Morfometrická metoda hodnocení vlivu aplikace podzimních
regulátorů růstu u ozimé řepky olejky
(certifikovaná metoda)
Autoři: RNDr. Hana Konrádová, PhD.
doc. RNDr. Helena Lipavská, PhD.
Praha, červenec 2017
Katedra experimentální biologie rostlin
www.natur.cuni.cz/biologie/biologie-rostlin
Certifikovaná metodika vznikla s využitím poskytnuté podpory MŠMT jako součást řešení
projektu NPU: Centrum experimentální biologie rostlin UK (LO 1417).
Metodika prošla oponentním řízením a získala osvědčení o uplatnění certifikované metodiky
získané dle MZe pod číslem …………………
Autoři: RNDr. Hana Konrádová, PhD. ([email protected])
Doc. RNDr. Helena Lipavská, PhD. ([email protected])
Oponenti: Ing. Eva Plachká, Ph.D. (OSEVA vývoj a výzkum s.r.o., pracoviště Opava)
Ing. Michaela Budňáková (Ministerstvo zemědělství ČR)
Poděkování:
RNDr. Aleši Soukupovi, Ph.D. za umožnění práce na scanneru jeho týmu (EPSON Perfection
V800) i za cenný tip na vhodný barvící roztok.
Foto obálka:
Horní řada: Podélný mediální řez oblastí kořenového krčku a stonku přezimující růžice řepky,
vlevo kontrola, vpravo po ošetření morforegulátorem Caryx®. Barveno toluidinovou modří
dle prezentované metodiky, snímáno pomocí stolního kancelářského scanneru.
Dolní řada: Příčný řez primárním kořenem řepky (1cm pod kořenovým krčkem), vlevo
kontrola, vpravo rostlina ošetřená morforegulátorem Magnello®. Barveno toluidinovou modří
dle prezentované metodiky, snímáno pomocí stolního kancelářského scanneru.
(H. Konrádová)
Obsah
Cíl metodiky .............................................................................................................................. 1
Úvod ........................................................................................................................................... 1
Dedikace .................................................................................................................................... 2
Stručný popis metodiky ........................................................................................................... 2
Detailní popis metodiky ........................................................................................................... 2
1. Použitý rostlinný materiál………………………………………….…………………………………...2
2. Pomůcky a chemikálie……………………………………………………...…………………………...2
3. Zpracování rostlinného materiálu a postup hodnocení vybraných parametrů…………….3
3.1. Příprava materiálu v terénu……………………………………………………………..3
3.2. Zpracování materiálu v laboratoři……………………………………………………...3
3.3. Snímání řezů kancelářským scannerem……………………………………………….4
3.4. Zpracování a analýza obrazu…………………………………………………………...4
3.5. Výsledky: základní kvantitativní charakteristiky rostlin…………………………….6
3.6. Porovnání parametrů řezů získaných navrhovanou metodikou a tradičními
histologickými metodami…………………...............................................................7
Popis uplatnění certifikované metodiky ................................................................................. 8
Srovnání novosti postupů ........................................................................................................ 8
Ekonomické aspekty ................................................................................................................ 8
Seznam použité literatury ........................................................................................................ 8
Seznam publikací, které předcházely metodice …………………………………….……...9
Příloha 1 – Informace o nástrojích pro jednoduchou analýzu obrazu ................................ 9
Příloha 2 – Postup a pomůcky pro doprovodnou anatomickou studii .............................. 10
1
Cíl metodiky
Cílem metodiky je poskytnout zemědělské praxi efektivní metodu pro hodnocení stavu růžice
a kořenového krčku řepky po aplikaci podzimních regulátorů růstu založeného na stanovení
základních morfologických charakteristik s využitím běžných technických prostředků
a nejjednodušších volně přístupných metod analýzy obrazu.
Úvod
Fyziologický stav porostu řepky v podzimním období je z hlediska utváření budoucího
výnosového potenciálu rostlin zásadní. Před nástupem zimního období se v úžlabí listů
zakládají pupeny, ze kterých se budou v jarním období vyvíjet postranní větve nesoucí květy.
Zásadně se ale i na prospívání porostu podílí silný a zdravý kořenový systém, jehož základ se
tvoří také v podzimním období.
