Při práci s biopolymery, jako jsou DNA, RNA či proteiny, potřebujeme molekuly velmi často rozdělit podle velikosti. K to- muto účelu využíváme elektroforézu, ústřední metodu molekulární biologie. Tato technika je založena na skutečnosti, že se molekuly biopolymerů v roztoku pohybují v elektrickém poli rychlostí zá- vislou na poměru jejich náboje a hmot- nosti. Pokud mají dvě molekuly např. stej- nou hmotnost a tvar, bude se molekula s větším nábojem pohybovat v elektrickém poli rychleji. Nukleové kyseliny obsahují fosfátové skupiny, které jim udělují ne- gativní náboj, takže se v elektrickém poli pohybují ke kladné elektrodě. Bez ohledu na svou velikost však mají téměř stejný poměr náboje a hmotnosti, protože jejich stavební bloky (nukleotidy) mají přibližně stejnou hmotnost a náboj. Pokud by elek- troforéza probíhala pouze v roztoku, ne- byli bychom téměř schopni rozdělit různě velké molekuly. Proto se při elektrofore- tické separaci biopolymerů používá místo roztoku agarózový nebo polyakrylamido- vý gel. Ten vytváří jakési molekulární síto s kanálky umožňujícími pohyb dělených molekul. Velikost pórů v gelu omezuje po- hyblivost molekul, takže nukleové kyse- liny s téměř stejným poměrem náboje a hmotnosti se v elektroforetickém gelu dělí podle své velikosti. V praxi to zna- mená, že delší molekuly nukleových kyse- lin se pohybují v gelu pomaleji než kratší molekuly. Pomocí elektroforézy je možné rozlišit fragmenty lišící se pouze o několik procent své délky. U kratších molekul s délkou maximálně několik set nukleo- tidů je možné elektroforeticky oddělit i molekuly lišící se o jediný nukleotid! Elektroforeticky rozdělené molekuly v gelu se pak zviditelňují vhodným bar- vením. Pro DNA se velmi často používá fluorescenční barvivo ethidium bromid. Po osvícení UV lampou tato látka naváza- ná na DNA oranžově fluoreskuje, přičemž nenavázaná barva fluoreskuje pouze slabě. Výsledkem gelové elektroforézy je cha- rakteristický vzor pruhů, přičemž každý pruh obsahuje molekuly o určité velikosti. Gelová elektroforéza se využívá při nej- různějších postupech analýzy DNA (např. klonování či sekvenace DNA). Elektro- foretické gely však mohou sloužit také jako výchozí materiál pro blotovací techniky. Než se dostaneme k samotným technikám, připomeňme si některé důležité vlastnosti nukleových kyselin. Hybridizace DNA DNA je negativně nabitá dvojvláknová molekula. Dvě antiparalelní vlákna jsou tvořena lineárním polymerem deoxyribo- nukleotidů. Báze jsou na jednotlivých vláknech uspořádány tak, že navzájem specificky interagují s bázemi na druhém vlákně prostřednictvím vodíkových vazeb (adenin – A – se páruje s tyminem – T, cytosin – C – s guaninem – G). Protože báze párují specificky, mluvíme o kom- plementaritě vláken: na základě znalosti sekvence jednoho vlákna je možné odvo- dit sekvenci vlákna druhého. Ačkoli jsou vodíkové vazby poměrně slabé, jejich vy- soký počet (spolu s patrovými interakcemi heterocyklů bází) činí dvoušroubovicovou strukturu molekuly DNA velmi stabilní. Pokud je však molekula DNA vystavena působení vysoké teploty či silně alkalic- kého pH, dojde k její denaturaci – roz- rušení vodíkových vazeb a patrových in- terakcí, což vede k oddělení jednotlivých vláken. V případě, že pomalu snížíme tep- lotu (a/nebo pH), mohou se oddělená vlákna znovu spojit a vytvořit stejnou dvoušroubovici jako původní molekula. Ve směsi různých nukleových kyselin rea- sociují pouze komplementární vlákna – tento proces prakticky není ovlivněn přítomností nekomplementárních vláken (obr. 1). Tato specifická reasociace se též označuje jako hybridizace nukleových kyselin a může k ní dojít i mezi komple- mentárními vlákny DNA a RNA. Pokud se pro reasociaci použije DNA z různých buněk či organismů, je možné na základě míry hybridizace určit vzájemnou podob- nost sekvencí – vyšší míra hybridizace znamená vyšší podobnost. Počátečním krokem je náhodné nalezení