Interpretacióncrítica de ANAMª José Martínez Becerra

Inmunólogo Adjunto

Sección Autoinmunidad y Alergia

HU Fundación Jiménez Díaz

EAI: VARIABILIDAD

Your Date Here Your Footer Here 2

Distintas interacciones entre genes y medio ambiente condicionan fenotipos variables de una misma EAI

En cada individuo se da una combinación única de anticuerpos

3

¿ANA?

EASI/IUIS (2014)

Anti-celulares

ICAP

Ensayo de IFI en Hep2 (Hep2 IIFA)

4

IFI

Línea Celular Hep2

Patrón de fluorescencia

Título: mayor dilución* que mantiene fluorescencia

Variabilidad: subjetividad, limitaciones para anticuerpos (Ro/Jo1), etc.

¿SOSPECHA DE ENFERMEDAD AUTOINMUNE SISTÉMICA?

Identificar especificidad de ANA

Your Date Here Your Footer Here 7

Didier K, Bolko L, Giusti D, Toquet S, Robbins A, Antonicelli F and Servettaz A (2018) Autoantibodies Associated With Connective Tissue Diseases: What Meaning for Clinicians? Front. Immunol. 9:541

CRITERIOS DE CLASIFICACIÓN

8

PL Meroni et al. Nat Rev Rheum 2014

2013 ACR:Scl70

RNA Pol IIICentrómero

2019 EULAR/ACR:ANA

dsDNACL/B2GPI/AL

Sm

2016 ACR/EULAR:Ro

ANTICUERPOS VALOR PRONÓSTICO: SSc

Mecoli CA, Casciola-Rosen L. An update on autoantibodies in scleroderma. Curr Opin Rheumatol. 2018 Nov;30(6):548-553.

Your Date Here Your Footer Here 10

Journal of Internal Medicine, Volume: 280, Issue: 1, Pages: 8-23, First published: 25 November 2015, DOI: (10.1111/joim.12451)

Betteridge Z, McHugh N. Myositis-specific autoantibodies: an important tool to support diagnosis of myositis. J Intern Med. 2016 Jul; 280(1):8-23

ANTICUERPOS VALOR PRONÓSTICO: MII

Jiří Vencovský

Institute of Rheumatology, Prague, Czech Republic

MSA EXCLUYENTES

Betteridge et al. Frequency, mutual exclusivity and clinical associations of myositis autoantibodies in a combined European cohort of idiopathic inflammatory myopathy patients .J Autoimmun. 2019 Jul; 101: 48–55.

Positivo/NegativoValor numérico

Negativo por una mezcla de antígenos

/ Positivo por mezcla

Positivo, Título y Patrón

Positivo, Título y Patrón (AC-X)

+Estudio de especificidades

ANA: INFORMES AL DIAGNÓSTICO

¿IMPORTANCIA DE PATRÓN Y

TÍTULO?

Lupus 2019

ControlEAI

¿IMPORTANCIA DE PATRÓN Y

TÍTULO?

Lupus 2019

SOLICITUDES ANA

17

Fritzler M. (2019) Perspective: Widening Spectrum and Gaps in

Autoantibody Testing for SystemicAutoimmune Diseases.

J Rheumatol Res, 1(1): 10-18.

Mahler et al.Journal of Immunology Research 2014

INTERPRETACIÓN EN CONTEXTO.PROBABILIDAD PRE Y POST-TEST

ANA: MÉTODO DE ESTUDIO

ACR: IFI gold standard

EASI/IUIS: Especificar método

2009

2014

Ej. FJD: Negativo por una técnica multiparamétrica que incluye Ro,

La, dsDNA, Cromatina, U1RNP, Sm, Jo1, Scl70, CENPB, Ribosomal P.

• Variabilidad en las combinaciones comercializadas

CRIBADO CRIBADO

ANA: MÉTODO DE ESTUDIO

ACR: IFI gold standard

EASI/IUIS: Especificar método

EULAR Task force

2009

2014

2019

ANA EN CONTEXTO

Bossuyt X, Fieuws S. Ann Rheum Dis 2014;73:e10.

