Metodika odběru vzorkůu reprodukčních poruch

a onemocnění skotu

MVDr. Petr Václavek, Ph.D.Státní veterinární ústav Jihlava

Seminář ČBS, Brno, 14. listopadu 2015

Reprodukční poruchya onemocnění skotu

Neinfekční faktory:• toxická agens, otravy• metabolické poruchy• genetické abnormality• teplotní stres• trauma apod.

Infekční faktory:• bakteriální patogeny• virové patogeny• parazitární (protozoální) patogeny• ostatní infekční agens – chlamydie, mykoplazmata apod.• plísně - mykotoxiny

2

Bakteriální původci reprodukčních poruch skotu

Nákaza / původce četnost zmetání

doba zmetání (stádium březosti)

opakování zmetání

vhodné vzorky

laboratorní diagnostika

brucelóza Brucella abortus

do 80% inf. v 1. nebo 2. trimestru

6-9 měsíc většinou pouze jednou

placenta, zmetek, krev matky

sérologie matky, izolace, kultivace, MALDI, PCR

Campylobacter fetus veneralis

>10% 5-8 měsíc

vzácné, rekonvalescentní krávy jsou rezistentní

placenta, obsah žaludku plodu (abomasum), výtěry, vaginální a prepuciální výplašky

izolace, kultivace mikroskopie, fenotypové testy MALDI, PCR

Campylobacter fetus fetus, C. jejuni

sporadicky 4-9 měsíc

vzácné, rekonvalescentní krávy jsou rezistentní

viz výše viz výše

leptospiróza:Leptospira interrogans, L. hardjo, L.grippotyphosa, L. pomona, L. sejroe, atd.

5-40%

poslední trimestr (L. pomona), ostatní kdykoliv, aborty 2-5 týdnů po infekci

imunita k sérotypu, který způsobil zmetání ale vnímavost k dalším sétypům

placenta, zmetek, krev matky a dalších krav v chovu

mikroskopický aglutinační test (MAT) + sérotypizace, ELISA, kultivace, Real-timePCR (patogenní sérovary)

Listerióza:Listeria monocytogenesListeria ivanovii

většinou sporadicky, ale může dosáhnout 50%

2. ale většinou 3. trimestr může se opakovat

placenta, zmetek, obsah žaludku plodu (abomasum), krev matky

kultivace /izolace z placenty či z obsahu žaludku, PCR, sérologie matky

Trueperella pyogenes(syn. Arcanobacterium pyogenes)

sporadicky jakékoliv stádium není známo placenta,

zmetek

kultivace /izolace z placenty či z obsahu žaludku, MALDI, PCR

3

Nákaza / původce četnost zmetání

doba zmetání (stádium březosti)

opakování zmetání

vhodné vzorky

laboratorní diagnostika

bovinní virová diarrhoea(virus BVD-MD)

většinou nízká

variabilní, většinou do 4 měsíců

není běžné, vytvoří se imunita

placenta, zmetek (např. slezina), sérum matky, plodu,popř. býka

izolace, PCR, ELISA Ag, průkaz viru v plodu, průkaz virémie u matky či býka, prekolostrálníprotilátky u zmetaného plodu

BHV1infekční bovinní rhinotracheitida (IBR)

5-60%

jakékoliv stádium, ale více od 4. měsíce

není běžné, vytvoří se imunita

placenta, plod, sérum matky

PCR či IHC z tkání, izolace viru, sérologie -párové vzorky (VNT)

virus katarální horečky ovcí - bluetongue (BT)

většinou nízká variabilní nepravděpodobné

placenta, plod, vzorky séra matky

izolace viru, PCR

Schmallenberg virus (SBV)

většinou nízká 3. trimestr

není běžné, vytvoří se imunita

plod (mozek), prekolostrálníkrev plodu

PCR, sérologie krve plodu

4

Viry způsobující reprodukční poruchy skotu

Schmallenberg virus

5

• rod Orthobunyavirus, čeleď Bunyaviridae• krátká virémie 1-5 dní• u skotu jsou kritické 70-120 dny březosti, kdy ještě imunitní systém

není dodatečně vyvinutý, virus přestupuje přes placentu a může způsobovat zmetání a malformace telat.

