Kateřina Pilátová, Lenka Zdražilová DubskáOddělení laboratorní medicínyMasarykův onkologický ústav
Hodnocení morfologie a imunofenotypizace leukocytů jako reflexní testy automatizovaného krevního obrazu:
koncept, možnosti a kazuistiky
Úvod
Automatický KO + diff.
Mikroskopie nátěru na sklo
Morfologie (např. tvar erytrocytů, přítomnost
buněčných inkluzí, struktura jádra aj.)
Přítomnost parazitů, artefaktů aj.
Flowcytometrie
Subpopulacelymfocytů (T- a B-
lymfocyty, NK buňky…)
Imunofenotyppatologických
lymfocytů
Přítomnost CD34+ buněk
Automatický analyzátor KO + diff.
B-lyB-lyMono
Laserový paprsek
T-lyT-ly
Morfologie buňky SFL (fluorescence)obsah DNA/RNA
RELATIVNÍ/ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE
Morfologie buňky FSC (boční rozptyl)vnitřní struktura / granularitabuňky
Velikost buňky SSC (přímý rozptyl)ID
ENTI
FIK
AC
E6t
i pop
ulač
ní d
if. ro
zpoč
et le
ukoc
ytů
Leukocyty
Sysmex XE-5000™
Automatický analyzátor KO + diff.
Erytrocyty a trombocyty – impedanční metoda (opticky)
Hemoglobin – absorpční spektrometrie
NRBC, retikulocyty: speciální kanály,
Erytrocyty Trombocyty
Sysmex XE-5000™
ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE
IDEN
TIFI
KA
CE
Digitální mikroskopie
Velikost buňkyMikroskopie – software (neuronová síť), oko
RELATIVNÍ KVANTIFIKACE
IDEN
TIFI
KA
CE
včet
ně n
ezra
lých
fore
m a
pat
olog
ií
CellaVision® DM1200 Morfologie buňkyMikroskopie – software (neuronová síť), oko, speciální barvenívlastnosti cytoplazmy (granulace, cytoplazmatické inkluze) vlastnosti jádra (velikost, přítomnost jadérek, struktura chromatinu, segmentace jader)
Leukocyty
Přítomnost parazitů, artefaktů aj.Mikroskopie – oko
Digitální mikroskopie
Velikost Mikroskopie – software (neuronová síť), oko Ery: mikrocytóza, makrocytóza,
anizocytóza Trombo: makrotrombocyty,
mikrotrombocyty, anizocytóza
Morfologie Mikroskopie – software (neuronová sít), oko, speciální barvení Ery: např. abnormální tvar, chromie,
inkluze, penízkovatění aj. Trombo: hypochromie trombocytů,
shlukování trombocytů NRBC Retikulocyty
ErytrocytyTrombocyty
ORIENTAČNĚ KVANTIFIKACEtrombocyty, schistocyty
IDEN
TIFI
KA
CE
CellaVision® DM1200 CellaVision® DM1200
Flowcytometrie
B-lyB-ly
Anti-CD19
Mono
T-lyT-ly
Anti-CD3
Anti-CD14
Laserový paprsek
Morfologie buňky FSC (boční rozptyl) vnitřní struktura / granularita
buňky
Velikost buňky SSC (přímý rozptyl)
ImunofenotypFluorescence
IDEN
TIFI
KA
CE
včet
ně s
ubpo
pula
cíly
mfo
cytů
, id
entif
ikac
e ly
mfo
mov
ých
buně
k,
CD
34+
buně
k aj
....
ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACEFluorescenční kuličky (např. cirkulující endoteliální buňky,
CD34+ buňky)
RELATIVNÍ KVANTIFIKACE
Leukocyty
Navios, Beckman Coulter
Flowcytometrie ErytrocytyTrombocyty
Pouze speciální aplikace:
Ery: paroxysmální noční hemoglobinurie,fetomaternální hemoragie aj.
Trombo:diagnostika vrozených poruch funkce destiček, imunitních a megakaryocytárních trombocytopenií,polymorfie systému lidských trombocytárnich antigenů (HPA) ve vztahu k aloimunizaci aj.
Navios, Beckman Coulter
Úvod
Automatický KO + diff.
Mikroskopie nátěru na sklo
Morfologie (např. tvar erytrocytů, přítomnost
buněčných inkluzí, struktura jádra aj.)
Přítomnost parazitů, artefaktů aj.