Jolien Claessens, Thibaut Belmondo, Ellen De Langhe, ReneWesthovens, Koen Poesen, Sophie Hüe, Daniel Blockmans, Michael Mahler, Marvin J. Fritzler, Xavier Bossuyt , Solid phase

assays versus automated indirect immunofluorescence for detection of antinuclear antibodies. Autrev(2018)

ANA EN CONTEXTO

Adaptar la técnica a la sospecha clínica

Informar al laboratorio del contexto clínico

EIA ANA

POSITIVO

IFI

+ -

NEGATIVO

Especificidades

ANA SIN DATOS CLÍNICOS / BAJA SOSPECHA

Negativo por una técnica que incluye: dsDNA, Ro, La, Scl70,

Jo1, U1RNP, RibP, CENPB, Cromatina, y Sm.

OsteopeniaDepresiónLumbalgiaArtralgias…

Informar Ej. Anti-Ro52 / Hep2 NEG

Sm

Sm/RNP

Scl70

CENPB

Jo1

SSA

SSB

DNA

Rib P

Cromatina

EIA ANA

POSITIVO

IFI

+ -

NEGATIVO

Informar

LESSm

Sm/RNP

Scl70

CENPB

Jo1

SSA

SSB

DNA

Rib P

Cromatina

ANA sin especificidad?

Ku??PCNA??

Informar Ej. Anti-Ro60 / Hep2 NEG

EIA ANA

POSITIVO

IFI

+ -

NEGATIVO

La baja sensibilidad de Hep2 para anti-Ro determina que los EIA mejoren lasensibilidad del estudio de ANA en SS.

ANA en dx SS

Negativo por una técnica que incluye:

dsDNA, Ro, La, Scl70, Jo1, U1RNP, RibP,

CENPB, Sm y Cromatina.

Informar Ej. Anti-Ro60 / Hep2 NEG

Informar

Sm

Sm/RNP

Scl70

CENPB

Jo1

SSA

SSB

DNA

Rib P

Cromatina

Especificidades*

EIA ANA

POSITIVO

IFI

+ -

NEGATIVO

ANA en dx SSc

RNA Pol III?ThTo?

Fibrilarina?PmScl 100/75?

Ku?CENPA?

RNA Pol III?

Sm

Sm/RNPScl70

CENPB

Jo1SSA

SSB

DNA

Rib P

Cromatina

Free creative templates, charts, diagrams and maps

for your outstanding presentations

SSc: PROBLEMAS TÉCNICAS ESPECÍFICAS

• Fibrilarina

• ThTo

Koenig M et al. Rheumatology 2019;58:1784-1793

EIA ANA

POSITIVO

IFI

+ -

NEGATIVO

Especificidades*

ANA en dxMiopatías AI

MDA5?Mi2?

NXP2/MJ?SAE1/2?

TIF1Gamma?HMGCoAr?

PL7, PL12, EJ? OJ, Ks, Ha, Zo?

MDA5?NXP2/MJ?SAE1/2?

HMGCoAr?? HALIPOJ, Ks, Ha, Zo?

Sm

Sm/RNP

Scl70

CENPB

Jo1

SSA

SSB

DNA

Rib P

Cromatina

La combinación de técnicas es la mejor herramienta. Ninguna técnica englobatodas las posibilidades diagnósticas con adecuada sensibilidad y especificidad

IFI Hep2

+

Nuclear

Moteado fino / grueso

Mi2* SAE TIF-1γ*

Citoplasmática

Moteado fino / difuso

SRP* PL-7 PL-12 EJ Jo1 HMGCoAr

-

Jo1 MDA5* TIF-1γ* HMGCoAr SRP*

*Variabilidad inter-fabricanteCuando para un mismo antígeno existen dos opciones, en cursiva se recoge la segunda opción, de menor probabilidad

Propuesta de algoritmo diagnóstico para Miopatías Autoinmunes basado en los resultados obtenidos en el Taller SEI 2015

Sospecha Miopatía Autoinmune

Taller AI SEI 2015. Mª José Martínez Becerra

¿Ha, Zo, Ks, OJ?

• El estudio de ANA y especificidades tiene un gran valor diagnóstico y pronóstico

• Los ANA carecen de valor en la monitorización

• Pocas especificidades tienen utilidad en el seguimiento:

– dsDNA en LES (Nucleosomas*)

– Ro en Lupus neonatal

– MDA5**

– HMGCoAr**

2014 ACR/ARHP Annual MeetingDidier K, Bolko L, Giusti D, Toquet S, Robbins A, Antonicelli F and Servettaz A (2018) Autoantibodies Associated With Connective Tissue Diseases: What Meaning for Clinicians? Front. Immunol. 9:541.

