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1
Ion University (for use with: Torrent Server / Torrent Suite™ v5.12.1)
Technical Support2020.04
[email protected]
3
2
• ランデータの編集・管理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・71
• 再解析・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・73
• データ統合・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・75
• ラン統計情報の比較・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・77
• サーバの空き容量確認・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・78
• データアーカイブ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・80
• データのバックアップについて・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・83
• データ管理（ストレージ、NAS、セキュリティ）・・・・・・・・・・・・84
• ソフトウェアアップデート方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・89
• Ion Reporter™による変異の絞り込み・・・・・・・・・・・・・・・・・・・95
• 有償解析ソフトのご案内・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・107
• 補足資料： 解析系・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・111
• データ解析概略・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・3
• トレントスイートソフトウェア・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・11
• ランレポート・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・23
• トラブルシューティング用ファイル（CSA、サーバ情報）・・・32
• リファレンス配列、領域ファイルの登録・・・・・・・・・・・・・・・・・・35
• BEDファイルについて・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・39
• プラグイン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・43
• Coverage Analysis ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・47
• Torrent Variant Caller・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・51
• RNASeqAnalysis ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・59
• AmpliSeq RNA・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・63
• Assembler SPAdes・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・67
• FileExpoter ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・69
目次
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3
データ解析概略
4
解析の流れとTorrent Suiteソフトウェアの機能の範囲
Variant検出
ベースコール>GATCTGATCTGAGTCGATTATGCT
マッピング
Torrent Suiteの主要な機能
生データ
AGGTGTAGGGCCTAGCGGTGTAGGGCCTAGCC
GTAGGGCCTAGCCGATGGGCCTAGCCGATGA
CTAGCCGATGATGCGGTGATGATGCGGTAGCAGT
ATGCGGTAGCAGTTTGATGCGGTAGCAGTTTGAT
AGGTGTAGGGCCTAGCCGATGATGCGGTAGCAGTTTGAT
de novoアセンブル
リファレンスが無い場合
リファレンスがある場合
3rdパーティ/フリーソフトも使った方が良い
Ion Reporter™
（クラウドサービス/ローカルサーバシステム)
発現解析
unmappedBAM
3rdパーティ/フリーソフトが必要
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5
外付けサーバ
128 GB RAM
NVIDIA™ K40
12×3 TB （実効容量 28 TB）
Ubuntu™ 14.04
外付けサーバ
256 GB RAM
No GPU
8×4 TB （実効容量 25 TB）
Ubuntu™ 14.04
Ion GeneStudio S5 series Torrent Server Specifications
Server
Memory
GPUs
Storage
OS
内蔵サーバ
256 GB DDR4
NVIDIA™ P5000
4×2 TB SSD4×8 TB HDD（実効容量 24 TB）
Ubuntu™ 14.04
Ion GeneStudio™
S5 Plus SystemIon S5™ XLSystem
Ion GeneStudio™
S5 Prime SystemIon GeneStudio™
S5 System
内蔵サーバ
128 GB DDR3
GeForce GTX TITAN
4 × 4 TB （実効容量 12 TB）
Ubuntu™ 14.04
注： データのバックアップを行う際は、別途NASなどが必要（p.78~87参照）。Ubuntu™ 18.04への外付けサーバOSのアップデートをご希望の場合はお問い合わせください。
6
Ion GeneStudio S5 series System Data Pipeline
110 GBRaw Voltage Data DAT 530 GB 1 TB*
15 GBSignal Processing WELLS 75 GB 330 GB
520 RunsIon GeneStudio™ S5 Plus / Prime 140 Runs 50 Runs
Data Pipeline Step File Type Ion 520™ chip Ion 530™ chip Ion 550™ chip
中間データ
塩基配列、QV、マッピングポジション
Ion 510/520/530 850 flowsIon 540/550 500 flows
246 RunsIon GeneStudio™ S5 System 68 Runs 20 Runs
Data Storage Capacity
5 GBBase Calls - Aligned BAM 25 GB 90 GB
Ion 510™ chip Ion 540™ chip
210 GB 2 TB
30 GB 180 GB
10 GB 55 GB
123 Runs 37 Runs
260 Runs 80 Runs
圧縮ファイル
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7
Ion PGM and Ion Proton Torrent Server Specifications
Dual 8-core 2.9 GHz CPUs
128 GB RAM
2x NVIDIA™ Tesla™ GPUs
12 × 3 TB （実効容量 27TB）
Ubuntu™ 14.04
Processors
Memory
GPUs
Storage
OS
/rawdata ~16TB/results ~11TB
注：データのバックアップを行う際は、別途ハードディスクなどが必要（p.78~84参照）。Ubuntu™ 18.04へのOSアップデートをご希望の場合はお問い合わせください。
Dual 6-core 2.6 GHz CPUs
64 GB RAM
6 × 3 TB （実効容量 12TB）
Ubuntu™ 14.04
Ion PGM™ Ion Proton™
8
Ion PGM System Data Pipeline
30 GBRaw Voltage Data DAT 135 GB 225 GB
2 GBSignal Processing WELLS 9 GB 16.4 GB
0.2 GBBase Calls - Base FASTQ 1-1.5GB 1.8-2.5 GB
Data Pipeline Step File Type
0.5 GBBase Calls - Aligned BAM 3.1 GB 4.2 GB
Ion 314™ chip Ion 316™ chip Ion 318™ chip
中間データ
塩基配列QV
マッピングポジション
塩基配列とQV
*v4.2 250bp runs (500 flows) May 2015
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9
Data Pipeline Step File Type Ion PI™ Chip File Size*
*Uncompressed file sizes shown. Ion Torrent is actively working on enhancing its data file compression algorithms to reduce file sizes
219 GBSignal Processing WELLS 中間データ
30 GBBase Calls - Base FASTQ 塩基配列とQV
44 GBBase Calls - Aligned BAM 塩基配列、QVマッピングポジション
(520 flows)
Ion Proton System Data Pipeline
10
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トレント スイート ソフトウェア
12
IP アドレス
． ． ．
Torrent Serverと同じネットワーク上のコンピュータのWebブラウザから、ランのデータを参照することが可能
アドレスの指定
http://[Torrent ServerのIPアドレス]/
例
Webブラウザ
Google Chrome、 Firefox、 Safari、 Internet Explorer などで参照可能
※一部の古いブラウザ(例えば Internet Explorer 8)では表示上の問題が生じる可能性あり
ログインユーザ名 ： ionuserパスワード ： ionuser
※ユーザ名、パスワードの変更は不可
Torrent Suiteの使い方
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13
• Home – ソフトウェアや装置のシステム概要、新着情報
