Metodická základna molekulární patologie
Michala Fiurášková, Jan Bouchal, Zdeněk Kolář
Laboratoř molekulární patologie LF UP Olomouc http://lmp.upol.cz http://ustavpatologie.upol.cz
Molekulární metody
• genová úroveň nemoci• přesné stanovení diagnózy
– infekční choroby– onkologická onemocnění– určení proliferační aktivity (imunohistochemické stanovení Ki67, PCNA)– predispozice k chorobám-ateroskleróza, diabetes– stanovení otcovství– stanovení DNA ploidie - počítačová analýza, průtoková cytometrie)– stanovení diferenciačních markerů (CD), onkoproteinů, onkofetálních antigenů (imunohistochemie, průtoková
cytometrie) – stanovení exprese receptorů pro růstové faktory (imunohistochemické: steroidní hormony, c-erbB-2…)– somatické a germinální mutace
ÚVOD
Molekulární diagnostika
Zásadní roli hrají:• Monoklonální protilátky• Hybridizace• PCR (polymerázová řetězová reakce)
• Imunohistochemie (téměř 200 protilátek na Ústavu patologie)
• Analýza proteinů v buněčných lyzátech (imunoblotting)
• ELISA test
Monoklonální protilátky
Imunohistochemie
afinita antigenu a specifické protilátky
aplikace imunologických metod při studiu tkání nebo buněk
• „sandwich“ protilátka-antigen
• Kvantitativní analýza exprese proteinů
• Těhotenské testy
• Detekce infekčních agens
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Western analýza=imunoblotting (proteiny)
elektroforéza(polyakrylamidový gel)
p53
Bcl-XL
nitrocelulózová membrána
kDa
66
45
97
bandy
prim, sek. protilátka
chemiluminiscence
220
3020
Southern-Northern blotting (DNA, RNA)
• rozštěpení NK – restrikční endonukleáza• elektroforéza• detekce specifického fragmentu kapilárním přenosem a hybridizací
Metody založené na hybridizaci
arteficiální spojení dvou vláken DNA komplementarita bází, DNA sonda (próba)
• ISH (in situ hybridizace)• FISH (fluorescenční ISH)• SKY (spektrální karyotypování)• mFISH (multi color FISH)• CGH – komparativní genomová hybridizace• DNA čipy
FISHfluorescenční in situ hybridizace
- Možnost analýzy interfázních chromozomů (nevyžaduje kultivaci buněk a přípravu metafázických chromozomů)
- Detekce polysomií, translokací, inverzí, delecí
SKY – spektrální karyotypování(spectral karyotyping)
- počítačové zobrazení a analýza-cytogenetické laboratoře-identifikace početních i
strukturálních chromozomálních aberací
mFISH
Multi color FISH/
high resolution banding
kombinace fluorochromů
CGH – komparativní genomová hybridizace(Comparative Genomic Hybridization)
vizualizace chromozomových poruch
hybridizace
DNA čipy (microarray)
Alterace DNA
změněná exprese a aktivita proteinů DNA sekvence (array)
1. izolace DNA2. hybridizace3. počítačové zpracování
DNA čipy
DNA čipy
- identifikace nových genů- unikátní informace o
změnách v expresi celého genomu v
odpovědi na pokusný zásah- nové diagnostické markery
(BRCA1, BRCA2-adenokarcinom mléčné žlázy nebo ovaria)
PCR – polymerázová řetězová reakce(polymerase chain reaction)
detekce abnormální funkce genu (onkogeny, viry, bakterie, paraziti)enzymatická syntéza a amplifikace specifických sekvencí NK
primer
Využití PCR- detekce libovolných mutací- identifikace virů, bakterií, buněčných parazitů- RT-PCR (reverzní transkriptáza) –pro detekci mRNA
3SR amplifikační reakce (self-sustained sequence replication)
• metoda detekující genové amplifikace• využívá kolektivního účinku reverzní transkriptázy
(např. z ptačího myeloblastového viru), RNázy H • (z Escherichia coli) a T7 RNA polymerázy. • přírodní replikační proces retrovirů realizovaný in
vitro.
