Metody histologického studia

(biologická technika)

Histologie

- z řečtiny: histos = tkáň, logos = nauka

Zařazení histologie:* biologie

* morfologie* histologie

* cytologie* obecná histologie* speciální histologie * histotechnologie

Rozdělení histologie:- obecná - speciální

Příbuzné a související obory:

• buněčná biologie • histopatologie • histochemie • imunohistochemie• anatomie• morfologie

Využití:

• v medicíně při zkoumání patologických změn tkáně • pomocí histochemických technik lze prokázat přítomnost látek v buňkách a tkáních

Tkáň• soubor morfologicky podobných buněk, které plní určitou funkci• buňky tvořící tkáň mohou stejného typu, nebo existují tkáně tvořené buňkami tvarově i funkčně rozdílnými

Typy tkání:• epitelová (krycí)• pojivová

* vazivo* kost* chrupavka

• svalová* hladká* příčně pruhovaná

epitel

kolagenovévazivo měkkýše

• nervová* neurony* neuroglie

• tekutá (trofická)* krev* krvomíza* míza

kost

krev

Postup při přípravě preparátu

• Odběr tkáně

• Fixační činidla

• Zalévání

• Krájení na mikrotomech

• Barvení

• Mikroskopy

Odběr tkáně

• Odběr tkání a buněk:– Ze živého organismu (BIOPSIE)– Z mrtvoly (NEKROPSIE)

– Je nutno provést fixaci, jinak se tkáň vlivem vlastních enzymů a působením bakterií rozloží (AUTOLÝZA)

– Blok tkáně pro fixaci ve světelné mikroskopii nemá být větší než 1cm3

Fixační činidla

• Fixace zastaví metabolické děje v buňce buď jejich zpomalením nebo denaturací enzymů.

• Fyzikální metody: » Teplo (mikrovlnná trouba)

» Zmražení (tekutý dusík – 170 oC)

• Chemické metody:» Imerzní (ponoření do fixační tekutiny)» Perfuzní (nástřik cév)

Fixační činidla - Chemická fixaceAldehydy Formaldehyd,

glutaraldehyd

Alkoholy Methanol, ethanol

Kyseliny Kyselina octová, trichloroctová, pikrová

Soli těžkých kovů Chlorid rtuťnatý, oxid osmičelý,dvojchroman draselný

Fixační činidla - Fixační tekutinyFormaldehyd 4%

Bouinova tekutina trinitrofenol, formol, kys.octová

Susa chlorid rtuťnatý, chlorid sodný, kys.octová, kys.trichloroctová, formol

Zenkerova tekutina chlorid rtuťnatý, dvojchroman draselný,síran sodný, kys. octová

Carnoy ethanol, chloroform, kys.octová

Methacarn Methanol, chloroform, kys.octová

Zalévání• Pro krájení je nutno tkáň zpevnit zalitím do zalévacích

médií (parafin, celloidin)• Protože tato media nejsou mísitelná s vodou, je nutno

vodu z tkání odstranit vzestupnou řadou alkoholů (odvodnění) a poté prosytit rozpouštědlem zalévacího media (xylen, toluen, aceton), který tkáň „projasní“

• Pro zhotovení dostatečně tenkých a kvalitních řezů pro studium je nutné tkáň zalít do média, které ji zpevní a vytvoří homogenní blok vhodný ke krájení

• Pro světelné mikroskopické studium bývají řezy tlusté 4 - 20 µm, pro elektronové mikroskopy zpravidla 100 nm a tenčí

Krájení na mikrotomech• Tkáň je třeba nakrájet na řezy o tloušťce

jedné vrstvy buněk, tedy m. Tkáň je pak průhledná a „dobře čitelná“

• Přístroje, které se k tomu užívají se jmenují mikrotomy.

• Nakrájené řezy se dávají na podložní sklo, kde se teplem natáhnou. K přilepení se používá bílek-glycerin

laserový mikrotom

mikrotom zn. Leica

Barvení

• Umožňuje rozlišení jednotlivých součástí buněk a tkání.

• Barviva jsou rozpustná ve vodě, proto je třeba z řezu odstranit parafin.

• Po obarvení se řez montuje do pryskyřic. Tak vzniká trvalý preparát, který se prohlíží v mikroskopu.

Barvení

• Z řezů je třeba odstranit parafin a znovu je zavodnit, aby bylo možno tkáně barvit.

• Většina barviv je rozpustných ve vodě.

Trvalý preparát• Po obarvení se z tkáně znovu odstraní voda

• Trvalý preparát se připraví přilepením krycího skla pomocí kanadského balzámu (má stejný lom světla jako sklo) nebo umělých pryskyřic

Po zaschnutí vznikne TRVALÝ PREPARÁT

PostupParafínové řezy Kryostatové řezy

Fixace Zmražení při – 170 oC

Vypírání

Odvodnění řadou alkoholů

Prosycení rozpouštědlem

Zalití do parafínu

Krájení Krájení v kryostatu

Nalepení řezů na podložní sklo Nalepení řezů na podložní sklo

Odparafínování a zavodnění Někdy krátká fixace

Převedení do vody

Barvení, histochemická reakce Zejména histochemické reakce

Odvodnění a projasnění Někdy odvodnění a projasnění

Montovací medium zpravidla bezvodé

Bezvodé medium nebo glycerin -želatina

Barvení• Přehledná

• Hematoxylin eosin

• Massonovy trichromy

• Weigert van Gieson

• Heidenhainův železitý hematoxylin

• Selektivní• Weigert resorcin fuchsin

• Impregnace stříbrem

Hematoxylin - eosin

Zelený Massonův trichrom

Žlutý Massonův trichrom

Weigert-van Gieson

Heidenhainův železitý hematoxylin

Weigert resorcin - fuchsin

Impregnace stříbrem

Další barviva

Barvení dle Pappenheima

Kresylová violeť

Luxolová modř

Methylenová modř

Mikroskop

• Stativ – Mikrometrický šroub

• Optický systém:– Okuláry– Objektivy– Kondenzor– Zdroj

Rozlišovací schopnost

• Rozlišovací schopnost je nejmenší vzdálenost mezi dvěma body, při které je ještě dovedeme rozlišit jako dva samostatné objekty.

• Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je 0,2 m.

Konec