• virus postihuje nervový systém plodu - u telat nehybné neflexibilníklouby, opistotonus, torticollis - zvrácený krk a páteř,hydroencephalus, zkrácená čelist a další abnormality = „syndromartrogrypózy a hydroencefalu“ (AG/HE syndrom)

• postižená telata jsou od matek infikovaných před 5-7 měsíci• infikované matky nemusí mít žádné klinické příznaky• může být horečka, snížení dojivosti či průjem (vše max. 5 dní)

Schmallenberg virus

© MVDr. František Kostka

Schmallenberg virusVhodné diagnostické vzorky Z živých zvířat na průkaz akutní infekce (PCR)• EDTA krev• sérum – min. 2 ml, transportovat chlazené

Z předčasných porodů a malformovaných telat:detekce viru:• mozek a mozkový kmen• amniové tekutiny• z živých nově narozených - amniové tekutiny a placenta (popř.

meconium)

detekce protilátek:• tekutina z perikardu• prekolostrální krev • sérologie (ELISA, VNT) matky je z hlediska

abortu neprůkaznáhistopatologie - fixovaný mozek a mícha © MVDr. František Kostka

Parazitární (protozoální) patogeny způsobující reprodukční poruchy skotu

Nákaza / původce četnost zmetání doba

zmetání (stádium březosti)

opakování zmetání

vhodné vzorky

laboratorní diagnostika

neosporózaNeospora caninum

vysoká u prvotelek a když se infekce dostane do naivního stáda - do 30% u prvního vzplanutí enzooticky: 5-10%

jakékoliv stádium, ale nejčastěji 5-6 měsíc

klesá s paritou, ale vždy možné(cca 5%)

placenta, zmetek (mozek, srdce, játra, těl. tekutiny), sérum matky

PCR, histologie -mozek, IHC - tkáně, sérologie matky (ELISA, IFAT)

Tritrichomonasfoetus

sporadicképrvní polovina březosti (často 2-4 měsíc)

zvířata získávají imunitu, ale ne celoživotní

placenta, plodové tekutiny, zmetek, vaginální výtok /výplašek

kultivace z placenty, z obsahu žaludku, plodových tekutin či z vaginálních výplašků, PCR

8© B. Koudela© B. Koudela© P.J: Dubey

Další (méně časté) infekční faktoryreprodukčních poruch a onemocnění skotu

• Q horečka - Coxiella burnetii (QF)• chlamydióza - Chlamydophila sp. (Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci) • Mycoplasma spp. (M. bovigenitalium)• Toxoplasma gondii• Sarcocystis spp.• Salmonella spp.• Anaplasma phagocytophila• Histophilus somni• Ureaplasma diversum• Staphylococcus spp., Streptococcus spp. • bovinní herpesvirus typ 4 (BHV4)• virus parainfluenzy 3 (PI3)

plísně – mykotoxiny (přímý účinek, kumulace účinků více toxinů, imunosuprese a následné závažnější projevy infekcí jako např. BVD, Neospora caninum apod.)• uvádí se, že mohou být důvodem 3-10 % abortů

Ø námelové alkaloidy (Claviceps purpurea): ergotoxin, ergotaminØ fusariotoxiny (rod Fusarium): DON (vomitoxin), T-2 toxin, zearaleonØ aflatoxiny (Aspergillus flavus, A. parasiticus)

9

Správný odběr diagnostických vzorků u reprodukčních onemocnění skotu

Matrice - biologický materiál k vyšetření:

Ø ZMETEK, PLACENTA, PLODOVÉ OBALY A TEKUTINY

Ø PREPUCIÁLNÍ A VAGINÁLNÍ VÝPLAŠEK/SEŠKRAB

Ø VÝTĚR

Ø KREV/SÉRUM

Ø KRMIVO

Obecná pravidla odběru vzorků u reprodukčních onemocnění skotu

Diagnostický úspěch v laboratoři bývá pouze v 25-30%Proto u odběru vzorků na diagnostiku zmetání platí obecné pravidlo:„čím více, tím lépe“

Vzhledem ke složitosti průkazu původce/důvodu zmetání je ideálníodebrat k vyšetření všechny možné druhy vzorků (plod, placenta,plodové obaly, krev zmetalky, výplach či výtěr, popř. krmivo).

