu• T >> Ta= primery
nenasedají=žádný product• T << Ta= primery nasedají
nespecificky – nespecifické produkty
ELONGACE (amplifikace) DNA
• in vivo DNA polymeráza začíná syntetizovat novou DNA z 3 ´ konce RNA primeru
• in vitro z primerů – syntéze probíhá z primerů
• 72 °C – optimální teplota pro DNA polymerázu
• 45 s-3 minut – v závislosti na délce produktu a procesivitě polymerázy
• závěrečná elongace 5-15 minut
PCR principPCR=Polymerase Chain Reaction (1983 Kary Mullis)in vitro amplifikace vybraných úseků DNA(obvykle 100 bp – 1500 bp) pomocí DNApolymerázy ohraničených dvěma primery(synteticky připravené oligonukleotidy)
Typický počet cyklů= 30 - 45
5´
3´5´
5´3´
5´
5´3´
3´5´
5´
5´ 3´
3´
volný 5´ primer (forward primer) volný 3´ primer (reverse primer)
hybridizovaný 5´ primer
hybridizovaný 3´ primer
templát
sekvence identické s primery
sekvence komplementární s primery
Průběh PCR reakce
Exponenciální fáze
• Účinnost amplifikace se blíží 100 %
• V každém cyklu dojde k replikaci takřka všech přítomných produktů
Lineární fáze
• Snížená účinnost amplifikace
• Pouze část PCR produktů je replikována
Plateau
• Nedochází k další replikaci přítomných PCR produktů
• Nedostatek či degradace některé komponenty
• Reasociace nasednutých primerů může být preferována z termodynamických důvodů (množství již přítomných PCR produktů v reakci)
PCR princip
http://www.ebioe.com/uploadfile/2010/0314/20100314110534183.gif
Chyba na začátku (nasednutí primerů na jiná, než cílová místa v DNA a amplifikace) –Největší vliv – dále propagována v následných krocích (vzniklé produkty již obsahují pro primeryKomplementární sekvenci)
DNA (genovomová, plazmidová, cDNA)
Primery (forward, reverse)
Termostabilní DNA polymeráza
Mg2+ (kofaktor pro DNA polymerázu)
dNTP mix (dCTP, dATP, dTTP, dGTP) – stavební kameny pro nově syntetizovanou DNA
Voda bez přítomnosti Dnáz a RNáz–(enzymy, které degradují DNA, RNA –“nuclease free water”)
MASTERMIX
Celkový objem – 25 μl – 50 μl
PCR princip
Reakční pufr
(vhodné prostředí pro polymerasu - iontová síla, pH)
složka obvyklá koncentrace v reakční směsi
nízká koncentrace vysoká koncentrace
templát DNA 0,01 ng-1000ng (plazmid-genomová DNA)
nízký výtěžek nízká specifita nasedání primerů
(přítomnost inhibitorů PCR reakce)-EDTA, heparin, (PO4)3-
primer A 0,1-1µM nízký výtěžek nízká specifita nasedání primerů
primer B 0,1-1µM
DNA polymerasa 0,01-0,05 U/µl nízký výtěžek nízká specifita
Mg2+ 1-5mM
(množství Mg2+ je přímo úměrné množství dNTP)
nízký výtěžek nízká přesnost DNA polymerasy
stabilizace ds DNA – neúplná renaturace – nižší výtěžek
stabilizace nespecifické vazby primerů-nespecifické
Reakční pufr 10mM Tris-HCl, 50mM KCl
pH<7 poškození templátu
dNTP (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)
200µM pro každý nukleotid
vyšší přesnost chybné zařazení
Reakční směs (koncentrace)
Taq DNA polymeráza• Získána z termofilní bakterie Thermus aquaticus (nyní
rekombinantně)• teplotní optimum 75-80°C (150 nt/s)• Částečně aktivní při pokojové teplotě – nutnost pracovat na
ledu• při teplotách nad 90°C je inaktivní, ale při ochlazení se znovu
aktivuje• pouze 5´exonukleasová aktivita (degradace Okazakiho fr.) • nikoliv 3´exonukleasová aktivita (proofreading) = 1 chyba na 10-20 tisíc nukleotidů
DNA polymerázy
Další typy polymeráz:• Proofreading polymerázy (3´exonukleasová aktivita)• Tth polymeráza- reverzní transkripce (Mn2+) nebo polymerázová aktivita (Mg2+) v
závislosti na přítomných kofaktorech
Hot startové polymerázyAktivita při pokojové teplotě je inhibována – polymeráza je vázána na svoji protilátku nesenou na voskových kuličkách – k aktivaci polymerázy doje až po záhřevu na 94 °C (destrukce protilátek)
1) Uvolnění DNA z buňky
- Lýze buněčné stěny detergenty nebo teplem, degradace proteinů proteinázou K
- Ošetření Rnázou pro RNA-free genomovou DNA
2) Izolace DNA z uvolněné buněčného obsahu
=odstranění RNA, proteinů, lipidů atd.