¿ANA EN EL SEGUIMIENTO?

TAKE-HOME MESSAGES

GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN

• IFl gold standard para estudio de ANA

InconvenientesVentajas

Subjetiva

Falta estandarización

50% Antígenos no disponibles: Baja sensibilidad para algunos Antígenos (Ro, La y Jo1)

Larga retraso

NO específica de

Antígeno Estudios en positivos

Aumento demanda

¿viable?

Múltiples antígenos, estado nativo

Informativa (Patrón, Otros Ac.)

Sencilla

Reproducible

ANA: MÉTODO DE ESTUDIO

*Variabilidad en los ensayos comercializados

Informar al laboratorio del contexto clínico

Free creative templates, charts, diagrams and maps

for your outstanding presentations

Abeles et al. The clinical utility of a positive antinuclear antibody test result. The American Journal of Medicine, Vol 126, No 4, April 2013

Free creative templates, charts, diagrams and maps

for your outstanding presentations

¿IMPORTANCIA

DE PATRÓN Y

TÍTULO?

La frecuencia de títulos bajos de ANA (≤1/320) essignificativamente mayor en NAD (70%) y en Sanos (67%) que enEAI sistémicas.

Moteado fino es el patrón de IFI más frecuente en todos losgrupos (32% EAIS, 35% NAD, 49% Sanos)

EAIS: Moteado grueso y Homogéneo

Sanos y Control enfermo: Moteado fino denso DFS

Lupus 2019

DESAFÍOS IFI

Estandarización:

Armonización:Nomenclatura

FABRICANTES

Fijadores

Cultivo

Conservantes

USUARIO

Conjugados

Dilución partida

Titulaciones

Microscopio

Criterio observador

EIA ANA

POSITIVO

IFI

+ -

NEGATIVO

Especificidades

ANA SIN DATOS CLÍNICOS / BAJA SOSPECHA

Negativo por una técnica que incluye: dsDNA, Ro, La, Scl70,

Jo1, U1RNP, RibP, CENPB, Cromatina, y Sm.

OsteopeniaDepresiónLumbalgiaArtralgias…

Informar Ej. Anti-Ro52 / Hep2 NEG

Sm

Sm/RNP

Scl70

CENPB

Jo1

SSA

SSB

DNA

Rib P

Cromatina

ANTICUERPOS ≠ GLUCOSA

MUESTRAS HETEROGÉNEAS

• Los sueros de pacientes con EAI presentan anticuerpos policlonales

• Reconocen diferentes epítopos

• De diferentes isotipos (IgG 1, 2, 3, 4, IgM, IgA)

• Variedad en punto isoeléctrico

• Variabilidad en región Fc

• Diferente avidez

¿¿ESTANDARIZACIÓN??

Mahler M et al. Clin Immunol 2003

a) ANA CON ESPECIFICIDAD b) ANA SIN ESPECIFICIDAD0

Negativo para especificidades

Anti-CENPB +

Colangitis Biliar Primaria (CBP)

Esclerosis Sistémica (SSc)

FUENTE ANTIGÉNICA

• Vector Modificaciones post-traduccionales, importantes en la respuesta autoinmune

– Generación de neoepítopos

– Modula afinidad por HLA y/ó TCR

Nativo

• Fuente: mamíferos

• Autenticidad (modificaciones post-traduccionales, plegamiento)

• Falta de Pureza (purificación)

• Problemas de Reproducibilidad

Recombinante

• 1980

• Identificación de dianas antigénicas

• Reproducible

• Mejora la pureza

• Importancia de vector

ANTICUERPO – VALOR DIAGNÓSTICO

Mahler et al.Journal of Immunology Research 2014

Damoiseaux J, Andrade LEC, Carballo OG, et al. Ann Rheum Dis. 2019;78:879–889.

• Paso previo a IFI: Enzimoinmunoensayos (ELISA, Quimioluminiscencia, Luminex, etc.) basados en mezclas de antígenos celulares para CRIBADO de ANA

• Tipos:

Cualitativo: POSITIVO /NEGATIVO para la mezcla.

