INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE

aneb

CO NÁM MOHOU VIBRACE ŘÍCI O

(BIO)MOLEKULÁCH

Vladimír Baumruk

Seminář BCM094 „Úvod do problémů současné biofyziky“

vibrační spektroskopieinfračervená spektroskopie (IČ)Ramanova spektroskopie (RS)

vibrační cirkulární dichroismus (VCD)

Ramanova optická aktivita (ROA)

vibrační optická aktivita (VOA)

Metody

2

CO2 - lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie

n = 3 ⇒ 3n – 5 = 4 ⇒ 2 valenční vibrace ⇒ nesymetrická ⇒ aktivní v IČ⇒ symetrická ⇒ aktivní v RS

⇒ 2 deformační vibrace (degenerované) ⇒ aktivní v IČ

střed symetrie ⇒ alternativní zákazvibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní v Ramanově spektru a vice versa (tedy komplementarita IČ a Ramana)

frekvence vibrace

f – silová konstanta (síla vazby)μ – redukovaná hmotnost

(průměrně velký protein má přibližně 20 000 vibračních stupňů volnosti !!!)

Vibrační spektroskopie – princip

3

h h E ERν ν= ± −0 2 1( )

Vibrační spektroskopie – princip

⇒ vibrace aktivní v IČ spektru (změna dipólového momentu)

⇒ vibrace aktivní v Ramanově spektru (změna polarizovatelnosti)

Ramanův posuv νvib = ν0-νR

4

Vibrační spektroskopie – spektra

Infračervené absorpční a Ramanovo spektrum kyseliny benzoové

inte

nzit

a ro

zpty

lu

pro

pust

nost

(%)

IČ

Raman

daleká IČ

5

ν1 460 cm-1

plně symetrickáν2 214 cm-1

2x degenerovanáν3 780 cm-1

3x degenerovanáν4 313 cm-1

3x degenerovaná

polarizované spektrum

depolarizované spektrum

Jednoduché molekuly – symetrie a vibrace (příklad CCl4)

6

Detailní pohled na ν1 pás v Ramanově spektru CCl4

Izotopické štěpení díky existenci dvou stabilních izotopů 35Cl a 37Cl(jednotlivé komponenty odpovídají různému zastoupení těchto dvou izotopů v molekule CCl4)

C 35Cl337Cl

C 35Cl4C 35Cl237Cl2

C 35Cl 37Cl3

ν1 - symetrická valenční vibrace

7

strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice)

neomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám, možnost dynamických studií)

velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně)

je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturou a funkcí biomolekul

Proč vibrační spektroskopie ?

8

Výhody vibrační spektroskopie

RS a IČ jsou nedestruktivní metody (možnost testování biologické aktivitypo skončení měření).Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné,suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Probiomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejichstruktura v krystalu a v roztoku.Nenáročné na objem vzorku (cca 10 μl pro konvenční RS, 20 μl pro IČ).Rychlá časová škála absorpce i rozptylu (≈ 10-15 s) - využití vibračníspektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupnépomocí fluorescence či NMR.Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazenípásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).

9

Specifické výhody Ramanovy spektroskopie

Voda představuje ideální rozpouštědlo pro Ramanovu spektroskopii(na rozdíl od IČ).

Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, přikterých dochází k velké změně polarizovatelnosti (např. aromatickémolekuly).

Relativně snadné měření i v oblasti nízkých vlnočtů (pod 400 cm-1,daleká IČ oblast)

Selektivní rezonanční zesílení (tzv. rezonanční Ramanův jev).

Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS)

10

Nevýhody vibrační spektroskopie

Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, alenižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečněkompenzováno chemickou (izotopická záměna) nebo biologickou (bodovámutace) modifikací.

Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku (≈ 10-100 μg/μl) byťv malých objemech.

Jak H2O tak i D2O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii(na rozdíl od Ramanova rozptylu).

Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (vesrovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistotavzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).

11

Pásy ve vibračním spektru představují detailní a jedinečný „otisk prstu“dané molekuly.

Složité molekuly ⇒ vibrační módy a jim příslušející spektrální pásynemohou být přímo přiřazeny souřadnicím výchylek atomů ani z nich jednoduševypočítány.

⇒ vibrační spektrum nelze použít pro výpočet struktury.⇒ Vibrační spektrum daného strukturního motivu nemůže sloužit jako

„otisk prstu“ této struktury dokud s ní není korelováno pomocí nezávislémetody.

⇒ Jako základ pro stanovení takové korelace zpravidla slouží strukturyurčené pomocí difrakčních nebo NMR metod.

⇒ Každý pás ve spektru odpovídá vibraci specifické skupiny atomů (tzv.normální vibrační mód) s dobře definovanými geometrickýmicharakteristikami (délka vazby, vazebné úhly, atd.) ⇒ správně přiřazenýpás může sloužit jako jednoznačný indikátor (strukturní marker) tohotostrukturního rysu.

Vibrační konformační markery

12

Ve vibračních spektrech nukleových kyselin rozlišujeme dva základnítypy strukturních markerů:

nukleosidové konformační markery jako indikátory konformace cukru atorze glykosylu citlivé k torzním úhlům δ (C2´-endo nebo C3´-endokonformace cukru) a χ (anti nebo syn orientace báze)

páteřní konformační markery jako indikátory fosfodiesterové torzecitlivé k torzním úhlům α a ξ popisujícím rotaci kolem esterových vazeb5´O-P a 3´O-P)

Vibrační strukturní markery

Ve vibračních spektrech proteinů rozlišujeme řadu strukturníchmarkerů, které jsou citlivými indikátory bezprostředního okolípostranních řetězců, jejich interakce s ním a konformace (Trp, Tyr,Cys). Pásy amidu I, II a III jsou citlivými indikátory sekundárnístruktury.

13

C2’ endo/anti C3’ endo/anti C2’ endo/anti (pyrimidiny)C3’ endo/syn (puriny)

B-DNA A-DNA Z-DNA

Obrázky skeletu B-DNA, A-DNA,a Z-DNA. Každé vlákno B-DNA aA-DNA obsahuje 20 nukleotidůstejné sekvence. Z-DNA jetvořena alternujícími GC páry.

Kanonické struktury DNA

14

C3´endo Sugar Pucker

C2´endo Sugar Pucker

Deoxyguanosinev

B-DNA

Deoxyguanosinev

Z-DNA

A. Poloha osy helixu (+) v rovině páru bazí pro B-DNA, A-DNA a Z-DNA.

B. Konformace nukleosidů v kanonických DNA strukturách. Nahoře: C2’ endo pucker s anti torzíglykosylu vyskytující se u všech reziduí v B-DNA a upyrimidinových reziduích v Z-DNA. Diagram také ilustrujepáteřní (α, β, γ, δ, ε, ζ) a glykosylové torzní úhly (χ). Dole: C3’ endo/syn vyskytující se v purinovýchreziduích v Z-DNA. V A-DNA všechna rezidua zaujímajíC3’ endo sugar pucker s anti glykosylovou torzí.

Kanonické struktury DNA

15

Ramanova spektra krystalů A-, B-, a Z-DNA. Označenyjsou nukleosidové a páteřní konformační markery.