11

Je třeba brát v potaz, že např.infekční zmetání je výsledekinfekce, která proběhla oněkolik týdnů či měsícůdříve něž nastal problém apokud vůbec patogen byl vplodu, často už není v časezmetání detekován.

ZMETEK, PLACENTA, PLODOVÉ OBALY A TEKUTINYJAK a KDY a DO ČEHO?Zásady:

ü placentu či plodové obaly balíme individuálně, ne společně se zmetkem

ü ideálně použijeme dvojitý / trojitý obal

ü plod či placentu neřežeme či jinak nedělíme, ale zašleme celé

ü plod ani placentu neomýváme

ü vzorky nezamrazujeme!

ü transport a uchování při chladničkové teplotě 2-8°C

ZMETEK, PLACENTA, PLODOVÉ OBALY A TEKUTINY

PRO JAKÁ VYŠETŘENÍ?Zmetek a placenta jsou vhodné pro o patologickoanatomické vyšetření adiagnostiku většiny bakteriálních, virových či parazitárních původcůzmetání, ale i na diagnostiku zmetání jiného původu (např. mykotoxiny,alkaloidy apod.).Průkaz patogenů ze zmetka provádíme metodami: kultivace, izolace, PCR, IFA(imunofluorescence), IHC (imunohistochemie), ELISA Ag, histologie,mikroskopie apod.Pozn. zmetek slouží v diagnostice rovněž z hlediska signifikantních lézí azměn na plodu, či pro některé patogeny charakteristický stářím plodu apod.

www.teara.govt.nz

PREPUCIÁLNÍ A VAGINÁLNÍ VÝPLAŠKY/SEŠKRABYJAK a KDY a DO ČEHO?

Výplašky/seškraby se používají zejména k diagnostice venerálních patogenůjako např. Tritrichomonas foetus a Campylobacter fetus:

Výplašky plemenných býků se provádí:

Ø před přesunem do OPB

Ø pravidelně na OPB

Ø pravidelně na inseminační stanici býků

• nařízené preventivní vyšetření, které je součástí MKZ SVS ČR• u krav resp. jalovic se odebírají výplašky pouze pro preventivní vyšetření

(např. při exportech a prodeji) nebo při situacích s klinickými příznakyonemocnění.

Odběr vzorků se provádí ve všední dny, pokud možno ráno či dopoledne a tokvůli včasnému doručení do laboratoře a neprodlenému zpracování. Vevýjimečných případech lze po telefonické dohodě s laboratoří zajistit případnézpracování vzorků i po pracovní době.

ODBĚR VÝPLAŠKŮ U BÝKŮ• před odběrem provedeme sedaci zvířete a zevní očistu genitálu• k získání výplašku se zavedeme do prepucia až ke glans penis sterilní

katetr (inseminační pipeta, sterilní hadička apod.)• vyústění prepucia pak manuálně zkomprimujeme a do prepucia se

pozvolna vstřikneme stříkačkou 30-50 ml vlažného fyziol. roztoku• katetrem se následně provedeme mírný seškrab glans penis a masáž

prepucia po dobu 2 minut. Pak se výplašek vypustí katetrem do sterilnínádoby (např. sterilní plastové kyvety dodávané po tel. domluvě z SVÚ).

• jeden odběr se dá použít pro oba patogeny - Campylobacter f. aTritrichomonas f.

