Date post: | 02-Feb-2018 |
Category: |
Documents |
Upload: | truongthien |
View: | 213 times |
Download: | 0 times |
Nové typy očkovacích látek
pro prevenci infekcí a
imunoterapii nádorů
P. Šebo
Toto ustálené souţití s mikroflórou občas naruší vetřelci
– patogenní infekční mikroorganismy -
speciálně vybavené pro přeţití v hostiteli
nějakou dobu odolávají imunitnímu systému
po přemnoţení vyvolají poškození a přenos
Mikrobiální orgán člověkanosíme si sebou cca. 1013 našich vlastních buněk a na 1014 mikroorganismů
nos 108
Staph. aureusStaph. epidermidisDiphtheroidsStreptococci
kůţe 1012
Staph. aureusStaph. epidermidisPs. aeruginosaPropionibacterium acnesAnaerobes
nosohltan, hrtan a jícen 1010
Staph. epidermidisHaem. influenzaeNeisseria spp.Strep. PneumoniaeStrep. pyogenes
močová trubice a vagína 108
Staph. epidermidisStreptococciLactobacilliVeillonellaetc.
ţaludek 104
Hel. pylori
ústní dutina 1010
Strep. mutansPor. Gingivalis pluscca. 700 druhů
střeva 1014 ~220gBacteroides spp.Bifidobacter spp.Bacillus spp.EubacteriaRuminococcus albuscca. 1000 druhů
(Wilson et al, 2002)
Toto souţití s mikroflórou občas naruší vetřelci
patogenní mikroorganismy
vybavené pro manipulaci s imunitou hostitele
po přemnoţení vyvolají poškození a případný přenos
Nejefektivnější je infekcím předcházet
• Zlepšením ţivotních podmínek a hygienických návyků
• Čištění vody, odpadové hospodářství, výživa, bydlení
• Bezpečnějšími potravinami
• Chladový řetězec, pasteurizace, omezení kontaminace
• Kontrolou přenašečů
• Komárů, vší, much a přenašečů zoonos
• Omezením promiskuity a pouţitím kondomů…
• Léčbou a prevencí infekcí
– Chemoterapie infekcí (antibiotika)
– Očkovací látky
Cílem očkování je manipulace adaptivního
imunitního systému• zaloţený na obrovském repertoáru individuálních klonů B a T lymfocytů,
vzniklých reorganizací genů a somatickými mutacemi, z nichţ kaţdý receptor
nese unikátní, specifický receptor (BCR or TCR)
• Rozpustnými receptory adaptivního systému jsou protilátky
• Adaptivní systém je “předvídavý”, klonální, “předimenzovaný”
klonální expanze B lymfocytů Aktivace T lymfocytů
peptid
jádro
endocytóza kříţová
prezentace
lymfocyt
lymfocyt
Nebyl první, ale první pochopil a vědecky ukázal, ţe oslabené
nebo zabité mikroorganismy lze pouţít pro prevetivní očkování
( s cílem předejít infekci nebo omezit její dopad)
„Otec“ dnešních očkovacích látek
Louis Pasteur(1822 – 1895)
• Pasteur nebyl první - po tisíciletí bylo známo, ţe ti co přeţili infekci se zřídka nakazili znovu.