Použití regulátorů růstu v podzimním období je agrotechnický zásah, který podstatně
snižuje riziko vyzimování porostu a zároveň výrazně zvyšuje výnosovou jistotu. V současné
době je pro podzimní regulaci růstu v praxi používána řada agrochemických prostředků
spadajících do skupiny regulátorů růstu či fungicidů s významnými morforegulačními účinky.
Jedná se předně o kombinace azolů, kde majoritní regulující složkou je tebuconazole nebo
metconazole, často v kombinaci s jinou účinnou látkou ze skupiny azolů, jejíž funkce je
převážně fungicidní. Druhou skupinu tvoří přípravky na bázi metconazole a mepiquat
chloridu (CCC), které jsou přímo registrovány mmj. jako přípravky pro zvýšení jistoty
přezimování. Používané přípravky s morforegulačními účinky indukují mnoho
morfologických i biochemických změn a mají obecně velmi dobrý vliv na růstové parametry -
prodlužují kořen, zesilují krček, zkracují listy a především upravují poměr nadzemní a
kořenové biomasy. Velkým přínosem je také zvýšení podílu sušiny na celkové hmotnosti, což
pozitivně ovlivňuje přezimování. Jedním z důsledků regulace je také tvorba většího množství
listů (tím i vyššího počtu úžlabních pupenů), které ale mají kratší řapíky a menší listové
čepele, listová růžice je výsledně přisedlá k zemi. Tím se nesnižuje listová plocha potřebná
pro asimilaci, ale oddaluje se zapojení porostu a také se prodlužuje doba intenzivního nárůstu
kořenové hmoty (Šaroun, 2012). Morrison a Andrews (1992) zjistili, že regulátory růstu
ovlivňují i velikost buněk a zvyšují jejich počet v listu. I díky tomu po jejich aplikaci vzrostla
u řepky zimovzdornost. Vašák a kol. (2001) zmiňují krom přisedlé listové růžice, podpory
kořenového systému a silnějšího kořenového krčku i významné fungicidní účinky u azolů
aplikovaných v plných dávkách. Aktuální stav ošetřeného porostu ovšem závisí nejen na
použitém prostředku, ale také na dalších, obtížně ovlivnitelných okolnostech aplikace
(stanovišti, průběhu počasí, genotypu apod.). Proto je výhodné mít k dispozici metodu, která
rychle a snadno umožní zhodnocení aktuální situace konkrétního porostu.
Pro hodnocení účinku zmíněných regulátorů na morfologické úrovni se nejčastěji
používá soubor kvantitativních znaků - průměr kořenového krčku, počet listů, délka listů a
výška epikotylu. Hodnoceny jsou obvykle tradičními metodami na makroskopické úrovni
(posuvné či tradiční měřítko nebo pravítko), bez možnosti vzít v úvahu i základní anatomické
uspořádání vnitřních pletiv zkoumané rostliny. Přitom právě podíl jednotlivých druhů pletiv
může mít velký význam vzhledem k funkci celého zkoumaného orgánu/souboru pletiv (podíl
vodivých/zásobních/základních pletiv apod.). Tradiční anatomické (histologické) metody jsou
ovšem technicky i časově velmi náročné – především příprava trvalých či dočasných
preparátů a dále pak jejich hodnocení (nejčastěji pomocí mikroskopických technik).
2
Analýza obrazu je moderním nástrojem pro kvantitativní hodnocení a extrakci dat z
obrazu. Tato metoda v sobě zahrnuje celou řadu přístupů a je využívána v mnoha oborech
(např. průmyslová kontrola, kriminalistika, užitá grafika, počítačové vidění, vědecké obory
apod.). Kvantitativní výstupy konkretizují a objektivizují srovnání výsledků experimentů,
které pozorujeme prostým okem či pod lupou/mikroskopem a umožňují sledování rozdílů
běžným pozorováním nepostihnutelných a vylučují zatížení subjektivním hodnocením
pozorovatele. Pro číselný výstup měření v reálných jednotkách lze snadno uvést hodnoty
obrazových bodů do poměru k reálným hodnotám - kalibrovat systém za pomoci znalosti
velikosti obrazového bodu. Nejjednodušším způsobem jak změřit některé parametry je použití
nástrojů pro přímé interaktivní měření. Uživatel vizuálně detekuje objekty s jejich hranicemi a
"přikládá na ně měřítka". V praxi vypadá postup tak, že virtuální úsečkou vymezíme délkovou
charakteristiku, která nás zajímá a systém nám vypočítá její hodnotu. Podobně můžeme kreslit
různé obrazce a zjišťovat jejich parametry - v závislosti na použitém softwaru. Výhodou
oproti tradičním metodám jednorázového měření rostlin je také uchování obrazového
materiálu pro případné další použití.