© BonDurant, R.H. Diagnosis Merck Manual

TRICAMPER™SAMPLING DEVICE

ODBĚR VÝPLAŠKŮ U KRAV• před odběrem se provede ev. sedace zvířete, zevní očista genitálu• k získání výplašku se zavede do vaginy sterilní katetr (inseminační

pipeta, sterilní hadička apod.)• manuálně se uzavře vaginální otvor a pozvolna se vstříkne stříkačkou

30-50 ml vlažného fyziol. roztoku a provede se masáž• pak se výplašek vypustí katetrem do sterilní nádoby (např. sterilní plastové kyvety)

___________________________________________________________VÝPAŠKY / SEŠKRABY: UCHOVÁNÍ A TRANSPORT VZORKŮ?• transport a uchování při teplotě v rozmezí 5°-38°C.(do přepravek se vzorky je vhodné vložit PET láhev s teplou vodou)• uložení do temna (box, krabice apod.) nutné u vzorků na

Tritrichomonas f.• vzorek co nejrychleji (nejlépe dopoledne) doručit do laboratoře, aby

zde byla časová rezerva na zpracování vzorků (registrace, odstřeďování,kultivace).

Vyšetření trvá 7 dní u Tritrichomonas f., resp. 5-7 dní Campylobacter f.

VÝTĚRYVýtěry/stěry mohou sloužit jako alternativa k výplaškům např. v situacích, kdy nelze výplašek z nějakého důvodu provést.

Vaginální výtěrvyužíván k preventivnímu vyšetření na Campylobacter fetus (AMIES) čiTritrichomonas foetus (CAT SWAB). Výtěry lze využít i na diagnostikudalších bakteriálních (AMIES) či virových původců abortů (Eswab).Vaginální výtěr není zcela vhodný na stanovení původců metritid.

Výtěr z děložního krčku / z dělohyJe využíván na diagnostiku puerperálních onemocnění, metritid apod.

VÝTĚRY/STĚRY

JAK A DO ČEHO?

Výtěry se provádí nejčastěji do těchto odběrových souprav:

Vaginální výtěry

Ø AMIES Agar Gel Medium Transport Swab - with charcoal

Ø C.A.T. SWAB fi Dispolab na Tritrichomonas fetus

Výtěry z děložního krčku

Ø Eswab - Copan Eswab™ Collection Kit

Ø Odběrová souprava fi Labmediaservis

VAGINÁLNÍ VÝTĚRYAMIES Agar Gel Medium Transport Swab - with charcoalCat. No. 114C (COPAN Italia) - bakteriologické vyšetření

• nevhodný pro virologickou diagnostiku (málo matrice, médium může způsobit inhibici PCR)

• nejčastěji využíván na vaginální výtěr k prev. vyšetření na Campylobacter f.• stěr lze provést i z orgánů zmetka (ale lépe zaslat zmetka celého do laboratoře)

Souprava obsahuje: odběrový tampon (plastová tyčinka se smotkemsyntetické bavlny) a zkumavku s médiem obsahující aktivní uhlí.

Tampon se se po odběru vloží do transportního media. Jedná se o universálnítransportní půdy zaručující přežití odebraných mikroorganismů (aerobních ianaerobních bakterií) po dobu nejméně 48 hodin, včetně náročných druhů. Tatomedia udržují mikroorganismy vitální při jejich sníženém metabolismu, nepomnožujíse.

VAGINÁLNÍ VÝTĚRY

C.A.T. SWAB fi Dispolab• na výtěr vaginy pro vyšetření na Tritrichomonas fetus

• alternativa místo výplašku

• dodává fi Dispolab nebo po telefonické domluvě SVÚ (Oddělení bakteriologie)

• odběrový tampon se opatrně zasune do vaginy, provede se krouživýmpohybem výtěr vaginální sliznice a tampon se vloží se do transportníhomedia, které je součástí setu.

• speciální odběrová souprava (plastová zkumavka s tamponem na konci opatřeným balónkem s kultivačním médiem)

• skladování před transportem: max. 24 hodin při pokojové teplotě (15 -30 °C)

Doc. RNDr. Josef Reischig, CSc

Výtěry z děložního krčkuEswab - Copan Eswab™ Collection Kit – Cat. No 480CE (COPAN Italia)

ü vhodný pro virol. i bakteriologické vyšetření (+Leptospira spp. Chlamydophila spp.)