- Centrifugace „odpadu“ do peletky (tepelná izolace)
- Iontově výměnná chromatografie (komerční kity) – zachycení DNA iontovými interakcemi na kolonce (DNA je negativně nabita)
- Magnetická separace (komerční kity) –zachycení DNA na magnetické částice např. pomocí náboje (DNA záporně nabitá, náboj částic upraven pomocí pH – pro zachycení DNA kladně nabité, pro uvolnění DNA záporně nabité)
- Fázová separace (vodná/chloroformová fáze–CTAB method)
Izolace DNA
PCR - Detekce potravinových patogenůPrincip: využití rodově či druhově specifických primerů
komplementárních k rodově či druhově specifickým úsekům DNA
(k rodově či druhově specifickým genům či genovým sekvencím)
Identifikace čistých kultur = bez problémů
Průkaz či kvantifikace mikroorganismů v potravinové matrici – možné problémy
• Účinnost izolace DNA
– metody průkazu – izolace DNA teoreticky i z jedné buňky několika ve 25 g/10 g není možná
– metody průkazu: nutno pomnožení
– metody kvantifikace: kvantifikační limit, volba vhodných matric (např. oplachy kuřecího masa)
• Účinnost PCR amplifikace
– detekční a kvantifikační limit
– přítomnost PCR inhibitorů (blokují zvláště polymeraci)
– přítomných v reálném vzorku, nutnost jejich odstranění při izolaci DNA
• Odlišení DNA z mrtvých a živých buněk
– ethidium monoazide (EMA) se ireverzibilně inkorporuje do DNA mrtvých buněk – aplikován před izolací DNA – DNA z mrtvých buněk je sice izolována, ale „neviditelná“ pro PCR – EMA brání polymeraci
– využití reverzní transkripce = izolace mRNA – přepis do cDNA
– volba malých objemů – BAX system
PCR - principOčekávaný PCR produkt má svoji specifickou délku a sekvenci
Vizualizace produktu na základě délkyelektroforetická separace v agarosovém geluinterkalačními činidla: Ethidium bromide, Sybr GreenVazby na dsDNA PCR produktu – změna fluorescence
elektroforetická separace v polyakrylamidovém gelu na automatickém sekvenátoru fluorescenční značka na 5´ -konci primeru
Druhově specifická PCRDUPLEX PCR =dvě dvojice primerů C. jejuni: C1 + C4 komplementární k úseku pro domnělý gen oxidoreduktázy, 159 bpC. coli: 18F + 519R komplementární k domnělému genu pro aspartátokinázu a flanking ORF, 500 bp
PCR - principPCR produkt má svojí specifickou délku a sekvenci
Vizualizace produktu na základě sekvence Hybridizace s imunochemicky značenými probami
15-25
cyklů
PCR-ELISA
microarray (mikročipy)macroarray (makročipy)
hybridizace PCR produktu s fluorescenčně značenou sondou DNA (shoda sekvencí)
DNA čipy
Interkalační činidla vázáno do dsDNA – emituje fluorescenční signál po excitaci
Pokud je PCR produkt zahřán k teplotě tání, dochází k denaturaci dsDNA na ssDNA, interkalační činidlo se uvolní = pokles fluorescenceŽádný
signálSignál Rostoucí teplota
Interkalační činidlo
PCR - principPCR produkt má svojí specifickou délku a sekvenci
Křivka tání: Vizualizace PCR produktu na základě sekvence a délky a jim odpovídající teploty tání
Inflexní bod = maximum či minimum 1. derivace rovná nulemaximum na funkci - 1. derivace
Teplota tání (melting temperature - Tm) = teplota, při které dochází k denaturaci produktu
Závisí na délce PCR produktu a jeho složení
Roste s počtem bazí a obsahem C-G
PCR - princip
Křivka tání
Křivka tání: Vizualizace produktu na základě sekvence a délky
Optimalizace PCR• Analytické PCR = zjištění přítomnosti sekvencí komplementárních k
primerům a jejich vzájemné vzdálenosti
– 1. specifita = amplifikace pouze žádaných úseků
– 2. reprodukovatelnost
– 3. citlivost = počet kopií templátu, které lze detekovat
• Preparativní PCR = využití amplifikovaných PCR produktů k dalším účelům (sekvenace, klonování aj.)