Dedikace
Tato certifikovaná metodika vznikla za podpory MŠMT jako součást řešení projektu NPU:
Centrum experimentální biologie rostlin UK (LO 1417).
Stručný popis metodiky
Předkládaná metodika využívá pro hodnocení charakteristik popisujících stav přízemní růžice
a kořenového krčku před zimou (respektive po podzimním regulačním ošetření) zjednodušený
přístup měření pomocí maximálně zjednodušené analýzy obrazu z ručních řezů rostlinnými
pletivy, a tedy kombinuje zjišťování standardních biometrických charakteristik s možností
zhodnocení vnitřního uspořádání základních pletiv zkoumaného objektu. Předpokládá totiž
sekundární využití získaných skenů k orientačnímu hodnocení vnitřní stavby orgánů (podíl
základních pletiv atd.).
Detailní popis metodiky
1. Použitý rostlinný materiál
Pro vypracování této metodiky byly použity rostliny řepky Brassica napus L. (odběr v BBCH
cca 19) pocházející ze dvou experimentálních ploch: 1.) Červený Újezd, Praha-západ
(Výzkumná stanice České Zemědělské Univerzity Červený Újezd u Prahy); odběr proveden
dne 25. 11. 2015; a 2.) Trutnov (Zkušební stanice Trutnov s.r.o.); odběr proveden 4. 11.
2015). Na obou stanovištích byly k odběru použity rostliny, které prošly ošetřením
následujícími přípravky dle jejich doporučeného agrotechnického termínu v BBCH 15
(Červený Újezd 17. 9. 2015, Trutnov 22. 9. 2015): Magnello, Caryx, Tilmor. Dále byly jako
kontrolní pro každé stanoviště použity rostliny regulátory růstu neošetřené (Kontrola).
2. Pomůcky a chemikálie
Nádobky k odběru materiálu v polním prostředí (ideálně skleněné, s dobře těsnícím
víčkem, např. lékovky, sklenky od dětské výživy apod.), opatřené vhodným popisem
odebíraných variant.
3
Fixační roztok pro uchování materiálu do dalšího zpracování (50% etanol či pro delší
skladování 50% FAA). Příprava FAA: 35% formaldehyd + ledová kys. octová + 50%
ethylalkohol v poměru 5 + 5 + 90 dílů, viz např. Němec a kol. (1962).
Žiletky
0,002% roztok toluidinové modři ve vodě. Zásobní roztok (0,02%) může být uchováván
v lednici a před vlastním barvením segmentů naředěn na finální požadovanou koncentraci
0,002% (v/w).
Běžný kancelářský scanner, umožňující uložení skenů ve formě .tif či .jpg souborů a
kvalitě optimálně 600-800 dpi.
Program umožňující zjištění délkových charakteristik z naskenovaných řezů – volně ke
stažení např. ImageJ, dále např. NIS elements, CellF apod. (viz Příloha 1). V této
metodice jsou prezentovány postupy s využitím programu ImageJ.
Tmavý samet nebo tmavý papír je doporučen jako kontrastní pozadí pro skenované ruční
řezy.
3. Zpracování rostlinného materiálu a postup hodnocení vybraných
parametrů
3.1. Příprava materiálu v terénu
Rostliny řepky jsou přímo na místě odběru zbaveny zbytků zeminy a ořezány na segment o
délce cca 3-5 cm (dle velikosti rostlin) obsahující oblast listové růžice (včetně základů
nejmladších listů a apikálního meristému prýtu), oblast kořenového krčku a 1-1,5 cm kořene.
Takto upravené segmenty jsou uloženy do nádobky obsahující fixační roztok (viz výše) a
dopraveny do laboratoře.
3.2. Zpracování materiálu v laboratoři
Před vlastní analýzou jsou segmenty zbaveny fixačního roztoku postupným prosycením
nejprve 40% etanolem, následně 20% etanolem (každý krok minimálně 6 hodin). Segmenty
jsou vyňaty z 20% etanolu na rovnou plochu a podélně rozříznuty žiletkou tak, aby byl řez
veden mediální rovinou segmentu (obr. 1a, b). Dále jsou obě poloviny segmentu seříznuty tak,
jak ukazuje obrázek 1c – důvodem je zmenšení tloušťky ručního řezu pro barvení a následnou
manipulaci během skenování. Z obou řezů z takto zpracovaných polovin segmentu je pro
další zpracování vybrána ta, která lépe zachytila mediální oblast podélného řezu.
