1
Mikroskopie v mikrobiologii&
Mikrobiologická barveníVýuková prezentace z:
Lékařské bakteriologieJan Smíšek © ÚLM 3. LF UK 2009
2
Mikroskopický průkaz infekčních agens
• Pro průkaz infekčních agens používáme jejich přímé pozorování pomocí– Světelné mikroskopie– Fluorescenční mikroskopie– Pozorování v temném poli– Metodu fázového kontrastu– Elektronové mikroskopie
3
• Světelný mikroskop je složené optické zařízenískládající se ze – Zdroje světla – žárovka– Posuvného reostatu, který reguluje světelný tok
vycházející ze žárovky– Kondenzoru který soustřeďuje proud paprsků– Clony která upravuje jejich množství– Stolku na nějž upevňujeme řez umístěný na
podložním sklíčku do speciální svorky– Objektivu, který zvětšuje obraz řezu a promítá ho
směrem k okuláru– A ze samotného okuláru který obraz ještě více
zvětšuje a jímž obraz pozorujeme
Světelná mikroskopie
4
Světelná mikroskopie
5
– Zaostření mikroskopu provádíme mikrometrickým šroubem, který se nachází z obou stran a posunuje polohu stolku se sklíčkem
– Polohu sklíčka upravujeme posuvnými šrouby, které sklíčkem upnutým ve svorce pohybují předozadně a pravolevě
– Běžná rozlišovací schopnost u světelného mikroskopu je 0,5 - 0,2 um
Světelná mikroskopie
6
• V mikrobiologii se nejčastěji používáběžného binokulárního mikroskopu– V parazitologii se používají objektivy se
zvětšením 200-300 násobným– V bakteriologii pak se zvětšením 1000 a více
násobným– Ve virologii se běžný světelný mikroskop
používá jen zřídkakdy např. při průkazu buněčných inkluzí v tkáních
Světelná mikroskopie
7
• Ve mikrobiologii se pro pozorování ve světelném mikroskopu používají– Nativní preparáty – zejména pro pozorování
pohybu a dělení mikroorganizmů. Tento druh preparátů je diagnosticky významný zejména v parazitologii.
– Fixované preparáty – nejčastěji nátěry suspenze obsahující infekční agens barvenépomocí přehledných nebo diagnostických barvení.
Světelná mikroskopie
8
• Preparáty pozorujme– Suchým optickým systémem
• U něj je však limitováno dosažitelné zvětšenína 60-450x)
– Imerzním optickým systémem• Na fixovaný a obarvený nátěr suspenze se
kápne kapka kvalitního oleje a speciálníimerzní objektiv se do něj ponoří (takto se v prostředí s dobrým indexem lomu u běžných mikroskopů možné zvětšení zvýší na 1050 násobné a vyšší)
Světelná mikroskopie
9
• Fluorescenční mikroskop se od běžného světelného mikroskopu odlišuje hlavnězdrojem světla
• Ten vydává nejčastěji ultrafialové záření, které je po styku se speciálními barvivy (fluorochromy) absorbováno a vyzářeno jako viditelné světlo
Fluorescenční mikroskopie
10
• Je speciální a již zřídkakdy užívaný způsob mikroskopování používajícíspeciální mikroskop, který pomocídoplňkové optiky odkloní zdroj světla od zdroje a umožní pozorování mikrobiálních částic zachycujících rozptýlené světlo v temném poli
• Rutinně se využívá při diagnostice syfilis
Pozorování v temném poli
11
• Je speciální druh mikroskopie, který používá clony pracující na principu tzv. fázové destičky, která mění vytváříohybové spektrum
• To po průchodu pozorovanými mikrobiálními částicemi vytváří duhový efekt, který umožňuje pozorovánínebarvených a nefixovaných preparátů
Metoda fázového kontrastu
12
• Tzv. nativní preparáty – používají se pro pozorování pohybových
projevů a dělení mikrobů a dále v parazitologii
Metoda fázového kontrastu
13
• Elektronový mikroskop se od světelného mikroskopu odlišuje rozlišovací schopností která je až1000x větší tj. až 0,2 nm
Elektronová mikroskopie
14
• Jednotlivé typy elektronové mikroskopie– TEM - Transmisní elektronová mikroskopie je
nejstarší metodou EM a pracuje v analogii se světelným mikroskopem.