– 4.výtěžek = dostatečné množství produktu
– 5.přesnost = bez chybného zařazení bazí
• Optimalizace
– Složení reakční směsi: koncentrace Mg2+, primerů, druh polymerasy
– Reakční cyklus : Ta, počet cyklů
Analytická PCR Co hledám? Co chci zjistit?
Přítomnost specifické sekvence=specifického genu=
k těmto specifickým oblastem navrženy PRIMERY
oligonukleotidy o délce 20-25 nukleotidů
Návrh primerů
free software např. FastPCR (vyvinut na univerzitě Helsinkách http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/download.html)
komerční software, návrh též možno objednat
sekvence potřebné k navržení primerů – viz např. www.pubmed.com
Primery-požadavky POZOR na intramolekulární komplementární sekvence – tvorba
sekundárních struktur
vyrovnaný poměr GC a AT
3´ konce primerů (od nich probíhá syntéza)
Nutně plně komplementární k templátu
NE vzájemně komplementární– tvorba a amplifikace dimerů
NEtymin (nízká specifita párování) = degenerace kodonu
NE více jak dva G či C - vysoká stabilita (3 vodíkové vazby)=nespecifické produkty (nasednutí i pokud další část nekomplementární)
často tzv. GC svorka (zakončení GC)-zvýšení účinnosti hybridizace k templátu
5´ konce primerů
Plná komplementarita k templátu není vyžadována =
vložení restrikčního místa,
detekce mutace
připojeny různé značky (např. barviva)
• amplifikace ne zcela známé sekvence či sekvence s variabilními pasážemi = degenerované primery
– směs primerů lišící ve variabilním místě
– zařazení inosinu (páruje se se všemi bazemi) či tyminu (nízká specifita k A)
Primery-požadavky
Optimalizace PCR
A – 51 °C, 0,3 U DNA polymerasy Dráha 1 – CCM 6212 C. jejuni c = 407 ng/µl
B – 51 °C, 0,5 U DNA polymerasy Dráha 2 – CCM 6211 C. coli c = 262 ng/µl
C – 51 °C, 0,7 U DNA polymerasy Dráha 3 – CCM 4897 C. lari c = 475 ng/µl
D – 56 °C, 0,3 U DNA polymerasy Dráha 4 – ATCC 43954 C. upsaliensis c = 369 ng/µl
E – 56 °C, 0,5 U DNA polymerasy M – Marker 100 bp DNA Ladder
F – 56 °C, 0,7 U DNA polymerasy Nt – beztemplátová kontrola
Optimalizace množství DNA polymerasy v reakci a teploty nasedání primerů
Rodově specifická PCRprimery (OT1559 a 18–1) komplementární k DNA kódující úsek 16S rRNA Campylobacter jejuni, Campylobacter coli a Campylobacter lari. Produkt amplifikace má velikost 287 bp
Druhově specifická PCRDUPLEX PCR =dvě dvojice primerů C. jejuni: C1 5' - CAA ATA AAG TTA GAGGTA GAA TGT-3'
C4 5' - GGA TAA GCA CTA GCTAGC TGA T-3' komplementární k úseku pro domnělý gen oxidoreduktázy, 159 bpC. coli: 18F 5' - GGT ATG ATT TCT ACAAAG CGAG-3'
519R 5'- ATA AAA GAC TAT CGT CGC GTG-3´komplementární k domnělému genu pro aspartátokinázu a flanking ORF, 500 bp
Multiplex PCR = přídavek násobného množství párů primerů+ možnost analysy více parametrů- zvýšení tvorby nespecifických produktů
diskriminace delších DNA fragmentů
M - marker 100 bp DNA LadderNt - beztemplátová kontrola1 – CCM 6212 C. jejuni , 2 – CCM 6211 C. coli3 – CCM 4897 C. lari, 4 – ATCC 43954 C. upsaliensis
Specifita primeru Forward Reverse Produkt Sada produktů (bp)
C. jejuni F1 THERM 4 186 bp 129, 186
C. coli F2B THERM 4 173 bp 129, 173, 186
C. lari F3 THERM 4 461 bp 129, 173, 186, 461
C. upsaliensis F4 THERM 4 129 bp 129
Druhově specifická PCR
Jednotlivé dvojice primerů jsou komplementární k DNA kódující úsek 23S rRNA a poskytujícíh u termofilních druhů kampylobaktera jinou sadu PCR produktů.