Obrázek 1 - Postup zpracování fixovaných segmentů řepky k získání mediánních ručních řezů.
a b c
4
Takto připravené ruční řezy mohou být uchovány opět v 20% etanolu do doby barvení.
Barvení probíhá přenesením nařezaných mediálních segmentů do 0,002% vodného roztoku
toluidinové modři. V roztoku se segmenty obvykle barví 5 minut. Dobu barvení je možné
upravit dle potřeby, aby byl docílen žádoucí kontrast pro skenování. Po uplynutí doby barvení
se řezy krátkodobě uchovávají ve vodě (do doby snímání obrazu na scanneru).
3.3. Snímání řezů kancelářským scannerem
Řezy jsou vyjmuty z barvícího roztoku či vody, šetrně osušeny pomocí savého papíru a
umístěny na snímací plochu scanneru. Před skenováním je nutno zvolit kvalitu skenování
(dostačující je 600dpi, pro účel této metodiky bylo zvoleno 800dpi - tento údaj je nutné
pečlivě zaznamenat, pro jednoduchost nejlépe do názvu ukládaného souboru s daným
snímkem). Tento údaj (dpi = dots per inch) slouží k přepočítání obrazových bodů na reálné
délkové charakteristiky.
3.4. Zpracování a analýza obrazu
Pokud je to potřeba, nasnímané řezy je možné standardním způsobem upravit (jas, kontrast,
ořez apod.), a to v jakémkoli programu určeném pro práci s fotografiemi (z volně přístupných
např. IrfanView), nebo již přímo v programu pro analýzu obrazu (v této metodice je využit
volně přístupný program a uživatelsky příjemný ImageJ zajišťující, že zmíněnou metodiku
úspěšně použije i pracovník bez předchozí zkušenosti s podobnými technikami). Zmíněné
úpravy zde provedeme po otevření zvoleného obrázku v ImageJ pomocí Menu/Image Adjust
(Brightness, Contrast…) či Menu/Tools/Rectangular selection). Rozložení základních
ovládacích prvků ImageJ ukazuje obrázek 2. Na návody a užitečné odkazy související s tímto
programem odkazuje Příloha 1.
Obrázek 2 – Rozložení základních ovládacích prvků programu ImageJ.
Vybrané délkové charakteristiky nasnímaných segmentů se měří pomocí přikládání
virtuálních úseček (krajové body se označí kliknutím myši). Pokud chceme měřit v reálných
jednotkách, je třeba uvést hodnoty obrazových bodů do poměru k reálným hodnotám -
kalibrovat systém. Pro rozměrové charakteristiky je třeba
zjistit reálnou velikost obrazového bodu. Před vlastním
měřením je doporučeno provést kalibraci obrazového bodu, tu
je možné provést přímo v programu ImageJ před vlastním
měřením (doporučeno): pomocí cesty Menu/Analyze/Set
scale; zadat informace dle nastaveného rozlišení scanneru
(např. 800dpi odpovídá 25,4 mm), případně naskenovat
přesné (objektivní) měřítko známé velikosti a kalibraci
provést dle něho. Kalibrace pomocí přesného objektivního
měřítka není nutná, pokud je naším cílem získání relativních
hodnot pro vzájemné porovnání vybraných situací. Při
zaškrtnutí volby Global se kalibrace stává obecnou i pro
5
následující otevírané soubory (do změny kalibrace). Také je možné měření provést
v obrazových bodech (není-li provedena kalibrace, výsledky se ukládají v pixelech (px,
obrazový bod) a teprve až při převodu do tabulkového procesoru provést přepočet ze známého
rozlišení při skenování do reálných délkových jednotek (počet dpi; 1 inch (palec) = 2,54 cm).
