Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin

2. GS, FCM, FISH/GISH

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013

Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických

oborů PřF JU

reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

Velikost genomu

► množství DNA v buňce

► uvádí se v různých jednotkách:» pg [pikogram] DNA (= jednotka hmotnosti)» Mbp nebo Gbp (= počet bazí)» 1 pg ~ 978 Mbp (1Mbp = 106 bp)» 1 pg ~ 0.978 Gbp (1Gbp = 109 bp)» 1 Gbp ~ 1.022 pg (= 1 / 0.978)

► pojem ovšem může znamenat velmi různé věci

► užitečný údaj pro více účelů» taxonomie (odlišení druhů)» znalost velikosti genomu je potřebná při přípravě materiálu pro

některé metody vyžadující „správné“ množství DNA

Holoploidní velikost genomu

► 1C hodnota – obsah DNA v 1 buňce, která má jeden „chromosome complement“ (sada chromozómů, která při pohlavním rozmnožování jde od jednoho rodiče) = má n chromosomů» u mechorostů (a někt. řas) dominatní fáze, gametofyt» u cévnatých kytek (a spousty živočichů) pouze gamety

► 2C hodnota – u cévnatých kytek (aj. diplofazických organismů) obsah DNA v jedné somatické buňce, která právě neprochází buněčným dělením, tj. má 2n chromosomů» právě toto se většinou rozumí pod pojmem velikost genomu

► analogicky 3C (např. endosperm), 4C, 8C,…

► nezohledňuje ploidní stupeň!

Holoploidní velikost genomu

Příčiny změn

► chromosomové přestavby» fúze / fragmentace celých chromosomů nebo částí

» skokové nebo postupné

» zvýšení i snížení

► aktivita retroelementů» zvýšení

► polyploidie» zvýšení, viz dále

Polyploidie

► znásobení počtu chromosomů v buňce» chyby v meiose

» přestavby na úrovni celého genomu

» neredukované gamety

» hybridizace

» … resp. kombinace několika příčin

► několik zásadně odlišných typů» významné důsledky pro populační genetiku, rekonstrukci

fylogeneze,…

Auto- a allopolyploidie

Autopolyploidie

► chromosomy od jednoho předka

► jednotlivé kopie „stejné“» v hrubém pohledu, v detailu ne, pro daný lokus může existovat

víc alel

► náhodné párování v meiose, volná rekombinovatelnost alel

Auto- vs. allopolyploidieAllopolyplodie► chromosomy od různých předků, polyploidizace spojená s hybridizací► jednotlivé kopie různé► chromosomy různého původu se nepárují

» rekombinace alel pouze v rámci sady od stejného předka» v meiose se chová jako diploid

► přechodné typy (segmentární allopolyploidie)» část (méně odlišných) chromosomů se páruje a rekombinuje,…

+

Neo- vs. paleopolyploidie

Neopolyplodie► recentně vzniklá► všechny kopie chromosomů / lokusu přítomné► organismus se chová jako typický polyploid (auto- nebo allo-, viz

výše)

Paleopolyplodie► dávná polyploidizační událost► v průběhu evoluce dochází ke změnám genomu

» funkční rozrůznění jednotlivých kopií genu» ztráta funkce jedné z kopií genu (ale v genomu přítomný)» úplná ztráta jedné z kopií (delece)

► detekovatelná srovnávací analýzou celého genomu» u většiny krytosemenných 2-3 staré polyploidizace

Neo- vs. paleopolyploidie

Paleopolyplodie► organismus se chová jako diploid► evoluční tlak na odstranění redundantních kopií →

diploidizace» např. v evoluci většiny liníí krytosemenných několik cyklů

polyploidizace a následné diplodizace

► závažné důsledky zejména pro fylogenetiku» ortology (homologní kopie genu, tj. fyzicky ležící na stejném

místě v genomu)

» paralogy (nehomologní kopie, tj. na různých místech genomu ležící kopie původního genu vzniklé duplikací)

» fylogenetické metody předpokládají, že pracujeme s ortology

» …ale nemusí být jednoduché to rozlišit

Monoploidní velikost genomu

1Cx hodnota

► velikost (pg nebo Mbp) jedné chromosové sádky» pro diploida: 1Cx = 2C / 2

» pro tetraploida 1Cx = 2C / 4

» pro pentaploida 1Cx = 2C / 5

» … atd.

