101
Kultivační metody v potravinářské mikrobiologii Sabina Purkrtová
Kultivační metody v potravinářské mikrobiologii
Sabina Purkrtová
Mikrobiologické metody
Analyt – měřená komponenta vzorku
Přítomnost nebo nepřítomnost analytuv určitém množství vzorku
Kvalitativní metody
Množství analytu Měřené přímo či nepřímo v určitém množství vzorku
Kvantitativní metody
Analyty v mikrobiologii
mikroorganismy jako mikrobiální buňky
části mikroorganismů – např. DNA, proteins
produkty mikroorganismů – např. enterotoxiny S. aureus
Množství: dle legislativy EU obvykle 25 g (příp. příležitostně 10 g)
Množství: dle legislativy EU obvykle 10 g
Types of methods
1. Mezinárodní, regionální či národní standardy
• převzaté od mezinárodně, regionálně či národně uznávaných
autorit pro vývoj a validaci metod
• ISO, International Dairy Foods Association (IDFA), FDA (Food
and Drug Administration), AIJN (European Fruit Juice
Association), SZÚ (Státní zdravotní ústav, ČR)
2. Metody vyvinuté v laboratoři
• Metody (obvykle in vitro diagnostické testy) navržené,
vyráběné a užívané v určité laboratoři
3. Nestandardní metody
• Převzaté z jiných zdrojů než z obecně uznávaných autorit pro
vývoj a validaci metod
• Např. metody publikované v odborné vědecké literatuře,
nepublikované laboratorní metody
We're ISO, the International Organization for Standardization. We develop and publish International Standards.
Kultivační metodyKlasické kultivační mikrobiologické metody studují mikroorganismy nikoliv jako jednotlivé buňky, ale jako populaci dceřiných buněk vzniklých dělením jedné buňky mateřské.
4
Příklad: Přírůstek množství bakterií v exponenciální fázi (generační doba: 0.5 h)
Hod
Log 1
0(p
oče
t b
un
ěk)
http://www.cs.montana.edu/webworks/projects/stevesbook/artifacts/images/chapter_002/section002/typical_growth_curve_002.jpg
Kultivační metody
http://ibis.inrialpes.fr/rubrique51.html
Růst kolonie z jedné mateřské buňky (teoreticky)
5
Tato populace mikroorganismů („masa buněk“) je viditelná na ztuženém médiu jako kolonie
Tato populace mikroorganismů je viditelná v tekutém médiu (bujón)
Tato populace mikroorganismů je schopná dát detekovatelný signál v biochemických testech
http://accounts.smccd.edu/case/biol240/images/nutrientbroth2.jpg
Dobře izolovaná kolonie rostoucí z jedné původní mateřské buňky – ideální stav, ale pouze teoreticky (některé MO buňky v shlucích). Počet kolonií není proto označován jako odpovídající počtu buněk, ale jako odpovídající počtu kolonií tvořících jednotek (KTJ)
Video:https://www.youtube.com/watch?v=zrx7Xg0gkQ4
Kultivační metody
6
Schopnost mikroorganismů přežít a množit se (tj. být kultivovány, „růst“) za danýchenvironmentálních podmínek závisí na kompatibilitě mezi těmito podmínkami afyziologickými a biochemickými vlastnostmi mikroorganismů.
Fyzikální faktory• teplota*• pH*• osmotický tlak*• atmosféra*• tlak• záření (UV, γ...)
Biologické faktory• Vliv ostatních
mikroorganismů (synergismus –vzájemná podpora růstu, kompetice, antagonismus, symbióza, mutualismus…)
Fyziologický stav („fitness“)*• Kultivovatelné buňky
• v dobrém stavu• poškozené či
suprimované vnějšími podmínkami
• uncultivable cells
Chemické faktory• Nároky na výživu*
• Zdroj energie• Zdroj C, N• Zdroje dalších látek
• Antimikrobiální (bakteriocidní/bakteriostatické) and další chemické látky*
*...Faktory běžně užívané nebo uvažované v kultivačních metodách potravinářské mikrobiologie
VOLBOU KULTIVAČNÍCH PODMÍNEK LZE SELEKTIVNĚ VYBRAT SPEKTRUM MIKROORGANISMŮ, K JEJICHŽ PŘEDNOSTNÍMU POMNOŽENÍ BUDE DOCHÁZET
obligate anaerobes: oxygen is toxic for them
https://o.quizlet.com/CXi.qp97gMpOFIXSYF0skA.png
Kultivační metody
Salvadó Z et al. Appl. Environ. Microbiol. 2011;77:2292-2302
Teplotní rozsah růstu 27 kvasinek. Optimální růstová teplota je označena kolečkem. S., SaccharomycesSc, S. cerevisiae;Sp, S. paradoxus;Smik, S. mikatae;Sarb, S.arboricolus;Scar, S.cariocanus;Su, S. bayanus var. uvarum;Sk, S. kudriavzevii;Km, Kluyveromyces marxianus;Pf, Pichia fermentans;Td,Torulaspora delbrueckii;Cs, Candida stellata;Hu, Hanseniaspora uvarum.
Kultivační metody
9
Bacteria Tmin (°C) Topt (°C) Tmax (°C)
Listeria monocytogenes 1 30-37 45
Vibrio marinus 4 15 30
Pseudomonas maltophilia 4 35 41
Thiobacillus novellus 5 25-30 42
Staphylococcus aureus 10 30-37 45
Escherichia coli 10 37 45
Clostridium kluyveri 19 35 37
Streptococcus pyogenes 20 37 40
Streptococcus pneumoniae
25 37 42
Bacillus flavothermus 30 60 72
Thermus aquaticus 40 70-72 79
Archaebacteria Tmin (°C) Topt (°C) Tmax (°C)
Methanococcus jannaschii
60 85 90
Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 90
Pyrobacterium brockii 80 102-105 115
Kultivační teplota pro kvasinky: 25 °C.
Kultivační metody
http://image.slidesharecdn.com/microbiologyunit2-3-150710082502-lva1-app6892/95/microbiology-unit-23-bacteria-36-638.jpg?cb=1436518851
Kultivační metody
http://agrosum14.weebly.com/uploads/4/4/9/5/44958631/4965520_orig.jpg
Kultivační metody
http://image.slidesharecdn.com/microbiologicalprinciples-110819155057-phpapp01/95/food-microbiological-principles-fst-241-32-728.jpg?cb=1313769603
Kultivační metody
http://aqualab.decagon.com.br/assets/Article-Graphics/Key-concepts-in-water-activity-Table-1.JPG
http://image.slidesharecdn.com/factorsaffectingthegrowthandsurvivalofmicro-organismsinfoods-150306050511-conversion-gate01/95/factors-affecting-the-growth-and-survival-of-micro-organisms-in-foods-30-638.jpg?cb=1425640055
Kultivační metody
14
http://www.easynotecards.com/uploads/929/65/_4a88b4c5_140c98ff4b1__8000_00008247.png
Kultivační metody
http://www.oxfordscholarship.com/doc/10.1093/acprof:oso/9780199586936.001.0001/acprof_9780199586936_graphic_012.gif
Většina bakterií významných v klinické a potravinářské mikrobiologii, všechny kvasinky a plísně jsou chemoheteroorganotrofní: zdrojem uhlíku a energie a redoxních sloučenin jsou organické sloučeniny.
Kultivační média
15
Dělení dle konzistence: Tekutá média (bujóny) – buňka absorbuje živiny celým povrchem, lepší distribuce živin Tuhá média – např. brambor, mrkve – kultivace některých plísní Média ztužená
agarem (polysacharid - agarosa – 70 % + agaropektin – 30 %, není hydrolyzován většinou bakterií)
želatinou (hydrolyzát kolagenu) ztužená agarová média: 1-3 % agaru – vznik jednotlivých kolonií poloztužená agarová média: 0,2-0,5 % - sledování motility média ztužená želatinou: test na ztekucování želatiny (např. Clostridium
perfringens)
Dělení dle složení: Média pro chemoheteroorgantrofní organismy musí obsahovat: zdroj uhlíku a energie
(totožný), dusíku, u auxotrofů (nejsou schopni syntetizovat některé potřebné sloučeniny) též vitamíny a stopové prvky
Syntetická (chemicky definovaná) – je známo přesné chemické složení – připravena z čistých chemikálií
Komplexní média – připravena z různých chemicky nepřesně definovaných materiálů a některých jednoduchých čistých chemikálií
Dělení dle účelu kultivace
Kultivační médiaRůzné mikroorganismy se v nárocích na výživu velice liší
16
http://classes.midlandstech.edu/carterp/courses/bio225/chap06/06-T02_MediumChemo.jpg
http://classes.midlandstech.edu/carterp/courses/bio225/chap06/06-T03_MediumFastid.jpg
Výživově nenáročné mikroorganismy Např. E. coli – snadno kultivovatelná
Výživově náročné mikroorganismy (ang. fastidious): náročné na výživové podmínky
Kultivační médiaKomplexní média – základní složkyRůzné přírodní materiály (=přesné chemické složení se liší v jednotlivých šaržích dle výrobcea způsobu přípravy) + některé jednoduché čisté chemikálie
17
Kvasničný extrakt, extrakt z masa...Zdroj zvláště vitamínů a růstových faktorů (kvasničný extrakt – B vitamíny) Zdroj energie a uhlíku, minoritně dusíku
http://images.slideplayer.com/20/5940717/slides/slide_8.jpg
Produkty hydrolýzy různých druhů proteinů(maso, sója, želatina, kasein, rostlinná pletiva...)proteolytickými enzymy: pepsin (peptony),trypsin (tryptony), papain, pankreatin(pankreatická natrávenina...)= hlavní zdroj dusíku (též energie a uhlíku, aleutilizace je pomalejší)
Jednoduché sacharidy (glukóza, laktóza,maltóza...) – zdroj uhlíku a energie
Další růstové faktory pro náročnémikroorganismy:Beraní/koňská krev, NADH+
Minerální soli:NaCl – vhodné osmotické prostředí ( 0,85-0,90 % NaCl fyziologický roztok)Hydrogenfosforečnany a dihydrogenfosforečnany – pufrovací systém pro SO4
-2, Ca2+, Mg2+, Fe2+,3+, Mn2+ aj. – podpora růstu mikroorganismů
18
Dehydratedmixture preparedby the producer
Mixed from single parts
Ready-to-use
Kultivační média
Kultivační média
19
Univerzální kultivační média• Vhodná pro růst všech mikroorganismů, kterým vyhovuje jejich nutriční
složení (neobsahují žádná selektivní činidla) • Selekce růstu mikroorganismů částečně volbou kultivační teploty PCA (Plate Count Agar) – pepton z kaseinu, masový extrakt, glukóza, agar-
agar; pH: 7.0 ± 0.2 při 25°C živný agar (Nutrient agar) – pepton z masa, masový extrakt, agar-agar; pH:
7.0 ± 0.2 při 25°C trypton-sójový agar (Tryptic soy agar) – pepton z kaseinu, pepton ze sójové
drtě, NaCl, agar-agar; pH: 7.3 ± 0.2 při 25°C trypton-sójový bujón (Tryptic soy broth) - pepton z kaseinu, pepton ze
sójové drtě, glukóza, K2HPO4 (pufrovací aktivita v průběhu růstu), NaCl; pH: 7.3 ± 0.2 při 25°C
pufrovaná peptonová voda (Buffered Peptone water) - pepton z kaseinu, glukóza, Na2HPO4.12 H2O, KH2PO4 (pufrovací aktivita v průběhu růstu), NaCl; pH: 7.0 ± 0.2 při 25°C
20
Živný agar (Nutrient Agar)
Kultivační média
21
Obohacená univerzální kultivační média• Obohacená některými dalšími živiny (krev, extrakty...) pro
podporu růstu mikroorganismů, včetně výživově náročnějších Columbia agar – pepton z kaseinu, pepton z masa, srdcový
extrakt, kvasničný extrakt, škrob, NaCl, agar-agar; pH: 7.3 ± 0.2 při 25°C Columbia agar s 5 % beraní krve – k základu po ochlazení na
45 °C přidána beraní krev (např. 95 ml + 5 ml) – možnost sledování hemolýzy též
Čokoládový agar – k základu po ochlazení na 45 °C přidána beraní krev a směs povařena 10 min při 80 °C do zhnědnutí (např. 90 ml + 10 ml)
Mozko-srdcová infúze (BHI) – mozko-srdcový extrakt, pepton, glukóza, NaCl, Na2HPO4; pH: 7.4 ± 0.2 při 25°C
Columbia Agar s 5 % beraní krve
Escherichia coli
Streptococcus pyogenes
http://www.eolabs.com/columbia-agar-sheep-blood.html
Brain Heart Infusion Broth
Kultivační média
24
Selektivní kultivační média• Cíl: Selektivní kultivace pouze vybrané skupiny mikroorganismů• Růst ostatních nežádoucích skupin mikroorganismů je potlačen přídavkem selektivních
činidel a volbou kultivačních podmínek, která jsou pro tyto nežádoucí skupiny letální• Selektivní činidla:
• Povrchově aktivní látky: žluč a žlučové soli, lauryl suflát sodný, tergitol • Antibiotika: výběr závisí na nežádoucí skupině mikroorganismů• Anorganické soli: chlorid lithný (inhibuji G- a enterokoky), tetrathionát (inhibuje G+
a koliformní bakterie), azid sodný (inhibuje G-)• Barviva: krystalová violeť , briliantová zeleň, malachitová zeleň....