– SEM - Skenovací elektronová mikroskopie umí zobrazovat povrchy objektů a jejich tvar
Elektronová mikroskopie
15
• Preparát TEM
Elektronová mikroskopie
16
• Preparát SEM
Elektronová mikroskopie
17
• V mikrobiologii (zejména ve virologii) se nejčastěji používají klasické TEM a SEM metody– Preparáty pro TEM se připravují jako jemně
homogenizované suspenze nanesené na běžné elektronmikroskopické mřížce. Pro lepší zvýraznění se barví pokovením solemi kovů
– Preparáty pro SEM se připravují značněrozličně podle svého konkrétního účelu
Elektronová mikroskopie
18
• Nativní preparáty – Používají se zejména pro pozorování pohybu
a dělení mikroorganizmů– Tento druh preparátů je diagnosticky
významný zejména v parazitologii– Velmi často se pozorují metodou fázového
kontrastu
Příprava preparátu
19
• Nativní preparát připravíme pouze kápnutím suspenze mikroba na podložní sklíčko a překrytím krycím sklíčkem
• V případě, že chceme aby měl preparát delší trvanlivost musíme ho ochránit před vyschnutím přilepením okrajůkrycího sklíčka
Příprava preparátu
20
PodloPodložžnníí sklsklííččkoko
KrycKrycíí sklsklííččkoko
Kapka Kapka suspenzesuspenze
Tmel proti Tmel proti vyschnutvyschnutíí
Příprava preparátu
21
• Fixovaný preparát připravíme kápnutím suspenze mikroba na podložní sklíčko a pomocí bakteriologické kličky ji rozmícháme ve středu sklíčka
• Takto připravené sklíčko na Bunsenovým kahanem vysušíme a zfixujeme 3x protažením sklíčka v plameni
Příprava preparátu
22
PodloPodložžnníí sklsklííččkokoVysuVysuššenenáá a a zfixovanzfixovanáásuspenzesuspenze
Příprava preparátu
23
• Tato metoda fyzikální fixace je nejpoužívanější–Existují i jiné metody – např. fixace
chladem, chemická fixace methanolem a jiné
–Používají se však méně
Příprava preparátu
24
• Takto připravené preparáty můžeme barvit přehlednými mikrobiologickými barveními
• Po obarvení a vysušení jsou preparáty připraveny k pozorovánísuchým i imerzním systémem
Příprava preparátu
25
• Metodika jednoduchých (orientačních) mikrobiologických barvení je založena zejména na afinitě barviv k bakteriálním komponentám– Např. Krystalvioleť barví snáze struktury,
které neobsahují ve stěně mnoho nepolárních sloučenin
Princip barvení
26
ČČáástice barviva stice barviva kovalentnkovalentněě vváázanzanéév bakteriv bakteriáálnlníí ststěěnněě
Princip barvení
27
• U složitějších (diagnostických) barvenípoužívajících více barviv je pak obarveníči neobarvení dané struktury dáno jejími vlastnostmi– Např. U Gramova barvení si původní obarvení
krystalvioletí udrží pouze sloučeniny, kteréneobsahují ve stěně nepolární sloučeniny
– Při oplachu acetonem dojde totiž k vymytítěchto struktur a tím i vymytí krystalvioleti
Princip barvení
28
• Moderní metodika v poslední doběpoužívaných barvení dává přednost umělému zvýšení afinity ke konkrétním strukturám navázáním barviva na protilátky– To umožňuje selektivní průkaz daných
struktur v preparátu, což má značný diagnostický význam
– Ve virologii už tento typ metodik převládl
Princip barvení
29
ČČáástice barviva vstice barviva váázanzanáápomocpomocíí protilprotiláátky na tky na
bakteribakteriáálnlníí epitopepitop
Princip barvení
30
• Podle Grama: – Za normální teploty, běžnými koncentracemi.– Gram+ modré– Gram- červené– Gram labilní fialové
• (buď vlastnost,nebo špatný preparát)– Barvivo: Krystalvioleť,Karbolfuchsin– Moření: Lugolův roztok– Odbarvení: Aceton
Diagnostická barvení
31
• Postup Gramova barvení:– 1.Na fixovaný preparát dáme pár kapek krystalvioleti– 2.Barvíme asi 20 sec– 3.Opláchneme Lugolovým roztokem– 4.Navrstvit Lug.rozt. na 20 sec– 5.Slijeme a odbarvíme Acetonem asi 20(30) sec– 6.Dobarvíme Karbolfuchsinem 30 sec– 7.Sušíme mezi dvěma listy filtračního papíru– 8.Pozorujeme imerzním systémem
• Výsledek:– Gram + modré– Gram neg. červené
Diagnostická barvení
32
• Výsledek Gramova barvení
Diagnostická barvení
33
• Podle Ziehl - Neelsena:– Koncentrovanými barvivy,za tepla
• Slouží k znázornění acidorezistentních bakterií– = Mykobakterie (Kochův bacil – původce TBC)
• Preparát ze sputa (hlen,chrchle)– Barviva:
• Karbolfuchsin (koncentrovaný).• Malachitová zeleň(1%)
– Odbarvení: Kyselým alkoholem
Diagnostická barvení
34
• Postup barvení podle Ziehl - Neelsena :– 1.Preparát zfixujeme 3x protažením v plameni.– 2.Přelijeme koncentrovaným Karbolfuchsinem 3-5 min– 3.Odbarvujeme v kyselém alkoholu.– 4.Opláchneme ve vodě.– 5.Dobarvíme malachitovou zelení 0,5-1 min.– 6.Opláchneme ve vodě.– 7.Sušíme vysoko nad kahanem.– 8.Pozorujeme imerzním systémem
• Prohlédnout alespoň 50 zorných polí !!!