Detekce specifického genu• Detekce tet(O) – gen rezistence k tetracyklinu u Campylobacter sp. – kóduje
ochranný ribozomální protein
• Velikost produkty 559 bp = 1346 - 787
aaaaggc ggc gttttgttta tgtgcgtata tatagcggaa cattgcattt gagggatgtt 840gaattatatt catccgatac agcctgctct ggtgatattg taattttacc aaatgatgtt 960
ttgcag ctaa acagtatttt ggggaacgaa atactgttgc cgcagagaaa atttattgaa 1020ttctgg gctt ctgtcgggtt gtccata gag ccgctcccta ttggaagcgg agtgcagtat 1380
787
1346
Úsek sekvence tet(O), ke kterému jsou komplementární navržené primery
Sekvence forward primeru (5´- ggc gttttgttta tgtgcg- 3´) je obsažena v 5´-3´ vlákně (nasedá na 3´-5´ vlákno a ze 3´-konce amplifikace)Sekvence reverse primeru je k 5´-3´vláknu komplementární (tj. obsažena komplementární sekvence v opačné orientaci)
5´- gctt ctgtcgggtt gtccata – 3´3´- cgaa gacagcccaa caggtat – 5 ´: reverse primer5´- tatggac aacccgacag aagc – 3´: reverse primer
559bp179 bp
383 bp
500bp
1000bp
100bp
A 1 2 3 4 5 6
aaaaggc ggc gttttgttta tgtgcgtata tatagcggaa cattgcattt gagggatgtt 840gaattatatt catccgatac agcctgctct ggtgatattg taattttacc aaatgatgtt 960
AluI-restrikční enzym
ttgcag ctaa acagtatttt ggggaacgaa atactgttgc cgcagagaaa atttattgaa 1020
ttctgg gctt ctgtcgggtt gtccata gag ccgctcccta ttggaagcgg agtgcagtat 1380
štěpení produktu tet(O) restrikčním enzymem
Restrikční štěpení PCR produktu
A-100bp marker1-4-klinické kmeny C. jejuni rezistentní k tetracyklinu5-6- klinické kmeny C. jejuni sensitivní k tetracyklinuVelikost PCR produktu: 559 bpVelikost očekávaných produktů štěpení: 383 bp a 179 bp
787
1346
964
PCR kvantifikace• Účinnost izolace DNA z potravinové matrice
• Účinnost PCR detekce=citlivost (závislost signálu na výchozím množství templátu)
• DETEKČNÍ LIMIT!!!!L. monocytogenes
1kb 103 104 105 106
1003 bp
593 bp
Primery
komplementární
k Listeria spp.
Primery komplementární
k Listeria monocytogenes
semikvantifikace
• interkalační barviva
(např. SYBR green I)
• Fluorescenčně značené sondy = přesnější
– Hydrolyzační próby (hydrolysis probes)
– Hybridizační próby (hybridising probes)
• LUX system
Real-Time PCR
• Taq Man systém
•Hydrolyzační sonda s dvojicí
fluoroforů
PCR kvantifikace: Real-Time PCR
CT
CT (threshold cycle) – nejnižší cyklus ve kterém hodnota fluorescence
měřeného vzorku vzroste nad hodnotu fluorescence pozadí
BAX® system Q7
Validovaný systém pro detekci potravinových patogenů
Komerční kit pro izolaci DNA a PCR reakci
Validované schéma zkoušky (izolace DNA z malých objemů po pomnožení)
Detekce specifického produktu pomocí křivky tání
(případně též Real-Time PCR aplikace)
http://www2.dupont.com/DuPont_Home/en_US/index.html
BAX – postup
Pomnožené vzorky
Tepelná lýze přítomné DNA ve dvou krocích
2. PCR reakce a analýza
3. Výsledek
Přídavek lyzátu k hydratovaným PCR tabletám
Enrichment protocols vary depending on bacterial target and type of food you’re testing.