• Plan – 新しいランの設定や確認・編集
• Monitor – 実行中のランの進行状況を表示
• Data – ランの結果・データの参照、プラグインの実行、データ管理
Torrent Suiteのタブについて①
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• 設定 ( ) • About – インストールされているソフトウェアのバージョン情報
• Accounts – アカウント情報の管理（Connection to AmpliSeq : AmpliSeq Designerのアカウントをリンク ）
• Analysis Parameters – 解析条件の設定（上級者向け）
• Configure – サーバ管理機能（アップデート、シャットダウン等 : Admin Interface）
• Ion Mesh – 異なるトレントサーバと接続し、一覧表示(SamplesやCompleted Run & Reports)
• Ion Reporter Configure – Ion Reporter™へのデータアップロードに関するアカウント管理（p.106参照）
• Plugins – プラグインの管理
• Reference Sequences – リファレンス配列やBEDファイルの登録、バーコード配列やテストフラグメント
• Services – サーバ上のデーモン（プログラム）の状態
• Updates – 新キットの有効化やプログラムのアップデート
Torrent Suiteのタブについて②
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15
Plan タブ Samples ～サンプル情報の設定～
サンプル情報の入力1. サンプルのファイル(.csv)をインポート
or2. サンプル情報を手入力
Plan Sample Type :
・Ion Chefで Ion AmpliSeq ライブラリを調製する場合
・Ion Reporter で解析する場合
※ 詳細は納品説明補足資料を参照
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Plan タブ Templates ～ランの設定～Plan Template Run :
※ 詳細は納品説明補足資料を参照
a. Plan New Run : ひな型を使用せずに新しいランを設定
b.Plan Run : 既存のひな型を使用し、新しいランを設定
★ワークフローごとの使用キット
Flowの数は自動選択
☆自動使用するプラグイン
★実験系の名称Ion Reporter
設定
★プラン名参照配列
サンプル名アラート設定
実施するアプリケーション
ひな型新規作成
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• ラン開始から24時間表示
Monitor タブ – Table View & List View
List View/Table Viewで、実施中のランの状況を表示可能
モニター条件を満たさない場合
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• シーケンシングがスタートするまで表示
Monitor タブ – Ion Chef
テンプレート調製の進捗ライブラリ調製の進捗
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Data タブ – Table View & List ViewTable Viewは1ラン/1行表示
List Viewは各ランの解析レポートリストを表示
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Data タブ -サムネイル解析とフル解析
List View
フル解析:全てのデータを含む解析
サムネイル解析（Ion GeneStudio™ S5 series, Ion Proton™）:ランの状況を迅速に確認するため、一部のデータを使用して行う解析
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ランレポート
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レポートの構成
1. ランの評価
• リファレンスへのアライメント前/後の評価
2. ランの結果ファイル取得
• BAM, BAI のダウンロードリンク
3. Barcode Table 注：バーコードランのみ
4. その他
• テストフラグメント結果、Ion Chefサマリ
• キャリブレーション情報、解析詳細情報
• サポートファイルのダウンロード
• Software Version
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Run Summary
Total Bases : フィルタ及びトリムされた後の出力ファイルに出力された塩基数
ISP Loading : ビーズが入ったウェルの割合
Key Signal : Libraryキー配列のシグナルの強さ
---------------AGTCAAGCGTCCCATGAGC
目的配列キー配列
...---
---Primer---TCAGTTCGCAGGGTACTCG
伸長方向
Ion Sphere™ Particle (ISP) Density
ISP
Ion 314™ Chip v2
Ion PI™ Chip
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Total Reads : フィルタ及びトリムされた後のリード数
Loading :ビーズが入ったウェルの割合
Enrichment :テンプレートDNAが増幅したサンプルビーズの割合
Clonal :モノクローナルなISPの割合
Final Library :全てのフィルタをクリアして出力されたリードの割合
Test Fragments :テストフラグメントのキーシグナルを持つISPの割合
Adapter Dimer :25 bp以下のインサート長を持つISPの割合
Low Quality:シグナル精度が低いため除外されたISPの割合
Ion Sphere™ Particle (ISP) Summary
Run Summary
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27
Mean: 平均リード長
Median:中央値リード長
Mode：頻値リード長
Read Length: リード長分布
※数値は全てフィルタ及びトリムされた後のデータに基づく
リード長分布の例
Read Length
Run Summary
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Total Aligned Bases: フィルタ及びトリムされた後のアライメントされた合計塩基数
Reference Coverage:設定したリファレンスに対する冗長度(coverage)
Aligned Bases: アライメントされた塩基数の割合
紫色の領域の高さ =100bpのポジションでアライメントされなかったリードを含むリード数
紺色の領域の高さ = 100bpのポジションでアライメントされたリード数
紫色の領域の面積 : アライメントされなかった塩基数
紺色の領域の面積 : アライメントされた塩基数
Run Summary
Aligned Reads
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Mean Raw Accuracy: リファレンスへのアライメントに基づく精度(%)
グラフ: リードの各ポジションの精度(%)
＜精度が低い場合＞・リファレンスとサンプルの不一致
（設定誤り、変異の多さ等）
・バーコード設定の誤り
バーコード設定を誤った例: 先頭
にバーコードを持つ配列をマッピングしたため、その部分の精度が極端に低く表示される
Run Summary
Raw Accuracy
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BAMファイルは、有償や無償の様々な解析ツールに読み込むことが可能
リファレンスを登録した場合はマッピング後のBAMファイルを出力
登録しなかった場合はマッピング前のBAMファイルを出力
FASTQファイルはプラグイン 「File Exporter」で作成。実行方法は後述（プラグインの項目）。
マッピング後のBAMファイルとBAIファイル
BAMファイルの取得
リファレンスを指定した場合
リファレンスを指定しなかった場合
マッピング情報を含まないBAMファイル
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31
Barcoding information
Output Files欄にバーコード振り分けの情報を表示
マルチプレックス解析（バーコード使用）の場合
クリックで拡大
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トラブルシューティング用ファイル（CSA）
ラン単位のサポート情報
サムネイル解析※のレポートページ 下部の「Support」タブから、Customer Support Archive (CSA)をダウンロード (a)もしくは、Report ActionsからDownload CSAを選択 (b)⇒サーモフィッシャーサイエンティフィックのテクニカルサポートへ送付 ( [email protected] )
※Ion GeneStudio™ S5 series, Ion Proton™の場合： サムネイル解析の画面でのみCSAをダウンロードできます。
（画面左上のReportsより _tn に切り換え）
(a) (b)
①レポート 下部の「Support」タブを選択
②「Download」ボタンをクリック
→zip形式のファイル（CSAファイル）がダウンロードできたら展開せずに弊社テクニカルサポートへ
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33
トラブルシューティング用ファイル（サーバ情報）
サーバ単位のサポート情報
About画面の 下部の「System Support Diagnostics」をクリックし、画面に表示される情報を送付
この部分を
下部まですべてコピーしメールに添付
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35
リファレンス配列、領域ファイルの登録
36
リファレンス配列の登録
Torrent BrowerのReference Sequencesタブから、リファレンス配列の登録が可能
⇒Plan作成でリファレンス配列の選択が可能になり、解析時にマッピングが行われる
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Fastaファイルの主な注意点(1) 染色体別の複数ファイルになっている場合は、
マルチFASTA形式の1ファイルにマージする必要あり
(2) Zipファイルでもアップロード可能（１つのFASTAファイルのみ）
hg19の圧縮例：2.93 GB ⇒ 827 MB
(3) 以下の条件を満たしていること
• A, T, G, C の核酸塩基を表す文字のみ含む（それ以外のIUPACはVariant Caller Pluginが動作せず）