• Výsledek:– Acidorezistentní bakterie budou znázorněny červeně a zbytek
bude zelený.
Diagnostická barvení
35
• Výsledek barvení podle Ziehl - Neelsena
Diagnostická barvení
36
• Albertova metoda:– Za normální teploty, běžnými koncentracemi.– Slouží k znázornění metachromatických =– (volutinových=Erunt-Beletových granul)= Původci záškrtu (Corynebacterium diphtheriae)
• Barvivo: Albertův roztok• Moření: Lugolův roztok
Diagnostická barvení
37
• Postup při barvení Albertovou metodou– 1.Normálně zfixovaný preparát.– 2.Barvení Albertovým roztokem 3 min.– 3.Slití a opláchnutí ve vodě.– 4.Přelití Lugolovým roztokem na 1 min.– 5.Slití a opláchnutí ve vodě.– 6.Sušení mezi dvěma filtračními papíry.– 7.Pozorujeme imerzním systémem.
• Výsledek:• Korynebaktérie jsou zelené,metachromatická
granula jsou tmavě modrá až černá.
Diagnostická barvení
38
• Výsledek barvení podle Albertse
Diagnostická barvení
39
• Burriho metoda:– Za normální teploty,běžnými koncentracemi.– Slouží k negativnímu znázornění bakteriálních
pouzder.– Barvivo:
• Karbolfuchsin ředěný – (můžeme použít Krystalvioleť)
• tuš černá a 6% sacharóza
Diagnostická barvení
40
• Postup Burriho metody– 1.Na okraj podložního sklíčka dáme kapku sacharózy.– 2.Bakteriální kulturu rozmažeme v kapce.– 3.Rohem krycího sklíčka rozmícháme.– 4.Rozetřeme a necháme zaschnout.– 5.Zfixujeme metylalkoholem.– 6.Dobarvíme zřeď. Karbolfuchsinem (Krystalvioleťí)– 7.Opláchneme ve stojaté vodě.– 8.Sušíme vysoko nad kahanem.– 9.Pozorujeme.
• Výsledek:– Pouzdra nejsou obarvená a svítí na tmavém pozadí.
Diagnostická barvení
41
• Výsledek barvení podle Burriho
Diagnostická barvení
42
• Wirtz – Conklinova metoda:– Za vysoké teploty.– Slouží k znázornění bakteriálních spor– Barvivo:
• 5% Malachitová zeleň• Karbolfuchsin ředěný
Diagnostická barvení
43
• Postup u Wirtz – Conklinovy metody:– 1.Preparát zfixujeme běžným způsobem.– 2.Barvíme při zahříváním nad kahanem Malachitovou zelení 3x-
4x do výstupu par po dobu 5 min. Barvivo doléváme. Nesmívyschnout úplně !!!
– 3.Opláchneme ve vodě.– 4.Navrstvíme karbolfuchsin za norm.tep. 1-3min.– 5.Vysušíme mezi filt.pap. – 6.Prohlížíme imerzním systémem.
• Výsledek:– Spory zelené, tělo bakterie červené.– U starších kultur můžou být spory samostatně (vypadlé)
Diagnostická barvení
44
• Schaeffer – Fultonova metoda:– Za vysoké teploty.– Slouží k znázornění bakteriálních spor.– místo karbolfuchsinu použijeme eosin.– Postup stejný jako u Wirtz – Conklina.
• Výsledek:– Spory zelené,tělo bakterie červené.– U starších kultu můžou být spory samostatně
(vypadlé)
Diagnostická barvení
45
• Výsledek barvení podle Schaeffer – Fultona
Diagnostická barvení