Spektra kanonických struktur DNA

16

A·B hybrid

B-form

A-form

A-form

A. poly(rA).poly(dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (A·B hybridní struktura)B. poly(dA-dT).poly(dA-dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (B-form)C. poly(dA-dT).poly(dA-dT) fiber při 75% RH (A-form)D. poly(rA).poly(dT) fiber při 75% RH (A-form)

Určení struktury RNA·DNA hybridu v roztoku

Ramanova spektra

17

Raman spectra of poly(rA)+poly(rU) mixtures

Raman shift (cm-1)

600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

Inte

nsity

(rel

ativ

e un

its)

0

50

100

150

2000 % A5 % A10 % A15 % A20 % A24 % A30 % A36 % A42 % A50 % A56 % A65 % A75 % A85 % A95 % A100 % A

Interakce poly(rA) s poly(rU) v roztoku

Soubor Ramanových spekter série vzorků poly(rA) a poly(rU) s postupně se měnícím poměrem A:U od čistého poly(rU) (červené) k čistému poly(rA)(fialové). Spektra byla normalizována a signál rozpouštědla byl odečten.

18

Interakce poly(rA) s poly(rU)

Výsledky faktorové analýzy aplikované na první derivaci souboru Ramanových spekter směsi poly(rA) s poly(rU) s měnícím se poměrem A:U.

19

Constructed RS of poly(rA)

wavenumbers / cm-1600 800 1000 1200 1400 1600

Inte

nsity

/ re

l. un

its

0

20

40

60

80

100

120

140

Constructed RS of poly(rU)

wavenumbers / cm-1600 800 1000 1200 1400 1600

Inte

nsity

/ re

l. un

its

020406080

100120140160180200220

Constructed RS of poly(rA).poly(rU)

wavenumbers / cm-1600 800 1000 1200 1400 1600

Inte

nsity

/ re

l. un

its

0

20

40

60

80

100

120

140

Constructed RS of poly(rU).poly(rA).poly(rU)

wavenumbers / cm -1600 800 1000 1200 1400 1600

Inte

nsity

/ re

l. un

its

020406080

100120140160180

Constructed UV abs. spectrum of poly(rA)

wavelength / nm220 240 260 280 300

Abso

rban

ce /

rel.

units

0

1

2

3

Constructed UV abs. spectrum of poly(rU)

wavelength / nm220 240 260 280 300

Abs

orba

nce

/ rel

. uni

ts

0

1

2

3

Constructed UV abs. spectrum of poly(rA).poly(rU)

wavelength / nm220 240 260 280 300

Abso

rban

ce /

rel.

units

0

1

2

3

Constructed UV abs. spectrum of poly(rU)poly(rA).poly(rU)

wavelength / nm220 240 260 280 300

Abso

rban

ce /

rel.

units

0

1

2

3

Calculated fractions of species

poly(rA) content / %0 20 40 60 80 100

Rel

ativ

e fra

ctio

n

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

single str. poly(rA)single stranded poly(rU)duplex poly(rA).poly(rU)triplex poly(rU).poly(rA).poly(rU)

782

998

1092

1230

1627

1471

1397

1687

727

1101

784

814

1232

1302

1338

1482 15

7416

22

1689

632

630

647

727

782

816

869 10

9111

02

1183

1236

1262

1301

1348

1381

1480

1378

1513

1576

1615

1670

1694

1729

923

981

1006

1510

919

985

1008

643

918

644

727

811

1008 10

98

1177

1219 12

5213

0513

3813

7914

2514

8415

09 1579

Byly identifikovány 4 složky:jednovláknová poly(rU),jednovláknová poly(rA)poly(rA).poly(rU) duplex apoly(rU):poly(rA)*poly(rU) triplex.

Byla izolována spektra čistých komponent

20

Interakce poly(rA) s poly(rU)

IČ spektrum proteinu v H2O (tučně) a D2O (slabě). Tloušťka kyvety byla cca 6 μm (H2O) respektive 20 μm (D2O).