krátké kom- plementarity a vytvoření několika párů bází. Následuje rychlé „zazipování“ zby- lých komplementárních částí vláken. K rychlé tvorbě dvoušroubovice dochá- zí po snížení teploty tam, kde se vlákna nukleových kyselin z nějakého důvodu úplně neoddělila (např. při částečné dena- turaci či při kovalentním propojení vlá- ken). Stabilita dvoušroubovicové mole- kuly DNA může být vyjádřena pomocí teploty tání (označované Tm), přibližně odpovídající teplotě, při které je polovi- na dvoušroubovicové DNA denaturována na jednovláknovou. Zvyšování teploty nad tuto hodnotu vede k přerušení vodíkových vazeb a následné separaci vláken, naopak snižování teploty pod tuto úroveň vede k reasociaci vláken. Teplotu Tm určité dvoušroubovice ovlivňuje zastoupení jed- notlivých párů bází, délka a počet nepá- rujících oblastí a dále iontová síla roztoku. Vodíkové vazby mezi páry AT jsou méně stabilní než vodíkové vazby mezi páry GC, proto vyšší obsah párů GC v sekvenci zna- mená stabilnější interakci a vyšší teplotu tání dvoušroubovice. Delší dvoušroubovi- cové úseky jsou odolnější vůči denaturaci než kratší úseky, přítomnost nepárujících bází snižuje odolnost vůči denaturaci. Dů- ležitým faktorem je i pH a složení roztoku. Přítomnost jednomocných kationtů (zvý- šení iontové síly roztoku) stabilizuje dvou- šroubovici tím, že kompenzuje záporné ziva.avcr.cz 44 živa 1/2009 Martin Kuthan Hybridizační metody studia nukleových kyselin S rozvojem metod analýzy nukleových kyselin a jejich běžným používáním v moderní biologii přibývají i články v Živě, které se na ně odkazují. Při expe- rimentech je často potřeba zjistit množství nebo velikost konkrétní molekuly DNA či RNA ve vzorku obsahujícím značný počet podobných molekul. Mnohdy nás zajímá obsah mRNA určitého genu v daném typu tkáně, změna množství určité mRNA v závislosti na různých podmínkách či nalezení úseku DNA obsa- hujícího studovaný gen. Takové informace je možné získat mimo jiné pomocí hybridizačních metod, které v tomto článku podrobněji popíšeme. 1 1 Hybridizace nukleových kyselin. Působením denaturačního činidla dojde k oddělení jednotlivých vláken dvou- šroubovice a po navození vhodných renaturačních podmínek se jednovlákno- vé molekuly párují (na základě komple- mentarity bází) opět do dvoušroubovice. denaturace reasociace
Transcript
Při práci s biopolymery, jako jsou DNA,RNA či proteiny, potřebujeme molekulyvelmi často rozdělit podle velikosti. K to -muto účelu využíváme elektroforézu,ústřední metodu molekulární biologie.Tato technika je založena na skutečnosti,že se molekuly biopolymerů v roztokupohybují v elektrickém poli rychlostí zá -vislou na poměru jejich náboje a hmot-nosti. Pokud mají dvě molekuly např. stej-nou hmotnost a tvar, bude se molekulas větším nábojem pohybovat v elektrickémpoli rychleji. Nukleové kyseliny obsahujífosfátové skupiny, které jim udělují ne -gativní náboj, takže se v elektrickém polipohybují ke kladné elektrodě. Bez ohleduna svou velikost však mají téměř stejnýpoměr náboje a hmotnosti, protože jejichstavební bloky (nukleotidy) mají přibližněstejnou hmotnost a náboj. Pokud by elek-troforéza probíhala pouze v roztoku, ne -byli bychom téměř schopni rozdělit různěvelké molekuly. Proto se při elektrofore-tické separaci biopolymerů používá místoroztoku agarózový nebo polyakrylamido-vý gel. Ten vytváří jakési molekulární sítos kanálky umožňujícími pohyb dělenýchmolekul. Velikost pórů v gelu omezuje po -hyblivost molekul, takže nukleové kyse -liny s téměř stejným poměrem nábojea hmotnosti se v elektroforetickém geludělí podle své velikosti. V praxi to zna-mená, že delší molekuly nukleových kyse-lin se pohybují v gelu pomaleji než kratšímolekuly. Pomocí elektroforézy je možnérozlišit fragmenty lišící se pouze o několikprocent své délky. U kratších molekuls délkou maximálně několik set nukleo -tidů je možné elektroforeticky odděliti mo lekuly lišící se o jediný nukleotid!