• 各配列の一行の文字数は、 後の1行を除いて同じである
• 空白行を含まない
• ファイル名は半角英数字
リファレンスの登録と注意事項
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Torrent Serverがインターネットに接続されている場合、以下のリファレンスのダウンロード＆自動登録が可能
• Human (hg19)*, GRCh38.p2 Mask1 (TS5.2以降に対応)• Mouse (mm10) *
• Human RNA (hg19 RNA) ← Ion AmpliSeq™ RNA用 (Community Panel)
• hg19 AmpliSeq Transcriptome ERCC v1 • hg19 AmpliSeq Transcriptome v1.1 Ion AmpliSeq™ Transcriptome用
• AmpliSeq Mouse Transcriptome v1• Immune Response (v3.1) ←Oncomine™ Immune Response Research Assay用
• Circular RNA ←Ion AmpliSeq™ Circular RNA Research Panel用
• hg19 Lambda ←Ion AmpliSeq™ Methylation Panel for Cancer Research用
• Human papillomavirus type 16• Mycobacterium tuberculosis• Ebola virus
• Cow (bosTau7)• Chicken (galGal4)• Chinese hamster (crigri1)• Dog (canfam3)• Pig (susScr3)• Sheep (oviAri3)
• AgriSeq CanFam 3.1 (Canine),
リファレンスのダウンロードと自動登録
ダウンロードの進捗
* アノテーションの「gtfファイル」をインポート可能
• Ion AmpliSeq SARS CoV-2• Microbiome health panel
• AgriSeq Felis catus 8.0 (Feline)
• Maize (AGP v3)• Rice (IRGSP 1.0)• Soybean (glyma 1.1)• Tomato (SL 2.40)
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39
• Browser Extensible Data file (.bed)• 解析の領域を指定するために必要
• 染色体上の位置情報を持つ
• UCSC Genome Browserで作成 (http://genome.ucsc.edu/)• Guide for TargetSeq™ Custom Enrichment Kit Orders (PN:4471870)参照
BEDファイルについて
Target Regions BED file Hot Spot Regions BED file
C TReference
ポジション Target ID 遺伝子名 ポジション COSMIC ID* アノテーション
*COSMIC: Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ( https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic )
40
解析の対象にする領域を各リファレンスに対して設定することが可能
下記の２種類のBEDファイルを登録可能
Target Regions: プラグイン等で解析する対象領域を定義
• Ion AmpliSeq™に関しては、下記のAmpliseq DesignerのサイトからBEDファイルをダウンロード可能
• https://www.ampliseq.com/① Thermo Fisher Scientific AccountのIDでログイン② Panelsタブから、既成のパネル情報の表示・取得（Download panel files）が可能
My Designsタブは、カスタムデザイン（Download results）
ターゲット領域の登録
Hotspot Regions: 既知の変異の情報を含むBEDファイルを登録し、シーケンサで検出した変異にアノテーションを付けて出力
パネルZIPファイル
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41
(1) Torrent BrowerのReferencesタブから、”Target Regions”または”Hotspots”を選択し、
Add Target Regionsをクリック
(2) BEDファイルの選択※
(3) 関連付けるReferenceを選択
(4) Upload Target Regions File をクリック
※AmpliSeqではダウンロードしたパネルZIPファイル内のDesigned Bedを利用
ターゲット領域の登録方法
(1)
(2)
(3)
(4)
42
参考： AmpliSeq.comからパネルのPlan Templateを登録
パネルにBEDファイルが組み込まれているため、ターゲット領域の登録が可能
接続されていない場合
(3) 解析対象のパネルを Import ボタンで登録
(4) 歯車マークよりEditを選択し、各種設定を
適化(KitsやPlugins)、Save Templateで保存
適化前
適化後
機種 キット バーコード
(1) 予めAccounts画面でThermo Fisher Scientific のID（AmpliSeq Designerのアカウント）をリンク
• 『Username/Email』と『Password』を入力し、Saveを押す
(2) PlanのTemplates画面でAmpliSeq.com を押し、パネルタイプ(On-Demand/Made-to-Order/Ready-to-Use/Community)を選択
インターネットに接続されている場合
TS5.8～
パネルZIPファイル
Upload ボタンで登録
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43
プラグイン
44
プラグイン
① coverageAnalysis (molecularCoverageAnalysis)カバレッジ解析 (分子タグのカバレッジ解析用)
② variantCaller変異検出
③ RNASeqAnalysis発現解析 (Ion Total RNA-Seq Kit v2用)
④ ampliSeqRNA発現解析 (Ion AmpliSeq™ RNA & Transcriptome Kit用)
⑤ immuneResponseRNA発現解析 (Oncomine™ Immune Response Research Assay用)
⑥ AssemblerSPAdesde novoアセンブラー（<50 Mbp）
⑦ FileExporterFASTQ ファイル作成
ERCC_Analysis発現定量スパイクイン解析
IonReporterUploaderクラウドサービス連携
sampleIDサンプル同定キット用
FilterDuplicates重複リードの除去
PGxAnalysis変異解析(Ion AmpliSeq™ Pharmacogenomics Panel用)
指定した解析を追加実行する機能
解析完了後に実行
• 手動（Select Plugin to Run）
• 自動（プラン作成時に設定）
設定メニューでプラグイン機能の有効/無効、自動選択などの設定（p.70）
インストール済みのプラグイン例
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45
• プラン作成の際、チェックボックス□にチェック✔を入れると、解析完了後に指定したプラグインが自動実行される
• Configureをクリックし条件の指定が必要。設定し、Save Changesで設定を保存すること
プラグインの自動実行設定（プラン作成）
自動実行
FileExporterなど一部のプラグインでは、事前に条件設定が必要 (p.70)
自動実行の注意点
条件設定 (p.52)
46
プラグインの手動実行手順（レポート画面）
(1) レポート画面のPluginsからSelect plugins to runを選択
(2) リストの中から、目的のプラグインを検索し、クリック
v5.12.0.1
v5.12.0.0
v5.12.0.0
v5.12.0.0
v5.12.0.2
v5.12.0.0
v5.12.0.0
v5.12.0.1
v5.12.0.0
v5.12.0.40
v5.12.0.0
v5.12.0.0
v5.12.0.0
v5.12.0.4
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47
プラグイン① Coverage Analysisの概要
Gene A, exon 1 exon 2 exon 3BEDファイルによる領域定義
ゲノム上の特定領域にマップされたリードの数を計測
exon 1 = 11x, exon 2 = 6x, exon 3 = 13x
リファレンス配列
マップされたリード
coverageAnalysis Plugin
平均カバレッジ : 10x
カバレッジ解析
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プラグイン① Coverage Analysis （実行手順）
• カバレッジ(被覆率・冗長度)に関する統計情報やグラフを作成
(1) インストールされているプラグインのリストから、coverageAnalysisをクリック
(2) ライブラリタイプ
(3) ターゲット領域 (bedファイル)
(10)実行
(4) バーコード毎にターゲットを変更する場合にチェック
(6) 同一領域にマッピングされた重複リードを除外
”Mark PCR duplicates”をオンにした結果でのみ有効。Ion AmpliSeq™ Kitの場合は有効にならない。
(5) SampleIDを用いた場合にチェック
カバレッジ解析
(8) マッピングクオリティの 小値
(9) 任意のカバレッジを超えた割合の指定
(7) アライメント長の小値を設定
coverageAnalysis — v5.12.0.0
molecularCoverageAnalysis — v5.12.0.32
* AmpliSeq HDやOncomine cfDNA Assay用
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49
統計情報
リファレンス全体のカバレッジプロットターゲット領域を指定した場合は、横軸はターゲット領域を繋ぎ合わせたもの
カバ
ー塩
基数
(%)
高Depth側からの累積(%)
冗長度(reads)
バーをクリックすると、該当する冗長度(depth)の範囲のデータ量と全体に占める割合(%)を表示
横軸のbinサイズ(冗長度の幅)を変更可能
Depth of Coverage Chart
各種統計情報をダウンロード可能
プラグイン① Coverage Analysis （解析結果の参照） カバレッジ解析