Pomnožovací média: Navržena pro zvýšení počtu mikroorganismů na detekovatelnou úroveň• Neselektivní• Selektivní
Kultivační média
25
Diferenciační (diagnostická) média• Cíl: Odlišit kolonie cílové skupiny mikroorganismů od ostatních na základě
některé typické biochemické reakce• Např.
• A) fermentace cukrů za vzniku kyseliny (změna pH) a/nebo plynu (Durhamova plynovka)
• B) degradace některých sloučenin (např. dekarboxylace) – obvykle změna pH
• C) tvorba určitých sloučenin za vzniku precipitátu (např. tvorba sirovodíku)• D) změna barvy nebo fluorescence kolonií vzhledem k degradaci
chromogenních nebo fluorogenních substrátů• Typickým detekčním systémem je použití acidobazických indikátorů – změna
barvy kolonií v závislosti na pH média.
Selektivně – diferenciační (diagnostická) média• Potlačují růst nežádoucích skupin mikroorganismů• Umožňují selektivní růst cílového mikroorganismu a zároveň souběžně s
vizuálním odlišením jeho kolonie
Acidobazické indikátory
http://image.slidesharecdn.com/lab17-141201085153-conversion-gate01/95/-10-638.jpg?cb=1417424219
Chemické sloučeniny měnící barvu dle pH
http://mslavenda.com/images/bromocresol_purple_chart.jpg
http://mslavenda.com/images/bromothymol_chart.jpg
http://2.bp.blogspot.com/-XaGKyJzCBPk/UgS8FU96L3I/AAAAAAAAAt8/7B6bSjxLjjI/s1600/lol.PNG
http://www.dlt.ncssm.edu/tiger/diagrams/acid-base/WeakAcidTitration-General.gif
Selektivně-diagnostická kultivační média
MacConkey Agar Agar pro selektivní izolaci a odlišení laktózu fermentujících
a nefermentujících Enterobacteriaceae = selektivně-
diagnostické médium pro koliformní bakterie
Složení (g/l)
Pepton (z masa a kaseinu) 3.0
Pankreatická natrávenina želatiny 17.0
NaCl 5.000
Žlučové sole 1.5
Krystalová violeť 0.001
Laktóza monohydrát 10.0
Neutrální červeň 0.030
Agar 13.500
pH po sterilizaci (při 25°C) 7.1±0.2
Pepton (z masa a kaseinu)
Pankreatická natrávenina želatiny:
Zdroj dusíku a vitamínů
NaCl: osmotická rovnováha
Selektivní působení krystalové
violeti a žlučových solí inhibuje
růst většiny druhů G+ bakterií
(např.
S. aureus – neroste)
G- bakterie, zvláště
enterobakterie (žijící v
zažívacím traktu) rostou dobře.
Selektivně-diagnostická kultivační média
Diagnostická složka: fermentace laktózy za vzniku
kyseliny vede k poklesu pH a změně acidobazického
indikátoru (neutrální červeň) při pH nižším než 6.8 ze
žluté na červenou
Složení (g/l)
Pepton (z masa a kaseinu) 3.0
Pankreatická natrávenina želatiny
17.0
NaCl 5.000
Žlučové sole 1.5
Krystalová violeť 0.001
Laktóza monohydrát 10.0
Neutrální červeň 0.030
Agar 13.500
MacConkey Agar Kmeny fermentující laktózu
(koliformní bakterie)
rostou červeně nebo růžově, s
možnou zónou precipitované žluči
Kmeny nefermentující laktózu
(Shigella, Salmonella, Proteus...)
jsou bezbarvé a typicky
neodlišitelné vzhledem od média
http://2.bp.blogspot.com/-XaGKyJzCBPk/UgS8FU96L3I/AAAAAAAAAt8/7B6bSjxLjjI/s1600/lol.PNG
pH po sterilizaci (při 25°C) 7.1±0.2
Chromogenní kultivační média• Obsahují jeden nebo více chromogenních substrátů
(substrát pro specifický enzym s připojeným
chromoforem)
• Umožňují detekci specifických enzymů, schopných
odštěpit z chromogenního substrátu chromofor
(změna barvy)
CHROMOGENNÍ MÉDIUM (Colilert): Koliformní bakterie mají enzym β-galactosidasu a jsou schopny z ONPG odštěpit chromofor (o-nitrofenol) – změna barvy na žlutou z bezbarvé.
https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQp0jRYnmkNvmAadTkSzSsNYUpHuBzWmdbKoWQ79qbh3nLIhZ18ww
Koliformní bakterie (MPN metoda)
Fluorogenní kultivační média• Obsahují jeden nebo více fluorogenních substrátů
(substrát pro specifický enzym s připojenýmfluoroforem)
• Umožňují detekci specifických enzymů, schopnýchodštěpit z fluorogenního substrátu fluorofor(fluorescence po ozáření UV)
FLUOROGENIC MEDIUM (Colilert): E. coli (96-97 % kmenů mimo některé patogenní sérotypy) má enzym β-D-glucuronidasu, který je schopen rozštěpit MUG a vykazovat tak fluorescenci (UV 360 nm).
http://ga.water.usgs.gov/projects/bacteria/pictures/summaryanalysisecoli.jpg
E. coli (MPN metoda)
ProduktivitaProduktivita (PR – productivity ratio)
• vyjadřuje schopnost růstu
mikroorganismu v testovaném médiu ve
srovnání se schopností růstu na
referenčním médiu
•Pro kvantitativní vyjádření je definována
následně:
PR =NS / NO
NS - celkový počet KTJ na testovaném
médiu
NO – celkový počet KTJ na příslušném
referenčním médiu (min. 100 KTJ)
Hodnoty PR
• neselektivní média…..min. 0,7
• selektivní média……min. 0,1
Správný počet buněk (0.2 ml)
0.2 ml
Neselektivní médium (referenční)
Selektivní médium
Selektivita
Selektivita (SF)
• demonstruje, že
médium je schopno
potlačit růst nežádoucích
mikroorganismů
Správný počet buněk (0.2 ml)
0.2 ml
Neselektivní médium
Selektivní médium
Nejsou necílové
mikroorganismy
(doprovodná
mikroflóra) schopny
též růstu ?
Specifita
Specificita (fyziologická charakteristika)
Specifita kultivačního média označuje jeho schopnost rozlišit příbuzné
organismy na základ přítomnosti/nepřítomnosti nebo míry biochemické
odpovědi a velikosti kolonií a jejich morfologii.
Cílový mikroorganismus roste na daném médiu ve shodě se specifikací.
Jednotlivé kmeny stejné skupiny se mohou lišit – testováno proto více kmenů
dané skupiny.
Bude mít vždy cílový mikroorganismu pozitivní reakci ?
Cílový mikroorganismusDává očekávanou reakci
Plotnové metody a MPN (tekuté a tuhé vzorky) resuspenze vzorku ve vhodném dilučním roztoku (1:10) desítkové ředění
Filtrace (tekuté vzorky) Filtrace vzorku, příp. po vhodném naředění
ZPRACOVÁNÍ VZORKU
Mikrobiální kultury rostoucí na selektivních médií nejsou vhodné pro biochemické testování – selektivní médiu snižuje „fitness“ i cílových bakterií a jejich fenotypové vlastnosti, což interferuje s přesností a spolehlivostí testů
Kultivační metody stanovení počtu MO
Plotnové metody - výsev roztěrem či přelivem MPN – inokulace tekutého média Filtrace – přenos filtru na povrch ztuženého média
IZOLACE NA SELEKTIVNÍ/NESELEKTIVNÍ MÉDIA
SUB-IZOLACE PRESUMPTIVNÍCH KOLONIÍ NA NESELEKTIVNÍ MÉDIA
KONFIRMACE/IDENTIFIKACE PRESUMPTIVNÍCH KOLONIÍ
DESÍTKOVÉ ŘEDĚNÍ
VZOREK
IZOLACE
KULTIVACE
POČÍTÁNÍ KOLONIÍ
SUB-IZOLACE PRESUPMTIVNÍCH
KOLONIÍ
VÝSLEDEK
VZOREK: obvykle 10 g nebo 10 ml (1X)DILUČNÍ MÉDIUM: • např. fyziologický roztok s peptonem, pufrovaná peptonová
voda (prostředí neovlivňující počet MO)• Ředěno 1:9• 1. ředění – sterilní sáček (10 g/ml + 90 ml; 1X + 9X),
resuspenze/smíšení• Následující ředění – zkumavky (1 ml suspenze + 9 ml
dilučního média)
KULTIVACE A KONFIRMAČNÍ
TESTY
1:10 1:10000001:100 1:1000 1:10000 1:100000
Kultivační metody stanovení počtu MO
DESÍTKOVÉ ŘEDĚNÍ
VZOREK
IZOLACE
KULTIVACE
POČÍTÁNÍ KOLONIÍ
SUB-IZOLACE PRESUPMTIVNÍCH
KOLONIÍ
VÝSLEDEKKULTIVACE A
KONFIRMAČNÍ TESTY
Kultivační metody stanovení počtu MO
1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1:1000000
Izolace = inokulace vybraných ředění (výběr dle limitu výskytu MO v potravině) + kultivaceo Roztěrem na povrch média v Petriho misce (obvykle 0.1 nebo
0.2 ml) o Přeliv suspenze v prázdné Petriho misce sterilním rozehřátým
ztuženým médiem při teplotě 45 °C (obvykle 1 ml)
Inokulační metody
http://classes.midlandstech.com/carterp/Courses/bio225/chap06/Microbial%20Growth%20ss5.htm
Metoda přelivu dává lepší výsledky pro fakultativně anaerobní mikroorganismy než metoda roztěru
Metoda roztěru užívána pro aerobní mikroorganismy
Izolace čárkováním
http://department.monm.edu/chemistry/chemistry330/fall2004/abickert/images/streak.gif
DESÍTKOVÉ ŘEDĚNÍ
VZOREK
IZOLACE
KULTIVACE
POČÍTÁNÍ KOLONIÍ
SUB-IZOLACE PRESUPMTIVNÍCH
KOLONIÍ
VÝSLEDEKKULTIVACE A
KONFIRMAČNÍ TESTY
Kultivační metody stanovení počtu MOKultivace: čas a teplota závisí na MO a metoděPočítání kolonií: limit KTJ – obvykle 10-300 pro stanovení počtu všech mikroorganismů (neselektivní média), 10-150 pro stanovení počtu presumptivních/typických/atypických kolonií (selektivní média)Konfirmace: • výběr až 5 presumptivních/typických/atypických kolonií,
pokud přítomny, z každé plotny použité k výpočtu • Konfirmace biochemickými testy (viz selektivita a specifita
média) Výsledek: A.B x 10c KTJ/g, ml (např. 5.2 x 104 KTJ/g, ml)
http://www.studyblue.com/notes/note/n/lab-practical-exam-review-1/deck/6074578(ADAPTED S.P.)
