Membránový transport - mechanismy transportu malých molekul,
makromolekul a experimentální transport do buňky.
MUDr. Džubák Petr, Ph.D.Laboratoř experimentální medicíny při
Dětské kliniceLékařská fakulta Univerzity Palackého
Doporučená a použitá literatura:
Základy buněčné biologie – Alberts et al.
Další zdroje:Biochemie – Voet &Voetová
Role membránových transportních proteinů
Transport molekul
• volnou difusí,
• dočasnými nebo trvalými póry,
• usnadněnou difusí pomocí nízkomolekulárních nebo vysokomolekulárních přenašečů nebo
• mechanismem endocytosy nebo exocytosy.
Propustnost lipidové dvojvrstvy
Volná difuse
Klasifikace transportních proteinů1. Póry a kanály 2. Transportéry poháněné elektrochemickým potenciálem 3. Primární aktivní transportéry 4. Skupinové translokátory 5. Transmembránové přenašeče elektronů 6. skupina 7. skupina 8. Přídatné faktory v transportních pochodech 9. Neúplně charakterizované transportní systémy
Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)
1. Póry a kanály1.A α-Helikální kanály - 36 rodin
Transmembránové kanálové proteiny přítomné ve všech typech buněk. Katalýza pohybu solutů ve směru jejich potenciálového nebo koncentračního spádu. Jsou obvykle složeny z α-šroubovicových transmembránových segmentů.
1.B β-Hřebenové poriny - 34 rodin Energeticky nezávislý průchod solutů přes membránu. Transmembránové části proteinů obsahují pouze strukturu skládaného listu - β-soudky. Výskyt: vnější membrány gram-negativních bakterií, mitochondrií, chloroplastů a snad i gram-pozitivních bakterií rezistentních k nízkému pH.
1.C Toxiny tvořící póry - 58 rodin peptidy resp. proteiny tvořené v jedné buňce a secernované do membrány druhé buňky, kde způsobují perforaci. Ve výsledku dochází k zániku napadené buňky způsobenému výtokem elektrolytů a malých molekul, popř. naopak vstupem toxické látky do cytoplasmy. Perforins and perforins like.
1.D Kanály syntetizované mimo ribosomy - 12 rodin Nejčastější složení: řetězce L- a D-aminokyselin, laktát a β-hydroxybutyrát. Oligomerní transmembránové kanály.
1.E Holiny - 19 rodin Podtřída obsahuje integrální membránové proteiny, které regulují vstup fágových enzymů rozkládajících buněčnou stěnu (endolysinů). Holin a endolysin je potřeba pro usmrcení bakterie způsobené bakteriofágem. Značně variabilní skupina
Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)
2. Transportéry poháněné elektrochemickým potenciálem
2.A Přenašeče neboli transportéry (uniportéry, symportéry, antiportéry) - 80 rodin
V této podtřídě jsou zahrnuty systémy na bázi uniportu, symportu a antiportu bez využití energie chemické vazby.
2.B Přenašeče syntetizované mimo ribosomy - 6 rodin Může jít o depsipeptidy nebo sloučeniny neobsahující aminokyseliny.
Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)
3. Primární aktivní transportéry 3.A Přenašeče poháněné hydrolýzou vazeb P-P - 14 rodin
Transportní systémy těžící z volné energie disfosfátové vazby - transport látek proti jejich koncentračnímu nebo elektrochemickému spádu. Některé proteiny jsou během transportního cyklu přechodně fosforylovány (rodiny 3.A.3 a 3.A.4). Tyto přenašeče se vyskytují ve všech doménách organismů.
3.B Transportéry poháněné dekarboxylací - 1 rodina Málo početné prokaryontní systémy využívající volnou energii dekarboxylace oxokyselin k transportu Na+.
3.C Transportéry poháněné přenosem methylové skupiny – 1 rodina Je známa jediná rodina takových přenašečů, a to z archebakterií.
3.D Transportéry poháněné oxidoredukcí – 9 rodin Systémy, kde zdrojem energie pro transport je oxidace redukovaného substrátu zprostředkovaná tokem elektronů. Vyskytují se ve všech domén•ch organismů.