• variolizace – vdechování prášku z usušených puchýřů pravých (černých) neštovic v Indii
doloţeno jiţ cca. 1000 let před n. l., v Číně vpichování hnisu z puchýřků do kůţe…
• 1796 – Edward Jenner, pouţil kravské neštovice (virus vakcínie) pro očkování proti
pravým neštovicím, kráva = vacca latinsky >>> Vaccine – vakcína
• L. Pasteur - 1880 vakcína proti slepičí choleře, 1881 antrax, 1885 – vzteklina
• 1927 – BCG – Bacillus Calmette-Guérin – M. bovis pasáţované na bramborovém médiu
• Po 2. světové válce – spalničky, příušnice, zarděnky, Adenovirus, plané neštovice ,tyfus
• 1957 – ţivá atenuovaná vakcína proti poliomyelitidě – Sabin
• Československo byla první země světa kde byla vymýcena poliomyelitida - doc. Slonim
(USOL)
První vakcíny byly ţivé atenuované mikroorganismy:
Stojíme na ramenou velikánů
(1843 – 1910) (1863 – 1933) (1872 – 1961)
Ţivá vakcína z oslabeného Mycobacterium bovis
(BCG Pasteur) pro kalmetizaci
Zavedení kalmetizace umoţnilo ve vyspělejších zemích vymýtit miliární
(systemickou formu) tuberkulózy u dětí a významně omezilo šíření TB
Jonas Salk Albert Sabin
Československo se v roce 1961 stalo první zemí na světě, kde byl
přerušen proces šíření divokých poliovirů v populaci a poliomyelitida zde
byla eradikována vakcínou vyvinutou týmem doc. Slonima v ÚSOL Praha
Orální vakcína Alberta Sabina byla masivně testována v SSSR kolem roku 1960
Chumakovem a poté masově nasazena po celém světě v kampani SZO
Vakcína proti poliomyelitídě
1955 inaktivovaná Salkova a 1960 atenuovaná Sabinova vakcína
• 1896 - Tyfus, Cholera, 1897 - Mor
• 1926 – černý kašel 1936 – chřipka
• Po 2. světové válce – poliomyelitida (1952 Salk ), vzteklina, encephalitis, hepatitis A
• 1960s-1970s – eradikace pravých neštovic – program pro SZO vymýšlel prof. Karel Raška
Purifikované proteiny, konjugované a rekombinantní vakcíny
• 1923 – záškrt, 1927 tetanus (difterický a tetanický toxoid)
• po 1940 - DPT vakcína – první kombinovaná očkovací látka – záškrt, tetanus, pertuse)
Velkou roli sehrály téţ inaktivované a
podjednotkové vakcíny
Klíčový úspěch vakcinačních programů eradikace neštovic (virem vakcínie) – podíl prof. Karla Rašky ve SZO
200 – 300 milionů mrtvých
~10% úmrtnostbiologická zbraň pro hubení indiánů
odolnějšími dobyvateli z Evropy
Pokles počtu zemí s výskytem
pravých neštovic mezi lety
1950-1976
počátek
eradikační
kampaně SZO
rok
počet zem
í s v
ýskyte
m p
ravých n
ešto
vic
Očkování inaktivovanou celobuněčnou pertusovou
vakcínou bývalo velmi účinné…
masově nasazena
celobuněčná vakcína
pokles skupinové imunity
a zhoršení kvality
používané vakcíny
zavedena
bezbuněčná
vakcína
Klasické vakcíny předběhly
poznání imunitního systému:
• Připraveny čistě empiricky z celých bakteriálních buněk a virů
• Dodnes patří k nejúčinnějším vakcínám díky spektru obsažených
antigenů
• Jistá míra vedlejších účinků vedlejších a mnohdy zveličovaných účinků
(obsah endotoxinu, reverze poliovirů, automunita?).
Individuální bezpečnost na úkor ochrany populace???
Aktuální výzvy ve vývoji vakcín
• Malárie - P. falciparum – nová generace vakcín v klinických testech
• Tuberkulóza - 2 mld. latentně infikovaných – běţí klinické testy
• AIDS – 35 milionů HIV-pozitivních – zatím beznadějné?