Čeleď Enterobacteriaceae
Gramnegativní fakultativně anaerobní rovné tyčinky,
některé z nich pohyblivé
Většina rodů roste dobře při 37°C,
ačkoliv některé rostou lépe při 25 - 30°C
Fermentují glukózu, oxidáza negativní
Schopny růst v přítomnosti žlučových solí
Koliformní bakterie
Fermentují laktózu (přítomnost enzymu
β-galaktosidáza)
Escherichia coli
Většina kmenů (mimo některé patogenní
kmeny – cca 3-4 %) produkuje enzym
β-D-glukuronidázu
Tvorba indolu z tryptofanu
Enterobacteriaceae
TBX
VČŽG (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Glukóza) Agar
VČŽL (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Laktóza) Agar
Agar dle MacConkey, ENDO agar, Chromocult Coliform agar
VČŽG
Escherichia coli ATCC 8739
Shigella flexneri ATCC 29903
Vzhled kolonií MikroorganismyČervené, obklopené načervenalou precipitační zónou či bez zóny
Enterobacteriaceae a jiné
Bezbarvé Žádné Enterobacteriaceae nejsou přítomné
Typické složení (l): pepton 7 g; kvasničný extrakt 3 g, chlorid sodný 5 g; D(+) glukosa 10 g; směs žlučových solí 1,5 g; methylčerveň 0,03 g; krystalová violeť 0,002 g; agar-agar 13 g. Selektivní složkaKrystalová violeť inhibuje růst doprovodné grampozitivní bakteriální flóry ze vzorku. Žlučové kyseliny inhibují růst doprovodné mikroflóry a selektivně podporují růst EnterobacteriaceaeDiagnostická složkaFermentace glukosy – produkce kyselin je indikována změnou barvy přidaného acidobazického indikátoru methylčerveně. Půda není pro Enterobacteriaceae zcela specifická – stejný vzhled mohou vykazovat např. aeromonády.
VČŽG (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Glukosa) Agar půda s violetovou červení, žlučí a glukózouSelektivní půda pro Enterobacteriaceae
EnterobacteriaceaeČSN ISO 21528-2 (560096) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metody pro průkaz a stanovení
počtu bakterií čeledi Enterobacteriaceae - Část 2: Technika počítání kolonií
*Minimálně minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele
**ŘR..ředící roztok – PPV
***1 ml testované suspenze přelít půdou VČŽG temperovanou na 44 °C – 47 °C, doba od zaočkování inokula a přelití
inokula půdou nesmí přesáhnout 15 minut. Nejdříve asi 10 ml, po úplném ztuhnutí půdy převrstvit dalšími 15 ml –
vytvoření semi anaerobního prostředí.
Biochemické testy: test na oxidázu, fermentace glukózy - glukózový agar
(37 °C, 24 h)
Vzorek
0. ředění
VČŽG
Vyhodnocení biochemických testů
Výpočet a vyjádření výsledku
1. den
2. den
3. den
4. denVyhodnocení testů
10 g vzorku
+ 90 ml ŘR**
- 1. ředění
1 ml (-1. ředění)
+ 9 ml ŘR**
- 2. ředění
1 ml (-(X+1). ředění
+ 9 ml ŘR**
- X. ředění
….
VČŽG VČŽGVČŽG VČŽG VČŽG VČŽG
VČŽG
Příprava vzorku
a desítkové
ředění*
Kultivace: 37 °C, 24 h±2 h
Výběr typických (příp. atypických) kolonií pro konfirmaci
Přeočkování až 5 náhodně vybraných typických (příp. atypických) kolonií
živný agar, 37˚C, 24±3 h
Izolace na
selektivní ztužená
média
Přeočkování na
neselektivní agar
Konfirmační
testy
Přeliv 1 ml půdou VČŽG***
Průkaz oxidázyPrůkaz cytochromoxidáza/oxidázaPrůkaz enzymů, který se podílí na oxidativních procesech v bakteriální buňce, přítomny u všech aerofilních bakterií s respiračním metabolismem. Podstata testu je reakce derivátů p-fenylendiaminu se železem obsaženým v cytochromových respiračních komlexech. Přítomnost cytochromoxidázy je detekována barevnými reakcemi pomocí příslušných činidel.
Postupkultura je přenesena na plochu navhlčenou činidlem pomocí platinové či plastové kličky (nikoliv železné ! –možná falešně pozitivní reakce), produkce oxidázy dojde ke vzniku sytě fialové až modré barvy do cca 20-30 s – v závislosti na formátu testu
Oxidáza pozitivní G- bakterie (OXI +)Pseudomonas sp., Aeromonas sp.Oxidáza negativní G- bakterie (OXI -)Čeleď Enterobacteriaceae, Acinetobacter sp.
VČŽL
Vzhled kolonií MikroorganismyČervené, obklopené načervenalouprecipitační zónou či bez zóny
koliformní bakterie
Malé červené kolonie („tečky“) Příležitostně enterokokyBezbarvé laktóza negativní
enterobakterie a jiné
Typické složení (l): pepton 7 g; kvasničný extrakt 3 g, chlorid sodný 5 g; D(+) glukosa 10 g; směs žlučových solí 1,5 g; methylčerveň 0,03 g; krystalová violeť 0,002 g; agar-agar 13 g. Selektivní složkaKrystalová violeť inhibuje růst doprovodné grampozitivní bakteriální flóry ze vzorku. Žlučové kyseliny inhibují růst doprovodné mikroflóry a selektivně podporují růst EnterobacteriaceaeDiagnostická složkaFermentace laktózy – produkce kyselin je indikována změnou barvy přidaného acidobazického indikátoru methylčerveně.
VČŽG (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Glukosa) Agar půda s violetovou červení, žlučí a glukózouSelektivní půda pro Enterobacteriaceae
Escherichia coli ATCC 11775
Escherichia coliATCC 25922
Salmonella gallinarumNCTC 9240
Endo AgarSložení (l): Peptická natrávenina zvířecí tkáně 10.0 g , Laktóza 10.0, Hydrogenfosforečnan draselný 3,5 , Siřičitan sodný 2.5 , Základní fuchsin 0.5 , Agar 15.0, pH 7,4 ± 0,2 Selektivně-diagnostické médium pro izolaci a rozlišení druhů Enterobacteriaceae a dalších gramnegativních tyček z klinických vzorků či vyšetření potravin.
44
Selektivní složka:siřičitan sodný a základní fuchsin (částečné potlačení Gram pozitivních mikroorganismů)
Shigella flexneri ATCC 12022
Diagnostická složka:Koliformní bakterie – fermentace laktózy - tmavě růžové až středně červené kolonie s měňavým nazelenalým kovovým leskem a podobným zabarvením média. E. coli – dochází ke krystalizaci fuchsinu – nazelenalý metalický lesk.Kolonie organismů, které nefermentují, jsou na světle růžovém pozadí média bezbarvé až narůžovělé.
Endo
Agar
ChromoCult®Coliform Agar
Citrobacter freundii ATCC 8090
Escherichia coli ATCC 11775
Selective agar for the simultánní detekci koliformů a E. coli v pitné
vodě a potravinách
Typical Composition (g/litre)
Peptone 3.0; sodium chloride 5.0; sodium dihydrogen phosphate 2.2; di-sodium
hydrogen phosphate 2.7; sodium pyruvate 1.0; tryptophan 1.0; agar-agar 10.0;
Sorbitol 1.0; Tergitol® 7 0.15; 6-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside 0.2; 5-
bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid 0.1; isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside 0.1. pH: 6.8 ± 0.2 at 25°C.
Identifikace koliformů
Salmon-GAL – štěpen β-D-galactosidasou – charakteristický
pro koliformy – lososové až červené kolonie
Identifikace E. coli
X-glucuronide – štepen β-D-glucuronidasou – charakteristické
pro E. coli. E. coli též štěpí Salmon-GAL – tmavěmodré až
fialové kolonie.
TBXChromocult® TBX agar (trypton bile X-glucuronid)=chromogenní půda
Složení (l): pepton 20 g; žlučové soli No. 3 1,5 g; X-ß-D-glukuronid 0,075 g; agar-agar 15 g.Selektivně-diagnostické chromogenní médium pro β-D-glukuronidáza pozitivní kmeny E. coliInhibiční složka:Růst doprovodné mikroflóry je inhibován přídavkem žlučových solí a kultivační teplotou 44 °C.Diagnostická (chromogenní složka)E. coli se odlišuje od ostatních koliformních bakterií syntézou enzymu β-D-glukuronidázy, který je schopen štěpit chromogenní substrát 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-glukuronid (X-ß-D-glukuronid). Dochází ke štěpení vazby mezi chromoforem 5-bromo-4-chloro-3-indolyl a D-glukuronidem, odštěpení chromoforu vede k modrozelenému zbarvení kolonií E. coli.
Vzhled kolonií Mikroorganismymodrozelené –indikace přítomnosti β-D-glukuronidázy
E. coli
Bezbarvé glukuronidáza negativní E. coli (3-4 % kmenů) schopné růstu při 44 °C (např. E. coli O157) (další glukuronidázanegativní E. coli jako E. coli O157:H7 při 44 °C nejsou schopny růst)
Escherichia coli ATCC 25922
Escherichia coli DSMZ 502
Escherichia coliČSN ISO 16649-2 (560079) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu beta-
glukuronidázopozitivních Escherichia coli - Část 2: Technika počítání kolonií vykultivovaných při 44 °C
s použitím 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glukuronidu
*Minimálně minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele
**ŘR..ředící roztok – PPV
***1 ml testované suspenze přelít asi 15 ml půdy TBX temperované na 44 °C – 47 °C.
Vzorek
0. ředění
TBX
Odečet typických kolonií (biochemická reakce, která je základem vzhledu
kolonií, je považována za natolik specifickou, že není prováděna
konfirmace)
Výpočet a vyjádření výsledku
1. den
2. denVyhodnocení
10 g vzorku
+ 90 ml ŘR**
- 1. ředění
1 ml (-1. ředění)
+ 9 ml ŘR**
- 2. ředění
1 ml (-(X+1). ředění
+ 9 ml ŘR**
- X. ředění
….