Number of amplicons Median functional molecules per ampliconUniformity of amplicon molecular coverage Amplicons with LOD below 5% Amplicons with LOD below 1% Amplicons with LOD below 0.5% Amplicons with LOD around 0.1% Median number of reads per moleculeMedian molecular loss due to strand bias Median percentage of functional reads
Molecular Coverage Analysis Report
* LOD : Limit of Detection
50
G/C含量やストランドに基づいたカバレッジ情報の例
アンプリコンのG/C含量に対するカバレッジ
冗長度(reads)
Gene Symbolや染色体別に表示可能
アンプリコン長に基づいたカバレッジ情報の例
領域を絞り、IGVで閲覧可
能
アンプリコンの長さに対するカバレッジ
リード数の分布にG/C含量を重層 リード数の分布にアンプリコン長を重層
染色体や領域毎にカバレッジを表示
ストランド毎にカバレッジを表示
プラグイン① Coverage Analysis （各種グラフ） カバレッジ解析
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51
リファレンス配列
マップされたリード
GTGGGGGTGGG
G>T mutation, Frequency 20％ , Gene X exon1, COSM1234xとして検出
検出パラメータ
• クオリティ
• アリル頻度
• ストランドバイアス
① Target Regions BEDChr A : 1000 – 1100 , Gene X, exon1
② Hotspots BEDChromosome A : 1050 , COSM1234x, G>T
プラグイン② Torrent Variant Callerの概要
BEDファイルによるターゲットの指定• 解析領域の定義＆アノテーション付与
Torrent Variant Caller
変異検出
52
ターゲット領域の指定
Hotspot領域の指定
(2) variantCallerのパラメータを設定
ライブラリの種類を指定・Full Genome・Ion AmpliSeq™ Kit
Germ Line1倍体又は2倍体の生殖細胞系の変異を検出
Somatic体細胞変異を想定して頻度の低いものも検出
詳細なパラメータをカスタマイズ可能
プラグイン② Torrent Variant Caller （実行手順）
AmpliSeq Panelパネルを選択することで推奨のターゲット領域、ホットスポット領域、パラメータ設定が自動適用される（TemplatesタブでAmpliSeq.comからパネルが事前にインポートされている場合(p.42) ）
機種を指定
Low Stringency初期パラメータ
Customパラメータの編集
Load external parameter fileパラメータセットの読み込み
プラン作成時に自動実行設定が可能 (p.45)
(1) インストールされているプラグインのリストから、variantCallerをクリック
変異検出
variantCaller — v5.12.0.4
5.12
5.12
5.12
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53
(3) Customを選択し、variantCallerのより詳細なパラメータを設定可能
(4) Submitボタンをクリック（画面左上）
プラグイン② Torrent Variant Caller （実行手順）
MAN0017972_031419_TorrentSuite_5_12_UG.pdf
※同ページ下部にパラメータ詳細へのリンクあり
設定の保存
変異検出
設定名
54
• 各サンプルにおけるサンプル名、その変異検出数を一覧で確認可能
• 主な変異検出結果ファイル(VCF.GZ、VCF.GZ.TBI、XLSなど)がダウンロード可能
• VCFは変異情報ファイル。gVCFは変異情報と変異間のカバレッジ情報を含む
解析結果概略 Run Summary 内の 下部
プラグイン② Torrent Variant Caller （解析結果の参照）
(v5.6.0.4)
AmpliSeq
変異検出
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55
• 解析に使用したBEDファイルや設定したパラメータを記述したファイルをダウンロード可能
• マッピング結果のBAMファイルや変異検出結果のVCFファイルをダウンロード可能
• TS3.6バージョンでの結果確認が可能
ファイルのダウンロード用リンク
IGVを利用したマッピング状況の確認
各サンプルにおける解析結果 画面上段
TS3.6バージョンでの結果確認
詳細情報へのリンク
プラグイン② Torrent Variant Caller （解析結果の参照）
tvc 5.12-11 (35c9114)
Documentation
変異検出
56
• 各変異の位置や塩基の種類、その割合などの基本情報を確認可能
• BEDファイルで定義したアノテーション情報、統計情報、クオリティ情報の詳細も確認可能
• ポジション情報のクリックでIGVによる該当箇所のマッピング結果閲覧可能
プラグイン② Torrent Variant Caller （解析結果の参照）
各サンプルにおける解析結果 画面下段
表の絞り込み
選択した変異を出力
クリックでIGVを起動
変異検出
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SNP検出箇所(vcfファイルから)
遺伝子情報(IGVに予め登録されているリファレンスの場合)
マウスでポイントすると、情報を表示
アライメント(bamファイルから)
IGVを利用したマッピング状況の確認
詳細はAppendix参照
プラグイン② Integrative Genomics Viewer （解析結果の参照）
変異検出
58
Sanger Sequencing Primer pairs の配列情報の検索方法
① 当社のウェブサイト（www.thermofisher.com）でプライマーセットの検索を実施 （Gene IDやCOSMの数値等を入力しても可）
③カートをクリック
④カートに入れたプライマーをクリック④ カートに入れたプライマーを
クリック
② をクリックし、
カートに入れる
⑤ 検索したIDのPrimer配列情報が表示されます(通常のPrimer、およびM13 Tailed Primer)
• カートに入れたプライマーは直接オーダーできます（米国製造）お急ぎの場合は、配列情報をもとに国内合成をお勧めします
• http://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/oligonucleotides-primers-probes-genes/custom-dna-oligos.html
• 「カートに入れる」操作でプライマーの配列情報の確認を行うことができます
サンガーシーケンス用低頻度変異検出ソフトウェア
Minor Variant Finder （MVF） 108ページ参照
⑥ Primer IDはサーモフィッシャーコネクトでリファレンス作成に利用できます
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59
• 参照配列（リファレンス）にマッピング
• 転写単位ごとにマップされたリード数を算出
• FPKM値の計算
プラグイン③ RNASeqAnalysisの概要
ReferenceGene A Gene B Gene C Gene D
FPKMの算出
FPKM正規化Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped reads
各発現領域にマップされたリード数マップされたリード総数 (millions) × 発現領域長 (Kbp)
RNA-Seq
60
• cDNAのリードをアライメントし、発現遺伝子を検出・解析
• リファレンス： hg19 または mm10• マッピング： STAR （ジャンクションアライメント） ⇒ bowtie2• アライメント解析： HTSeq, Picard tools（リードカウント集計）、cufflinks（IsoformのFPKM算出）
プラグイン③ RNASeqAnalysis （実行手順）
(1)事前にThermo Fisher Connectよりプラグインをインストールし、RNA SeqAnalysisをクリック
RNA-Seq
(3)実行
(2) リファレンスゲノム (hg19 またはmm10)
プラン作成時に自動実行設定が可能 (p.45)
(4)結果の確認 （バーコード間の比較）
RNA SeqAnalysis — v5.6.0.0
RNA SeqAnalysis.html
https://apps.thermofisher.com/apps/spa/#/publiclib/plugins
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61
プラグイン③ RNASeqAnalysis （解析結果の比較）
リードの分布情報遺伝子発現プロファイルの相関
バーコード間の相関図とヒートマップ
遺伝子のリード数、正規化された値
サンプル間で発現変動の顕著な250遺伝子を図示
RNA-Seq
Correlation Heatmap
Correlation Plot
Gene Heatmap Isoform Heatmap.isoheatmap.png.genebc.hm.png
.corpairs.png
.corbc.hm.png
各統計情報のダウンロードBarcode Summary Report Absolute reads table Absolute normalized reads table Aligned reads distribution table Isoform FPKM values table
3’5’
遺伝子数
Isoform数
002001
001
002
Distribution Plots
RNA SeqAnalysis.html
62
各統計情報のダウンロードStatistics Summary Gene Read Counts Output Files (page) Cufflinks Output Files (page)
• サンプルの統計情報
プラグイン③ RNASeqAnalysis （解析結果の参照） RNA-Seq
リファレンスに対してマップされたリード数検出した遺伝子数およびIsoform数などの統計値
正規化された遺伝子上のカバレッジ分布
発現しているIsoform数（25以下）
マップされた領域
3’5’
UTRIntron
Coding
遺伝子間
リボソーム
詳細資料：IonTorrentではじめるRNA-seq解析 ⇒
IonXpressRNA_001
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63
• 参照配列（リファレンス）にマッピング
• 各ターゲット遺伝子に対してマップされたリードの数を算出
• RPM値を計算
RPM正規化
Reads Per Million mapped reads特定のターゲットにマップされたリードの数
全ターゲットのマップされたリードの総数 (millions)
プラグイン④ AmpliSeq RNAの概要
ReferenceGene A Gene B Gene C Gene D
Mapped Reads
RPMの算出