Cuantitativo: Si POSITIVO identifica especificidad y concentración de anticuerpos.

Sm

Sm/RNP

CENPB

Scl70

Jo1

SSA

SSB

DNA

Rib P

Crom

ANA: Métodos de estudio

Ann Rheum Dis 2013

ADAPTAR TÉCNICA A SOSPECHA CLÍNICA

Informar al laboratorio del contexto clínico

VARIABILIDAD ANA IFILES - ENSAYOS CLÍNICOS

David S. Pisetsky, Dana Kathryn Thompson, Joseph Wajdula, Annette Diehl, and Sudhakar Sridharan. Variability in Antinuclear Antibody Testing to Assess Patient Eligibility for Clinical Trials of Novel Treatments for Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis & Rheumatology Vol. 71, No.

9, September 2019, pp 1534–1538DOI 10.1002/art.40910

TALLER SEI 2015: S4 (TIF1γ)N=8

0 1 2 3 4 5 6

POSITIVO

NEGATIVO

TIF1 EN LABORATORIOS CON REACTIVO (N=8)

D-tek PMS12D24 Euroimmun DL 1530-1601-4 G

PROVEEDOR FUENTE ANTIGENICA

EUROIMMUN Recombinante humano / E. coli

DTEK TRIM33 (Recombinante, humano, expresado en HEK293)

ELISA Sant Pau WB Sant Pau

D.O.: 0,4 (Positivo >0.2) +

MIOPATÍAS: OPORTUNIDAD DE MEJORA

Mahler M, Betteridge Z, Bentow C, Richards M, Seaman A, Chinoy H and McHugh N (2019) Comparison of Three Immunoassays for the Detection of Myositis Specific Antibodies. Front. Immunol.

Cavazzana I, Fredi M, Ceribelli A, Mordenti C, Ferrari F, Carabellese N, et al. Testing for myositis specific autoantibodies: comparison between line blot and immunoprecipitation assays in 57 myositis sera. J Immunol Methods. (2016)

Infantino M, Manfredi M, Bizzaro N. Ann Rheum Dis 2019

MIOPATÍAS: OPORTUNIDAD DE MEJORA

56

¿ENA?

Extractable Nuclear Antigens1959 Holman y RobinsPero…

Antígenos no extraíbles: dsDNA Antígenos no nucleares: Ribosomal P, PL7, PL12, Jo1, etc.

Nomenclatura imprecisa y confusa Anticuerpos específicos

Ejemplo MII -1Cribado especificidades Negativo

IFI Positiva Citoplasma

https://atlasautoinmunidad.org/

EJ+ por LIA (Enzimoinmunoensayo en tira)

MDA5+ por LIA (Enzimoinmunoensayo en tira)

Ejemplo MII -2Cribado especificidades Negativo

IFI Negativa

MDA5

NEGATIVO

S16: MDA5 (+Ro)N=39

0 2 4 6 8 10 12 14 16

MDA5 POSITIVO

MDA5 NEGATIVO

MDA5 EN LABORATORIOS CON REACTIVO (N=20)

DTEK EUROIMMUN

++/MODERADO++/MODERADO

SIN REACTIVO MDA5

CON REACTIVO

PROVEEDOR FUENTE ANTIGENICA

DTEK Recombinante humano, células HEK293

Euroimmun Recombinante humano, E.coli

ELISA Sant Pau WB Sant Pau

Positivo +

Ejemplo MII -1Cribado especificidades Negativo

IFI Positiva Nuclear Moteado fino (AC-4?)

Mi2+ por LIA fabricante AMi2 – por LIA fabricante B

Mi2 confirmado por ELISA

S3: Mi2N=39

Mi2MI2

DEBIL

DISCORDANTE

NEG

95% Tenían reactivo Mi2

0 5 10 15 20 25 30

b1.Patrón homogéneo con tinción nucleolar homogénea.

b2 Patrón homogéneo con nucleolos negativos.

b3.Patrón moteado grueso tipo matriz nuclear

b4 Patrón moteado grueso.

b5 Patrón moteado fino.

b7 Patrón moteado pleomórfico

PATRON NUCLEAR (N)

TÍTULO (RANGO) 160-2560

MODA 640

Sant Pau: Mi2 POSITIVO

Dra. Laporta. Hep2 Inmunoconcepts.