TBX TBXTBX TBX TBX TBX
TBX
Příprava vzorku
a desítkové
ředění*
Kultivace: 44 °C, 18-24 hodin
Izolace na
selektivní ztužená
média
Přeliv 1 ml půdou TBX***
Celkový počet mikroorganismůČSN EN ISO 4833 (560083) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda pro stanovení
celkového počtu mikroorganismů - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C
*Minimálně minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele. je-li to vhodné a možné, zvolí se takový stupeň ředění,
která poskytnou počty kolonií mezi 15 a 300 na misku.
**ŘR..ředící roztok – PPV
***1 ml testované suspenze přelít asi 12-15 ml půdy PCA temperovanou na 44 °C – 47 °C, doba od zaočkování inokula po
přelití inokula půdou nesmí přesáhnout 45 minut. Pouze v případě očekává-li se výskyt mikroorganismů, jejichž kolonie
přerůstají povrch půdy, přelije se ztuhlá vrstva dalšími 4 ml půdy pro převrstvení.
Vzorek
0. ředění
PCA
Odečet kolonií
Výpočet a vyjádření výsledku
1. den
4. denVyhodnocení
10 g vzorku
+ 90 ml ŘR**
- 1. ředění
1 ml (-1. ředění)
+ 9 ml ŘR**
- 2. ředění
1 ml (-(X+1). ředění
+ 9 ml ŘR**
- X. ředění
….
PCA PCAPCA PCA PCA PCA
PCA
Příprava vzorku
a desítkové
ředění*
Kultivace: 30 °C, 72 h±3 h
Izolace na
neselektivní
ztužená média
Přeliv 1 ml půdou PCA***
3M Petrifilm™ Count Plates
an all-in-one plating system made by the Food Safety Division of the 3M Corporation
cost-effectiveness, simplicity, convenience, and ease of use
3M Petrifilm™ Count Plates - principle3M Petrifilm™ Count Plates:Coating technology
1. Top FilmPlastic Film coated withadhesive, indicator and cold water soluble gel.
2. Bottom FilmPlastic coated paper printed with a grid, adhesive standard methods nutrients, cold water soluble gel.
3M Petrifilm™ Coliform Count Plates
Koliformní bakterie – fermentace laktózy za vzniku kyseliny a plynuVČŽL dehydratované médium• Červeně až fialově zbarvené
kolonie• Umožněna však též detekce
tvorby plynu (plyn je zachycen vrchním filmem)
• Vyšší specifita stanovení
Stanovení počtu metodou filtrace1. KROK FILTRACE TEKUTINY (OBVYKLE 100 ML)
3. KROK KONFIRMACE TYPICKÝCH KOLONIÍ
2. KROK PŘENOS FILTRU SE ZACHYCENÝMI MIKROORGANISMY NA SELEKTIVNÍ MÉDIUM
54
TTC – ze spodu
Zvrchu
Reálný vzorek
Laktózový
TTC agar s tergitolem
Stanovení počtu metodou MPN1. KROK PŘÍPRAVA VÝCHOZÍ SUSPENZE TESTOVANÉ POTRAVINY A DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ
2. KROK INOKULACE VÝCHOZÍ SUSPENZE A JEDNOTLIVÝCH ŘEDĚNÍ DO SÉRIE PO 3, 5, 10 ČI 15 ZKUMAVKÁCH SE SELEKTIVNÍ POMNOŽOVACÍ PŮDOU (SPP)
3. KROK KONFIRMACE ZKUMAVEK SE ZÍSKANOU POZITIVNÍ REAKCÍ
10 ml 2X SPP + 10 ml výchozí suspenze = 1 g/ zkumavka (2x – dvojnásobná koncentrace média z důvodu vysokého ředění vzorkem)10 ml 1X SPP + 1 ml výchozí suspenze=0.1 g/ zkumavka10 ml 1X SPP + 1 ml 2.ředění výchozí suspenze =0.01 g/ zkumavka10 ml 1X SPP + 1 ml 3.ředění výchozí suspenze=0.001 g/zkumavka etc.
o Jaká je pravděpodobnost, že při X KTJ/ml suspenze, bude v A případech odebrána alespoň jedna buňka v daném objemu (poz.) a v B případech naopak žádná (neg.) = odhad počtu bakterií na základě statistiky
o Zde pro vyhodnocení získán číselný kód 4-2-1
Předpoklad: o v tekutém médiu je distribuce buněk
uniformní, nejsou spojeny ve shluky, k detekovatelnému růstu (=projevuje se pozitivní reakcí) dochází i kdyby pouze jedne životaschopná buňka byla ve zkumavce)
Odhad nejvýše pravděpodobného počtu 1) Výpočet dle vzorce –IS0 7218:2007 10.5.6.12) Software programy3) Použití MPN tabulekB.5 ISO 7218:2007MPN indexy pro 3 následující ředění se 3 zkumavkami, kdy první zkumavka obsahuje 1 g vzorku (43 možností) B.7 ISO 7218:2007/ Tabulka A.1 ISO 7251:2005(E) MPN index pro 3 následující ředění s 5 zkumavkami, kdy první zkumavka obsahuje 1 g vzorku (63 možností).)
Počet pozitivních výsledků
Index MPN
Kategorie Hranice spolehlivosti (95%)
Dolnílimit
Horní limit
2 0 0 0.92 1 0.15 3.5
2 0 1 1.4 2 0.4 3.5
2 0 2 2.0 0 0.5 3.8
2 2 1 2.8 3 0.9 9.4
Kategorie:Pokud je analýza provedena přesně, poté 95 % kombinací spadá do kategorie 1; 1.4% do kategorie 2; 0.9 % do kategorie 3 and 0.1 % do kategorie 0.
Stanovení počtu metodou MPN
Odhad nejvýše pravděpodobného počtu 1) Výpočet dle vzorce –IS0 7218:2007 10.5.6.12) Software programy3) Použití MPN tabulekB.5 ISO 7218:2007MPN indexy pro 3 následující ředění se 3 zkumavkami, kdy první zkumavka obsahuje 1 g vzorku (43 možností) B.7 ISO 7218:2007/ Tabulka A.1 ISO 7251:2005(E) MPN index pro 3 následující ředění s 5 zkumavkami, kdy první zkumavka obsahuje 1 g vzorku (63 možností).)
Počet pozitivních výsledků
Index MPN
Kategorie Hranice spolehlivosti (95%)
Dolnílimit
Horní limit
2 0 0 0.92 1 0.15 3.5
2 0 1 1.4 2 0.4 3.5
2 0 2 2.0 0 0.5 3.8
2 2 1 2.8 3 0.9 9.4
Kategorie:Pokud je analýza provedena přesně, poté 95 % kombinací spadá do kategorie 1; 1.4% do kategorie 2; 0.9 % do kategorie 3 and 0.1 % do kategorie 0.
Stanovení počtu metodou MPN
Výběr série zkumavek pro výpočet
Vzorek
Tekutý vzorek10 ml
1 ml 10-1 ml 10-2 ml 10-3 ml MPN
Ostatní vzorky1 g
10-1 g 10-2 g 10-3 g 10-4 g Tek. vzorek(ml-1 )
Ost. vzorky(g -1 )
1 3 3 2 1 0 1.1x101 1.1x102
Dolní limit 0.2x101 0.2x102
Horní limit 4.0x101 4.0x102
Pokud x gramů vzorku v první zkumavce, násobit výsledek 1/x) – např. pro 10 g – násobit 0.1, pro 0.1 g = násobit 10
Počet pozitivníchvýsledků
Index MPN
Kategorie
Hranice spolehlivosti (95%)
Dolní limit Horní limit
3 3 2 110 1 20 400
3 2 1 1.4 2 0.4 3.5
2 1 0 1.5 1 0.4 3.8
1 – lepší kategorie3-3-2: vyšší celkový počet pozitivních zkumavek
Stanovení počtu metodou MPN
Horizontální metoda průkazuPrůkaz přítomnosti či nepřítomnosti byť jen jediné životaschopné buňky cílového mikroorganismu v testované potravině, obvykle 25 g (dáno Nařízením č. 2073/2005)Kultivační metoda stanovení: Získání cílového mikroorganismu jako jednotlivě rostoucích kolonií, které lze dále identifikovat
Primární pomnožení: X g, ml potraviny + 9X ml pomnožovacího média resuscitace a opatrné pomnožení stresovaných mikroorganismů (nižší nebo žádná koncentrace selektivních činidel, přídavek složek pro potlačení toxicity selektivních činidel)
Sekundární pomnožení: přenos 0,1-10 ml z primárně pomnožené suspenzeintenzivní pomnožení cílového mikroorganismu na koncentraci detekovatelnou v izolačním kroku
1. KROK POMNOŽENÍ CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU V POTRAVINĚ V TEKUTÉM MÉDIU
2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z POMNOŽOVACÍHO MÉDIA NA ZTUŽENÉ MÉDIU
Vyočkování z pomnožovacího média na selektivní nebo selektivně-diagnostické půdyNárůst cílového mikroorganismu v jednotlivých typických koloniích
Vyočkování typických kolonií na neselektivní kultivační médium a provedení příslušných biochemických testůPřímé provedení biochemických testů nemusí poskytovat spolehlivé reakce
3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ
Listeria monocytogenesČSN EN ISO 11290-1: Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes – Část
1: Metoda průkazu (aktuální znění ČSN EN ISO 11290-1/Amd 1:2004).