Vibrační spektroskopie proteinů

21

wavenumber(cm-1)6008001000120014001600

0

200

400

600

800

1000

1200

1400 c-Myb(R2R3) fragment

1654

1621

(W1)

1579

(W2)

1553

(W3)

1461

δCH

314

46 δ

CH2

1360

(W7)

1340

δCH

2+ W

7

1126

(W13

)10

6010

11 (W

16)

876 (

W17

)85

3 (Y)

759 (

W18

)82

3 (Y)

643

677

amide I amide III

1267

54011

75 δ

CH3

wavenumber (cm-1)24002600

Ram

an in

tens

ity

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

2554

νS-Hcysteine

Fragment c-Myb(R2R3) obsahuje 6 tryptofanů (3 v R2 i R3), 2 tyrosiny (1 v R2 i R3),a 1 cystein (v R2). Jejich pásy v Ramanově spektru dominují.

Ramanovo spektrum (R2R3) fragmentu proteinu c-Myb(minimální sekvence pro specifickou vazbu k cílové sekvenci DNA)

Vibrační spektroskopie proteinů

22

Ramanova spektra (600-1800 cm-1) fd viru excitovaná 514.5 nm(dole, 50 mg/mL), 257 nm (uprostřed, 0.5 mg/mL) a 229 nm(nahoře, 0.5 mg/mL).

Rezonance s aromatickými zbytky (229 nm) – spektru dominují pásy Trp (W) a Tyr (Y) proteinových podjednotek

Rezonance s virovou DNA (257 nm ) -spektru dominují pásy bazí jednovláknové DNA (A,G,T,C)

Nerezonanční excitace (514,5 nm) – spektrudominují pásy proteinových podjednotek obálky viru (tvoří cca 88% hmotnosti viru)

Volba excitace ⇒ selektivita !!!

Ramanova a rezonanční Ramanova spektroskopie

G @ 668 cm-1 ⇒ 3´endo/anti (A marker)amid I @ 1651 cm-1 ⇒ α helix

Phe

23

Schematické znázornění vibračních módů amid I, amid II a amid III v molekule N-methylacetamidu, modelu peptidové skupiny v trans konformaci. Jejich frekvence odrážejí strukturu polypeptidového řetězce (NH2-CαHR1-CO-NH-CαHR2-CO-) nezávisle na typu postranního řetězce (R1, R2, …).

Vibrační spektroskopie a struktura peptidů a proteinů

24

FT- IČ spektra

vlnočet (cm-1)

15001550160016501700

abso

rban

ce

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 diferenční FT- IČ spektra

vlnočet (cm-1)

15001550160016501700

ΔA

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3 VCD spektra

vlnočet (cm-1)

15001550160016501700

ΔA

x105

-5

0

5

Tvarová variabilita FT-IČ (vlevo), diferenčních FT-IČ (uprostřed) a VCD (vpravo) spekter referenčního souboru 19 proteinů v H2O v oblasti amidu I a II. FT-IČ spektra jsou normali-zována na Amax = 1 amidu I. Diferenční spektra byla získána odečtením průměrného FT-IČ spektra referenčního souboru od jednotlivých spekter.

sekundární strukturaKabsch a Sander

helix β-struktura obrátka ohyb ostatní

minimum 0 0 6,9 1,9 11,1

maximum 77,1 47,7 20,9 20,5 33,0

střední hodnota 26,7 23,1 12,8 13,7 23,7

směrodatná odchylka 20,4 14,5 3,8 4,8 5,9

Distribuce sekundárních struktur v referenčním souboru 19 proteinů (v % zastoupení jednotlivých konformací).

Vibrační spektroskopie a struktura proteinů

25

Stabilita proteinů (folding ↔ unfolding)WT (přirozený) mutant (Pro → Ala)

26

Vibrační spektroskopie a počítačové modelování proteinů

27

Vlevo: kyselý α1-glykoprotein (orosomukoid) v nativním stavu.Vpravo: vazba progesteronu vede k transformaci α-helikálního segmentu ve smyčce nad

β-barelem na antiparalelní β-strukturu (označeno šipkou).