► umožňuje srovnání mezi ploidiemi

► obvykle s rostoucím ploidním stupněm klesá, někdy i poměrně výrazně („genome downsizing“)

Průtoková cytometrie

► Flow cytometry, FCM

► spíše cytologická než molekulární metoda» ale děláme ji u nás v laboratoři…

» měří obsah DNA v jádře = velikost genomu

» umožňuje odhadnout ploidii / počet chromosomů, což je často nezbytné pro interpretaci výsledků molekulárních metod!

» vypovídá o genomu v nejhrubším měřítku• velikost• počet kopií chromosomů• lze odhadovat i zastoupení bazí (AT vs. GC) na úrovni celého

genomu

Průtoková cytometrie

► cytometrie = metoda umožňující sledovat vlastnosti optické částic (buňky, buněčná jádra)» intenzita fluorescence

» rozptyl světla

► průtoková = sledované částice v suspenzi, při průtoku měřící kyvetou

► velmi často používaná v medicíně (běžná diagnostická metoda)

► použití v botanice / zoologii jen výsekem možných aplikací

Vzorky► suspenze sledovaných částic

» krev, hemolymfa,…» voda (plantkton,…)» a u kytek co? jak to dostat z buněčné stěny ?

• chemické narušení → protoplasty

• izolace jader

► izolace buněčných jader u rostlin (cca 5 min.)» nasekání tkáně žiletkou v izolačním pufru

• stabilizace jader (vhodné pH, osmolarita, antioxidanty,…)

• detergent (snižuje slepování jader)

» přefiltrování (tkanina 42 μm)» přidání fluorescenční barvy (pokud není součástí izolačního

pufru)

Vzorky

► Obvykle analyzované tkáně» čerstvé listy, stonky, květy,… apod.

» semena

» vysušené tkáně (silikagel)• nepredikovatelné posuny fluorescence, lze použít jen orientačně

– určení ploidie

» fixovaná jádra (glycerol apod.) ?

Průtokový cytometr

Průtokový cytometr

vzorek

zdroj světla» laser» UV lampa /

UV dioda

fluidika» pumpa» sheath fluid

kyveta

odpad

optika + počítač

Fluorescence

► barviva vázající se na DNA» propidium jodid (PI) – interkalační, nespecifické

» DAPI – vazba na AT páry

» příp. jiná barviva specifická pro GC páry (např. mitramycin)

► výsledek vždy porovnáván s vnitřním standardem» rostlina o známém obsahu DNA, zpracovávaná společně se

vzorkem

► zobrazujeme jako histogram» poměr průměrů / mediánů píků

» koeficient variance („šířka“ píků)

» počet buněk

Výpočet velikosti genomu► poměr mezi fluorescencí vzorku a standardu

► absolutní» barvivo PI» vyjadřuje se v pg nebo Mbp,

1 pg = 978 Mbp» obvykle průměr ze 3 měření jedince

► relativní» barvivo DAPI» standard = 1» vhodná např. pro určení ploidie» přesnější a méně jedovaté

než PI

► porovnáním obou lze spočítat obsah bazí AT / GC

Centaurea weldeniana+

* Glycine max ‘Polanka’

Centaurea 157.92Glycine 189.46poměr 0.833

Glycine 2.50 pgCentaurea = 2.50 *

0.833= 2.08 pg

Výhody / nevýhody

Výhody► nedestruktivnost► obvykle nejsou potřeba speciální tkáně (× karyologie)► rychlost, statisticky robustní data na populační úrovni

» cca 100 vz. za den, někdy lze analyzovat více jedinců / vz.

► přesnost, detekce drobných rozdílů a vzácných cytotypů► cena

Nevýhody► většinou potřeba čerstvého materiálu► problémy se sekundárními metabolity, slizy,… + analýza pylu► omezená citlivost při vyšších chromosomových počtech (detekce

aneuplodie, B-chromosomy apod.)► stanovení chromosového počtu jen nepřímé

Aplikace FCM v botanice

Analýza ploidního stupně► ploidii odhadujeme nepřímo z velikosti genomu,

nutná kalibrace klasickým počítáním!

