KLONOVÁNÍ
• Vytvoření jednoho nebo mnoha geneticky identických jedinců využívající jedné somatické buňky mnohobuněčného organismu
• Klon je linie geneticky identických jedinců nebo buněk
• Klon je organismus geneticky identický s jiným organismem (lidově)
Vegetativní rozmnožování =přírodní klonování
A
J.Petr 2004
Totipotence
• Totipotence u rostlin
• Diferencované buňky zůstávají totipotentní
• Schopnost dediferenciace
• U živočichů se dosahuje genomické ekvivalence přenosem jader somatických buněk do neoplodněných vajíček nebo zygoty
Jaderné transplantace u živočichů I
• 1950s, Briggs, King, Gurdon, žabí model, jádra se diferenciací mění
• 1997, Wilmut, Dolly, genomický potenciál somatické buňky lze revertovat
• 1998, myš, dodnes 13 savčích druhů• Buňka dospělého savce může zopakovat
svůj vývoj od počátku a lze z ní vytvořit nového jedince
Přenos jaderEnukleace oocytuEnukleace oocytu
Přenos somatické buňky pod zonu cytoplastuPřenos somatické buňky pod zonu cytoplastu
J.Petr 2004
Jaderné transplantace u živočichů II
• Malá úspěšnost, důvodem může být nesprávná metylace embryonální DNA
• Syndrom náhlého úmrtí dospělých klonů, poruchy imunity, nadváha, deformace vnitřních orgánů, defekty placenty
• Klonování u primátů se nedaří, Makak rhesus, proteiny mitotického vřeténka (2000)
• Genetické a epigenetické faktory, imprinting genů
Klonování
• REPRODUKČNÍ• Výsledkem je
narození nového jedince
• LÉČEBNÉ• Výsledkem jsou
embryonální kmenové buňky, použité v budoucnu k léčbě např. chorob srdce, mozku i genetických chorob, organismus je nevnímá jako cizí
Léčebné klonování
• Lidské reprodukční klonování je neetické, ale může přinést prospěch
• Jak učinit léčebné klonování bezpečným?
• Neúspěch u makaka, nutné stadium blastocysty
• Fúze ESC s normálními buňkami, riziko nádorového onemocnění
Odběr buněk pokožkyOdběr buněk pokožky
Potřebuje srdeční Potřebuje srdeční svalovinusvalovinu
PacientPacient
Terapeutické klonování
J.Petr 2004
chrupavkachrupavkaSval Sval kosternkosterníí
LangerhansovLangerhansovy y ostrůvkyostrůvky
Srdeční Srdeční svalsval
ESCESCDiferenciaceDiferenciaceDiferenciaceDiferenciace
PacientPacientJ.Petr 2004
Soumrak klonování lidí?(Nature Rewiew Genetics)
Ian Wilmut: „Na současném stupni poznání jsou neodpovědným hazardem i pokusy s klonováním pro léčebné účely. “
Josef Fulka ml.: „Pokusů bylo provedeno žalostně málo.“
Klonování pomocí přenosu somatických jader je
neefektivní
Dokud nebudeme znát hlavní faktory, které je vymezují, jsou
snahy o klonování u lidí vědecky naivní a naprosto
neodpovědné
Kmenové buňky jsou jediné buňky, které si zachovaly schopnost sebeobnovy a
diferenciace v alespoň jeden, často však v mnoho
buněčných typů.
Kmenové buňkyvlastnosti a příklady
• Přítomny v mnoha tkáních savců,• Zajišťují tkáňový repair a homeostázi,• Spermatogoniální kmenové buňky jsou
unipotentní, tvoří spermatozoa,• Hematopoetické kmenové buňky jsou
pluripotentní, tvoří erytrocyty a všechny typy bílých krvinek,
• Pluripotentní kmenové buňky dávají teoreticky vzniknout všem buněčným typům savčího organismu a jsou odvozeny z embryonálních tkání.
Pluripotentní kmenové buňky
• V kultuře se mohou neomezeně množit• Zachovávají stejný karyotyp• Jsou schopné vytvořit jakýkoliv buněčný
typ v lidském těle• Představují obrovský opravný zdroj
nemocných nebo poškozených tkání• Důležité pro poznání vývoje
embryonálního, fetálního a postnatálního
Typy embryonálních savčích pluripotentních kmenových
buněk
• Embryonální karcinomové buňky ECC
• Embryonální kmenové buňky ESC
• Embryonální zárodečné buňky EGC (primordial germ cells PGC, prvopohlavní buňky)
Jaká je skutečnost?