* ALOA – povinný selektivní agar, **Oxford – volitelný selektivní agar
***Vyočkovat z každé plotny nejméně jednu kolonii považovanou za typickou nebo suspektní na živný agar. Další čtyři
kolonie se vyberou až poté, je-li první kolonie negativní. (Pro epidemiologické studie: konfirmace nejméně pěti kolonií. Pokud typických
kolonií méně než pět na misce, vyberou se všechny typické nebo suspektní ke konfirmaci.)
zaočkujeme 0,1 ml
25g vzorku + 225 ml ½ Fraser (poloviční Fraser)
kultivace 30 ˚C, 24 h
10 ml plný Fraser
kultivace 37 ˚C, 24 h
Sterilní očkovací kličky s očkem o objemu
10 µl
ALOA*
37˚C, 24±3 h
Oxford**
37˚C, 24±3 h
Výběr typických (příp. atypických)
kolonií pro konfirmaci***
Biochemické testy (37 °C, 24 h)
ALOA*
37˚C, 24±3 hOxford**
37˚C, 24±3 h
TSYEA
37˚C, 24±3 hTSYEA
37˚C, 24±3 h
TSYEA
37˚C, 24±3 h
TSYEA
37˚C, 24±3 h
Vyhodnocení biochemických
testů
1. den
2. den
3. den
4. den
5. den
6. den
Výběr typických (příp. atypických)
kolonií pro konfirmaci***Sterilní očkovací kličky s očkem o objemu 10 µl
Biochemické testy (37 °C, 24 h)
Vyhodnocení biochemických
testů
Selektivní
předpomnožení
(pre-enrichment)
Selektivní
pomnožení
(enrichment)
Izolace na
selektivní ztužená
média
Přeočkování na
neselektivní agar
Konfirmační testy
Vyhodnocení testů
Selektivní
předpomnožení
(pre-
enrichment)
Izolace na
selektivní
ztužená média
Přeočkování
na
neselektivní
agar
Konfirmační
testy
Vyhodnocení
testů
Horizontální metoda průkazu
Primární pomnožení: X g, ml potraviny + 9X mlpomnožovacího média POLOVIČNÍ BUJÓN DLE FRASER (poloviční koncentrace inhibujících složek- akriflavin, kyselina nalidixová - opatrné pomnožení stresovaných mikroorganismůKultivace: 30 °C, 24 h ±3 hodiny
Sekundární pomnožení: přenos 0,1 ml z primárně pomnožené suspenze do 10 ml plného Fraserova bujónu (plná koncentrace inhibujících látek)Kultivace: 35/37 °C, 48 ±3 hodiny
1. KROK POMNOŽENÍ LISTERIA MONOCYTOGENES PŘÍTOMNÉ V POTRAVINĚ V TEKUTÉM MÉDIU
2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z POMNOŽOVACÍHO MÉDIA NA ZTUŽENÉ MÉDIU
Vyočkování z obou pomnožovacích médií na plotnu dvou selektivních ztužených půd - povinná půda ALOA (kultivace: 37 °C, 24 ±24 hodiny)+ druhá volitelná půda (Oxford agar, Palcam agar)
Příklad: ISO 11290-1:1996: Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes - Část 1: Metoda průkazu
L. monocytogenes – bujón dle FraseraPomnožovací médium: bujón podle FraseraSložení (g/l):Proteose peptone 5.0; pepton z kaseinu 5.0; kvasniční extrakt 5.0; masový exktrakt 5.0; NaCl 20.0; hydrogenfosforečnan disodný 9.6; dihydrogenfosforečnan draselný 1.35; eskulin 1.0; chlorid lithný 3.0. pH: 7.2 ± 0.2 at 25°C.Suplementy: Suplement citrát amonno-železitý: 500 mg/l pro poloviční Fraserův bujón Selective Supplement:akriflavin 12.5 mg; kyselina nalidixová 10 mg /l pro poloviční Fraserův bujón
Vysoký obsah živinPufrovací systém - udržování stálého pH, které se měnívlivem biochemické činnosti rostoucích mikroorganismůInhibiční látky inhibice doprovodné mikroflóry aněkterých druhů listeriíDetekce β-D-glukosidázy rodu Listeria:Glukóza eskulin je štěpen na eskuletin, který s železitýmkationtem tvoří komplex – v průběhu růstu L.monocytogenes dochází ke zčernání média
http://www.solabia.fr/solabia/produitsDiagnostic.nsf/SW_PROD/B65A7945AE2BC87AC12574C6002FD7BD?opendocument&LG=EN&
L. monocytogenes – ALOA agarALOA agar (agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho) – složení báze g/l agar-agar 13.0
Pepton z masa 18.0 Pepton z kaseinu 6.0 Kvasničný extrakt 10.0
Pyruvát sodný 2.0 Glycerofosforečnan hořečnatý 1.0
glukóza 2.0
Ochrana přes letálním účinkem inhibičních látek bohaté na živiny
NaCl 5.0 Hydrogenfosforečnandisodný 2.5
pufrovací systém
chlorid lithný 10.0 Síran hořečnatý 0.5 inhibice doprovodné mikroflóry
Selektivní suplement (mg/l): Amphotericin B 10 mg; Ceftazidim 20 mg; Sodná sůl kyseliny nalidixové 20 mg; Polymyxin B síran 76700 U.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranosid 0.05; Chromogenní substrát – detekce β-D-glukosidázové aktivityRod Listeria má β-D-glukosidázovou aktivitu – tvorba modrozelených kolonií
Detekční systém
Obohacovací suplement (g/l): L-α-fosfatidylinositol 2 gDetekce enzymu fosfatidylinositol fosfolipázy C (PI-PLC) - virulenčního faktoru L. monocytogenes Fosfolipázová aktivita L. monocytogenes – průhledná haló zóna kolem kolonií (pro L. ivanovii tvorba zpožděná)
ALOA agar – L. monocytogenesALOA agar (agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho)
Růst Vzhled
L. monocytogenes Výborný Modrozelené kolonie Haló zóna
L. ivanovii Výborný Pokud haló zóna, tak po 48 hodinách
L. inocua Zpomalený Bez haló zóny
L. seeligeri inhibovaný Bez haló zóny
Listeria monocytogenes ATCC 13932 Listeria innocua ATCC 33090
Typické kolonie branépro další konfirmaci:Modrozelené kolonie s haló zónou – nutno potvrdit (mohou být L. monocytogenes, L. ivanovii či některé bacily)
L. monocytogenes - Oxford agar Oxford agar – složení báze g/l agar-agar 13.0
Pepton 23.0 škrob 1.0 méně výživný agar
NaCl 5.0
Chlorid lithný 10.0 inhibice doprovodné mikroflóry a některých druhů listerií
Selektivní suplement (mg/l): Cycloheximid 200.0 mg, kolistin sulfáte 10.0 mgAcriflavin 2.5 mg, Cefotetan 1.0 mg, Fosfomycin 5.0 mg
eskulin 1.0; citrát amonno-železitý 0.5 L. monocytogenes hydrolyzuje eskulin na eskuletin, který tvoří černý komplex s železitými kationty – tvoří hnědo-zelené kolonie s haló efektem
Detekční systém
Listeria monocytogenes ATCC 19118
Listeria innocua ATCC 33090
L. monocytogenes - PALCAM agar Oxford agar – složení báze g/l agar-agar 13.0
Pepton 23.0; glucose 0.5; starch 1.0 živiny
Kvasničný extrakt 3.0; NaCl 5.0
lithium chloride 10.0 inhibice doprovodné mikroflóry a některých druhů listerií
Selektivní suplement (mg/l): Polymyxin B sulfate 5.0 mg, Ceftacidime 12.0 mgAcriflavine 2.5 mg
eskulin 1.0; citrát amonno-železitý 0.5 L. monocytogenes hydrolyzuje eskulin na eskuletin, který tvoří černý komplex s železitými kationty – hnědo-zelené kolonie s černou haló zónou
Detekční systém
D(-)mannitol 10.0; phenol red 0.08.Odlišení manitol pozitivních G+ bakterií (např. stafylokoky, enterokoky) –žlutý nárůst
Listeria monocytogenes ATCC 19118
Listeria innocua ATCC 33090
Horizontální metoda průkazuPříklad: ISO 11290-1:1996: Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes - Část 1: Metoda průkazu
3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ
Vyočkování 1-5 typických kolonií na neselektivní kultivační ztužené médium TSYEA (Agar s tryptonem, sójovým peptonem a kvasničným extraktem) Z každé plotny selektivního agaru vzít jednu a při negativním potvrzení až do pěti typických koloniíKultivace: 37 °C, 24 ±3 hodinya provedení příslušných biochemických testůBiochemické testy pro potvrzení rodu ListeriaGramovo barvení: G+ štíhlé, krátké tyčinkyKataláza pozitivníMotilita – Listeria spp. jsou pohyblivé při 25 °C
Biochemické testy pro potvrzení druhu Listeria monocytogenes
KTJ
Hemolýza Produkce kyseliny z CAMP test
Druh Rhamnózy Xylózy S. aureus R. equi
L. monocytogenes + + - + -
Konfirmace rodu ListeriaVýběr pro konfirmaci:Z každé plotny selektivního agaru vzít jednu a při negativním potvrzení až do pěti typických koloniíKonfirmační biochemické testy nutno provádět s kulturami narostlými za optimálních, nezátěžových podmínekINKUBACE NA SELEKTIVNÍCH PŮDÁCH ZATĚŽUJE I CÍLOVÉ MIKROORGANISMY, PROVÁDĚNÉ TESTY MOHOU POSKYTOVAT NESPOLEHLIVÉ REAKCE
Inokulace na TSYEA (trypton-sójový agar s kvasničnímextraktem)
Živiny (g/l): trypton 17.0, pepton ze sóji 3.0, kvasničný extrakt 6.0, glukóza monohydrát 2.5, Osmotický a pufrovací systém: hydrogenfosforečnan disodný 2.5, NaCl 5.0, Bakteriologický agar 15.0, (g/l)Inkubace: 35 °C nebo 37 °C, 18-24 h či déle, až je nárůst dostatečný
KTJ
Rodová konfirmaceGramovo barvení: G+ štíhlé, krátké tyčinkyKataláza pozitivníKataláza: enzym, který katalyzuje rozklad toxického peroxidu vodíku na vodu a kyslík
Konfirmace rodu Listeria
2 H2O + O22 H2O2
katalázabubliny
Průkaz katalázy – do kapky 3%peroxidu vodíku přeneseme kličkou vyšetřovanou kolonii. V pozitivním případě se uvolňují bublinky kyslíku.
Motilita – Listeria spp. jsou pohyblivé při 25 °CPřímý test za použití mikroskopie1 kolonie suspendována ve zkumavce s trypton-sójovým bujónem skvasničným extraktem a inkubována při 25 °C, 8 - 24 h - pohyb jesledován po nakápnutí kultury na podložní sklíčkoAgar pro motilituInokulace vpichem, inkubace 48 h (až pět dnů, pokud není růstdostatečný) při 25 °C – typický nárůst podél vpichu ve tvaru„deštníku“ – důsledek motility
Konfirmace L. monocytogenesHemo
lýzaPozn.
Druh
L. monocytogenes + úzké, jasné, světlé zóny β-hemolýzy
L. innocua - bez hemolýzy
L. ivanovii + široká, neohraničená zóna β-hemolýzy
L. seeligeri + slabá zóna β-hemolýzy
L. welshimerii (+) hemolýza: degradace hemoglobinu či lýze erytrocytů přidaných do půdy (hemolýza) :α- hemolýza - viridace - tvoří se meziprodukty (zelenohnědé zbarvení)/β- hemolýza - projasnění půdy způsobené difúzí uvolněného hemoglobinu do okolí/γ - negativní hemolýza -barva půdy beze změny
L. grayi subsp.grayi
-
L. grayi subsp.marrayi
-
Inokulace na krevní agar společně s pozitivní (L. monocytogenes) a negativní (L. innocua) kontrolou, inkubace při 35 nebo 37 °C, 24±2 h
V: variabilní reakce, (+): slabá reakce, +: > 90 % kmenů pozitivní reakce, -: žádná reakce
Poznámka : Vzácně existují kmeny L. monocytogenes, které nevykazují β-hemolýzu anebo pozitivní reakci CAMP testu za podmínek daných normou ISO 11290.
Konfirmace L. monocytogenes
L. monocytogenes
Staphylococcus aureus
L. inocua
L. ivanovii
Testovaný izolát (L. inocua)
Rhodococus equi
Krevní agar
1-2 mm
1 cm
Test dle Christie-Atkins-Munch-Peterson = (CAMP) test β-hemolytický Staphylococcus aureus a nehemolytický Rhodococcus equiInkubace při 35° C, 24-48 hL. monocytogenes (listeriolysin O způsobuje hemolýzu erythrocytes) a hemolytické reakce L. seeligeri jsou slabě zvýrazněny v zóně v blízkosti S. aureus čáry, zatímco hemolytická reakce L. ivanovii je silně zvýšena v zóně R. equi.Ostatní druhy netvoří hemolýzu anebo pouze slabou hemolýzu bez synergestického efektu (L. welshimerii).