Salmonella, Enterobacter sakazakii,E. coli O157:H7, E. coli O157:H7 MP, Campylobacter jejuni/coli, Yeast and Mold37° +/- 2°C, 20 minut, poté 95° +/-3°C, 10 minutListeria and L. monocytogenes55° +/- 2°C, 60 minut, poté 95° +/-3°C, 10 minut
5 µl pro bakterie (obvykle), 20 µl pro kvasinky a plísně
• PCR tableta v suchém stavu
• DNA-polymeráza
• Primery
• Nukleotidy
• Suplementy (pufry)
• SybrGreen nebo fluorescenční próby
• Primery
• Interní kontrola
Použití malých objemů – řešení problémů odlišení DNA ze živých a mrtvých buněkDetekční limit 104 KTJ/ml v pomnoženém lyzátu = pouze pokud jsou přítomny živé buňky je tohoto limitu dosaženo. Při pozitivním výsledku nutna konfirmace pomocí izolace na ztužené médium (ověření živých buněk)
BAX – PCR tablety
Mastermix v tabletě – minimální riziko kontaminace• Externě přidaný úsek DNA (např. plazmid), který
obsahuje sekvence komplementární k použitým primerům• PCR produkt amplifikovaný z interní kontroly má však jinou délku a sekvenci než cílový
produktu amplifikovaný z DNA cílového mikroorganismu• Kontrola průběhu PCR v každé jednotlivé reakci – vyloučení falešně negativního
výsledku, pokud by PCR v dané reakci neproběhlo
Detekce
Analýza křivky tání za použití SybrGreen
•Vysoká senzitivita (pomnožení)
Staphylococcus aureus
Campylobacter jejuni/coli/lari
Vibrio cholerae/ parahaemolyticus/vulnificus
Fluorescenční DNA proby
•Kvantifikace
Salmonella
Enterobacter sakazakii
Listeria monocytogenes
Genus Listeria
E. coli O157:H7
Yeast and molds
BAX - detekce
+
DNA cílového mikroorganismu BAX® systemprimery
v tabletáchPCR
+ Amplifikace není detekována
Ostatní DNA
PCR
BAX® systemprimery
v tabletách
Amplifikace specifických fragmentů DNA
Detekce specifických fragmentů
Analýza křivky tání (fluorescenční signál v průběhu záhřevu)
BAX – detekce
BAX – křivka táníNaměřená data Processed Data
Silný pozitivní výsledek
Negativní výsledek
Cílový produkt
Pozitivní kontrola
Pozitivní kontrol
Křivky tání –teplota tání je specifická pro cílový produkt a pro produkt interní kontroly
BAX – křivka táníKaždá cílová sekvence má specifickou křivku tání
E. coli O157:H7 positive
Salmonella positive
L. monocytogenespositive
Listeria positive
E. sakazakii positiveE. coli O157:H7 MP positive
C. jejuni/coli positive
BAX - detekce
Křivka tání: slaba interní kontrola v přítomnosti
vysoké koncentrace Salmonella spp.
Real time: slabá interní kontrola v přítomnosti
vysoké koncentrace Campylobacter spp.