3.E Světlem poháněné transportéry - 1 rodina Tato podtřída zahrnuje jedinou rodinu archebakteriálních proteinů. Homologní proteiny obsahující retinal se však vyskytují u plísní, kde mohou fungovat jako proteiny teplotního šoku, popřípadě jako molekulové chaperony. Klasifikace transportních proteinů Arnošt
Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)
4. Skupinové translokátory 4.A. Fosfotransferasové systémy - 6 rodin
V této podtřídě jsou zahrnuty systémy, které katalyzují vektoriální enzymové reakce, kdy substrát je na startovní straně membrány a produkt, odlišný od substrátu, na cílové straně membrány.
Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)
5. Transmembránové přenašeče elektronů
nově objevená skupina několika proteinů, které přenášejí elektrony pro udržení cysteinových zbytků v redukované formě, popřípadě fungují v součinnosti s oxidasami tvořícími superoxidy.
5.A Dvouelektronové transportéry - 2 rodiny 5.B Jednoelektronové transportéry
Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)
8. Přídatné faktory v transportních pochodech
8.A Pomocné transportní proteiny - 13 rodin Podtřída zahrnuje proteiny usnadňující transport přes
biomembrány bez přímé účasti na transportu. Příkladně se jedná o tvorbu membránového komplexu, o pomoc při využití energie, nebo regulaci transportu.
Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)
Dvě třídy transportních proteinů
Koncentrace iontů uvnitř a vně buňky se mohou lišit.
Několik příkladů transportovaných látek.
Pasivní vs. aktivní transport
Trojrozměrná struktura přenašečového proteinu
bakteriorhodopsin
Trojrozměrná struktura kanálového proteinu
Kinetické schéma membránového transportu
Ionofory
Pasivní transport
Gradient elektrochemického potenciálu.
Aktivní transport
Sodno-draselná pumpa10-30x nižší
Model čerpacího cyklu sodno-draselné pumpy
Uniport-symport-antiport
Symport – pohon aktivního transportu druhé molekuly.
Na+-glukosový symport
Osmoza
Osmotické bobtnání
Rostlinná vs.
živočišná buňka
Příklady přenašečových proteinů.
Struktrura iontového kanálu
Terčíkový zámek
Proud procházející iontovým kanálem
Řízené iontové kanály
Mechanicky aktivované kanály
Distribuce iontů – membránový potenciál
Úloha K+ při tvobě membránového potenciálu.
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Transportní proteiny a jejich vztah k lékové rezistenci
• P- glykoprotein (Pgp, P170)
• Lung resistance related protein
• Breast cancer resistance protein
• Multidrug resistance related protein(MRP 1-7)
(BCRP, MXR1, ABC-P)
(LRP, MVP)
transport přes cytoplazmatickou membránu
ABC transportníproteiny
nukleocytoplazmatický transport
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Transm em bránové dom ény
Transm em bránové dom ény
Glykosylace
N-konec
C-konec
Spojovač
ATP-vazebná doména ATP-vazebná doména
Vnější stranacytoplazmatické
membrány buňky
Vnitřní stranacytoplazmatické
membrány buňky
P-glykoprotein
Schema struktury proteinu:
• U lidí kódován genem mdr1 (dlouhé raménko chromozómu 7)
• Nejdéle popsaný, nejznámější a dodnes klinicky nejvýznamnější protein asociovaný s MDR
• Neprokázáno, zda se přímo uplatňuje v navození klinické rezistence, nebo zda je
• ATP dependentní membránová pumpa exportující toxické látky z buňky a
způsobující tak sníženou intracelulární akumulaci léčiva
pouze indikátor více maligního fenotypu a tedy nepříznivým prognostickým znakem.