Flowcytometrie
Subpopulacelymfocytů (T- a B-
lymfocyty, NK buňky…)
Imunofenotyppatologických
lymfocytů
Přítomnost CD34+ buněk
Kritéria pro nátěr a flowcytometrické vyšetření PK
Onkologické diagnózy „C“
Parametr Hodnota menší než
Hodnota větší než Jednotka
Leukocyty 1,0 30,0* 109/l
Hemoglobin 60** ženy: 180 muži: 195 g/l
Trombocyty 50 1000 109/l
Neutrofily - 20,0* 109/l
Eozinofily - 4,0 109/l
Monocyty - 3,0 109/l
Lymfocyty - 4,5 109/lNezralé granulocyty - 0,3* 109/l
NRBC počet - 0,1*** 109/l
Neonkologické diagnózy „Z“
Parametr Hodnota menší než
Hodnota větší než Jednotka
Leukocyty 4,0 30,0 109/l
Hemoglobin 70* ženy: 180 muži: 195 g/l
Trombocyty 100* 1000 109/l
MCV 75 105 fl
RDW - 22 %
Neutrofily 1,0 20,0 109/l
Eozinofily - 2,0 109/l
Bazofily - 0,5 109/l
Monocyty - 1,5 109/l
Lymfocyty - 4,0 109/lNezralé granulocyty 0,1 109/l
NRBC počet - 0,0 109/lRetikulocyty počet - 0,15 1012/l
Kvantitativní
* Nejsou-li podávány růstové faktory granulocytů.** Je-li anémie doprovázena trombocytopenií (trombocyty 100x109/l).*** Nejsou-li podávány růstové faktory erytropoézy (erytropoetin).
* Flowcytometrické vyšetření se provádí pouze, je-li současně anémie a trombocytopenie.
Kritéria pro nátěr a flowcytometrické vyšetření PK
Flag WBC Akce
Abn Lympho / L_Blasts? Nátěr C + ZFlow C + Z
Atypical Lympho? Nátěr ZFlow Z
Blasts? Nátěr C + ZFlow C + Z
Immature Gran? Nátěr C + ZFlow C + Z
Left Shift? Nátěr ZFlow Z
RBC Lyse Resistance? Nátěr C + ZFlow C + Z
NRBC Abn Scattergram Nátěr C + Z
WBC Abn Scattergram Nátěr C + Z
Flag RBC Akce
Fragments? Nátěr C + Z
HGB Defect? Nátěr C + Z
Iron Deficiency? Nátěr C + Z
RBC Agglutination? Nátěr C + Z
Dimorphic Population Nátěr Z
RBC Abn Distribution Nátěr Z
RET Abn Scattergram Nátěr Z
Flag PLT Akce
PLT Clumps? Nátěr C + Z
PLT Abn Distrib. Nátěr Z
PLT Abn Scattergram Nátěr Z
Kvalitativní
Kazuistika 1Automatizovaný KO + diff.
Hodnocení: abnormální B-lymfocyty s imunofenotypem CD19+ CD20+ HLA-DR+ CD45+ sIg(kappa)+ FMC7+CD79b+ CD5+ CD23- CD38+ CD10+ CD200- CD117- CD11c+/- odpovídající monoklonální B-lymfoproliferaci znezralých buněk. Res: B lymfoproliferace z nezralých buněk
Muž 79 let, C61 (ca prostaty) CT zvětšené a zmnožené uzliny v malé pánvi a RP14. 4. 2016 – patologický KO + diff.
Digitální mikroskopie
CD23-APC
CD
5-AP
C75
0
Flowcytometrie
HLA
-Dr-
PC5
B-lymfo74 %
CD19-FITC
kappa-FITC
lam
bda-
PE
lambda 1 %
kappa 98 %
CD
45-K
rO
SSC
lymfo79 %
FMC7-FITC
CD
79b-
PE
CD10-PC5
CD
38-P
B
CD19-PC5
CD
20-P
C7
Kazuistika 1Imunohistochemie cyklinD1
Hodnocení: abnormální B-lymfocyty s imunofenotypem CD19+ CD20+ HLA-DR+ CD45+ sIg(kappa)+ FMC7+CD79b+ CD5+ CD23- CD38+ CD10+ CD200- CD117- CD11c+/- odpovídající monoklonální B-lymfoproliferaci znezralých buněk. Res: B lymfoproliferace z nezralých buněk …. B-PLL?
Muž 79 let, C61 (ca prostaty) CT zvětšené a zmnožené uzliny v malé pánvi a RP14. 4. 2016 – patologický KO + diff.
Kazuistika 1Automatizovaný KO + diff. Flowcytometrie
Hodnocení: leukopenie, trombocytopenie, v biochemii LDH = 16,51 kat/l (14. 4. 2016: LDH = 4,81 kat/l)
27.4. 2016 - zahájena léčba obinutuzumabem (anti-CD20) a leukeranem3. 5. 2016 – kontrola KO + diff
CD3-APC750 CD34-PC7
SSC
CD
45-K
rO
CD19-FITC
HLA
-Dr-
PC5
B-lymfo0,6 %Lymfo
23 %
T-lymfo92 %
Kazuistika 2Muž 19 let, zarudlý krk s bílými čepy, únava, afebrilní
Automatizovaný KO + diff.