Elektroforeticky rozdělené molekulyv gelu se pak zviditelňují vhodným bar-vením. Pro DNA se velmi často používáfluorescenční barvivo ethidium bromid.Po osvícení UV lampou tato látka naváza-ná na DNA oranžově fluoreskuje, přičemžnenavázaná barva fluoreskuje pouze slabě.Výsledkem gelové elektroforézy je cha -rakteristický vzor pruhů, přičemž každýpruh obsahuje molekuly o určité velikosti.
Gelov á elektroforéza se využívá při nej-různějších postupech analýzy DNA (např.klonování či sekvenace DNA). Elektro -foretické gely však mohou sloužit také jakovýchozí materiál pro blotovací techniky.Než se dostaneme k samotným technikám,připomeňme si některé důležité vlastnostinukleových kyselin.
Hybridizace DNADNA je negativně nabitá dvojvláknovámolekula. Dvě antiparalelní vlákna jsoutvořena lineárním polymerem deoxyribo-nukleotidů. Báze jsou na jednotlivých
vláknech uspořádány tak, že navzájemspecificky interagují s bázemi na druhémvlákně prostřednictvím vodíkových vazeb(adenin – A – se páruje s tyminem – T,cytosin – C – s guaninem – G). Protožebáze párují specificky, mluvíme o kom-plementaritě vláken: na základě znalostisekvence jednoho vlákna je možné odvo-dit sekvenci vlákna druhého. Ačkoli jsouvodíkové vazby poměrně slabé, jejich vy -soký počet (spolu s patrovými interakcemiheterocyklů bází) činí dvoušroubovicovoustrukturu molekuly DNA velmi stabilní.Pokud je však molekula DNA vystavenapůsobení vysoké teploty či silně alkalic-kého pH, dojde k její denaturaci – roz -rušení vodíkových vazeb a patrových in -terakcí, což vede k oddělení jednotlivýchvláken. V případě, že pomalu snížíme tep-lo tu (a/nebo pH), mohou se oddělenávlákna znovu spojit a vytvořit stejnoudvou šrou bovici jako původní molekula.Ve smě si různých nukleových kyselin rea-sociu jí pouze komplementární vlákna– tento proces prakticky není ovlivněnpřítomností ne komplementárních vláken(obr. 1). Tato spe cifická reasociace se téžoznačuje jako hybridizace nukleovýchkyselin a může k ní dojít i mezi komple-mentárními vlákny DNA a RNA. Pokudse pro reasociaci použije DNA z různýchbuněk či organismů, je možné na základěmíry hybridizace určit vzájemnou po dob -nost sekvencí – vyšší míra hybridizaceznamená vyšší podobnost. Počátečnímkrokem je náhodné nalezení krátké kom -ple mentarity a vytvoření několika párůbází. Následuje rychlé „zazipování“ zby-lých komplementárních částí vláken.
K rychlé tvorbě dvoušroubovice dochá-zí po snížení teploty tam, kde se vláknanukleo vých kyselin z nějakého důvoduúplně neoddělila (např. při částečné dena-turaci či při kovalentním propojení vlá-ken). Stabilita dvoušroubovicové mole -kuly DNA může být vy jádřena pomocíteploty tání (označované Tm), přibližněodpovídající teplotě, při které je polovi-na dvoušroubovicové DNA denaturovánana jednovláknovou. Zvyšování teploty nadtuto hodnotu vede k přerušení vodíkovýchvazeb a následné separaci vláken, naopaksnižování teploty pod tuto úroveň vedek reasociaci vláken. Teplotu Tm určitédvou šroubovice ovlivňuje zastoupení jed-notlivých párů bází, délka a počet nepá-rujících oblastí a dále iontová síla roztoku.Vodíkové vazby mezi páry AT jsou méněstabilní než vodíkové vazby mezi páry GC,proto vyšší obsah párů GC v sekvenci zna-mená stabilnější interakci a vyšší teplotutání dvoušroubovice. Delší dvoušroubovi-cové úseky jsou odolnější vůči denaturacinež kratší úseky, přítomnost nepárujícíchbází snižuje odolnost vůči denaturaci. Dů -ležitým faktorem je i pH a složení roztoku.Přítomnost jednomocných kationtů (zvý-šení iontové síly roztoku) stabilizuje dvou-šroubovici tím, že kompenzuje záporné
ziva.avcr.cz 44 živa 1/2009
Martin Kuthan
Hybridizační metody studianukleových kyselin
S rozvojem metod analýzy nukleových kyselin a jejich běžným používánímv moderní biologii přibývají i články v Živě, které se na ně odkazují. Při expe-rimentech je často potřeba zjistit množství nebo velikost konkrétní molekulyDNA či RNA ve vzorku obsahujícím značný počet podobných molekul. Mnohdynás zajímá obsah mRNA určitého genu v daném typu tkáně, změna množstvíurčité mRNA v závislosti na různých podmínkách či nalezení úseku DNA obsa-hujícího studovaný gen. Takové informace je možné získat mimo jiné pomocíhybridizačních metod, které v tomto článku podrobněji popíšeme.