• Chlamydia pneumoniae
• infekční mononukleóza – EBV a téţ CMV………………………………………………………………………………………………………
• Imunoterapeutické vakcíny proti alergiím,
autoimunitě
• T-buněčné vakcíny pro imunoterapii rakoviny slibné, první vakcína na léčbu nádorů prostaty registrovaná v USA
Nové vakcíny staví na pokroku
molekulární biologie,
genomiky
a
buněčné imunologie
Nové koncepty (1):
• Nová adjuvans – soli hliníku, MPL, olejové suspenze PolyICLC – aktivují
inflamasom anebo signalizují přes TLR ligandy (poly I:C + polylysin)
• konjugace málo imunogenního kapsulárního polysacharidu s proteiny
(Hemophilus, Neisseria meningitidis C, Streptococcus pneumonieae)
• rekombinantní pseudovirové částice (HPV, HBV)
• orální a intranasální atenuované a enkapsulované vakcíny (rotavirus,
Salmonella, Shigella, poxvirus, adenovirus, intranasální chřipková vakcína)
• rekombinantní podjednotky vakcín, např. gdPT pouţitý v italské vakcíně
Toxoidy (chemicky nebo geneticky inaktivované bakteriální toxiny
Cholerový toxin
LT
Pertusový toxin
Difterický Toxin
Typické podjednotky polyvalentních vakcín
Tetanový toxin
např:
• rekombinantní pseudovirální částice (HPV, HBV)
• směs purifikovaných antigenů v pediatrické hexavakcíně (DTPH + polio + HBV)
Podjednotkové vakcíny
VLP = pseudovirální (virus-like particle) částice
lidského papiloma viru 16 (HPV16)
Nové koncepty (2):
- polyvalentní vakcíny –
- od 1.1. 2009: INFANRIX hexa™ - Diftérie, Tetanus, Pertuse, Hepatitis B,
Polio, a Haemophilus influenzae typ b
• reverzní vakcinologie – ochranné antigeny hledány v genomových
sekvencích
• DNA vakcíny a genetická, aţ genomická vakcinace
• Systémy pro cílenou prezentaci antigenů na dendritických buňkách
pro detekci latentních infekcí a imunoterapii nádorových
onemocnění
Genomika umoţnila vznik reverzní vakcinologie
(R. Rappuoli et al. – Chiron/Novartis Vaccines, Siena)
Reverzní vakcinologie
Neisseria meningitidisséroskupiny B
exprese
a
purifikace
Purifikované
proteiny
imunizace
~350 proteinů produkováno v E.coli,
a pouţito k imunizaci myší
570 ORFs, potenciálně kódujících
povrchové proteiny
Reverzní vakcinologie
100,000
200,000
300,000
400,000
500,000
600,000
700,000
800,000
900,000
1,000,000
1,100,0001,200,000
1,300,000
1,400,000
1,500,000
1,600,000
1,700,000
1,800,000
1,900,000
2,000,000
2,100,000
2,200,000IHT-A
IHT-B
IHT-C
1
Objeveno 91 nových
povrchových proteinů
Identifikováno28 nových antigenů indukujících baktericidní protilátky
Polysacharidová kapsula
Vnější membrána
Periplasmatický prostor
Cytoplasmatická membr.
Cytolasmatický prostor
Kapsula
PorA
PorB
Opa
Opc
LPS
Pili
T-buněčné vakcíny pro prevenci
infekcí a terapii nádorů
Dvě dráhy prezentace antigenů:
cesta k protinádorovým vakcínám
endogenní proteiny
antigeny virů, intraculárních bakterií a parazitů
Nádorové antigeny
Endoplazmatické
ReritkulumTCR
aktivovaný
pomocný
CD4+
T lymfocyt
maturace B lymfocytů
Zabíjení
infikovaných
a nádorových buněk
aktivovaný
cytotoxický
CD8+
T lymfocyt
produkce protilátek
a
cytokinů
Jak dopravit antigen do cytosolu prezentujících buněk a
stimulovat CD8+ cytoxické T lymfocyty?
• DNA a RNA vakcíny – i.d./s.c./i.m. nebo
ex vivo aplikace na APC a transfer do těla
(zatím jenom pro zvířata)
• dendritické buňky maturované a nabité antigeny in vitro pro imunoterapii
nádorů (Provenge = první registrovaná vakcína na rakovinu prostaty – 2010)
• Intracelulární baktérie - uvolňující rekombinantní antigeny (atenuovaná Listerie,
Salmonella, BCG…)
• Atenuované rekombinantní viry produkující antigeny (např. vakcínie, adenovirus)
• Liposomové preparace peptidů
• Proteiny pronikající do buněk (Tat, bakteriální toxoidy - dCyaA (Procervix)
• protilátky s geneticky (nebo chemicky) připojeným antigenem, které rozeznávající
endocytické receptory dendritických buněk (R. Steinman – Celldex Therapeutics)
antigenní fuze se streptavidinem (v komplexu s biotinylovanou směřovací protilátkou?)
mRNA
transfekce
dendritické
buňky
DNA/RNA aplikace in vivo
adoptivní
přenos
DNA vakcíny
DNA vakcíny byly objeveny náhodou
kontrolním pokusem. Fungují na principu
produkce a prezentace antigenu vlastními buňkami
příjemce. Výborně fungují u myší. U lidí zatím není
ţádná schválená a vývoj stál firmy cca.