Hodnocení: expanze cytotox. CD8+ T-lymfocytů s reaktivním imunofenotypem. Res: infekční mononukleóza
Digitální mikroskopie
CD3-APC750
CD
4-PB
Th-lymfo12 %
Flowcytometrie
T-lymfo89 %
CD3-APC750CD19-FITC
HLA
-Dr-
PC5
B-lymfo2,5 %
SSC
CD
45-K
rO
Lymfo65 %
CD3-APC750
CD
8-AP
C
Tc-lymfo71 %
HLA
-Dr-
PC5
CD4-PB
SEROLOGIECytomegalovirus (CMV)
CMV IgG negativníCMV IgM pozitivní
Epstein-Baarové virus (EBV)EBV VCA IgG pozitivníEBV VCA IgM pozitivníEBV EBNA IgG negativní
Kazuistika 3Žena 67 let, C181 (tu appendixu, dlouhodobá remise)Lymfocytóza v KO + diff. – došetřeno flowcytometricky
Automatizovaný KO + diff. Flowcytometrie
CD3-APC750
T-lymfo89 %
SSCC
D45
-KrO
Lymfo62 %
CD3-APC750
CD
4-PB
Th-lymfo16 %
CD3-APC750
CD
8-AP
C
Tc-lymfo12 %
CD19-FITC
HLA
-Dr-
PC5
B-lymfo4 %
Kazuistika 3Žena 67 let, C181 (tu appendixu)Lymfocytóza v KO + diff. – došetřeno flowcytometricky
Flowcytometrie
Hodnocení: Atypický nález v oblasti T-lymfocytů; cca 60% lymfocytů periferní krve představují gamma delta T-lymfocyty; jež jsou z 99% TCRgamma9/delta2 CD4- CD8low+ CD56low+ CD16low+ NKG2D+ CD69- HLA-Dr-.Res: gammadelta T-lymfocyty s expresí znaků NK buněk.
Digitální mikroskopie
TCRgamma9-PC5
TCR
delta
9-PB
99 %
TCRgd-FITC
CD
314-
APC
TCR gammadelta
59 %
gammadeltaCD314+
59 %
Kazuistika 4Automatizovaný KO + diff.
Žena 79 let, DM II.typu na inzulinoterapiiV rámci pravidelné diabetologické kontroly zjištěna v KO leukocyotózas lymfocytózouPrvní hematologické vyšetření – B-CLL???
Digitální mikroskopie
Hodnocení: aberantní T-lymfocyty: CD3- CD8- CD4+ CD34- CD14- CD19- CD5+ CD25- CD103- CD27+CD45RO- CD38- CD16- CD56- dělící se dle exprese CD45 do dvou populací. Res: T-lymfoproliferace
Flowcytometrie
CD
45-K
rO
SSC
lymfo71 %
CD3-APC750
T-lymfo3,1 %
CD19-FITC
HLA
-Dr-
PC5
B-lymfo4,5 %
CD3-APC750
CD
4-PB
88 %
Kazuistika 5Žena 85 let, vyšetření pro pancytopenii PK + KD
Automatizovaný KO + diff. Flowcytometrie
SSC
CD
45-K
rO
CD34-PC7CD14-PE
SSC
Hodnocení: leu: neutropenie, monocytopenie, hypersegmentované granulocyty; ery: makrocytóza, anizocytóza(dimorfní populace), makroovalocyty, knizocyty, stomatocyty; trombocytopenie.
Digitální mikroskopie
Kazuistika 5Žena 85 let, vyšetření pro pancytopenii PK + KD
Automatizovaný KO + diff.
Hodnocení: Středně buněčný aspirát KD, hyperplastická erytrocytopoéza. Res: megaloblastová anémie.
Flowcytometrie
CD14-PE
SSC
CD34-PC7
SSC
SSC
CD
45-K
rO
Kazuistika 6Muž 68 let, C229 (hepatocelulární karcinom)8.1.2016 přichází na MOÚ pro susp. tu jater15.1.2016 v rámci předoperačního vyšetření patologický KO + diff.
Automatizovaný KO + diff.
Hodnocení: flowcytomericky v periferní krvi zachyceno 7% CD34+ buněk/blastů; jedná se o buňky CD45low+CD34+ CD14- HLA-Dr+ CD19- CD3- CD4-. Morfologicky bez aureových tyčí vzhledu negranulovanýchnediferencovaných blastů. Res: hemoblastóza v PK.
Flowcytometrie Digitální mikroskopie
CD34-PC7
SSC
CD34+ buňky 7 %
SSCC
D45
-KrO
Lymfo32 %
Kazuistika 7Automatizovaný KO + diff. FlowcytometrieDigitální mikroskopie
Žena 67 let, C502 (ca mammae)16.2. chemoterapie25.2. KO + diff., pro neutropenii podány G-CSF (filgrastim, Zarzio)29.2. Ko + diff. – kontrola
Mono 19 %
CD14-PE
SSC
CD
45-K
rO
Lymfo32 %
Granulocca 40 %
Neutrofily = 20,8 %Lymfocyty = 39,4 %Monocyty = 18,1 %Eozinofily = 2,7 %Bazofily = 2,1 %
Metamyelocyty = 4,8 % Myelocyty = 5,3 %Promyelocyty = 6,4 %
IG = 16,5 %