Manuální měření délkových charakteristik se provádí v programu ImageJ, v kterém je
otevřen soubor se skenem objektu. Ukázka pracovního prostředí při měření délkových
charakteristik řezu je znázorněna na obrázku 3. Pomocí nástroje přímé čáry (Tools/Straight
line) lze měřit vytipované délkové charakteristiky. Je vhodné výsledek měření zaznamenat po
každém naměření úsečky pomocí příkazu Measure (Analyze/Measure; zkratková klávesa
Ctrl+M) – výsledky se zapíší do dialogového okna Results. (Délka nakreslené úsečky je ale
zobrazena také přímo v dialogovém okně.) Dalším krokem je export změřených hodnot např.
do programu MS Excel pro další zpracování (pomocí Edit/Copy nebo Ctrl+C).
Obrázek 3 – Příklad pracovního prostředí při měření délkových charakteristik nasnímaného řezu.
Pro účely této metodiky byly zjišťovány následující kvantitativní charakteristiky
popisující stav přezimující růžice řepky: šířka kořenového krčku, výška osy růžice
(vzdálenost apikálního meristému a kořenového krčku), šířka osy růžice (maximální
vzdálenost protilehlých odstupujících listových stop, cca v polovině výšky růžice) – viz
schéma na obr. 4b. Porovnání vybraných kvantitativních charakteristik přezimujících růžic
ozimé řepky ošetřené několika morforegulátory, které byly porovnávány v rámci vypracování
této metodiky, jsou sumarizované v následující kapitole 3.5.
6
Dále byla provedena doprovodná základní anatomická studie s cílem porovnat výsledky
dosažitelné předkládanou metodikou se standardní anatomicko-histologickou analýzou
trvalých preparátů (stručný popis metodiky viz Příloha 2). Porovnání výsledků orientačního
hodnocení stavu a podílu pletiv získaných touto studií a předkládanou metodikou je
sumarizováno v kapitole 3.6.
3.5. Výsledky: základní kvantitativní charakteristiky rostlin
Na obrázku 4a, c, d jsou graficky shrnuty výsledky získané předkládanou metodikou,
srovnávající rostliny řepky ošetřené několika morforegulátory, pocházející ze dvou
experimentálních ploch: 1.) Červený Újezd (ČÚ), a 2.) Trutnov (TR). Zvolené měřené
charakteristiky jsou znázorněny na obrázku 4b.
Obrázek 4 – Kvantitativní analýza řezů řepky provedená navrhovanou metodikou. Rostliny z dvou
experimentálních ploch: 1.) Červený Újezd, Praha-západ (ČÚ); odběr proveden dne 25. 11. 2015; a 2.) Trutnov
(TR.); odběr proveden 4. 11. 2015.; použité morforegulátory: Magnello, Caryx, Tilmor; Kontrola: rostliny
neošetřené. Kvantitativní charakteristiky popisující stav přezimující růžice (obr. 4b): šířka kořenového krčku,
výška osy růžice (vzdálenost apikálního meristému a kořenového krčku), šířka osy růžice (maximální vzdálenost
protilehlých odstupujících listových stop, cca v polovině výšky osy růžice). Počet měřených řezů pro každé
stanoviště a ošetření n = 8-14 (úsečky nad sloupci značí příslušnou směrodatnou odchylku).
a b
c d
0
2
4
6
8
10
12
Ko
ntr
ola
TR
Ko
ntr
ola
ČÚ
Mag
ne
llo T
R
Mag
ne
llo Č
Ú
Tilm
or
TR
Tilm
or
ČÚ
Car
yx T
R
Car
yx Č
Ú
[mm]
Šířka kořenového krčku
02468
10121416182022
Ko
ntr
ola
TR
Ko
ntr
ola
ČÚ
Mag
ne
llo T
R
Mag
ne
llo Č
Ú
Tilm
or
TR
Tilm
or
ČÚ
Car
yx T
R
Car
yx Č
Ú
[mm]
Výška osy růžice
0
2
4
6
8
10
12
14
Ko
ntr
ola
TR
Ko
ntr
ola
ČÚ
Mag
ne
llo T
R
Mag
ne
llo Č
Ú
Tilm
or
TR
Tilm
or
ČÚ
Car
yx T
R
Car
yx Č
Ú
[mm]
Šířka osy růžice
7
Provedená orientační studie porovnávající vliv tří látek s morforegulačním účinkem
aplikovaných na porosty dvou rozdílných výzkumných stanic ukazuje zřetelně nejen vliv
použitého látky s morforegulátoru, ale také vliv podmínek stanoviště. Jednoduchost
předkládané metodiky umožňuje opakované zhodnocení stavu porostu v každé konkrétní
kombinaci aplikovaného ošetření a podmínek stanoviště.