S3: Mi2

S3: Mi2 TOTAL

PROVEEDOR INMUNOBLOT

DTEK

ORGENTEC

PALEX

Lab 1Lab 10

Lab 36

Lab FJD

0

50

100

150

200

250

300

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

THERMOPROVEEDOR FUENTE ANTIGENICA

THERMO Recombinante humano

DTEK CHD4+Mi2b (recombinante en sf9 infectadas con baculovirus)

Orgentec Purificado

Palex* CHD4+Mi2b (recombinante en sf9 infectadas con baculovirus)

Mi2 total. Técnica.

FEIA (THERMO)

INMUNOBLOT

N=22

100% Positivo

S3: Mi2 ALFA

MI2 ALFA

NEGATIVO

DUDOSO

POSITIVO

PROVEEDOR / MODELO FUENTE ANTIGENICA

EUROIMMUN / MYOPATHIES 16 AG (1530/1601/4G) Recombinante (Baculovirus – celulas insecto)

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

8/128

6/116

Lab

. 1La

b. 2

Mi2α (% UA CONTROL POSITIVO)

N=13

100% EUROIMMUN 4G

S3: Mi2 BETA

MI2 β

DUDOSO NEGATIVO

POSITIVO

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Lab. 1 Lab. 2 Lab. 3 Lab. 4 Lab. 5 Lab. 6 Lab. 7 Lab. 87/116 12/190 12/127 10/144 7/116 8/130 16/186 12/140

% UA CONTROL POSITIVO 6% 6% 9% 7% 6% 6% 9% 9%

Mi2β (% UA CONTROL POSITIVO)

N=25

100% EUROIMMUN (G / 3G /4G)

PROVEEDOR / MODELO FUENTE ANTIGENICA

EUROIMMUN / MYOPATHIES 16 AG (1530/1601/4G) Recombinante (Baculovirus – celulas insecto)

DESAFÍOS IFI: ESTANDARIZACIÓN

Estudio LE Andrade et al. Dresden 2017• 275 EAIS• 293 Enf. No autoinmunes• 300 voluntarios sanos

Hep2: 4 fabricantes• Aesku / Bion / Inova / Hemagen

3 observadores ciegoDilución 1/80; Objetivo 400xNomenclatura ICAP

HETEROGENICIDAD TAMBIÉN EN REACTIVOS

• Pureza Especificidad (contaminantes)

• Expresa los epítopos?? Fuente antigénica (nativa, recombinante, vector Eucariota vs. Procariota, etc.)

• Capacidad para detectar anticuerpos aglutinantes / precipitantes

• Avidez de los anticuerpos detectados

FUENTE ANTIGÉNICA

VECTORES DE EXPRESIÓN

E coli (Procariota)

-Proteínas de pequeño tamaño

-Ausencia de modificaciones post-traduccionales(glicosilación, fosforilación, acilación)

-Problemas de solubilidad (cuerpos de inclusión)

Levaduras (Eucariota)

+Modificaciones post-traduccionales

+Fácil manilpulación

+Rápido crecimiento

-Extracción dificil

-Adición de carbohidratos

Baculovirus + Células de Insecto

+Proteínas de cualquier tamaño

+Rápido

+Modificaciones post-traduccionales

-Glicosilación puede saturarse

Células mamífero (hamster)

-Dificultad de generar líneas estables

-Lento crecimiento

-Bajos niveles de expresión

AC-0: NegativoAC-XX: No clasificables. Incluir

descripción

AC-29: Scl70/Topoisomerasa I

ANA IFI (Hep2) Junio 2013Negativo

Especificidades antigénicas1) ANA ELISA (QUANTA Lite®)

CENPB, Ro, La, Scl70, Sm, U1RNP, Jo1, dsDNA, M2, Histonas, PCNA y RibosomalP

Negativo2) Inmunoblot PM/DM (Dtek® Modelo PMS12)

PmScl 100 kDa, PL7, PL12, Mi2, SRP54, MDA5, TIF-γ, EJ, Scl70, Jo1, Ro52 y Ku

MDA5 (Recombinante) Positivo Moderado/++

Hospital Santa Creu i Sant Pau: Anti-MDA5ELISA y Western-blot in-house (recombinante)

PositivoELISA DO: 1.2 (Positivo >0.2)