molekulární a bun né biologie reg. č....

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Inovace studiamolekulární a buněčné biologie

reg. č. CZ.1.07/2.2.00/07.0354



Genomové projekty










GROUP GENUS BAC MAP WGS EST

Asterids tomatotobaccopotato

Rosids Arabidopsis thalianaArabidopsis lyrataCapsella BrassicacottonMedicagoLotusMimuluspoplar

Monocots bread wheatsorghumAe. tauschiibarleySaccharumriceBrachypodiummaize

GymnospermsPinusGnetum

Club moss Selaginella

SEKVENOVANÉ ROSTLINNÉ GENOMY


Arabidopsis thaliana

Arabidopsis genome inititative (AGI)Sekvenování postupem „shora dolů“ – na základě fyzické mapy kosmidových klonů.Osekvenováno cca 115 Mbp (euchromatin) – 25 500 genů (11 000 genových rodin). Během evoluce patrně 2x duplikace celého genomu.

Geny specifické pro rostlinný genom:- více než 800 jaderných genů je plastidového původu- enzymy pro výstavbu buněčné stěny- enzymy a jiné makromolekuly účastnící se fotosyntézy- produkty uplatňující se při vzniku turgoru, fototropismu a geotropismu- enzymy účastnící se produkce speciálních sekundárních metabolitů- geny pro rezistenci k patogenům

The Arabidopsis Information Resource (TAIR) www.arabidopsis.org


GENOMOVÉ PROJEKTY PRO OBILOVINY

- přednostně věnována pozornost ekonomicky významným znakům:- znaky související - s výnosem (morfologie zrna, množství semen,

doba kvetení)- s kvalitou produktů

- odolnost vůči biotickým a abiotickým stresům (prostředí, patogeny)

Modelové genomy

Rýže

Brachypodium130-470 Mbp


Kukuřice(2,3 Gbp)

- na základě sekvence předpovězeno 32 000 genů- 85% genomu – transponovatelné elementy

Pšenice, ječmen, žito, oves, tritikale

- velké komplexní genomyInformace o sekvencích, mapách, markerech, ESTech, knihovnách, literatuře, novinkách – databáze GrainGenes, Graminae


GrainGenes is a compilation of molecular andphenotypic information on wheat, barley, rye, triticale, and oats. The project is supported by theUSDA-ARS Plant Genome Research Program, and by the community of scientists who are providing theinformation and the reasons to be interested in it.


Pšenice (Triticum aestivum)

allohexaploidní druh – 2n=6x=42, genom AABBDDvznikl na základě dvou nezávislých hybridizacíGenom cca 110x větší než Arabidopsis, 1 chromozóm větší než celý genom rýže

17,000 Mbp (1C)1.2% genů


Možné strategie sekvenování

a) redukující přístupy- sekvenování ESTů – nezachytí celé sekvence a všechny geny- metylfiltrace, sekvenování založené na Cot frakcionaci – jen malé obohacení o kódující sekvence, sekvence nelze uspořádat

b) shotgun sekvenování – není u tak velkého genomu proveditelné

c) sekvenování klon po klonu (clone-by-clone sequencing)


K sekvenování klon po klonu jsou nutné knihovny velkých inzertů(BAC, YAC) a fyzická mapa – u pšenice za současných technologií není realizovatelná (genomická knihovna pšenice ve vektoru BAC má 1 200 000 klonů!)

Fyzická molekulární mapa (bp)

Genetická mapa (cM)

Ukotvené markery

Fyzická cytogenetická mapa (μm)

A B C D E F G

DNA molekula

Fyzická molekulární mapa (bp)

Genetická mapa (cM)

Ukotvené markery

Fyzická cytogenetická mapa (μm)

A B C D E F GAA BB CC DD EE FF GG

DNA molekula


Chromosomes: 605 - 995 Mbp(3.6 – 5.9% of the genome)

Nuclear genome

;

Genome size

Arabidopsis thaliana(2n = 2x = 10)1C ~ 150 Mbp

Triticum aestivum(2n = 6x = 42)

1C ~ 17 000 Mbp

AA BB

DD

Chromosome arms: 225 - 585 Mbp(1.3 – 3.4% of the genome)

Řešení nabízí strategie založená na použití chromozómově specifických knihoven - vytvořeny z jednotlivých chromozómů (ramen) vytříděných pomocí průtokového cytometru

Umožňuje rozdělit přípravu fyzických map a sekvenování mezi laboratoře.