1
1 Hybridizace nukleových kyselin.Působením denaturačního činidla dojdek oddělení jednotlivých vláken dvou-šroubovice a po navození vhodnýchrenaturačních podmínek se jednovlákno-vé molekuly párují (na základě komple-mentarity bází) opět do dvoušroubovice.
denaturace
reasociace
elektrostatické odpudivé síly fosfátovýchskupin. Opačný vliv na teplotu tání má při-dání různých organických látek. Zvýšeníkoncentrace formamidu o 1 % vede ke sní-žení teploty tání přibližně o 0,7 °C.
Jednou z nejběžnějších aplikací využí-vajících hybridizaci nukleových kyselin jetechnika známá jako Southern blot (Sou -thernův přenos) pro vyhledávání příbuz-ných sekvencí v DNA. Vyvinul ji EdwardSouthern v r. 1975 a její podstatou je vy -užití značených molekul nukleových ky se -lin (tzv. sond) pro zkoumání směsi nu kleo -vých kyselin imobilizovaných na pev népodložce. Princip metody je na první po -hled banálně jednoduchý. Pokud je po -třeba identifikovat určitý fragment DNAv elektroforetickém gelu, musí se DNAz gelu přenést na nějaké jiné médium tak,aby se zachovaly proužky (resp. rozděle-ní molekul) získané elektroforézou. Tentopřenos je nezbytný, protože pokud byDNA zůstala v gelu příliš dlouho, tak byrozdělené molekuly vyputovaly z gelu vli-vem difuze. Zde je podstata celé Souther-novy metody – DNA je z gelu přenesenana nitro celulózovou membránu. Na mem-bráně se tak vytvoří kopie gelu, DNA seimobilizuje a dá se s ní dále pracovat. Toje počátek techniky, která se stala zákla-dem mnoha metod molekulární biologievyužívaných v diagnostice i výzkumu.
Při technice Southern blot (obr. 2) seDNA na štěpí jedním nebo několika re -strikčními enzymy a výsledné fragmentyse elektroforeticky rozdělí. Ponořenímgelu do silně alkalického pufru dojde k de -naturaci DNA. Na gel se potom položí ni -trocelulózová nebo nylonová membránaa gelem se ponechá vzlínat pufr kolmo nasměr elektroforézy směrem k membráně.Tím se fragmenty DNA vymyjí z gelu namembránu, na kterou se naváží. Na mem-bráně tak získáme přesnou repliku elek tro -foretického rozdělení fragmentů DNA.Fragmenty delší než 20 kb však mohou zů -stávat při přenosu uvězněny v gelu. Protoje zvláště před přenosem větších fragmen-tů vhodné gel ponořit do zředěné kyselinychlorovodíkové, čímž dojde k částečné de -purinaci (ztrátě purinové báze A či G) a přinásledné denaturaci v al kalickém puf ruke štěpení fragmentů DNA v místech bezpurinových bází.