Vazba progesteronu s orosomukoidem

28

Dependence of the Raman S-H frequency and bandwidth on hydrogen bonding

Cysteine S-H stretching vibration (2500 - 2600 cm-1)

Raman spectrum (670-2800 cm-1) of the P22 trimeric tailspike protein at 10°C. The inset at upper right, which shows an amplification of the spectral interval 2480-2620 cm-1, exhibits the compositeS-H stretching profile (bands at 2530, 2550, 2565 and 2585 cm-1) of the eight cysteine residues per unit. The data are not corrected for solvent contribution. From Raso et al. J. Mol. Biol. 307 (2001) 899.

Side-Chain Conformations and Local Environments

29

Cysteine

A. The Raman S-H profiles observed for the wild-type tailspike and for each of eight Cys → Ser mutants, as labeled.

B. Raman difference spectra computed as mutant minus wild-type, for each of theeight Cys → Ser mutants. In each trace, the S-H Raman signature of the mutated Cys site is revealed as a negative band.

Spectral contributions and hydrogen-bond strengths of cysteine sulfhydryl groups of

the native P22 tailspike proteinS-H Raman signatures (2480-2630 cm-1)of tailspike cysteine residues

Side-Chain Conformations and Local Environments

30

( ) ( )R LI I IΔ = + − +pro molekulu (+)

pro molekulu (-) ( ) ( )R LI I I−Δ = − − −

L-alanyl-L-alanin D-alanyl-D-alanin(+) (-)

vlnočet (cm-1)

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

IR+I

L (x10

-8)

0

20

40

60

80

IR-IL (x

10-5

)

-20

-10

0

10

20 L-Alanyl-L-Alanin

D-Alanyl-D-Alanin

ROA

Raman

Vibrační optická aktivita - princip

31

Vibrační optická aktivita (VOA)

diferenční metoda – měříme rozdílnou odezvu chirální molekuly vůči pravo- a levotočivě kruhově polarizovanému záření,

spojuje stereochemickou citlivost konvenční optické aktivity s vyššímrozlišením a tudíž i bohatším strukturním obsahem a konformační citlivostí vibrační spektroskopie,

v případě konformačně flexibilních molekul můžeme pomocí VOA rozlišitkonformace, jež jsou stabilní z hlediska časové škály vibračních pohybů (narozdíl od NMR, kde díky pomalejší časové škále (v porovnání s konformačníkonverzí) může dojít k vyrušení strukturních rysů, je vibrační spektrum váženým průměrem spekter jednotlivých konformerů).

vibrační cirkulární dichroismus (VCD)

Ramanova optická aktivita (ROA)

32

stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace

ROA – základní aplikace

33

34

ROA – určení absolutní konfiguraceChirálně deuterovaný neopentan (R)-[2H1, 2H2, 2H3]-neopentan

Haesler et al., Nature 446, 526 (2007).

Ramanova a ROA spektra (R)-[2H1,2H2,2H3]-neopentanu. Dvě horní křivky ukazují změřená spektra. Spodní křivkyukazují jednotlivá vypočítaná spektra devíti rotamerů R1 to R9 a zprůměrované spektrum směsi všech rotamerů.

vlnočet (cm-1) vlnočet (cm-1)

stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace

ROA – základní aplikace

35

přímé měření enantiomerního přebytku bez nutnostiseparace enantiomerů

36

Měření enantiomerní čistoty

wavenumber [cm-1]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

( IR-IL ) x

10-6

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

vlnočet (cm-1)

ROA [ ] %R SEE

R S

c cfc c

−=

+

Soubor ROA spekter 19 vzorků trans-pinanu o různé enantionerní čistotě.

enantiomerní čistota

from ROA data

enantiomeric excess (%)-100 -50 0 50 100

scor

e V i1

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.99912R =

Lineární regrese

J. Hrudíková, Bakalářská práce (2007).

stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace

ROA – základní aplikace

37

přímé měření enantiomerního přebytku bez nutnostiseparace enantiomerů

určení konformace biologických molekul v roztoku(proteinů, nukleových kyselin, cukrů, virů …)

ROA a Ramanova spektra (1S)-(-)-a-pinenu: (a) zjednodušený (tzv. polární) a (b) konvenční model výpočtu ROA intenzit, (c) experimentální ROA spektrum, (d) simulované a (e) experimentální Ramanovo spektrum.