2A 3A 4A 5A1A 6A 7A

1D 2D 4D 5D 6D 7D

2B

3D

1B 3B 4B 5B 6B 7B

MEZINÁRODNÍ SPOLUPRÁCE PŘI SEKVENOVÁNÍ ROSTLINNÉHO GENOMU

21 chromozómůpšenice seté

International

Wheat

Genome

Sequencing

Consortium


Projekt sekvenování lidského genomu


PROJEKT LIDSKÉHO GENOMU (HGP)Zahájen v r. 1990, 3 pětileté plány

Původní cíle:1) Vytvoření genetických a fyzických map o vysokém

rozlišení, které pomohou lokalizaci genů spojenýchs chorobami

2) Získání kompletní sekvence genomu3) Identifikace genů – kombinací vyhledávání ORF,

vytváření databází ESTů, využití dat o funkci z jinýchživočišných genomových projektů

4) Sestavení databáze polymorfismů, zejména SNP usnadnění integrace genom. a klinických datstudium lidské diverzity a evoluce

5% rozpočtu na výzkum etických, právních aspolečenských aspektů (projekt ELSI)


Významné milníky

1991 – Craig Venter – sekvenování ESTů(10 000 ročně)

1992 – vzniká TIGR1994 – hustá genetická mapa s 1200 markery po 1cM

- v TIGRu osekvenován genom H. influenzae shotgun technikou

1995 – fyzická mapa z 52 000 STS po 60 kb- databáze 30 000 ESTů (NIH)- Venter publikuje v Nature podrobné údaje o své sbírce ESTů (175 000 vlastních – z 37 tkání, celkem345 000)

1998 – popsána kolekce 3000 SNP (2004 – 1,8 mil SNP)2000 – kompletní sekvence nejmenšího chromozómu (21)


Hrubé sekvenování ukončeno v r. 2000. V té době odhady počtu genů 20 000-120 000.

E. coli S. cerevisiae Drosophila A. thaliana Myš Člověk

Velikost genomu (Mb)

4,6 12,0 120+ 115+ 2500+ 3000+

Počet genů 4300 6250 13600 25500 30000 25000

+ pouze sekvenovaný chromatin

Enzymy účastnící se metabolismu – stejný počet jako jiná eukaryota, vzrůstá počet genů s regulačními funkcemi. Zhruba stejný obsah genů jako jiní savci, některé třídy genů dokonce pokles.


Čí genom byl sekvenován?

Mezinár. konsorcium Celera

> 50 dobrovolných dárců DNA 21 dárců DNA

knihovny velkých inzertů knihovny 2-, 10-, 50-kb

(BAC/PAC)

vybráno 8 knihoven, vybráno 5 knihoven (2 muži,vše muži, etnický původ 3 ženy, různý původ)

neznámý

hierarchické sekvenování shotgun sekvenování

75% od 1 dárce 66% od 1 dárce


Kdy bude projekt dokončen?

Původní cíl - 1 chyba na 10 000 bp.

Dnes 99% euchromatinu – 1 chyba na 100 000 bp.

Rozsáhlé úseky heterochromatinu, zejména

centromerického (cca 20% genomu) se možná vůbec

nepodaří poskládat.