Konfirmace L. monocytogenesHemolýza Produkce kyseliny z CAMP test
Druh Rhamnózy Xylózy S. aureus R. equi
L. monocytogenes + + - + -
L. innocua - V - - -
L. ivanovii + - + - +
L. seeligeri + - + (+) -
L. welshimerii (+) V + - -
L. grayi subsp.grayi
- - - - -
L. grayi subsp.marrayi
- V - - -
V: variabilní reakce, (+): slabá reakce, +: > 90 % kmenů pozitivní reakce, -: žádná reakce
Poznámka : Vzácně existují kmeny L. monocytogenes, které nevykazují β-hemolýzu anebo pozitivní reakci CAMP testu za podmínek daných normou ISO 11290.
Produkce kyseliny z cukrů: L-rhamnóza, D-xylóza
Inokulace do média s jednotlivými cukry, inkubace při 35 °C nebo 37 °C až 5 dnů
Média obsahují acidobazický indikátor – pozitivní reakce (tvorba kyseliny) je indikována změnou barvy z fialové na žlutou, obvykle během 24 až 48 hodin
Konfirmace L. monocytogenesAPI Listeria – 24 hodinová identifikace všech druhů Listeria sp.Výrobce Biomérieux – patentované biochemické testy (DIM)Miniaturizované biochemické testy jsou zaočkovány inokulem o nízké bakteriální koncentraci (0.5 McFarland)
SinglePath L.Mono
Příklad LFA (lateral flow assay) – imunochemická metodadetekce Listeria monocytogenes po pomnožení veFraserově bujónu aneb BLEB bujónu
SalmonellaČSN EN ISO 6579 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu bakterií rodu Salmonella
* XLD – povinný selektivní agar, **BGA – volitelný selektivní agar
***Vyočkovat z každé plotny nejméně jednu kolonii považovanou za typickou nebo suspektní na živný agar. Další čtyři
kolonie se vyberou až poté, je-li první kolonie negativní. (Pro epidemiologické studie: konfirmace nejméně pěti kolonií. Pokud typických
kolonií méně než pět na misce, vyberou se všechny typické nebo suspektní ke konfirmaci.)
zaočkujeme 0,1 ml
25g vzorku + 225 ml PPV (pufrovaná peptonová voda)
kultivace 37 ˚C, 18±2 h
zaočkujeme 1 ml
10 ml Müller - Kauffman
kutivace 37 ˚C, 24±3 h
10 ml Rappaport - Vasilliadis
kultivace 41˚C, 24±3 h
Sterilní očkovací kličky s očkem o objemu 10 µl
XLD*
37˚C, 24±3 hBGA**
37˚C, 24±3 h
Výběr typických (příp. atypických) kolonií pro konfirmaci***
Biochemické testy (37 °C, 24 h), sérologická konfirmace, sérotypizace
Neselektivní
pomnožení
(pre-enrichment)
Selektivní
pomnožení
(enrichment)
XLD*
37˚C, 24±3 hBGA**
37˚C, 24±3 h
Izolace na
selektivní ztužená
média
živný agar
37˚C, 24±3 h
Přeočkování na
neselektivní agar
Konfirmační testy
živný agar
37˚C, 24±3 h
živný agar
37˚C, 24±3 hživný agar
37˚C, 24±3 h
1. den
2. den
3. den
4. den
Vyhodnocení biochemických testů
5. den
Vyhodnocení testů 6. den
SalmonellaPufrovaná peptonová vodaSložení (l) : pepton 10 g; NaCl 5 g; dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného 9 g; dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 g.Pepton bohatý na obsah živin umožňuje resuscitaci buněk, subletálně poškozených či oslabených vlivem zacházení s potravinou či přídavkem konzervačních látek.Fosfátový pufrovací systém chrání bakterie před změnami pH v médiu v důsledku metabolismu , které by jinak nastaly v důsledku metabolismu rostoucích buněk.
RAPPAPORT a VASSILIADIS (RVS Broth) obohacené bujóny pro salmonely Složení (l): pepton ze soji 4,5 g, hexahydrát chloridu hořečnatého 29 g; NaCl 8 g; hydrogenfosforečnandidraselný 0,4 g; dihydrogenfosforečnan draselný 0,6; malachitová zeleň 0,036 g.pH: 5.2 ± 0.2 at 25°C, kultivace 41˚C, 24±3 hSelektivní podmínky pro růst salmonel v přítomnosti doprovodné bakteriální mikroflóry, zvláště Enterobacteriaceae) - vyšší rezistence k malachitové zeleni a vyššímu osmotickému tlaku (přídavek chloridu hořečnatého), nízkému pH, vyšší teplotě a nižším nároku na živiny (pepton ze sóji). Fosfátový pufrovací systém. RVS bujón není vhodný pro selektivní pomnožení S. typhi and S. paratyphi A.
MULLER-KAUFFMANN (MK) bujón s tetrathionanemSložení média (l): masový extrakt 0,9 g; pepton z masa 4,5 g; kvasničný extrakt 1,8 g; NaCl 4,5 g; uhličitanvápenatý 25,0; thiosíran sodný 40,7 g; volská žluč 4,75 g. Přidává se jodid draselný 5 g; jód 4 g abriliantová zeleň 0,01 g.pH: 7.6 ± 0.2 at 25 °C, kultivace 37 ˚C, 24±3 hInhibice doprovodné mikroflóry: žluč, briliantová zeleň – G+ bakterie, tetrathionan (tvořen z thiosíranupřídavkem jódu) –koliformní a dalších enterobakterie. Salmonella, Proteus a další druhy redukujítetrathionan za vzniku kyseliny sírové (následně pufrována uhličitanem vápenatým).
Buffered Peptone Water (BPW)
pH: 7.0 ± 0.2 at 25 °C.
Pufrovaná peptonová vodaSložení (l) : pepton 10 g; NaCl 5 g; dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného 9 g; dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 g.Pepton bohatý na obsah živin umožňuje resuscitaci buněk, subletálně poškozených či oslabených vlivem zacházení s potravinou či přídavkem konzervačních látek.Fosfátový pufrovací systém chrání bakterie před změnami pH v médiu v důsledku metabolismu , které by jinak nastaly v důsledku metabolismu rostoucích buněk.
Rappaport-Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth
http://www.kisanbio.com/shopimages/kisanbiotech/0390100000492.jpg
RAPPAPORT a VASSILIADIS (RVS Broth)
obohacené bujóny pro salmonely
Složení (l): pepton ze soji 4,5 g, hexahydrát
chloridu hořečnatého 29 g; NaCl 8 g;
hydrogenfosforečnan didraselný 0,4 g;
dihydrogenfosforečnan draselný 0,6; malachitová
zeleň 0,036 g.
pH: 5.2 ± 0.2 při 25°C, kultivace 41˚C, 24±3 h
Selektivní podmínky pro růst salmonel v přítomnosti doprovodné bakteriální
mikroflóry, zvláště Enterobacteriaceae vyšší rezistence k malachitové zeleni a
vyššímu osmotickému tlaku (přídavek chloridu hořečnatého) nízkému pH, vyšší
teplotě a nižším nároku na živiny (pepton ze sóji). Fosfátový pufrovací systém. RVS
bujón není vhodný pro selektivní pomnožení S. typhi and S. paratyphi A.
MULLER-KAUFFMANN (MK) bujón s tetrathionanemSložení média (l): masový extrakt 0,9 g; pepton zmasa 4,5 g; kvasničný extrakt 1,8 g; NaCl 4,5 g;uhličitan vápenatý 25,0; thiosíran sodný 40,7 g;volská žluč 4,75 g. Přidává se jodid draselný 5 g; jód 4g a briliantová zeleň 0,01 g.pH: 7.6 ± 0.2 at 25 °C, kultivace 37 ˚C, 24±3 hInhibice doprovodné mikroflóry: žluč, briliantovázeleň – G+ bakterie, tetrathionan (tvořen z thiosíranupřídavkem jódu) –koliformní a dalších enterobakterie.Salmonella, Proteus a další druhy redukujítetrathionan za vzniku kyseliny sírové (následněpufrována uhličitanem vápenatým).
Muller-Kauffmann Tetrathionate-Novobiocin Broth (MKTTn)
1. Salmonella (turbidity and
decoloration)
2. Shigella (turbidity and
turquois)
3. Other Enterobacteriaceae
(without turbidity)
http://www.medioscultivo.com/tetrathionate-broth-mueller-kauffman-verde-brillante-base/
1. 2. 3.
A sediment of calciumcarbonate appears in the turbid broth at the bottom of the tubes
Salmonella – XLD agar
Vzhled kolonií Mikroorganismy
Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné se
zónami precipitace
Escherichia coli, Enterobacter,
Aeromonas
Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné, na
povrchu slizké se zónami precipitace
Klebsiella
Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné,
mohou mít černý střed
Citrobacter
(laktosa-positivní kmeny)
Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné Serratia, Hafnia
Žluté, obklopené žlutými zónami, průsvitné s
černými středem
Proteus vulgaris,
nejčastěji Proteus mirabilis
Kolonie mající stejnou barvu jako agarové médiem,
průsvitné
Shigella, Providencia,
Pseudomonas
Kolonie mající stejnou barvu jako agarové
médiem, průsvitné, s černým středem
Typické kolonie Salmonella
H2S+, XYL -, LAC -, SAC -
Oranžové, lehce neprůsvitné Salmonella Typhi
(xylóza-pozitivní kmeny)
Růžové kolonie s tmavším růžovým středem Sulfan neprodukující salmonely
(S. Paratyphi A)
Žluté kolonie, které mají nebo nemají černý střed Laktóza pozitivní salmonely
Xylóza Lysin Deoxycholát Agar (XLD)Složení média (l): kvasničný extrakt 3 g; NaCl 5 g; D(+) xylóza 3,75 g; laktóza 7,5 g;sacharóza 7,5 g; L(+) lysin 5 g; deoxycholát sodný 1 g; thiosíran sodný 6,8 g; citrátželezitoamonný 0,8 g; fenolová červeň 0,08 g; agar-agar 14,5 g.Zkvašování cukrů (xylóza, laktóza a sacharóza) za vzniku kyselin = zežloutnutíacidobazického indikátor fenolová červen. Produkce sulfanu v přítomnosti thiosíranusodného a železitých solí - tvorba precipitátu černého sulfidu železitého ve středukolonií. Dekarboxylace lysinu na kadaverin – zvýšení pH vede ke vzniku fialovéhozabarvení kolem kolonií (acidobazický indikátor).
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Salmonella enteritidis NCTC 5188
Salmonella enteritidis NCTC 5188
Vzhled kolonií Mikroorganismy
Světle růžové, průsvitné, obklopené červenými zónami
Laktóza-negativní:
Salmonella, výjimečně
Proteus a Citrobacter
Žlutozelené, neprůsvitné,
obklopené žlutozelenými
zónami
Laktóza-pozitivní:
E. coli, Enterobacter,
Klebsiella. Ostatní jsou
převážně inhibovány.