Simulace Ramanových a ROA spekter

(1S)-(-)-α-pinene

exp

exp

38

PLP in H2O

IR-IL

PLP in TFE

hinge peptide in H2O

wavenumber (cm-1)

200 500 800 1100 1400 1700

Ramanova optická aktivita peptidů

ROA spektra poly-L-prolinu v TFE

ROA spektra hinge peptidu, paralelního dimeru oktapeptidu Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Prove vodě

ROA spektra poly-L-prolinu ve vodě

39

valenční vibrace skeletu(νCα-C, νCα-Cβ, νCα-N)~ 870 – 1150 cm-1

rozšířená oblast amidu III(νCα-N, + δN-H a δCα-H)

~ 1230 – 1340 cm-1

oblast amidu I(νC=O)~ 1630 – 1700 cm-1

ROA proteinů

Amid III Amid I

X-ray PDB:69,2% α-helix

1,7% 310-helix

43,5% β-list

1,7% α-helix

1.3% 310-helix

28,7% α-helix

10,9% 310-helix

6,2% β-list

40

α-helix β-list

disorder

order

ROA proteinů – PCA (Principal Component Analysis)

41

the simplest amino acid

ideal benchmark system for studying:

conformational behavior

interaction with solvent

L-Alanine

42

χ (CH3)

60 90 120 150 180

E (k

cal/m

ol)

0

1

2

3

B3LYP/6-31G** B3LYP/6-311G** B3LYP/6-31++G**

ψ (COO-)

-90 -45 0 45 90

E (k

cal/m

ol)

0

2

4

6

8

B3P86/6-31G** B3P86/6-311G** B3P86/6-31++G**

ϕ (NH3+)

0 30 60 90 120

E (k

cal/m

ol)

0

1

2

3

χ (CH3)

60 90 120 150 180

ϕ, ψ

-30

0 ϕ (NH3+)

ψ (COO-)

ψ (COO-)

-90 -45 0 45 90

ϕ, χ

-60

-30

ϕ (NH3+)

0 30 60 90 120

ψ, χ

-60

-30

0

ψ (COO-)χ (CH3)

ϕ (NH3+)

χ (CH3)

B3LYP/COSMO/6-31++G**

1D scan 2D scan

Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689

Dependencies of molecular energy (E, left) and dihedral angles (right) on the angles ϕ, ψ, and χ. The remaining coordinates in the one-dimensional scans were allowed to fully relax.

L-Alanine – potential energy surface

43

Wavenumber

400 800 1200 1600

IR +

IL

0

4

Wavenumber

400 800 1200 1600

(IR -

IL ) × 1

04

-1

0

1

Wavenumber

400 800 1200 1600

IR +

IL

0

4

Wavenumber

400 800 1200 1600

(IR -

IL ) × 1

04

-1

0

1

Wavenumber

400 800 1200 1600

IR +

IL

0

4

Wavenumber (cm-1)

400 800 1200 1600

(IR -

IL ) × 1

04

-1

0

1

3 4 5 6 7 8 9 11 12,1310 14,15 16 1718,1920,21

22,23 24 25,26

68 128153

98

175

128

180140113

88

135

105138

65 to 85

173 135

113 85

-60-35

25 15

-80

20

-15

6015

60

70

-5

0

70

40

-55

0

70

10-65

60

-25

70

-25

10 -40 to -90

20-75 -55

25

2510

-40-15

-30

60

85

25-60

1525

65 -3525 60

-35 45

20

55 to 90-90 to -30

Mode number:

60

105

600

115

25

95

25

10 75 115

55

25 60

60

520

70

20

85105

5530

30

8085

35

15

ϕ (NH3+)