Ion AmpliSeq™ RNA& Transcriptome
64
• 検出された遺伝子の発現量を算出し、正規化（RPM：Reads per million mapped reads）
プラグイン④ AmpliSeq RNA （実行手順）
(1)インストールされているプラグインのリストから、 ampliSeqRNAをクリック
(2) ライブラリタイプ(Ion AmpliSeq RNA)
(3) ターゲット領域 (bedファイル※)
(6)実行
(4) 不使用のバーコードをフィルターする場合にチェック
(5) ライブラリ作製時にERCCを添加した場合にチェック
※ bedファイルはImport References (p.38)またはAmpliSeq Designer (p.42)から登録可能
プラン作成時に自動実行設定が可能 (p.45)
Ion AmpliSeq™ RNA& Transcriptome
Planで設定したリファレンスIon AmpliSeq RNAではhg19_rna(Homo sapiens RNA Canonical Transcript)
ampliSeqRNA — v5.12.0.0
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65
プラグイン④ AmpliSeq RNA （解析結果の参照）
統計情報
リファレンスに対してマップされたリード数ターゲット領域（遺伝子）を検出した有効なリードの割合
各サンプルの発現量プロットと相関分析（r： 相関係数）
Log2 RPM pair correlation plots
リード数毎の統計値（<10-100-1K-10K-100K+）
サンプル間の発現変動値Log2(Experiment/Control)を算出
Ion AmpliSeq™ RNA& Transcriptome
各種統計情報をダウンロード可能遺伝子のアノテーション情報、リード数、正規化された値
AffyTAC用のCHPファイル
66
プラグイン⑤ immuneResponseRNAの概要
• Oncomine™ Immune Response Research Assayデータ解析概要
• 参照配列（ImmuneResponse_v3.1）にマッピング
• immuneResponseRNA plugin*により遺伝子発現レベルを算出 *TS5.2.1以降対応
• プラグインの出力データをAffymetrix™ Transcriptome Analysis Console (TAC) 4.0 softwareにより解析
統計解析
• PCA、ヒートマップ、遺伝子発現分布プロット
• サンプル相関プロット
• fold-changeの推測
• ボルケーノプロット解析
USER GUIDE: MAN0015867
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67
• 得られたリードをde novoアセンブルし、新たなゲノム配列を構築（<50 Mbp）
プラグイン⑥ Assembler SPAdes （実行手順および解析結果の参照）
(2)実行
リードの使用量などを変更可能
(3)結果の確認
コンティグやレポートをダウンロード可能
各種統計情報
N50： アセンブル評価の指標。長い配列が多いと大きくなる
(1)インストールされているプラグインのリストから、AssemblerSPAdesをクリック
AssemblerSPAdes — v5.12.0.0
68
プラグイン⑥ Assembler SPAdes （統計情報の詳細）
QUAST report生成されたコンティグ数や長さ(bp)コンティグを長い順に繋げた際、ゲノム全長や半分、3/4に達した数とその長さ
Plots: Cumulative Length コンティグ数と合計塩基長
スペードの詳細 http://bioinf.spbau.ru/spades
Plots: Nx 各コンティグの比率とその長さ
L50
L75
14 28 104
N75N50
326 kb
96 kb
56 kb
Total Length
Largest Contig
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69
• Fastqファイルの作成
プラグイン⑦ FileExporter （実行手順）
(1) FileExporter をクリック (2) 出力ファイルや名前を設定
(3) 完了するとレポート画面からfastqファイルをダウンロードできます。
✔
Pluginsタブで初期
設定や自動実行設定が可能 (p.70)
*1バーコードでシーケンスし、Fastqファイルを作成する場合はお問い合わせください(RNA_Barcode_Noneなど)
自動実行させず、Variant Callerの完了確認後に実行
FileExporter — v5.12.0.0
BAM, BAI, VCF, XLSなどの出力にも利用可能
ファイルの命名によりデータ管理が容易
＊Archiveに☑した場合、ひとまとめの圧縮ファイルを作成：
Custom Nameを入力し、選択すると、Compressed FilesでダウンロードされるZIPファイルに固有名がつけられる
＊
＊
＊
＊
70
• Selected by Default のチェックボックス□にチェック✔を入れると、Plan作成時に選択された状態になる ⇒ ラン終了後に指定したプラグインが自動実行される
プラグインの自動選択の設定
有効 / 無効 自動選択
右上の歯車アイコンからPluginsを選択
一部のプラグインでは、自動実行の設定が予め必要
IonReporterUploader (p.105)、FileExporter (p.69) など
Configureで条件設定
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71
ランデータの編集・管理
72
• 再解析
• 解析条件を変更し、新たな解析データを作成（リファレンス、バーコード、詳細パラメータなど）
• データ統合
• 複数ランにまたがる同一サンプルのシーケンスデータを統合（BAMファイルを作成）
• 統計情報の比較
• 同一プロジェクト内のランサマリーに関する統計情報を比較（塩基数、リード数、リード長など）
• サーバの空き容量確認、アーカイブ
• 十分なスペースがない場合、データのアーカイブが必要
• サーバアップデート
ランデータの編集・管理
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73
バーコード設定やサンプル名を変更する場合
• Report ActionsからEdit Run Planを選択
• Planの内容を変更
• 画面右下のUpdate Run & Reanalyzeをクリック
B) List View
A) Table View
再解析： 3つのReanalyzeボタンA) DataタブのTable View画面から歯車ボタンB) DataタブのList View画面C) ランのレポート画面
C) レポート画面
再解析：Torrent Suiteからの再解析
74
(1). Report Nameを入力
(2). フル解析を実施する場合、Thumbnail onlyにチェックを入れない
(3). 再解析に用いるファイルタイプを選択Signal Processing : DATファイルから
Base Calling : Wellsファイルから
(4). 画面左のタブから解析オプションを選択
(5). 設定が完了したらStart Analysisをクリック
(4) Analysis OptionsBase Calibration設定の変更など
再解析と設定の変更
References & Barcoding
Plugins再解析後に自動実行するプラグインを選択
Analysis Parametersについては、Torrent Suite Software Documentation参照https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017972_031419_TorrentSuite_5_12_UG.pdf
(2)外す（Ion PGM™は不問）
(5)
(1)
(4)
(3)
リファレンスやバーコード情報の変更は事前にEdit Run Planで編集後に再解析
5.12
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75
複数のランのデータを纏めたBAMファイルを作成可能※ サンプル名およびバーコード番号は同一であること
【Project の新規作成】
(1) Torrent SuiteのDataタブをクリックし、“Projects”を選択
(2) 画面右上にある"Create a New Project"をクリック
(3) プロジェクトの名前を入力してSaveをクリック
【Project に登録】
(4) 画面上部の"Completed Runs & Results"をクリックして、解析結果のリストの画面に切り替え
データ統合： Project(1)
(2)
(3)
(4)
(1)
76
(5) “List View”において、マージしたい解析結果の右端にある歯車アイコンをクリックし、リストの中から“Add Report to Project”を選択し、(3)で作成したプロジェクトをチェック
【マージの実行】
(6) 画面上部の“Projects”をクリックしてProjects画面へ
作成したプロジェクトの名前をクリック
(7) マージしたいデータにチェックを入れ、画面下部にある"Combine Alignments"を選択
(8) 名前を付けて"Launch"ボタンをクリック
⇒複数のデータにまたがる解析を開始
データ統合： Project(2)
✓
(5)
(7)
Merge 【マージ】複数のファイルやデータを決められたルールに従って一つに統合すること
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77
• 複数のラン間における統計情報を比較
1. DataタブのProjects画面で比較したいProjects名をクリック（同一プロジェクト内で比較）
2. 画面の一番下にあるCompare Allをクリックし、表示
3. 必要に応じて、Customizeボタンで表示内容を取捨選択
4. ダウンロードボタンでPDFファイルやCSVファイルを入手可能（全統計情報）
ラン統計情報の比較
78
• 充分な空き容量が確保されていることを確認
1. Dataタブ ⇒ Data Management を選択
2. Disk Usageの図を確認
• Free(青)が空きスペース
• １ラン分の容量は p.6～9 参照
• スペースを空ける操作は p.80~83 参照
サーバの空き容量確認： Data Management
ディスク使用容量を表示
レポート画面のReport Actionsから選択した場合はp.82へ
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79
Data Management画面：データ管理
ディスク使用容量を表示
データのインポート
アーカイブの実行状況（自動・手動）
手動アーカイブの実施
自動アーカイブ機能の設定
各種ファイルの管理統計情報
80
トレントサーバ上のデータをアーカイブ/削除する機能
Servicesタブにて設定を実施
主な注意点；
・アーカイブ用ディスク(USBドライブやNAS: Network Attached Storage)が別途必要
※アーカイブ機能は、サーバハードウェアトラブルに対するデータの二重化ではないので注意