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Transm em bránové dom ény
Transm em bránové dom ény
Glykosylace
N-konec
C-konec
Spojovač
ATP-vazebná doména ATP-vazebná doména
Vnější stranacytoplazmatické
membrány buňky
Vnitřní stranacytoplazmatické
membrány buňky
Transm em bránové dom ény
Rodina MRP proteinů
Schema struktury proteinů:
• jednosměrná ATP dependentní membránová pumpa pro glutathion-S-konjugáty
• transportuje široké spektrum hydrofobních, záporně nabitých substrátů, nejvyššíje jeho substrátová specifita k leukotrienu LTC4 (úloha v regulaci zánětlivých procesů)
• MRP pozitivní pacienti mají statisticky významně vyšší riziko relapsu, kratšídlouhodobé přežití, jsou rezistentnější na deriváty platiny, Doxo, MIT-C a VP-16
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE BCRP proteinSchema struktury proteinu:
• nově popsaný protein z nadrodiny ABC transportérů
mikroorganismu Aspergillus fumigatus
• ABC polotransportér (aby byl funkční musí homo- či heterodimerizovat)
• jeho specifickým inhibitorem je Fumitremorgin C izolovaný z
• jeho exprese koreluje s klinickým průběhem onemocnění u AML pacientůs prognosticky nepříznivými cytogenetickými alteracemi, jeho zvýšená exprese by mohla být dobrým prognostickým markerem
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
LRP protein a organely vaults
Struktura subcelulárních organel vaults:
• tvoří 70% organel vaults, kromě LRP jsou vaults tvořeny ještě ze 3 druhů minor vault proteinů a malých molekul RNA• vaults jsou duté struktury, transportují toxické látky z jádra do lyzozómů, kde
probíhá jejich degradace• k navození MDR fenotypu je potřebná celá funkční organela vault, nikoliv pouze
zvýšená exprese LRP (léčivo je inaktivováno uzavřením v organele)
Přítomnost transportních proteinů u plicního karcinomu.
MRP-1 p53
TopoII Pgp
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Transportní proteiny a rezistence na nádorová léčiva – model
nádorové linie CEM.
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
DNR VCR Pgp MRP LRP
CEM 0,0724 g/ml
0,0003 g/ml
+ - +
CEM-DNR-bulk 26x 302x +++ - ++
CEM-DNR-0.3/A2 16x 707x ++ - -
CEM-DNR-1/D5 4x 16100x ++ - +
CEM-VCR-bulk 5x 626x ++ - +++
CEM-VCR-1/F3 10x 1930x ++ - -
Látky transportované proteiny MDR
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
PgpAntracykliny, Vinca alkaloidy, deriváty Camptotecinu, epipodofylotoxiny, taxany, chromopeptidové antibiotika, HIV-1 proteázové inhibitory, fluroforykortikoidy (Dexametazon)MRPOrganické anionty, glutathionové konjugáty, leukotrien LTC4, antagonisté leukotrienových receptorů LTsR, deriváty Pt, glukuronidy.BCRPMitoxantron, topotecan, flavopyridol, prazosin a řada dalších hydrofobních a amfifilních látek.LRPAntracykliny, Vinka alkaloidy, VP-16, deriváty platiny.
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
Používané inhibitory MDR
PgpVerapamil 6-10 M, Nifedipin 35M, CyA 0.8-2M, PSC 833 0.1M
MRPCyA 0.8-2MProbenecid 2mM,
BCRPFumitremorgin C 1M
Funkční aktivita transportních Funkční aktivita transportních proteinů.proteinů.
LABORATORY OF
EXPERIMENTAL
MEDICINE
LABORATOŘ
EXPERIMENTÁLNÍ
MEDICÍNY
Různé formy léčiva – různý mechanismus transportu
volné léčivo liposomální polymerní
Ref. S.R.D. Johnston – Bussines briefing,Long term healthcare, 2004
Hematoencefalická bariéra
Nature Reviews vol 6., no 8 2007, pp.650-661.
Modelování hemato-encefalické bariéry in vitro
Nature Reviews vol 6., no 8 2007, pp.650-661.
Faktory ovlivňující funkci hematoencefalické bariéry.
Nature Reviews vol 6., no 8 2007, pp.650-661.
VěkStres
NedostatekŽivin
Toxiny
Děkuji za pozornost