3.6. Porovnání parametrů řezů získaných navrhovanou metodikou a tradičními
histologickými metodami
Pro ověření možnosti použití této jednoduché
metodiky nejen ke změření základních
morfometrických charakteristik relevantní
oblasti rostliny, ale i k zjištění základní
anatomicko-histologické stavby (například
zjištění podílů jednotlivých typů pletiv apod.),
byla provedena klasická anatomická studie
formou přípravy trvalých preparátů parafínovou
metodou (obrázky 5a, c). Takto zhotovené
preparáty byly použity k posouzení, zda
zrychlená metodika pomocí skenování ručních
řezů (obrázky 5b, d) dokáže přispět i
plnohodnotnou informací o vnitřní struktuře
zkoumaných segmentů.
Výsledky porovnání ukazují na velmi dobrou použitelnost navrhované metodiky pro
posouzení vlivu aplikace růstových regulátorů na morfologické parametry rostlin řepky, které
jsou rozhodující pro úspěšné přezimování porostu.
Obrázek 5 – Srovnání řezů zhotovených tradiční parafínovou metodou do formy trvalých preparátů (5a, c) a
ručních řezů zhotovených dle navrhované certifikované metodiky (5b, d).
Magnello Kontrola
a c b d
8
Popis uplatnění certifikované metodiky
Uplatnění metodiky je zejména v poradenské činnosti v zemědělství. Lze tak rychle získat
podklady pro operativní rozhodování o vhodnosti či účinnosti sledovaných ošetření a
následný návrh dalšího postupu. Mohou ji však využít i samotní pěstitelé, resp. agronomové
zemědělských podniků při průběžném hodnocení stavu porostů během předzimního období.
Další skupinou možných uživatelů jsou střední či vysoké školy, především zemědělského
směru, pro účely výuky morfologie/anatomie či technologie ošetření porostů.
Srovnání novosti postupů
Předložená metodika rozšiřuje soubor standardně používaných metodik předzimního
hodnocení porostů ošetřených látkami s morforegulačním účinkem. Umožňuje hodnocení
stavu přezimující růžice a kořenového krčku řepky po aplikaci podzimních regulátorů růstu
pomocí kombinace vnějších i vnitřních morfologických ukazatelů. Předností metodiky je její
jednoduchost a malá náročnost na potřebné vybavení a chemikálie, a to při zachování vysoké
vypovídací schopnosti o stavu porostu řepky a jeho potenciálu pro růst a vývoj rostlin
v následujících fázích vegetační sezóny. Zhodnocení stavu porostu tedy může být provedeno
pro každé stanoviště a konkrétní ošetření morforegulátorem.
Ekonomické aspekty
Na zavedení postupů uvedených v metodice není třeba žádných zvláštních nákladů a
vybavení, jedná se o využití běžně přístupného laboratorního (laboratorní sklo, běžné
chemikálie a nástroje) či kancelářského vybavení (skener). Jedinou položkou, která nemusí
být v běžné laboratoři k dispozici, je toluidinová modř k barvení ručních řezů – např. u firmy
Sigma Aldrich 1400,- Kč + DPH / 5g (vystačí na 250 litrů barvícího roztoku).
Ekonomický přínos pro uživatele spočívá v možnosti získání poměrně rozsáhlého
množství informací a výsledků v relativně krátkém čase, konkrétně: 1) kvantitativní
(biometrické) hodnocení důležitých strukturních charakteristik; 2) kvalitativní hodnocení
stavu pletiv; 3) možnost rychlého a nezávislého otestování širokého spektra vybraného
rostlinného materiálu; 4) uchování obrazového materiálu pro případné další
hodnocení/použití. Na základě výše uvedených bodů se výrazně snižují náklady na hledání
vhodného morforegulačního postupu.
Seznam použité literatury
Morrison M.J a Andrews C.J. (1992) Variable increases in cold hardiness induced in winter rape by
plant growth regulators. Journal of Plant Growth Regulation, 11: 113–117.
Němec B. a kol. (1962) Botanická mikrotechnika. Nakladatelství ČSAV, Praha.
Poláčková D. a Beneš K. (1975) The staining of chromosomes and nuclei in squashes of root tips with
aluminium lake of nuclear fast red. Biologia Plantarum, 17: 374–375.