Přehled 1
• Diagnostika– Monoklonální protilátky (IHCH, elisa,
imunoblotting)– Hybridizace (FISH, CGH, DNA čipy)– PCR– detekční koncovka (fluorescenční,
radioaktivní, barevná)• Základní výzkum• Terapie
Základní výzkum
• Snaha o pochopení životních pochodů a možnosti jejich ovlivnění
• Může vycházet z dat získaných při klinické práci
• Buněčné kultury – ovlivňování chemickými látkami– cílené zásahy do vnitřního prostředí buněk (antisense
RNA, transientní nebo stabilní transfekce = zavádění cizích genů do buněk)
– studium proliferace, apoptózy, jednotlivých i globálních změn exprese genů (DNA čipy, WB, IHCH)
Základní výzkum
• In vivo na zvířatech (výsadní postavení myší)– athymické nahé myši pro studium nádorů– knock-out/in myši (inaktivace/nový gen transgenní organismy)
• Průtoková cytometrie• Tkáňová mikroarray• Mikrodisekce– mechanická– laserová
Průtoková cytometrie
• technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množství částic (např. buněk) v suspenzi
• cíleně separovat částice (buňky) splňující požadované parametry
• běžně užívané aplikace: – detekce apoptózy – analýza buněčného cyklu – mnohobarevná imunofenotypizace – buněčná proliferace
Tkáňová microarray (TMA)
0.06cm0.2cm1 parafinový blok – soubor různých tkání
Imunohistochemické barvení TMA
Lung
MB
H&E
MNF-116 (total keratin) barvení
Mechanická mikrodisekce
separace buněk z tkáně
Laserová mikrodisekce (LCM)
Restrikční endonukleázy
enzymy– vyštěpení určitých úseků DNA Molekulární klonování (plasmidy = extrachromozomální
kruhové molekuly DNA
- DNA knihovna (soubor sekvencí lidské DNA, DNA inzert) - cDNA knihovna (přepis mRNA) Sekvenování - lineární sekvence nukleotidů
Projekt HUGO
-složení lidského genomu -30-40 tisíc genů (jen 2x více než háďátko
nebo octomilka)-pouze 3-5% celého genomu jsou sekvence překládané do proteinů
-95% genomu představují repetice-nekódující sekvence
(Human Genome Mapping Organization)
Přehled 2
• Diagnostika– Monoklonální protilátky– Hybridizace– PCR
• Základní výzkum– Buněčné kultury + DNA manipulace– Zvířecí modely – Tkáňová mikroarray– mikrodisekce
• Terapie
Terapie
• Získání léku na základě poznání biologického procesu, na základě screeningu chemických knihoven
• Klinické testy• Genová terapie
Amplifikace HER2-NEU u nádorů prsu
Indikace léčby„herceptinem“ (blokace receptoru)Vyšetření 6 tis. x roční léčba 1 mil Kč
(červeně HER2, modře centromera 17, zeleně TOPO2a)
Imunohistochemické vyšetření
+FISH
Her2 = receptor z rodiny epidermálních růstových
faktorů, gen amplifikován u 25-30% karcinomu mléčné
žlázy
Genová Terapie
-Přenos genetického materiálu, jenž má léčebný
účinek -Cílené vyřazení aberantního proteinu (např.onkogenu u
rakoviny)-Obnova exprese mutovaného
genu u dědičných chorob-Problém obranných
mechanismů buňky k cizorodé DNA
-Problém selektivní terapie defektních buněk
Genová Terapie („antisense“ technologie)
Antisense RNA – RNA komplementární k určité mRNA
komplex
translace
umlčení genu
Shrnutí
• Diagnostika– Monoklonální protilátky– Hybridizace– PCR
• Základní výzkum– Buněčné kultury + DNA manipulace– Zvířecí modely– Tkáňová mikroarray– mikrodisekce
• Terapie – snaha o zacílení na molekulární úrovni