(přímé stanovení počtu Campylobater jejuni/coli/lari z oplachů kuřecího masa – vhodná matrice pro
izolaci DNA)
Salmonella AFNOR (ISO 16140) protocolVzorek 1:10 BPW
18 h,37ºC
RVS Müller-Kauffmann
24 h, 41,5 / 37 ºC
5 suspektní kolonie na TSA
24 h, 37º CBiochemická a sérologická konfirmace
XLD 2. Plate
24 h, 37ºC
BHI
3h, 37 ºC
22 h, 37 ºC
1.5 d neg. and pos. result
3 d neg., 5 d pos. results
Salmonella ( ISO 6579:2003) versus BAX®-PCR
Listeria monocytogenes
MOPS-Bleb
22h, 35 °C
23 h, 30 °C
2.5 d neg. a poz. výsledek
Vzorek 1:10 ½ Fraser
0,1 ml v 10 ml Fraser
24 h, 35 °C
Konfirmace
24 h při 30ºC
ALOA OCLA
24-48 h, 37 °C
18-24 h bei 37 °C
Suspektní kolonie na TSYEA
3-4 dny neg., 5-6 dny poz. výsledek
L. monocytogenes (ISO 11290-1:2005) versus BAX®-PCR
Využití MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů
Sabina Purkrtová1 , Petra Junková2
1Laboratoř potravinářské mikrobiologie, 2Laboratoř aplikované proteomiky
Ústav biochemie a mikrobiologie, Fakulta potravinářské a biochemické technologie,
Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮIdentifikace na základě fenotypu:Fyziologické + biochemické znakya) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barvení, tvar)b) požadavky na teplotu, atmosféru, živné látkyc) základní biochemické testy: oxidáza, kataláza, fermentace/oxidace glukózy, hemolýzy
apod.d) Biochemické testy specifické pro určitou skupinu mikrorganismů testů
Např. Bacillus cereusG+ tyčka tvořící endospóry, vlhké, snadno rostoucí kolonie při 37 °Ckataláza pozitivní, β-hemolýza, nefermentuje manitol + enzym lecitináza: na půdě MYProste v růžových koloniích se zónou precipitace
http://www.foodhaccp.com/memberonly/newsletter164.html
http://www.napavalley.edu/people/srose/PublishingImages/Bacillus%20cereus%202(Gram%20stain).jpg
Souprava biochemickýchtestů Microgen Bacillus ID(doba stanovení: 48 hodin)
95
IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮIdentifikace na základě genotypu:Kritérium druhu u prokaryot (bakterie a archea):Sbírka kmenů, které jsou charakterizovány nejméně jedním diagnostickým fenotypovým znakem a jejich purifikované DNA molekuly vykazují nejméně 70% DNA-DNA hybridizaci, což odpovídá nejméně 97% shodě v sekvenci genu pro 16S rRNASekvenace genu pro 16S rRNA a analýza získané sekvence
Mapa genomu pro B. cereus ATCC 14579
http://www.acgtinc.com/specialty_dna_sequencing.htm96
MALDI-TOF MSIdentifikace na základě fenotypu:Analýza převážně intracelulárních proteinů – MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry= Hmotnostní spektrometrie s průletovým analyzátorem a ionizací laserovou desorpcí v přítomnost matrice
Obrázek 1: Schéma MALDI (http://biomikro.vscht.cz (květen 2008)
měkká ionizační metoda - nízký stupeň fragmentacevzorkumatrice absorbuje energii laseru – při odpařování ssebou matrice strhává molekuly vzorku, převádí je doplynného skupenství a ionizuje přenosem protonu -vznik pseudomolekulové ionty [A+H] +
vzorek: mikrobiální kultura (buněčný materiál jedné nebo více kolonií) nebo extrakt intracelulárních proteinů nanesen na vodivou kovovou desku apřekryt matricí
97
MALDI-TOF MSPrůletový analyzátor - měření tzv. doby letu - doba letu je funkcí měrné hmotnosti iontu (m/z)
2
2
2L
teU
z
m
m hmotnost, z náboj,
L délka driftové
zóny, e elementární
náboj, U urychlovací
napětíObrázek 2: Schéma MALDI TOF MS (http://biomikro.vscht.cz (květen 2008)).