• Jaké jsou vlastnosti pluripotentních kmenových buněk (PSC)?
• Jak blízko jsme k použití PSC v klinice?
Původ a vlastnosti PSC
• První linie z teratokarcinomů (ECC)
• ESC jsou odvozeny z vnitřní buněčné masy (ICM) z preimplantovaných embryí ve stadiu blastocysty
• EGC jsou odvozeny z prekursorů gametických buněk
• Markery PSC (Oct4)
Kultivace PSC
• PSC se dělí symetricky, je známo doposud malo faktorů odpovědných za sebeobnovu PSC
• Kultivace na vrstvě fibroblastů (živná vrstva - feeder layer), diferenciaci-inhibující aktivita (DIA) faktoru LIF (cytokin)
• K izolaci kromě LIF nutný i ligand Kit a bFGF
Multipotentní kmenové buňky
• Počet derivátů je snížen
• Není třeba embryonální zdroj a jeho zničení
• „Dospělé“ kmenové buňky (orgánové kmenové buňky)
Kmenové buňky v klinice
• Úspěchy na živočišných modelech
• Terapie pomocí buněk u člověka
• Kultivace ve velkém množství
• Zatím málo použitelných linií
• Optimalizace kultivačních podmínek, pomoc genomiky
Bezpečnost terapie pomocí buněk
• 3 klíčové aspekty:
• Histokompatibilita
• Vedlejší nádorové onemocnění
• Asociace s infekčními agens v kultivačních mediích
Úvod do genové terapie
Léčebný postup nebo postup zmírňující projevy
genetické poruchy pomocí geneticky modifikovaných
buněk pacienta s terapeutickým přínosem pro
pacienta
2 x 2 základní strategie
• Reparace genů in situ - terapie genů
• Ektopická reparace – terapie geny
• GT somatická
• GT germinální
Přenos genetického materiálu (genů, genových segmentů, oligonukleotidů
• GENOVÁ TERAPIE IN VIVO (IN SITU)
• Genetický materiál je přenášen přímo do buněk pacienta
• GENOVÁ TERAPIE EX VIVO
• Buňky jsou odebrány z těla pacienta
• Genetická manipulace je provedena in vitro
• Buňky jsou transplantovány zpět do těla pacienta
Typy nemocí vhodných ke genové terapii
• Infekční choroby (virový nebo bakteriální patogen)
• Nádorová onemocnění (poruchy biologické funkce protoonkogenů, nádorových supresorových, apoptotických a opravných genů)
• Genetická onemocnění (genetická deficience genového produktu, nepřiměřená exprese genu)
• Poruchy imunitního systému (alergie, záněty a autoimunní choroby)
Strategie genové terapie
• KLASICKÁ GENOVÁ TERAPIE
• Optimální exprese vloženého genu
• Tvorba chybějícího produktu
• Přímá likvidace nemocných buněk
• Aktivace imunitního systému
• NEKLASICKÁ GENOVÁ TERAPIE
• Inhibice exprese patogenního genu
• Restaurace normální exprese
• siRNA
Podmínky zdařilé GT
• Ve správném čase, místě, množství a se stálým výsledkem EMIR (EST MODUS IN REBUS)
• Opravovaný gen nesmí být dominantní• Vysoká účinnost genového přenosu• Stálá integrace a exprese• Verifikace na savčích modelech• Bezpečnost manipulací, interference se
zárodečnými buňkami• Jen u vážných onemocnění• Etické posouzení protokolů
Transfer genů do buněk I
• Savčí virové vektory:
• Retrovirové vektory
• Adenovirové vektory
• Vektory viru herpes simplex
• Vektory adenoasociovaného
viru
5LTR 3LTRMarker Promotor Cizorodý gen
Identifikace/separace
Exprese genu
Opravný gen
Retrovirový vektor
Signál obalování
Transfer genů do buněk II
Nevirový přenos:
• Endocytóza mediovaná receptory
• Lipozómy
• Přímé injikování nebo
bombardování částicemi
Schválené protokoly
• Deficience adenosindeaminázy – první historicky úspěšný postup GT
• Familiální hypercholesterolemie, deficience LDLR – retrovirový transfer do hepatocytů
• Cystická fibróza – adenovirový transfer genu CFTR do epiteliálních buněk – aerosol
• DMD – chybí vhodný vektor
Etické aspekty GT
• Bezpečnost manipulací
• Ověření na savčích modelech
• Hierarchické schvalování protokolu
• Nebezpečí vedlejších účinků
• GT zárodečných buněk
• Perspektivy GT