Internetové zdroje

Centrální internetové zdroje koordinovány- Národním centrem pro biotechnologické informace

(NCBI) – USA- projektem Ensembl – spolupráce mezi Evropským

bioinformatickým institutem (EMBL-EBI) a Sangerovým centrem ve Velké Británii

správa databází, vývoj softwaru, rozšiřování biomedicínských informací, digitální archiv literatury

Součástí NCBI je webová stránka OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) – integruje genomická data s medicínskými (katalog dědičných nemocí)


ŽIVOČIŠNÉ GENOMOVÉ PROJEKTY

International Sequencing Consortium – spravuje datábazi živočišných a rostlinných genomových projektůNávrh na sekvenování nového organismu posuzuje NHGRI – podle přínosu získaných sekvencí pro biomed. výzkumJednotlivá sekvenační centra se ucházejí o projekt. Hrubá sekvence živočišného genomu za 3-6 měsíců.


Projekty genomu hlodavcůPROČ?

1) Existuje dostatek mutantních kmenů (dobře charakterizované) + možnost mutageneze celého genomu umožňuje genetickou analýzu jakéhokoli lokusu

2) Existuje sbírka cca 100 kmenů laboratorních myší s dobře charakterizovaným rodokmenem umožňuje studium genetické variace a komplexních kvantitativních znaků (asociační mapování)

3) Evoluční pozice hlodavců – dost vzdálení – konzervované sekvenční bloky jsou indikátorem funkční nutnosti- dost blízcí – mnoho aspektů vývoje, fyziologie a genetika jsou podobné


Myš – hrubá sekvence r. 2002

Krysa 2004

Mouse genome informatics - web stránka – obsahuje

- genetické, fyzické a komparativní mapy

- údaje o kmenech (včetně údajů o nádorech) a polymorfismech

- údaje o genové expresi

- rozsáhlý seznam genetických markerů

- umožňuje srovnání sekvencí myšího a lidského genomu – slouží

k identifikaci regulačních míst a pomáhá anotaci genů


DALŠÍ MODELOVÍ OBRATLOVCI

Pes – r. 2003- model pro řadu chorob – astma, parazitické infekce, rakovina, artritida, cukrovka, poruchy chování

Kur domácí – r. 2004- model pro onkogenezi a virologii

Primáti: šimpanz (r. 2005), makak- pro studium imunitního systému, mechanismu rezistence proti patogenům (HIV)- pro studium evoluce – v genech rozdíl jen 1,2%

Skot – draft r. 2004, prase – draft r. 2005

Modelové ryby:Danio rerio – model pro studium embryogeneze, neurogeneze, organogenezeTetraodon nigroviridis, Fugu rubripes


Paleogenomika

Mamut – listopad 2008- použito 454 sekvenování- sekvenováno 28 Mbp metagenomickým přístupem (ze vzorků mamuta ze Sibiře) – 13 Mbp opravdu DNA mamuta, zbytek bakterie aj.- homologie se sekvencí slona afrického – 98,55%


MODELOVÉ ORGANISMY BEZOBRATLÉPROČ?

- možnost získat mutace ve všech genech – saturační mutageneze + konstruce delečních map (Drosophila)- cílená mutageneze

- vhodné ke studiu procesu vývoje, ke studiu lidských chorob, včetně psychických poruch

Caenorhabditis elegans – nematoda – tělo 959 buněkGenom přečten r. 1998 – 97 Mbp, 19 099 genů– tvoří 25% genomu, 30% příbuzných s geny člověka.Zejména vhodný ke studiu nervového systému.WormBase web site

Drosophila melanogaster180 Mbp, třetina repetice, 13 500 genů- vysoký stupeň konzervace všech hlavníchregulačních a biochemických drah,jež jsou také u kvasinek a vyšších eukaryotFlyBase web site


Geny pro lidské choroby v modelových organismech

Modrá – DrosophilaOranžová – CaenorhabditisFialová - Saccharomyces

Gibson a Muse, 2004

Date post:	28-Feb-2019
Category:	Documents
Upload:	vandiep
View:	215 times
Download:	0 times

molekulární a bun né biologie reg. č....

Documents