データの二重化については、必要に応じて対策を実施する必要あり
自動アーカイブ機能の概要
自動実行する場合 [✔]設定
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81
●アーカイブの設定DataタブのData Management画面のconfigureにて設定を実施
(1) アーカイブ用ディスク（USB HDD等）をTorrent Serverに接続(2) 自動認識されると、上記のArchive directoryのプルダウンメニューに新しいディレクトリが追加される。
認識されない場合は下記のコマンドラインにてマウントを実行。sudo mkdir /media/usbdisksudo mount /dev/sdc1 /media/usbdisk
※/dev/sdb1は、ディスクを接続した際に/dev/以下に現れたパーティションの例
データの種類毎に設定 Archive/Delete/Disable
自動実行までの日数
ディスク使用量がこの値を超えたら即時実行
アーカイブ先
自動実行するにはEnableを[✔] （前頁参照）
自動アーカイブ機能 設定について
＜詳細資料＞
82
手動アーカイブの実施
＜詳細資料＞
②
①
①該当のランにチェックを入れる
（複数ランをまとめてアーカイブする場合は、複数チェック）
②Process Selectedをクリック
③データ種別を選択
④実施項目を選択
※サーバ内の各データ種別ごとに
Delete （削除）、
Archive （移動）、
Export （二重化）
が可能
④
【データ種別】 ・ Signal Processing Inputアナログ情報。
・ Basecalling Inputアナログ情報を加工したシグナルデータ。シグナル強度から塩基とクオリティの配列を作成可能。Torrent ServerのGUIでリファレンスを変更して再解析する際に必要。
・ Output FilesBamファイルやPluginの実行結果、レポートPDFファイルなど。
・ Intermediate FilesOutputを作成するための中間ファイル。
③
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83
• データアーカイブに関する詳細情報：
データ管理（アーカイブ・インポート）方法Torrent Suite のデータ管理（アーカイブ、インポートなど）に関する資料です。
以下のような場合にご利用ください。• トレントサーバのディスク容量がいっぱいで、データを他の媒体に移したい （アーカイブ）• トレントサーバのデータを外付けハードディスクにコピーしたい （エクスポート）• アーカイブしたデータをトレントサーバに戻したい （インポート）
内容：1. 外付けハードディスクの前準備（フォーマット、マウントなど）2. Torrent Suiteのデータ管理機能の操作方法
注意：Torrent Suiteのデータ管理機能を使用する場合のハードディスクについて(1) フォーマット: ext3又はext4形式でフォーマットされている必要があります。市販のUSB
ハードディスクの多くはNTFSやvfatでフォーマットされているため、フォーマットし直します。(2) 2TBを超えるハードディスクは、パーティションの再作成を必要とする場合があります。(3) 再解析を実施するために必要なファイル（生データ）の種類が、Ion PGM と Ion Proton /
Ion GeneStudio S5 seriesでは異なります。
詳細な説明や手順は資料をご覧ください。Ion GeneStudio™ S5, Ion GeneStudio™ S5 Plusの場合はNASやDataSafeをご利用ください。
データのバックアップについて具体的に知りたい場合
84
NAS (Network Attached Storage)データ管理にNASを使用できます
Torrent Server は Archive 先として NFS (Network File System) サーバーを利用可能ですNAS を NFS サーバーとしてセットアップすることでデータのアーカイブが可能になります
Ion GeneStudio™ S5、および Ion GeneStudio™ S5 Plus のデータ管理には NAS が必要です。（ハードディスクを USB 接続できません）
【重要】 S5 および S5 Plus の中には仮想マシンが入っており、その中で Torrent Server が動作しています。IP アドレスを持っているため、ネットワーク経由ではアクセスは可能です。ただし、物理的に USB 装置を接続することができないため、USB-HDD へのデータアーカイブができません。
Ion GeneStudio™ S5Ion GeneStudio™ S5 Plus
NAS要件 Torrent Server のデータ管理機能を用いる場合：
• NFS でマウントできることが必須です。市販のエントリーモデルのNASには、Torrent Server (Linux)から認識できないものがあります。
NAS(NFSサーバー)
LANケーブル
ルーターやハブなど
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85
DataSafe Solutions
• データを保管するための拡張可能なネットワークストレージ(NAS)大容量ストレージ（JCS）
特徴
CPUを持ったLinuxサーバーなので簡単な処理も可能。コンソール、UPS付き。
再解析用のデータもまとめて保管。Ion AmpliSeq Exome 等の結果から原因変異同定などの用途に、また、基礎研究でさまざまなデータを多角的に解析するユーザー様向け。
汎用Linuxサーバー
プロセッサ Intel™ Xeon™ Processor 2.5 GHz 10 Core x 2
メモリ 128 GB
ストレージ SATA 120 TB 7200 rpm (データ用100 TB)
データ保管容量 *1 Ion 540™ チップの場合：BAMファイル 約2,000run分、全データの場合は約200run分）
OS Cent OS
製品番号 A30038JP
価格 ¥4,800,000
*1 格納できるデータ量は解析の内容やリード長によって変動いたします。2019年5月現在の仕様であり、予告なしに変更する場合がありますので、予めご了承ください。
詳細は www.thermofisher.com/datasafe をご覧ください。
86
DataSafe Solutions Mini Storage
• データを保管するためのネットワークストレージ(NAS)をお客さまの環境に合わせて設定
• 信頼性の高いディスクベースのストレージ
• 冗長性を備えたディスク構成
大切なデータを保管するための
ネットワークストレージをお手軽に
DataSafe SolutionsMini Storage
Ion GeneStudio™ S5シリーズ
※ ディスク容量は概算です。フォーマット等により若⼲前後します。保存できるラン数は、Ion 540™ Chipを使った場合の目安です。アプリケーションやチップの種類によって変動します。
ReadyNAS 526X
D288 × W192 × H259 mm
¥430,000
¥610,000
希望小売価格
ReadyNAS 628X
7.97 kg
10GBASE-T ×2
9.38 kgD288.55 × W192 × H319 mm
10GBASE-T ×2 , 1000BASE-T ×2
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87
Torrent Serverのセキュリティ確保について
Torrent ServerのOSはLinux(Ubuntu)です。Windows PCと違い、セキュリティ対策として重要なのは、ウィルス対策ではなく、外部からのクラッキング対策です。• ウィルスに汚染された事例はございませんが、クラッキングにより違法なソフトウェアを外部から仕込まれるという事例
が日本国内でも報告されています。クラッキングされた場合、データ消失のみならず再インストールのためのダウンタイムや費用が生じます。
Torrent Server
internet
施設のルータまたは設置部門のルーターでアクセス制限
Ion PGM
ネットワークのセキュリティ確保方法
ソフトウェア更新等の内部から外部への必要な通信は許可
外部からのアクセスは拒否
Ion Proton
• グローバルIPアドレスは用いない。• 施設が管理するセキュアな環境にTorrent Serverを設置する。（ただしポリシーが厳しい場合、弊社からのリモート保守が出来なく
なる場合があります）• Internetに直接設置する場合はルーターまたはファイアーウォールを上位に設置 （※有償でルーター設定サービスを弊社にて
提供可能です）• どうしてもinternetからアクセスしたい場合は、ルーターでアクセス元をIPアドレス等で制限し、Torrent Serverのパスワードをデフォ
ルトから変更する。（お問い合わせください）
88
Page 45
89
③Ion OneTouch™ 2のアップデート
②サーバのアップデート
4. Admin Interfaceをクリック3. 歯車からConfigureタブをクリック
5. 以下の順でアップデート
トレントサーバの新バージョンリリース時には、装置類のアップデータもリリース
⇒Release Notesを確認し、サーバアップデート後は必ずシーケンサ本体とテンプレート調製装置もアップデートを実施
①ネットワーク確認*（p.115参照）* S5 / S5 Plus では確認不要
1. Torrent Suiteにユーザーネーム、
パスワードともに「ionadmin」でログイン
2. ServicesタブでActive Jobがないことを確認
（p.116参照）
ソフトウェアアップデート方法 重要：サーバと装置を共にアップデート
アップデートの流れ
Ion PGM™ / Ion Proton™
Ion GeneStudio™ S5 seriesIon Chef™Ion OneTouch™ 2
ソフトウェアアップデート
Torrent Suite
再起動
ファームウェアアップデート
Ion OneTouch™ 2のアップデート： サーバとIon OneTouch™ 2間をLANケーブルで接続（Ion GeneStudio™ S5, Ion GeneStudio™ S5 Plus : 装置本体LANポート、 その他のIon Torrent System： 付属トレントサーバ）
サーバ、装置
90
• Update Serverをクリック
アップデートの実行
アップデータが利用可能な場合
アップデートの実行
（環境によっては数時間かかる場合もあります。中断しないで下さい）
アップデート中 InstallingYour system is now upgrading, please wait a few minutes.
プロキシサーバを使用しているネットワーク環境下で、Torrent Suiteを用いたバージョンアップの手順がうまく行かない場合は、 [email protected] まで お問い合わせ下さい。
完了
Torrent Suite Softwareのリリースノート（MAN0017974）を確認し、全てバージョンが一致していることをチェックします
https://www.thermofisher.com/torrent-suite-software-docs.html
Upgrade completed successfully !