► taxonomický znak » Centaurea phrygia – diploid, C. erdneri – tetraploid; morfologicky

ale velmi podobné

► biologie polyploidů» rozšíření cytotypů, geografické, ekologické,… rozdíly» detekce meziploidní hybridů a vzácných cytotypů (např. nových

polyploidů)» detailní studie smíšených populací (prostorové rozmístění, vazba

na mikrostanoviště, hybridizace, kompetice, změny zastoupení cytotypů v čase,…)

Aplikace FCM v botanice

Velikost genomu► taxonomický znak (2C)

» odlišení taxonů se stejným počtem chromosomů, detekova-telné i drobné rozdíly, od 3 – 4 %) – např. Melampyrum

» „vystopování“ původu polyploidů (různé „součty“ možných předků)» skupiny příbuzných druhů (např. několik „základních“ Cx-hodnot,

které jsou stabilní mezi ploidiemi – Batrachium)

► obecnější biologické závislosti» redukce Cx hodnoty se stupněm ploidie» vztahy velikosti genomu k délce životního cyklu, prostředí (nadm.

výška, ostrovy, zeměpisná šířka), vlastnostem druhu (invazivnost,…)

ale pozor na design těchto studií, obvykle problematický

Aplikace FCM v botanice

Reprodukční systém, hybridizace

► u krytosemenných dvojité oplození» embryo 2C (1C ♀ + 1C ♂)

» endosperm 3C (2 * 1C ♀ + 1C ♂)

► jiné poměry v případě odchylek(apomixie, neredukované gamety) » viz grafy – Sorbus (data M. Lepšího)

» hybridizace diploida a tetraploida,vzniklo 3x semeno na diploidovi:(a) hybrid nebo (b) autopolyploid ?

a) 2 * 1C(♀) + 2C(♂) = 4C

b) 2 * 2C(♀) + 1C(♂) = 5C

embryo 2C (2x)

endosperm 3C (3x)normální sexualita

Bellis perennis

embryo

2C (4x)

Bellis perennis

endosperm 6C (12x)pseudogamie, neredu-kované embryo i pyl

Další aplikace FCM

► studium planktonu» detekce hlavních skupin (bakterie, sinice, zelené řasy)

» kombinace několika parametrů – velikost genomu, autofluorescence chlorofylů, specifické barvy pro bakterie,…

» lze i kvantitativně – stanovení počtu buněk / koncentrace► analýzy chromosomů, genomika► medicínské aplikace

» analýza buněčného cyklu (nádorová bujení apod.)

» přítomnost antigenů pro danou protilátku,…

► třídění buněk (sorting)

In situ hybridizace (FISH/GISH)

► metody na rozhraní karyologie a molekulární biologie► preparát mitotických (příp. i meiotických chromosomů)► pevné přichycení na mikroskopické sklíčko► denaturace DNA (formamid + další chemikálie)► hybridizace biotinem značené sondy (probe), tj. DNA ze

zájmového druhu / genu, atd.» zároveň obvykle zablokování častých repetitivních sekvencí, které

by mohly překrýt signál sondy, apod.

► fluorescenční značení sondy► při FISH nespecifické obarvení chromosomů jinou

fluorescenční barvou, typicky DAPI (counterstaining)► analýza preparátu pod fluorescenčním mikroskopem

In situ hybridizace (FISH/GISH)

FISH – fluorescent in situ hybridization► jako sonda slouží nějaká krátká sekvence

» vybraný gen / úsek DNA» repetitivní sekvence (včetně mikrosatelitů)

► sleduje se výskyt sondy (= komplementární sekvence) na jednotlivých chromosomech

GISH – genomic in situ hybridization► jako sonda slouží celková DNA zájmového druhu► typicky u polyploidů a hybridů, sleduje se barvení celých

chromosomů / jejich částí → původ od daného druhu

► používáno hlavně u úžitkových rostlin a umělých hybridů (hlavně GISH), pro divoké druhy zatím málo

FISH

Carmona et al. 2013, Ann. Bot. 112: 1845-1855► Hordeum marinum, dva 2x poddruhy + 4x,

morfologicky nerozeznatelný od 1 z diplodů► původ tetraploidů – auto vs. allopolyploidie► celkem 7 fluorescenčních sond

► jednoznačné odlišení všech chromo-somů (karyotyp)

► jeden 2x poddruh uniformní, v druhém určitá variabilita (stř. vs. Z Mediterán)

► 4x má dvě dílčí sady chromosomů →allopolyploid, jedna sada identická s morfologicky stejným 2x, druhý rodič neznámý (varianta druhého 2x?)

GISH

Renny-Byfield et al. 2010, Ann. Bot. 105: 527-533► učebnicový případ allopolyploidizace:

S. maritima 6x Eur × S. alterniflora 6x N.Am → S. ×townsendii 6xS. ×townsendii 6x steril. → S. anglica 12x fertil., invazní

► detailní průzkum původních lokalit s výskytem kříženců

► objev 9x rostlin► GISH ukazuje zastoupení genomů AAM

(~ 60 chromosomů S. alterniflora žlutě, ~ 30 chromosmů S. maritima červeně)

► asi zpětní kříženci► asi je to složitější, možný další genový

tok mezi taxony