Provedení analýzy – získání proteinovéhoprofilu daného izolátu specifického jako otiskprstu (fingerprint)
Proteinový profil mikroorganismu
Proteinový profil-složený z jednotlivých spekter (jedna expozicelaseru = jedno spektrum)-velikost píků odpovídá měrné hmotnosti iontum/z (z obvykle rovno jedné = molekulovéhmotnosti) – rozsah obvykle 2000 -20 000- intenzita odpovídá množství přítomnéhoproteinu 98
MALDI-TOF MS
1) Příprava vzorku• Mikrobiální kultura či
její proteinový extrakt je rozetřen na ocelovou destičku a překryt matricí
• Matrice zprostředkovává desorpci a ionizaci vzorku jako pseudomolekulových iontů [A+H] +
2) MALDI-TOF MS analýza• Získané proteinové spektrum (složené
hlavně z intracelulárních proteinů) je jedinečné („fingerprint) pro jednotlivé druhy či rody mikroorganismů, příp. též jejich kmeny
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry
http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2014/RA/C4RA05604C
http://cmr.asm.org/content/26/3/547.figures-only
3) identifikace:Srovnání proteinového spektra sproteinovými spektry obsaženými vdatabázi – vyjádření jejich shody
MALDI-TOF MS: PRINCIP
100
http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/custom-dna-oligos-qc-analysis-by-mass-spectrometry.html
Měkká ionizační metoda:• Nízká úroveň fragmentace vzorku
Animation: http: //cmgm.stanford.edu/pan/section_html/MS/
MALDI-TOF MS
Proteinový profil mikroorganismu• převážně intracelulární (vnitrobuněčné) proteiny menší než 15 kDa, které se
vyskytují ve velkém množství, jsou bazické a středně hydrofobní• většina ribozomální proteiny, proteiny vážící se na DNA, cold-shock proteiny, heat-
shock proteiny, chaperony atd. = proteiny kódované konzervovanými provozními (house-keeping) geny = nižší ovlivnitelnost kultivačními podmínkami + shoda s identifikací založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA)
101vizualizace proteinových profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol., 2010)
MALDI-TOF MS
Volba matrice absorpce při vlnové délce použitého laseru (obvykle 337 nm)tvorby žádoucích krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky)matrice obvykle kyselého charakteru (účinná ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organické kyseliny:-kyano-4-hydroxyskořicová kyselina (CHC) 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová kyselina(sinapiová kyselina - SA)2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB)
102
Příprava vzorkuPřímé nanesení intaktních buněk - k lýzi buněkdochází samovolně při kontaktu s matricí– většinabakteriíPlná extrakce proteinů - organické kyseliny a/neboalkoholy (kvasinky, plísně, některé druhy bakterií –v závislosti na odolnosti buněčné stěny) – např.extrakce za použití kyseliny mravenčí a ethanolu
http://cmr.asm.org/content/26/3/547.figures-only
CHC: -kyano-4-hydroxyskořicová kyselina (organické rozpouštědlo: 50% acetonitril s 2,5 % trifluoroctovou kyselinou)
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=CZ
MALDI-TOF MS
Analýza proteinového profilusrovnání proteinového profilu (fingerprint) s referenční (komerční) databází kontrolníchkmenů - provádí software – 3 komponenty1)shodnost neznámého spektra s nejpodobnějším spektrem databáze2) shodnost vybraného nejpodobnějšího spektra s neznámým spektrem3) korelace mezi intenzitami píků daných spekterhodnota 0 (žádná shoda) až 1000 (absolutní shoda) – převedeno do dekadického logaritmu –skóre podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace
Současné komerční databáze od výrobců MALDI-TOF MSBruker Daltonics – MALDI BIOTYPERShimadzu - ShimadzuLaunchpad software + SARAMIS databaseBiomérieux - VITEK® MSDalší databáze kompatibilní s oběma hardware systémynapř. Andromas
103
Bacillus cereus
104
Rank(Quality)
Matched PatternScoreValue
NCBIIdentifier
1( +++ )
Bacillus cereus DSM 31T DSM 2.554 1396