End User License Agreement を確認し、Agree and Update nowをクリック
アップデート完了
アップデータの有無を確認
Page 46
91
1. 本体のOptionボタンをタッチ
2. Updatesボタンをタッチ
3. Checkをタッチし、アップデートのリストを確認全てのチェックボックスをオンにして、Updateをタッチ
4. インストール完了後、Option画面からバージョンを確認
再度、Checkをタッチし、未適応のアップデートが残っていないことを確認
5. 装置本体とサーバの両方を必ず再起動（p.93, p.114参照）
※画面は Ion Proton™ Systemですが、Ion PGM™ Systemも同様の操作です。
Ion Proton / Ion PGM 本体のファームウェアアップデート方法
92
1. 本体のSettingsボタンをタッチ
2. Check for Updatesボタンをタッチ
3. Releasedをタッチし、アップデートのリストを確認全ての項目を選択し、Updateをタッチ
4. インストール完了後、Settings画面のInstrument Settingsを選び、Aboutでバージョンを確認
再度、Checkをタッチし、未適応のアップデートが残っていないことを確認します
5. 装置本体を再起動
Ion GeneStudio™ S5 Primeではサーバを必ず再起動してください（p.93, p.114参照）Ion GeneStudio™ S5, Ion GeneStudio™ S5 Plusは装置本体の再起動でサーバも再起動されます。電源が切れない場合は、一旦、電源を長押ししてオフにし、再度オンにしてください。
※Ion Chef™ではインストール完了画面を確認後、手動で電源を落とします。また、アップデート適応後もリストが消えません。
Ion GeneStudio S5 series / Ion Chef 本体のファームウェアアップデート方法
Ion GeneStudio S5
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93
各種プログラムのアップデート
• 装置使用前にアップデータの有無を確認（パッチなど随時リリース）
シーケンサおよびIon Chefは、必ずトレントサーバとバージョンを揃えること※ご不明の際は、Release Notesをご一読いただき、テクニカルサポートまでお問い合わせください（0120-477-392）
プログラムのアップデートトレントサーバのバージョン確認
94
通常、Torrent ServerのシャットダウンにはTorrent Suiteを使用
Management Actionsの Shutdown Server をクリック
メッセージを確認してOKをクリック※サーバの電源が切れるまで5分ほど要します
シャットダウン前に、SERVICESタブでActive Jobがない（解析実行中でない）ことを確認
サーバのシャットダウン**Ion GeneStudio™ S5, Ion GeneStudio™ S5 Plusでは本体のシャットダウンでサーバを落とします
トレントサーバのアップデート後は、再起動が必須
Configureタブで画面下部の Admin Interface をクリック
Page 48
95
Ion Reporterによる変異の絞り込み
96
VARIANTS and ANNOTATIONS
• ハードウエアの維持管理が不要
• ソフトウエアは自動的にバージョンアップ
• どこからでもアクセス可能
→遠方の共同研究者と簡単にデータ共有
• データは安全に統合的に管理
• ヒトおよび16S rRNAの変異解析に対応
Ion Reporter -Ion Torrentデータ解析クラウドサービス-
Page 49
97
• ボタン操作で簡単に情報解析ができ、どの研究室でも次世代シーケンサを活用
Ion Reporter ローカルサーバシステム
• ハードウエア /ソフトウエア一体で提供• データを施設内に留め管理• 迅速なデータ移行• ユーザー数や解析数の制限はありません• Ion Torrent System 4台までサポート• HIPAA(個人情報保護に関する規定)準拠
• ハードウエアスペック• 128 GB RAM• ～15 TB of usable storage• Ubuntu™ 14.04 LTS operating system
98
• 配列データを施設外に出せない• 費用が固定されている方が良い• 施設のインターネット回線が遅い• 解析パイプラインをカスタマイズしたい• HIPAA (個人情報保護に関する規定)準拠
• ラン頻度が低い• 使う分だけ費用負担する方が良い• 共同研究先とデータをシェアしたい• 固定資産に支出できない• 1 テラバイトまで無償
Ion Reporter™ ローカルサーバシステム Ion Reporter™ クラウド
ローカルサーバとクラウドの使い分け
Page 50
99
単一サンプルの解析– リファレンス配列との相違
ペアサンプル解析
– 二つのサンプル間の変異箇所の差異と共通性
癌の体細胞変異ペアサンプル解析
– 正常細胞と共通する変異を除外して、癌細胞特異的な変異を抽出
遺伝性疾患のトリオ解析– 家族内の変異解析
ヒトのサンプルを対象に、1サンプルから3サンプルの解析を簡単に実施可能
配列データアップロード
Hg19にマッピング 変異検出
データ管理と共有アノテーション絞り込み
Torrent Serverと同じアルゴリズム
Ion Reporterが対象にする解析
CNV （Copy Number Variation） 解析– 単一/ペアサンプルのCNVを検出
融合遺伝子解析– 癌細胞特異的な融合遺伝子を検出可能
免疫レパートリー解析– T細胞受容体 (TCR) βの多様性解析
16S rRNAメタゲノム解析– 細菌の属/種レベルでの分類
100
変異の一覧や、フィルタリング設定、絞り込みの結果のダウンロードなどが可能
全検出結果、絞り込み結果の出力
絞り込んだ変異の一覧
グループ分けされたアノテーション
様々なフィルタリング
結果の参照と絞り込み
Ion Reporter 5.10
Page 51
101
アミノ酸コードへの影響
位置
遺伝子名Gene OntologyCOSMIC
OMIM
様々な条件で変異の評価と絞り込み
102
Ion AmpliSeq™のペアサンプル解析結果から、CNVを絞り込むことが可能
IGVによる参照が可能
染色体上の位置を表示
Karyotypeを表示
Locusをクリック
CNV（Copy Number Variation）の解析
Page 52
103
16Sメタゲノム解析機能
• 16Sメタゲノム解析のための主要なリファレンスデータセット(MicroSEQ™ ID,GreenGenes)を活用
• リファレンスデータへのマッピング
• 分類法の各階層における割合の表示(class,order,familyなど)
• Kronaによるパイチャート作成機能
104
Ion Reporter™に関する詳細情報： www.thermofisher.com上で公開https://www.thermofisher.com/ion-reporter-software-docs.html
Ion Reporterについてもっと知りたい場合
関連情報：
Page 53
105
• Ion Reporter Uploader account configuration• 事前に作成したアカウント情報を登録
Ion Reporterのデータアップロード設定
Ion Reporter用のアカウントを作成（https://ionreporter.thermofisher.com/ir/）
Display Nameデータ転送時に選択する設定の名称
1. アカウントをアクティブにする
2. 歯車マークからIon Reporter Configure
3. Add AccountからIon Reporter Cloud
4. 必要事項入力
5. Get Versionsをクリック
6. Ion Reporter 5.xを選択
7. Addをクリックし、完了トレントサーバアップデート時は再作成すること
再作成時は、Plan Templateも編集すること
(1)
(4)
(5)
事前設定
(6)(7)
必ずTorrent Serverと同一バージョンを選択
例： TS 5.12 ⇔ Ion Reporter 5.12TS 5.10 ⇔ Ion Reporter 5.10TS 5.6, 5.8 ⇔ Ion Reporter 5.6TS 5.4 ⇔ Ion Reporter 5.4TS 5.2.2 ⇔ Ion Reporter 5.2
(3) (2)
106
または
(1)Plugin のSelect Plugins To Runボタンをクリック
(2) IonReporterUploaderをクリック
Torrent SuiteからのUpload
(1)トレントスイートレポート画面のUpload to IRボタンをクリックし、Display Nameを選択
(3)ファイルの種類やサンプルを選択し、Display Nameを確認して「Launch IRU」をクリック
(Version: 5.10 | User: Ion User | Org: IR Org)
Barcode Sample Settings +
(2)アップロードするファイルのボタンをクリック
IonReporterUploader — v5.12.0.40
Page 54
107
有償解析ソフトのご案内
108
Minor Variant Finder（MVF）ソフトウェア 概要
【特徴】• レア変異が検出できる• これまでのシーケンスのプロトコール変更なし（特殊な試薬などはいりません）• 次世代シーケンサより得られた変異データ(VCF file)をソフトウェアへインポートし、
比較やアノテーション付けが可能
キャピラリシーケンサのデータから、レアな変異（5%まで）を検出できるソフトウェア
バックグラウンドノイズに埋もれて判別できなかったレア変異。
ノイズを区別して排除。レア変異を検出できるようになります。
従来のデータ表示
MVFソフトウェア
検出感度
25%程度
5%程度
見やすいレポート
NGSの変異データとの比較青：NGS変異データ
赤：シーケンサ変異データ
【原理・方法】• 生じるバックグラウンドノイズはランごとにほぼ一定• コントロールサンプルでノイズを判別し、テストサンプルより差し引く• 解析にはフォワード、リバース両方のプライマーを用いたデータが必要