ψ (COO-)

χ (CH3)

NH3+

COO-

CH3

Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689 44

Wavenumber

400 800 1200 1600

(IL + IR

) × 1

0-9

0

2

Wavenumber

400 800 1200 1600

(IR -

IL ) × 1

0-5

-5

0

5

12,13 24

20,2

1

25,26

22,2

3

12,13

17

20,21

Wavenumber

400 800 1200 1600

IR +

IL

0

3

Wavenumber (cm-1)

400 800 1200 1600

(IR -

IL ) × 1

04

-5

0

5

Experiment

Calculation

114

89

10

12,13 16

17

19

181415

22

23

20,21

2,3

4 56 8 9

10

11 12,1314 17 24

18

20,21 25,26

22,2

3

1915 16

7

4 65

7

8 9 11

10

1415

1718

19

4

8 910

11

1415

16

18

19 22

23

L-Ala

D-Ala

Raman

ROA

Raman and ROA spectra can be reliably interpreted if the movement of flexible molecular parts is considered

Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689

L-Alanine

45

There is a significant difference between

Ala-Pro x Pro-Ala

Gly-Pro x Pro-Gly

ROA (Raman) can directly reflect flexibility of the molecule

Model dipeptides

46

Gly-Pro Pro-Gly

×ψ ψϕ ϕ

rigidity × flexibility

Model dipeptides

47

Hinge peptide and its analogs

hinge peptide(double thread)

single thread Met analog

Model of an entire human IgG1 molecule.1

S-S bridged tetrapeptide(H-Gly-Cys-OH)2

1Padlan E.A, Mol. Immunol. 31 (1994) 169.

HINGE peptide is a fragment 225-232/225’-232’ from the core of human immunoglobulin IgG1. It acts in this parentmolecule as a swivel point crosslinking two rather heavy peptide chains. Being a parallel dimer of the octapeptideH-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH (C2 symmetry). The sequence is rich in proline residues and isexpected to be quite rigid also due to a presence of two disulphide bridges. The peptide offers several advantagesfor use as a universal carrier of various active sequences (immunologically neutral, possesses six independentterminal groups: -NH and -OH on Thr residues and C-terminal carboxyl).

48

(H-Gly-Cys-OH)2

wavenumber (cm-1)200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

IR-IL (x

10-6

)

-2

-1

0

1

poly(L-Pro)

IR-IL (x

10-6

)

-2

-1

0

1

H-Thr-Met-Pro-Pro-Met-Pro-Ala-Pro-OH

IR-IL (x

10-6

)

-3

-2

-1

0

1

2

3

(H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH)2

IR-IL (x

10-6

)

-1

0

1

1643

1612

1456

1480

13201283

1258

1205

1193

1162

981

1004

937

893

924

659

523

322

212

95 1352

325

523

924

1003

1205

1255

1453

1612

1643

1481

892

938

976

1162

1193 13

2012

82

1352

1622

1606

1481

1459

1327

1351

1195

97894

692

210

00

1208

327

535

40314

5

900

668

834

834

1683

1415

1328

1393

1286

123011

82

1037

970

22011

5

1415

1683

1162

(H-Gly-Cys-OH)2

wavenumber (cm-1)200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

IR+I

L (x10

-9)

0

2

4

6

poly(L-Pro)

IR+I

L (x10

-9)

0

1

2

H-Thr-Met-Pro-Pro-Met-Pro-Ala-Pro-OHIR

+IL (x

10-9

)

02468

10121416

(H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH)2

IR+I

L (x10

-9)

0

2

4

6

8

667

510

501

510

657

ν(S-

S)ν(

S-S)

ν(C-

S)ν(

C-S)

Amide I

Amide I

Amide III

1252

1454

δ(CH

2)14

5214

53δ(

CH2)

δ(CH

2)

1633

1655

1655

Amide I

1685

49