2( ++ )
Bacillus cereus 994000168 LBK 2.203 1396
3( ++ )
Bacillus weihenstephanensis DSM 11821T DSM
2.158 86662
4( ++ )
Bacillus mycoides DSM 2048T DSM 2.155 1405
5( ++ )
Bacillus cereus 4080 LBK 2.147 1396
6( + )
Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM 1.975 1428
7( + )
Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM 1.787 64104
8( - )
Bacillus bataviensis DSM 15601T DSM 1.369 220685
9( - )
Brevibacterium linens IMET 11075T HKJ 1.347 1703
10( - )
Acinetobacter towneri DSM 14962T HAM 1.345 202956
Bacillus cereus
Bacillus cereus Rozsah skore Popis Symbol
2.300 ...3.000
vysoce pravděpodobná druhová identifikace
( +++ )
2.000 ...2.299
bezpečná rodová identifikace, pravděpodobná
druhová identifikace( ++ )
1.700 ...1.999
pravděpodobná rodová identifikace
( + )
0.000 ...1.699
nespolehlivá identifikace ( - )
Isolate A1
Rank(Quality)
Matched PatternScoreValue
1 ( +++ ) Cronobacter sakazakii LMG 2786 LMG 2.442
2 ( +++ ) Cronobacter sakazakii LMG 2758 LMG 2.438
3 ( ++ ) Cronobacter sakazakii CCM 1902 CCM 2.244
4 ( ++ ) Cronobacter sakazakii LMG 2789 LMG 2.229
5 ( ++ ) Cronobacter sakazakii CCM 3479 CCM 2.194
6 ( ++ ) Cronobacter sakazakii DSM 4485T DSM 2.044
7 ( ++ ) Cronobacter sakazakii LMG 2790 LMG 2.041
8 ( + ) Enterobacter kobei DSM 13645T DSM 1.838
9 ( + ) Escherichia coli ATCC 25922 CHB 1.825
10 ( + ) Escherichia coli ESBL_EA_RSS_1528T CHB 1.819
Cronobacter sakazakii
106
MALDI-TOF MS
Bacillus cereus
Rank
(Quality
)
Matched PatternScore
Value
1
( ++ )Bacillus cereus 4080 LBK 2.034
2
( + )Bacillus cereus 994000168 LBK 1.967
3
( - )
Bacillus pseudomycoides DSM
12442T DSM1.654
4
( - )Bacillus cereus DSM 31T DSM 1.514
5
( - )
Acinetobacter towneri DSM
14962T HAM1.479
6
( - )
Bacillus hwajinpoensis DSM
16206T DSM1.403
7
( - )
Tsukamurella sp RV_Feb_05
MLD1.338
8
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 4910 DSM1.304
9
( - )
Pandoraea pulmonicola LMG
18106T HAM1.297
10
( - )
Streptomyces chartreusis HKI
249 HKJ1.289
Rank
(Qualit
y)
Matched PatternScore
Value
1
( + )Bacillus cereus 4080 LBK 1.964
2
( + )
Bacillus cereus 994000168
LBK1.851
3
( - )
Clostridium novyi A
1025_NCTC 538 BOG1.388
4
( - )
Rhizobium rubi DSM 6772T
HAM1.388
5
( - )
Sphingobacterium mizutaii
DSM 11724T HAM1.378
6
( - )
Streptococcus pyogenes ATCC
19615 THL1.361
7
( - )
Staphylococcus aureus ssp
aureus DSM 3463 DSM1.352
8
( - )
Curtobacterium albidum HKI
11500 HKJ1.341
9
( - )
Clostridium paraputrificum
1083_ATCC 17796 BOG1.313
10
( - )
Bacillus cereus DSM 31T
DSM1.311
107
MALDI-TOF MS:STANDARD
108
Analyte name Rank (Quality) Matched Pattern Score Value
F4 1 ( +++ ) Escherichia coli DH5alpha BRL 2.439
109
MALDI-TOF MS: PROBLÉMYPROBLÉMY ZPŮSOBENÉ PŘÍPRAVOU VZORKU• KVALITA MATRICE– problém v krystalizaci, ionizaci a desorpci vzorků – kvalita matrice je
kontrolována na standardu !!! • KVALITA VZORKU
• PŘÍLIŠ NÍZKÁ ČI NEPRAVIDELNÁ KONCENTRACE NA SPOTU – „NO PEAKS FOUND“ (při měření spotu nejsou získána žádná spektra)
• PŘÍLIŠ VYSOKÁ KONCENTRACE ČI NEPRAVIDELNÉ ROZETŘENÍ VZORKU NA SPOTU –špatná krystalizace, vysoká úroveň šumu
• PŘÍTOMNOST DALŠÍCH CHEMIKÁLIÍ VE VZORKU (NaCl, agar...) – ovlivňuje chování vzorku (průběh krystalizace, šum, posun vrcholů a další)
• PŘÍPRAVA VZORKU NENÍ OPTIMÁLNÍ – např. pro kvasinky, plísně, rod Bacillus a další je doporučen proces extrakce proteinů – vyšší kvalita spekter
• ČISTÁ KULTURA !!!PROBLÉMY ZPŮSOBENÉ PRINCIPE IDENTIFIKACE• NĚKTERÉ DRUHY ČI DOKONCE RODY JSOU NAVZÁJEM OBTÍŽNĚ ROZLIŠITELNÉ, neboť si
jsou velmi blízce taxonomicky příbuzné či • Escherichia coli není současným postupem odlišitelná od rodu Shigella – taxonomicky
by měly tvořit jeden rod • ROD ČI DRUH NEJSOU V DATABÁZI
• Spektrum má dobrou kvalitu, avšak shoda se spektry databáze je nízká či nepravděpodobná (shoda na nízké úrovni se spektry velmi odlišných skupin)