解析には 低４サンプル必要コントロール(野生型)のフォワード、リバースとサンプルのフォワード、リバース
CF
CR
1F
1R
一緒にラン
シーケンスデータを解析
トライアルバージョンウェブより配布中
Page 55
109ご紹介するソフトウエアはいずれも急速に機能を拡充していますので、今後の 新の情報は各ベンダーにご確認ください。
3rdParty ソフトウェアの利用例
◎幅広いアプリケーションに対応
• CLC Genomics Workbench• NextGENe
◎発現＆ChIP解析機能が充実
• Partek™ Genomics Suite™
• Strand NGS• GeneSpring
◎メタゲノム解析向け
• Metagenome@KIN• Metatranscriptome@KIN
110
補足資料： 解析系
Page 56
111
• TS• hg19• SNV• CNV• WES• WGS• AQ• MRL• BAM• uBAM• FASTQ• VCF• MAPD• LOD• GUI
解析系 略語集
Torrent Suite™ Software (Torrent Server搭載ソフトウェア) UCSC human genome 19 (ヒト標準リファレンス配列) Single Nucleotide Variants (一塩基変異) Copy Number Variations (コピー数変異) Whole Exome Sequencing (全エクソームシーケンシング) Whole Genome Sequencing (全ゲノムシーケンシング) Alignment Quality (位置合わせをしたクオリティ) Mean Read Length (平均読み取り鎖長) Binary Aligned / Mapped file (位置情報を含む塩基配列) Binary file with unaligned / unmapped reads 各リードにクオリティスコアを持ったシーケンスリードのリスト
Variant Calling Format file (バリアントを記述したファイル) Median Absolute Pairwise Difference (領域間の変動) Limit of Detection (検出限界) Graphical User Interface (操作画面)
112
• puTTyのダウンロード：http://www.chiark.greenend.org.uk/~sgtatham/putty/latest.html
① PuTTyを起動② Category(カテゴリ)の欄の中からSession(セッション)を選択③ Host Name(ホスト名)の欄に下図のようにTorrent ServerのIPアドレスを設定し、Connection type (接続タイプ)
からSSHを選択④ Saved Sessions(セッション一覧)の欄にこの設定の名称を入力し、Save(保存)をクリック※名称は任意（下の例
では“Torrent Server”）⑤ Open(接続)をクリック
PuTTyを用いたTorrent Serverへの接続(1)
① ②
③
④
⑤
Page 57
113
⑥初めて接続する場合はWarningが表示されることがある⇒OK(はい)をクリック
⑦ユーザ名: ionadmin、 パスワード: ionadmin （入力中表示されない）を入力してログイン
PuTTyを用いたTorrent Serverへの接続(2)
114
起動
電源ケーブル、ネットワークケーブルを接続し、カバー内側の起動ボタンを押す
停止
(1) 直接接続したディスプレイとキーボードか、又はネットワーク上の他の端末のsshクライアント(PuTTyなど)を使用してログイン
login as: ionadminpassword: ionadmin
(2) 下記のコマンドを実⾏
sudo shutdown –h now
(3) 電源ボタンのLEDが消えることを確認
起動ボタン
Torrent Server管理者メモ
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Management ActionsのView Network Settingsをクリック
Torrent Suiteからネットワーク設定の変更
IPアドレスを変更してUpdateをクリックすると、今までのアドレスではブラウザにアクセス不可能。変更後のアドレスで改めてNetwork Settings画面を表示し、変更が反映されていることを確認する必要あり。
Torrent Server管理者メモ
歯車タブからConfigureタブを選択し、画面下部のAdmin Interfaceをクリック
116
解析中データの有無を表示（プラグインは表示されない）
• バックグラウンドで稼働している常駐プログラムや実行中のジョブの管理
Servicesタブ：プログラムの管理
強制終了
Statusに問題
がある場合はサーバ再起動
シーケンサからトレントサーバへデータを移すプロセスに関する情報
トレントサーバのRAID情報
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Incorporation for 1 Flow (DAT)
Incorporation over many flows (DAT)
Raw signals per flow (WELLS)
0.1 1.2 0.3 2.1 0.1 0.2 2.1 3.1 0.00.2 2.1 3.1 0.0 0.1 1.2 0.3 2.1 0.0 0.0 0.0 3.2 1.4 0.1 1.3 1.0 0.2 0.1
BAM
Base Calling
FASTQ
VCF
GATTGACCTCTTTTCGGTTAACGAAGAAGTCGGTTCATC
Unmapped BAM file with processedincorporation signals
69,0,101,0,0,89,0,100,10,64,103,0,201,220,5,4,90,0,0,203,0,100,99,116,114,0,0,19,203,1,9,0,97,0,114,0,0,118
Signal Processing
Torrent Suite Data Analysis Flow
118
すべてのウェル
1,262 ,519
Live ISPs1,020,656
Lib ISPs 1,009,803
TF ISPs10,853
Too weak signal
EmptyWells with ISPs
1,100,543
(Keyの配列で判別)(TCAG) (ATCG)
Lib reads 659,412
Adaptor dimer Low qualityPolyclonal
トリミング：アダプター配列とそれ以降を切り取りクオリティーの低い部分を切り取り
フィルタリング：アダプターダイマーポリクローナルビーズ
(Keyの強度で判別)
Ion Sphere Particle (ISP) Identification Summary
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代表的なゲノムビューア
IGVに予めリファレンスが登録されている生物種は下記のwebサイトで確認可能
http://software.broadinstitute.org/software/igv/genomes
※リストにあるリファレンスを使用する場合は、上記サイトにリンクされているデータベースからfastaファイルを
ダウンロードし、Torrent Serverに登録してランを実施
• 必要なファイル
1. リファレンス （fastaファイル）
2. マッピング結果 （BAMファイル）
3. BAM indexファイル （BAIファイル）
注意点：
• Torrent ServerとIGVに登録するリファレンスは、常に同一のfastaファイルを使用
• BAM、BAIファイルはIGVから読み込む際に同じフォルダ内に置かれている必要あり
• 入手先の違いによるリファレンスや染色体の名前の違いに注意
IGV（Integrative Genomics Viewer）について
120
IGVが起動
レポート上部のIGVボタンをクリック
変異の一覧のポジションをクリック
（リファレンスが既にIGVに登録されている場合）
Torrent Variant Caller：結果の参照（１）
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(1) Torrent SuiteのReferenceタブから、使用したリファレンスをダウンロードファイル名のxxx.fastaのxxxの部分をメモ ⇒ リファレンスをIGVに登録する際に必要
(1)対応するリファレンス名をクリック
(2) IGVの起動下記リンクページのそれぞれのOSに合ったlaunchボタンをクリックhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/download
（リファレンスがまだIGVに登録されていない場合）
Torrent Variant Caller：結果の参照（2）
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(3) IGVのFileメニューのCreate genome File…を選択(4) 右上の画面が表示されたら、Unique IdentifierとDescriptive nameの欄に
前ページ(1)でメモしたリファレンス名を入力(5) FASTA fileの欄の右側のBrowseボタンをクリックし、前ページ(1)で保存した
fastaファイルを選択(6) Saveをクリック
⇒保存先を指定するウィンドウが表示されるので、適当な保存先フォルダを指定(7) 保存したリファレンスがIGV左上のプルダウンから選択可能な事を確認
⇒一旦IGVを終了し、“結果の参照（１）”と同様にIGVを起動
(3) (4) (5)
(6)
（リファレンスがまだIGVに登録されていない場合）
Torrent Variant Caller：結果の参照（2）
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Technical Support
Tel : [email protected]
営業時間：午前9時から午後5時30分まで
ご不明な点がございましたら弊社テクニカルサポートまで
お問い合わせください
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