ü kapalné médium Eswabu uchovává jak nukleové kyseliny, tak antigeny bakterií, virů i chlamydií

ü umožňuje přežití aerobních, anaerobních i jiných kultivačně náročných bakterií

ü slouží pro odběr a transport stěru/výtěru z děložního krčku, vagíny, placenty, plodových obalů a plodových tekutin

• lze použít i pro zamrazení a archivaci

Souprava obsahuje:

• odběrový flokovaný tampon zalamovací tyčinkou

• zkumavku s 1 ml tekutého čirého Amiesova média

především pro vyšetření/screening metodou PCR

Nový screeningový test pro detekci původcůabortů u skotu

SVÚ Jihlava – laboratoř molekulární biologiePCR screeningový testCena: 2500,- Kč / 1 vzorek / 8 patogenů

• Campylobacter fetus• Leptospira spp. – patogenní sérovary• Listeria monocytogenes• Coxiella burnetii• Chlamydophila spp.• Salmonella spp.• Anaplasma phagocytophila• bovinní herpesvirus 4

23

Výtěry z děložního krčkuOdběrová souprava - LabMediaServis s.r.o.„Souprava na odběr vzorku pro vyšetření endometritid u dojnic“

24

Souprava obsahuje:ü katetr s mandrenem a sterilní výtěrovkouü sáček s dezinfekcíü přepravní médium ve zkumavce (Amies)

• tampon je na dostatečně dlouhé tyčce (59 cm)

• opatřen speciální koncovkou, která zabraňujekontaminaci vzorku z vaginy nebo z vnějšíhoprostředí

• vzorek je po odběru uložen do transportního media

• získává se takto čistá bakteriální kultura

Hodnocení soupravy pro mikrobiologické vyšetření endometritid u skotu (LabMediaServis s.r.o)

• 10/2014 – 3/2015 - SVÚ Jihlava (odd. bakteriologie) ve spolupráci s firmou Zoetis (MVDr. Borkovec)

• 45 ks vzorků odebraných od dojnic z 32 chovů s reprodukčnímonemocněním dojnic (popř. klinickými příznaky endometritid)

• bakteriologické vyšetření popř. stanovena citlivost na ATB diskovoumetodou.

• vzorky ve většině případů nebyly kontaminovány mikrobiologickýmosazením pochvy dojnic, nedocházelo k přerůstání bakteriemi jakonapř. Proteus sp., E. coli apod.

• prokázalo se, že přepravní médium Amies je vhodné médium prouchování a transport i těchto vzorků do laboratoře, k uchováníaerobních i anaerobních bakterií, a to i v širokém rozmezí teplot připřepravě (5 – 22°C).

25

26

Běžnými kultivačními technikami bylaizolována a metodou MALDI-TOFidentifikována řada bakterií, a to přímýchnebo potencionálních původců onemocněníreprodukčního aparátu dojnic.• většinou o oportunní, příležitostné

patogeny, u kterých závisí na imunitědaného zvířete či stáda, jak se projeví.

• již v primokultivaci většinou nárůst téměřčistých izolátů (usnadnění detekce bakteriálníchpatogenů)

• následný antibiogram u všech izolátů – ATBresistence

• u zájem ÚSKVBL – kvůli používání ATB sindikačním omezením

Z výsledků vyplývá, že odběrová souprava promikrobiologické vyšetření endometritid uskotu je vhodná pro použití ve vet. praxi a jepřínosem pro bakteriologickou diagnostiku anáslednou racionální léčbu antibiotiky.