Šaroun J. (2012) Udržitelné pěstování řepky ozimé v současných podmínkách. In: Kazda J. (ed.). Jak
maximalizovat ziskovost v pěstování řepky ozimé. Dow AgroSciences.
Vašák J., Bečka D. a Nerad D. (2001) Regulace růstu ozimé řepky na podzim. Agro – ochrana, výživa,
odrůdy, 6: 34-35.
9
Seznam publikací, které předcházely metodice
Při vypracování navrhované metodiky jsme vycházely především z těch prací našeho týmu,
které se zabývaly vývojovými změnami (organogeneze, somatická embryogeneze, kvetení,
regulace buněčného cyklu rostlin, a to včetně změn v anatomické struktuře rostlin / orgánů)
v souvislosti se sacharidovým metabolismem rostlin a s působícím stresem sucha, chladu,
těžkých kovů apod.
Hudec L., Konrádová H., Hašková A. a Lipavská H. (2016) Norway spruce embryogenesis: changes in
carbohydrate profile, structural development and response to polyetylene glycol. Tree
Physiology, 36:548-561.
Vojvodová P., Mašková P., Francis D. a Lipavská H. (2013) A yeast mitotic activator sensitises the
shoot apical meristem to become floral in day-neutral tobacco. Planta 238:793–806.
Lipavská H., Mašková P. a Vojvodová P. (2011) Regulatory dephosphorylation of CDK at G(2)/M in
plants: yeast mitotic phosphatase cdc25 induces cytokinin-like effects in transgenic tobacco
morphogenesis. Annals of Botany, 107:1071-1086.
Fischer L., Lipavská H., Hausman J-F. a Opatrný Z. (2008) Morphological and molecular
characterization of a[hL2] spontaneously tuberizing potato mutant: an insight into the
regulatory mechanisms of tuber induction. BMC Plant Biology 8:117-121.
Soukupová J., Albrechtová J., Svobodová (Konrádová) H. a Opatrná J. (2002) Anatomical and
histochemical changes of Norway spruce buds induced by simulated acid rain. Biologia
Plantarum, 45:77-84.
Lipavská H., Svobodová H. a Albrechtová J. (2000) Annual dynamics of the content of non-structural
saccharides in the context of structural development of vegetative buds of Norway spruce.
Journal of Plant Physiology, 157:365-373.
Svobodová H., Albrechtová J., Kumstýřová L., Lipavská H., Vágner M. a Vondráková Z. (1999)
Somatic embryogenesis in Norway spruce: Anatomical study of embryo development and
influence of polyethylene glycol on maturation process. Plant Physiology and Biochemistry
37:209-221.
Příloha 1 – Informace o nástrojích pro jednoduchou analýzu obrazu
Program ImageJ (National Institute of Health, Bethseda, Maryland, USA) - veřejně
dostupný program, volně ke stažení (freeware) pro zpracování a analýzu obrazu. Je založený
na programovacím jazyku JAVA, je proto možné jej používat na různých operačních
systémech. Jedná se o otevřený systém – je možné do něj implementovat další různé
uživatelsky vytvořené moduly.
Download: http://rsb.info.nih.gov/ij/
Uživatelský manuál: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html
Další software vhodný k analýze obrazu:
Ellipse (SK) http://www.ellipse.sk/
Laboratory Imaging (Cz) www.LIM.cz - systémy Lucia a NIS Elements:
NIS Elements (CZ) http://www.nis-elements.cz/cs
LUCIA http://www.lucia.cz/cs
10
Příloha 2 – Postup a pomůcky pro doprovodnou anatomickou studii
Pomůcky a chemikálie potřebné k přípravě tradičních trvalých anatomických preparátů
parafínovou metodou, tedy roztoky k odvodnění objektů a jejich zalití do parafínu (například
dle metodiky Němec a kol. 1962), konzolový či motorový mikrotom, podložní a krycí
mikroskopická skla, vhodná histologická barviva (např. pro použité duální barvení pravá
jádrová červeň a alciánová modř viz Poláčková a Beneš, 1975), montovací médium pro
uzavírání trvalých preparátů, mikroskop pro pozorování preparátů, případně scanner
s dostatečným rozlišením pro snímání mikroskopických preparátů. Tyto pomůcky a postupy
nejsou potřeba k použití předkládané certifikované metodiky.