Brilliant-green agar BGA (Agar s briliantovou zelení, fenolovou červení a laktózou) Složení média (l): pepton z masa 7 g; NaCl 5 g; laktóza 15 g; fenolová červeň 0,04 g; brilliantová zeleň 0,005 g; agar-agar 13 g. Inhibiční systém: briliantová zeleň – G+ bakterie, též Salmonella Typhi a rod Shigella, 0,2 % deoxycholátu sodného – inhibice plazivosti kolonií rodu ProteusDiagnostický systém:zkvašování laktózy je indikováno zežloutnutím acidobazického indikátoru fenolové červeně z červené na žlutou (v alkalickém prostředí tmavě červený)
Salmonella typhimurium ATCC 14028
Salmonella – BG agar
Kmeny Salmonella spp.
S. Typhi S. Parathypi A S. Parathypi B S. Parathypi C Ostatní kmeny
reakce % reakce % reakce % reakce % reakce %
TSI: tvorba kyseliny z glukózy
+ 100 + 100 + + + 100
TSI: tvorba plynu z glukózy
- 0 + 100 + + + 92
TSI: tvorby kyseliny z laktózy
- 2 - 100 - - - 1
TSI: tvorba kyseliny ze sacharózy
- 0 - 0 - - - 1
TSI: tvorba sirovodíku
+ 97 - 10 + + + + 92
Štěpení močoviny - - 0 - - - - 1
Dekarboxylace lyzinu
+ - 0 + + + + 95
Tvorba β-galaktozidázy
- - 0 - - - - 2
Voges-Proskauerovareakce
- - 0 - - - - 0
Tvorba indolu - - 0 - - - - 1
Biochemická konfirmace Salmonella spp.
• Izolace charakteristických kolonií na neselektivní média – živný agar (37±°C, 24± 3h)
• Konfirmace:
• Biochemická (37±°C, 24± 3h)
• TSI
• Urea agar (Christensen)
• L-lysin dekarboxylasa
• β-galaktosidasa (ONPG)
• VP test
• Indol test
• Motile (semi-solid nutrient agar)
• Sérologická (37±°C, 24± 3h)
• O antigeny (somatické)
• H antigeny (flagelární)
• Vi antigeny (kapsulární)
• fáze I
• fáze IIhttp://www.keydiagnostics.com.au/images/stories/virtuemart/product/microgen-salmonella-latex-kit.jpg
https://classconnection.s3.amazonaws.com/74/flashcards/1275074/jpg/biochemical_test_results-_shigella1332821047536.jpg
Biochemická konfirmace Salmonella spp.
Biochemická konfirmace Salmonella spp.• TSI Triple Sugar Iron Agar – agar s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým
- detekce fermentace glukózy, sacharózy a/nebo laktózy s produkcí či bez produkce plynu, detekcetvorby sulfanu z thiosíranu v kyselém prostředí
Složení / litrEnzymatická trávenina kaseinu...5 gEnzymatická trávenina zvířecí tkáně.... 5 gPepton s kvasničným extraktem..... 10 gDextróza ...... 1 gLaktóza..... 10 gSacharóza..... 10 gCitran železito-amonný... 0.2 gChlorid sodný...... 5 gThiosíran sodný............ 0.3 gFenolová červeň....... 0.025 gAgar ....... 13.5 gVýsledné pH: 7.3 ± 0.2 při 25 °C
Inokulace sloupce vpichemInokulace na povrch• Fermentace dextrózy (glukózy)
na kyselinu• anaerobně – pokles pH = žlutý
sloupec• Aerobně – vznik produktů, které
jsou na vzduchu dále oxidovány a pH zůstává zásadité = červený povrch
• Fermentace glukózy na plyn(anaerobně – ve vpichu)Trhliny, bublinky ve sloupci v místě vpichu a kolem• Tvorba sulfanu (H2S) – reakce se síranem želzitým a thiosíranem sodným – vznik černého precipitátu ve sloupci • Fermentace laktózy a/nebo sacharózyAerobně i anaerobně - Tvorba kyseliny – žlutý sloupec i povrch
Bakterie fermentující laktózu a/nebo sacharózu jsou schopny fermentovat též glukózu
Fenolová červeňAlkalické prostředí = červená, kyselé prostředí = žlutá
• TSI Triple Sugar Iron Agar – agar s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým
- detekce fermentace glukózy, sacharózy a/nebo laktózy s produkcí či bez produkce plynu, detekcetvorby sulfanu z thiosíranu v kyselém prostředí
Biochemická konfirmace Salmonella spp.
Agar s močovinou (Christensenův agar)- detekce štěpení močoviny ureázou za vzniku amoniaku a oxid
uhličitého
http://image.slidesharecdn.com/lab17-141201085153-conversion-gate01/95/-10-638.jpg?cb=1417424219
http://image.slidesharecdn.com/helicobacterpylori-copy-110516201901-phpapp01/95/campylobacter-jejunihelicobacter-pylori-39-728.jpg?cb=1305577391
Fenolová červeň:
Kyselé prostředí - žluté
(pH 6.8±0.2)
Zásaditá reakce v důsledku hydrolýzy močoviny –růžová barva
Složení g/l
Pepton ze zvířecí tkáně 1.000
Dextróza 1.000
Chlorid sodný 5.000
Hydrogenfosforečna disodný
1.200
Dihydrogenfosforečnan draselný
0.800
Fenolová červeň 0.012
Agar 15.000
Výsledné pH (25°C) 6.8±0.2
35-37 °C
Biochemická konfirmace Salmonella spp.
• Test na tvorbu indolu- detekce štěpení tryptofanu na indol
Složení g/l Trypton 10.00 L-Tryptofan 1.00 Chlorid sodný 5.00 Výsledné pH 7.5 ± 0.1 (25 °C)
http://www.microbiologyinfo.com/indole-test-principle-reagents-procedure-result-interpretation-and-limitations/
Tvorba indolu z tryptofanu
Inokulace tekutého média pro detekci tvorby indolu
Produkce indolu je detekována Kovacsovým činidlem
Kovácsovo činidlo
p-dimethylaminobenzaldehyd 50.0 gm
HCl, 37% 250.0 ml
amylalkohol 750.0 ml
Biochemická konfirmace Salmonella spp.
• L-lysin dekarboxyláza
- Detekce dekarboxylace lysinu na kadaverin (anaerobně – po inokulace do tekutého média je překry
sterilní parafínovým olejem)
http://fce-study.netdna-ssl.com/images/upload-flashcards/1029530/2332621_m.jpg
+ CO2 + OH-
Lysine Decarboxylase BrothTypical Composition (g/litre)Pepton ze zvířecí tkáně 5.000;Kvasničný extrakt 3.000;Dextróza1.000 (glukóza připravená ze škrobu, chemickyekvivalentní glukóze); L-Lysin hydrochlorid 5.000; bromokresolová červeň 0.020Výsledné pH (25 °C) 6.8±0.2
Dvoustupňová detekce:1. stupeňDextróza je fermentována za vzniku kyseliny – v kyselém prostředí bromokresolová červeň zežloutně –teprve v kyselém prostředí dochází k aktivaci lysindekarboxylázy 2. stepL-lysin je dekarboxylován za vzniku OH- - v alkalickém prostředí bromokresolová červeň mění svou barvu zpět do fialovo-červené Za předpokladu viditelného nárůstu kultury je výsledná fialovo-červená barva bujónu důkaz pozitivní reakce, žlutá barva bujónu důkaz negativní reakce
Biochemická konfirmace Salmonella spp.
• β-galactosidáza (ONPG) (use a 1 μl loop full)- stanovení přítomnosti ß-galaktosidázy za využití o-nitrofenyl-beta-D-galactopyranosidu (ONPG).- ONPG je hydrolyzováno na žlutý o-nitrofenol a galaktózu
ONPG je strukturně podobný laktóze, ONPG je bezbarvá sloučenina, O-nitrofenol je žlutý – vizualizace hydrolýzy
Laktózu fermentující bakterie (ONPG positive):Dva enzymyPermeáza – přenos molekul laktózy do buňkyβ-galactosidáza – štěpení galaktosidové vazby za vzniku glukózy a galaktózy, indukovatelný enzym, tvořený pouze v přítomnosti laktózyKoliformní bakterie jako E.coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp.
hydrolysis
Bakterie se zpožděnou fermentací laktózyPermeáza – není přítomnaβ-galactosidase – přítomnaONPG test je pozitivní, ale pozitivní reakce je zpožděnáCitrobacter spp., Arizona spp,
Laktózu nefermentující bakterie (ONPG Negative):Permeáza – není přítomnaβ-galactosidáza– není přítomnaSalmonella spp; Shigella spp; Proteus spp;Providencia spp., Morganella spp. a další
supenze ve fyz. roztoku + toluen + substrát ONPG
Biochemická konfirmace Salmonella spp.
• Voges–Proskauerův (VP) test
Detekce produkce acetylmethylkarbinolu (acetoinu) při fermentaci glukózy
Detekce acetoinu: acetoin je přeměněn na diacetyl v přítomnost in the ∝-
naphthol (VP činidlo I – nutno přidat jako první), silné zásady (VP činidlo II -
40% KOH) a kyslíku. Diacetyl a sloučeniny obsahující guanidin, které se
vyskytují v peptonech, poté kondenzují za vzniku růžovo-červeného polymeru.
MRVP bujón (pH 6.9)pepton = 7.0 g/lglukóza = 5.0 g/lhydrogenfosforečnan draselný = 5.0 g/l
Voges-Proskauer činidlo I(Barrittovo činidlo A)
Alfa-Nafthol, 5% 50 gm
Absolutní ethanol1000
ml
Voges-Proskauer činidlo II (Barrittovo činidlo B)
Hydroxid draselný 400 gm
Deionizovaná voda 1000 ml
Postup VP Testu
1.Inokulace čerstvé kultury
do MRVP bujónu.
2.Inkubace: 37 °C, 24 hod.
3. Přidat 6 kapek činidla VP I
a dobře promíchat (aerace).
4.Přidat 6 kapek činidla VPII
a dobře promíchat (aerace).
5.Pro pozitivní reakci tvorba
červeného zabarvení v
průběhu 30 minut.
Pozitivní reakce:Růžovo-červená zbarveníNapř. : viridantní streptokoky (except Streptococcus vestibularis), Listeria, Enterobacter, Klebsiella, Serratia marcescens, Hafnia alvei, Vibrio eltor, Vibrio alginolyticus, etc.Negativní reakce:Bez růžovo-červeného zbarveníNapř. : Streptococcus mitis, Citrobacter sp., Shigella, Yersinia, Edwardsiella, Salmonella, Vibrio furnissii, Vibrio fluvialis, Vibrio vulnificus, and Vibrio parahaemolyticus etc.A copper color should be considered negative. A rust color is a weak positive reaction.Kontrola kvalityVP positivní: Enterobacter aerogenes (ATCC13048)VP negativní: Escherichia coli (ATCC25922)
+ -
Biochemická konfirmace Salmonella spp.
• Miniaturizované komerční soupravy
• API 20E - souprava 20 biochemických reakcí pro identifikace Enterobacteriaceae adalších nenáročných gramnegativních tyčinek (BioMerieux)
http://www.retroscope.eu/wordpress/wpcontent/uploads/2010/10/SalmonellaAPI20E.jpg
• Miniaturizované komerční soupravy
• EnteroTest 24 (Erba Lachema, ČR) –
souprava 24 biochemických reakcí pro
rutinní identifikaci významných druhůstřevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae
ENTEROTEST 24Souprava ENTEROtest 24 je určena pro rutinní identifikaci významných druhů střevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae pomocí 24 biochemických testů.