V současnosti se upřednostňuje použitípozitivně nabitých nylonových membránpřed nitrocelulózovými. Nitrocelulózovémembrány jsou křehké a vážou DNA neko-valentně (poměrně slabě prostřednictvímhydrofobních interakcí), takže je možné jejíuvolnění. Nylonové membrány mají lepšímechanické vlastnosti, DNA se na ně váženevratně kovalentní chemickou vazbou.Po přenosu je DNA fixována na membrá-ně vysokou teplotou (nitrocelulóza) nebopomocí UV záření (ny lon, propojení UVzá řením). V případě kladně nabité nylo-nové membrány je možné použít při pře-nosu alkalický pufr obsahující hydroxidsodný, což zrychlí přenos DNA a navíc do -jde ke kovalentnímu připojení DNA namembránu bez dalších zásahů. Po přenosuDNA na mem bránu se k membráně přidáradioaktivně (nebo neradioaktivně) zna-čená sonda, specifická pro studovaný gen.Může jí být vyčištěná RNA, cDNA (vznikáreverzní transkripcí z mRNA) či segment
DNA klonovaný in vivo nebo in vitro po -mocí polymerázové řetezové reakce – PCR(Živa 2007, 4: 184–185). Značená sondahybridizuje s určitou částí (nebo fragmen-ty), které obsahují sekvenci komplemen-tární k sondě. Detekce hybridizované son-dy (např. autoradiografií při radioaktivnímznačení) poskytne specifický vzor proužkůodpovídající restrikčním fragmentům ob -sa hujícím komplementární sekvenci k po -u žité sondě.
Analýza RNAAnalogická technika hybridizační analýzyRNA byla nazvána northern blot („nor -thernový“ přenos). Tato metoda je jednouz možností, jak analyzovat expresi genů(obr. 3), sledovat přítomnost či nepřítom-nost vybraných transkriptů nebo studo-vat alternativní sestřih mRNA. Pro analý-zu se používá buď celková RNA, neboizolovaná mRNA. Protože mRNA tvořív buňce jen zlomek procenta celkovéhoobsahu RNA, je lepší použít pro studiummálo exprimovaných mRNA jako výcho-zí materiál izolovanou mRNA. Zacházení
s RNA je hlavní odlišností oproti postu-pům pro Southern blot. Protože RNA jejednovláknová molekula schopná tvořitsekundární struktury ovlivňující její elek-troforetickou pohyblivost, je nutné po užíttzv. denaturační elektroforézu. Jako vhod-ná denaturační činidla se používají for-mamid či dimethylsulfoxid (DMSO). Kromětoho je RNA daleko citlivější na de gradacia je nutné důsledně ji chránit před účin-kem všudypřítomných RNáz (enzymů ště-pících RNA). Před hybridizací se sondounení nutné RNA na membráně denatu -rovat, protože je jednovláknová a tudížschop ná vázat jednovláknovou DNA čiRNA sondu.
Pozornému čtenáři možná neunikl malýrozdíl v překladech názvů hybridizačníchtechnik (Southernův přenos, „northerno-vý“ přenos). Tento rozdíl je názorným pří-kladem toho, že i ve „vážné“ vědě můžebýt ukryta špetka humoru. Protože při „již-ním“ přenosu (Southern blot) se pracujes DNA, nazvali autoři metodu přenosuRNA „severní“ (northern blot). Tato slovníhříčka měla velký úspěch, takže obdobnámetoda pro přenos proteinů na membrá-nu nese název „západní“ (western blot).
živa 1/2009 45 ziva.avcr.cz
2
3
2 Schéma metody Southern blot. V případě využití radioaktivního značeníizotopem fosforu 32P je možné zobrazitsignál sondy na rentgenovém filmu.Modernější a pohodlnější variantou jepřímá digitalizace signálu přístrojemPhosphorImager.3 Analýza exprese kvasinkového genuTIP1 metodou northern blot. CelkováRNA byla po izolaci z buněk rozdělenana elektroforéze (levá část obrázku).Nahoře jsou dobře patrné pruhy ribozo-mální RNA, v dolní části méně zřetelnépruhy malých buněčných RNA. Moleku-ly mRNA jsou různě dlouhé a tvoří pou-ze část celkové RNA, takže není možnérozeznat pruhy jednotlivých mRNA (šip-ka označuje přibližné místo výskytu TIP1mRNA). Pomocí techniky northern blotje možné zobrazit pruh konkrétní mRNAa získat informace o jejím množství (pra-vá část obrázku). V případě analýzyexprese genu TIP1 je vidět, že s přibýva-jícím stářím kvasinkových buněk (zlevadoprava – 3, 4, 5, 7 a 10 dní) postupněklesá množství jeho mRNA (výsledkylaskavě poskytl V. Šťovíček). Všechna schémata orig. M. Kuthana