DĚLOŽNÍ VÝTĚRY 2015 - SVÚ JihlavaPůvodce Počet izolacíAcinetobacter pittii 1Acinetobacter sp 3Aerococcus viridans 1Bacillus sp. 3Bacteroides pyogenes 2Citrobacter braakii 1Clostridium perfringens 5Clostridium sp. 1Corynebacterium sp 1Enterococcus hirae 1Escherichia coli 29Escherichia coli var haemolytica 7Histophilus somni 2Klebsiella pneumoniae 2Mannheimia haemolytica 2Mannheimia varigena 1Pasteurella multocida 1Proteus mirabilis 5Proteus sp. 12Staphylococcus epidermidis 1Staphylococcus haemolyticus 1Staphylococcus chromogenes 4Stenotrophomonas maltophilia 1Streptococcus dysgalactiae 3Streptococcus lutetiensis 1Streptococcus pluranimalium 5Streptococcus sp. viridující 1Streptococcus uberis 15Trueperella pyogenes 21

Hodnocení soupravy LabMediaServispro endometritidy

JAK UCHOVÁVAT A TRANSPORTOVAT VZORKY VÝTĚRŮ?

AMIES Swab, Labmediaservis, C.A.T. SWAB - při teplotě 5 – 25°C - transport do laboratoře do 48 hodin

Eswab Collection Kit - pro virologické i bakteriologické vyšetření- transport a uchování při teplotě 5 – 25°C , pro virologii 2 – 8°C (popř. zamrazit)

- transport do laboratoře ideálně do 48 hodin

Po odběru vzorek doručte co nejdříve do laboratoře! Nutno počítat sčasovou rezervou (např. dodání vzorků ve večerních hodinách, předvíkendem nebo před svátky) tak, aby se 48 hodinový interval zbytečněneprodlužoval.

27

Správný odběr a transport ovlivňuje výsledekbakteriologického a virologického vyšetření.

KREV / SÉRUMSérum zmetalek (popř. sérum plodu) lze použít pro přímý i nepřímýprůkaz některých patogenům způsobujících reprodukční problémyNepřímý průkaz (sérologie)Ø kvalitativními testy (ELISA)Ø kvantitativními testy prokazujícími titr protilátek (IPMA, NPLA, VNT apod.)

Samotná kvantita protilátek recentní infekci neprokazuje - neexistuje něcojako „postinfekční“ titr protilátek.

Nutný průkaz sérokonverze z párových vzorků.• ze stejných zvířat odebraných v intervalu min. 3-4 týdnů (sledování

dynamiky titrů protilátek).• první odběr co nejdříve po zmetání, druhý odběr za 3 týdny.• signifikantní sérokonverze je potvrzena rozdílem v titrech mezi párovými

vzorky a to minimálně o dva až tři řády (např. 20 → 80, nebo 80 → 320, apod.)

Párové vzorky je nutné testovat najednou za stejných podmínek a se stejnou šaržítestu.Při odesílání prvního odběru, prosím upozorněte na žádance, že k těmto vzorkům přijdou časemdalší párové vzorky. Z prvního odběru pak séra zamrazí, archivují v laboratoři a vyšetřují se ažsoučasně se séry z druhého odběru.

KREV / SÉRUMPRO JAKÁ VYŠETŘENÍ je krev vhodná?

Sérologické vyšetření na průkaz specifických protilátek v krvi zmetalekbakteriální původce abortů:

• Leptospira spp., Brucella abortus, Listeria monocytogenesvirové původce abortů:

• BVD, IBR (BHV1), virus katarální horečky ovcí (BTV, bluetongue)parazitární (protozoální) původce abortů:

• Neospora caninum, Toxoplasma gondiiostatní infekční původce abortů:

• Chlamydophila abortus, Chlamydophila spp., Coxiella burnetii (Q horečka)

Virologické vyšetření na přímý průkaz původce v krvi:• BVD (ELISA Ag nebo PCR)

29

ZÁVĚREM:Spolehlivá a včasná laboratorní diagnostika

Výsledek laboratorní diagnostiky

ovlivněn mnoha faktory:• správným odběrem a transportem vzorků• zpracováním a uchováváním vzorků• výběrem laboratorních metod

nezbytná pro správnou volbu terapie, prevence a profylaxe

KAVALITNÍ VZOREK = ZÁKLAD PRO KVALITNÍ DIAGNOSTIKU

Děkuji za pozornost

31

STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA Oddělení virologie