Pro přípravu testu: zákalu, který odpovídá stupni 1 McFarlandovy zákalové stupnice, tj. cca 3 x 108 buněk v ml (zákal stupně 1 je definován zákalem, který vytvoří sraženina BaSO4 při smíchání 0,1 ml roztoku 1 % bezvodého BaCl2 a 9,9 ml 1 % H2SO4)
ENTEROTEST 24
Zkvašování cukrů
Zkvašování cukrů
dekarboxylace
deaminace
Hydrolýza eskulinu
Schopnost růst na citrátu jako jediném zdroji C (půda: Simonsův citrát)utilizace malonátu
Biochemické testyErba LachemaANAEROtest 23 - anaerobní bakterie, vyskytujících se nejčastěji v klinickém materiálu a v potravinách. NEFERMtest 24 - gramnegativní nefermentující bakterie a čeleď Vibrionaceae, Aeromonadaceae a druhu Plesiomonas shigelloides. STAPHYtest 24 - rod Staphylococcus a další grampozitivní kataláza pozitivní koky.STREPTOtest 24 - rody Streptococcus a Enterococcus a další grampozitivních kataláza negativní koky.CANDIDA-Screen je určena pro screeningové rozlišení nejčastěji se vyskytujících klinicky významných druhů kvasinek, CANDIDAtest 21 - rutinní identifikace kvasinek převážně z klinického materiáluBiomérieuxAPI® Gram negative Identification (např. API Listeria – 24-hour identification of all Listeria species), API® Gram positive Identification, API® Anaerobe Identification a další…. API 20E – Enterobacteriacae a další nenáročné gramnegativní bakterie
Microgen™Microgen™ Bacillus – identifikace mezofilních druhů rodu Bacillus
http://www.retroscope.eu/wordpress/wpcontent/uploads/2010/10/SalmonellaAPI20E.jpg
Sérologická konfirmace Salmonella spp.Sérotypizace - Kaufmann-Whiteovo schéma salmonely rozděluje podle antigenních vlastností a jejich kombinací, čímž je pro každý sérotyp vytvořena
specifická antigenní formule. Antigeny se nacházejí v buněčné stěně (somatické O-Antigeny), v bičících (flagelární H-antigeny) a
v kapsulích (Vi Antigeny). Somatické O-Antigeny jsou endotoxickou součástí lipopolysacharidových struktur, které se nachází na vnější
straně buněčné stěny. Vyvolávají specifickou imunitní reakci systému a zároveň jsou faktory patogenity, neboť chrání bakterie před bakteriolytickým účinkem komplementu. Podjednotky O-antigenu jsou tvořeny několika sacharidovými zbytky, jejich pořadí pak určuje variabilnost O-antigenu. Jeho variabilita nám umožňuje rozlišovat až 67 séroskupin, které značíme písmeny nebo číslicemi.
Bičíkové H-antigeny se vyskytují u pohybu schopných salmonel, tento antigen je tvořen z bílkovin, převážně flagelinem. Bičíkové H-antigeny mají dvě rozdílné antigenní fáze (první specifická fáze H1 a druhá nespecifická fáze H2). Odlišují se primární strukturou, která je způsobena střídavou expresí jednotlivých genů řídících tvorbu bičíků. Můžeme se setkat i s monofázními izoláty, u nichž se vyskytuje pouze jeden typ bičíkového H-antigenu. Rozlišujeme celkem 89 typů H-antigenu.
Kapsulární Vi antigeny jsou složeny z pouzderných povrchových polysacharidů a jsou zodpovědné za virulenci. Jsou charakteristické pro sérovary S. Typhi, S. Dublin a S. Hirschfeldii.
Sérologická konfirmace Salmonella spp.
Sklíčková aglutinace:Někteří bakteriální původci infekčních chorob uvolňují při svém množení v tekutém prostředí nadbytek svých pouzderných antigenů. Antigeny lze prokazovat např. pomocí latexových mikročástic pokrytých protilátkou proti příslušnému antigenu -částice výrazně aglutinují. Některé kmeny jsou schopny autoaglutinace – k aglutinaci dochází i bez přítomnosti antisér (protilátek) – aglutinaci s jednotlivými antiséry poté není možno stanovit.
určení poddruhu (biochemické testy – kmeny různých podruhů mohou mít stejné antigeny)
rozlišení O, H a Vi antigenů aglutinačními testy za použití antisér Rozlišení izolátů s jednou antigenní H fází a s dvěma fázemi – inokulace na
médium, které obsahuje antisérum k určitému H-antigenu. Výsledkem je, že bakterie, které mají pouze tento určitý H-antigen, budou imobilizované antisérem, kdežto bakterie syntetizující také druhý H-antigen, budou pohybu schopné a tak porostou v celém médiu.
Identifikace na základě aglutinace s omnivalentními, polyvalentními, monovalentní O , H a Vi antiséry.
Koagulázapozitivní stafylokokyČSN EN ISO 6888-1 (560092) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovenípočtu koagulázapozitivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další druhy)-Část 1: Technika spoužitím agarové půdy podle Baird-Parkera
Ředící médium: pufrovaná peptonová voda
1. KROK PŘÍPRAVA SÉRIE DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ TESTOVANÉ POTRAVINY
2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z JEDNOTLIVÝCH DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ
0,2 ml testované suspenze rozetřít na plotnu Baird-Parkerova agaru, po rozetření se inokulum nechá vsáknout 15 minut
Kultivace: 37 °C, 48 hodin
Vybrat plotny z dvou po sobě jdoucích ředění vhodné k výpočtu a z nich náhodně vybrat 5 kolonií pro konfirmaci a přeočkovat na a) krevní agar kultivace: 30 °C, 24 hodin - průkaz β hemolýzyb) BHI (brain-heart infusion, mozkosrdcová infúze) kultivace: 37 °C, 24 hodin - průkaz přítomnosti plazmakoagulázy
3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ, STANOVENÍ POČTU KTJ A VÝPOČET KTJ/G NEBO KTJ/ML
BAIRD-PARKER AGAR (BP)Složení (l):Základní půda (l):Pepton z kaseinu 10.0; masový extrakt 5.0; kvasničný extrakt 1.0; pyruvát sodný 10.0; glycin 12.0; chlorid lithný 5.0; agar-agar 15.0.SuplementEmulze vaječného žloutku s teluričitanem Egg-yolk tellurite emulsion 50 ml; pokud požadováno, sulfamethazin 0.05 g/l
Živiny: pepton, masový extrakt, kvasničný extraktInhibice doprovodné mikroflóry: chlorid lithný, terluričitandraselnýResuscitace oslabených buněk: glycin, pyruvát sodnýDiagnostické složky:Lipolýza a proteolýza vaječného žloutku – tvorba projasněných zón (přítomnost lecitinázy, lipázy atd. - typické pro S. aureus)Redukce teluričitanu draselného na telur – vznik černých kolonií
Tvorba projasněných zón kolem černých kolonií je obvykle v souvislosti s pozitivním testem na koagulázu (koagulázapozitivní stafylokoky – S. aureus a další druhy)
Staphylococcus aureus ATCC 25923
http://www.bacteriainphotos.com/photo%20gallery/staphylococcus%20aureus%20baird%20parker.jpg
BAIRD-PARKER AGAR (BP)
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Vzhled kolonií Mikroorganismus
Typické kolonie: Černé nebo šedé, lesklé, vypouklé, 1-5 mm vprůměru, obklopené zónou projasnění 2-5 mm širokou, která může být zčásti matná, po nejméně 24 hod inkubace se může v těsné blízkosti kolonií objevit opalescentní prstenec. Atypické kolonie:Šedé kolonie bez zóny projasnění, nebo černé kolonie s úzkým bílým okrajem nebo bez něj, zóna projasnění chybí nebo je sotva viditelná. Atypické kolonie vytvářejí hlavně kmeny koagulázapozitivních stafylokoků izolovaných z mléčných výrobků, mořských plodů a drobů.
Staphylococcus aureus
Černé, lesklé kolonie, nepravidelného tvaru. Matné zóny se vyvíjejí kolem kolonií po 24 hodinách.
Staphylococcus epidermidis
Občasný růst: velmi malé kolonie, hnědé až černé, bez projasněné zóny
mikrokoky
Tmavě hnědé, zmatnělé zóny se často objevují po 48 hodinách
Bacillus sp.
Bílé, bez projasněných zón Kvasinky
KOAGULÁZOVÝ TEST
http://faculty.mc3.edu/jearl/ML/coagulase.jpg
http://www.mgm.ufl.edu/~gulig/mmid/mmid-lab/images/coag-ex.jpg
Test na produkci koagulázy (enzym schopný koagulovat plazmu) odlišení Staphylococcus aureus (tvorba enterotoxinů, podmíněně patogenní, zdravotní riziko) od méně či zdravotně nezávadných, běžně rozšířených druhů stafylokoků (S. epidermidis, S. saprophyticus), výskyt ostatních koagulázapozitivních stafylokoků (S. schleiferi, S. intermedius) není tak běžný, produkce koagulázy obvykle koreluje s patogenitouS. aureus produkuje dva typy koagulázy
•vázaná koaguláza (též aglutinační faktor) zůstává přichycená k buněčné stěné•volná koaguláza - extracelulární enzym produkovaný při kultivaci v bujónu
Sklíčkový testsmísení husté suspenzeve FR s králičí plazmou„shlukování“ – detekcepouze vázané koagulázy
Zkumavkový test• inkubace kultury (narostlé v BHI, několika kolonií) společně s králičí plazmou• detekce volné i vázané koagulázy
• volná koaguláza reaguje s plazmatickým faktorem za vzniku tzv. stafylotrombinu• stafylotrombin katalyzuje přeměnu fibrinogenu na fibrin (tvorba chuchvalců, sraženin či
úplné ztuhnutí plazmy ve zkumavce)
Hemolýza
100
Ke zjištění hemolytické aktivity se používá krevního agaru, příp. dalších agarů s krví. Tvorba hemolyzinů je typická pro řadu patogenních bakterií, ale i některých podmíněně patogenních či nepatogenních (některé streptokoky, Staphylococcus aureus, hemolytické Escherichia coli, Pseudomonas, některé bacily apod.)
V okolí kolonie může dojít buď k úplné hemolýze nebo neúplné hemolýze–Při neúplné hemolýze neboli viridaci dochází k částečnému rozrušení hemoglobinu na zelenohnědý pigment methemoglobin a erytrocyty nejsou lyzovány. –Při úplné hemolýze dojde k úplnému rozložení hemoglobinu i lýzi erytrocytů, takže kolem kolonie dojde k vytvoření průhledného dvorce.Úplná hemolýza je často nepřesně obecně označována jako β-hemolýza, neúplná hemolýza poté jako α-hemolýza. Přesné označení však závisí na označení hemolyzinu, který hemolýzu vyvolává, což je rodově odlišné.
http://www.bacteriainphotos.com/photo%20gallery/staphylococcus%20aureus%20B.jpg
S. aureusúplná hemolýza způsobená αhemolyzinem
Rod Streptococcus/Enterococcus
β hemolyzin
γ hemolýza
α hemolyzin