1 mld. USD…
například virová RNA je přeloţena do
cDNA a sekvenována, klonována
podle
sekvence jsou
syntetizovány
geny pro
antigeny
a ty jsou
vloţeny do
plazmidu
plazmidová
DNA je
purifikovaná
chromatografií
purifikovaná DNA
tvoří vakcínu
Rekombinantní: mohou být multivalentní (Ulmer et al. Science 259, 1745-48, 1993)
Dendritické buňky maturované a nabité antigeny z
lyzátu nádorových buněk in vitro
endocytický receptor
raný /pozdní
endosom
endocytóza of
mAb-SA-Ag
komplexů
Lysosom
dissociace
Recyklující
receptory
endoplazmatické
retikulum
štěpení SA-Ag
Golgi
CD4+
T
buňkaCD8+
T
buňka
kříţově
prezentační
organela
MHC II MHC I
MHC II
peptid
komplex mAb-SA-Ag
signalizace
MHC I
+
peptid
Staněk et al. 2012, Mol. Biotechnol. 51:221-232, WO/2011/077258
Vyuţití antigenních fuzí se sreptavidinem pro dopravu
antigenů ke prezentaci na MHC molekulách
ProteazómEndozóm
MHC-II
glykoprotein
CD4+
T lymfocyt
Transportér peptidů vyštěpených
proteazómem z antigenů
MHC-I
glykoprotein
MHC II
Golgi
Endoplazmatické
retikulum
MHC-I peptid
AC
AC
Repeats
CD8+
T lymfocyt
Repeats
?
?
M2 integrin
CD11b/CD18
Ag
Ag
AgAg
Ag
Vložený antigen(z viru, bakterie,parazita, nádoru)
dCyaA toxoid jako nástroj pro dopravu antigenů do cytosolu prezentujících buněk
translokaceendocytóza
buňka prezentující antigeny
Immunotherapie nádorů vyvolaných u myší buňkami
transformovanými E6 a E7 onkogeny HPV16:
kombinovaná terapie dCyaA-E7 and MVA-E7 vakcínami
Macková et al. (2006) Cancer Immun. Immunother. 55, 39-46
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
2/8MVA-SigE7LAMP +
CyaA336/E7 ***P=0.0006
5/8CyaA336/E7 + PBS
*P=0.03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 900
50
100
150
200
0/8CyaA336/E7 +
MVA-SigE7LAMP ***P<0.0001
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
2/8CyaA336/E7 +
CyaA336/E7 **P=0.003
7/8PBS + CyaA336/E7
n.s. P=0.2
0
50
100
150
200
7/7PBS + PBS
Days after administration of 6x104TC-1 cells
Tu
mo
r are
a [
mm
2]
veliko
st
nád
oru
(m
m2)
dny po injekci 6 x 104 TC-1 nádorových buněk
www.genticel.com
Společnost Genticel Sarl z Toulouse vyvíjí na bázi toxoidu CyaA vakcíny pro
imunoterapii nádorů děloţního čípku (nyní probíhá klinická fáze I.)
the adenylate cyclase CyaA
Děkuji za pozornost !
rád zodpovím Vaše dotazy
Stav ‘technologie’ po 20-ti letech práce
• ověření konceptu v myších– specifické CTL CD8+ and CD4+ T buněčné odpovědi
• Ochranná imunita proti virům (LCMV)
– Ochranná imunita proti Plasmodium berghei (myší malárie)
– Imunoterapie experimentálních nádorů vyvolaných HPV16
– polyvalentní buněčná imunitní odpověď - několik antigenů v různých místech
(US Patent No. 5,503,829, No. 5,679,784, No. 5,935,580
EU Patent application No. 03291486.3, US Prov 03495, 6094 (2003) )
• Mnoho preklinických dat z in vitro a in vivo modelů
• Připravená toxikologická studie
• Běţí fáze I&II klinické testy na pacientech s:
– melanomy – the 6th EU RP projekt THERAVAC (Ludwig Institute)
– nádory děloţního čípku (HPV16) - BT Pharma S.A. Toulouse France
• Vylepšení detekce latentní infekce Mycobacterium tuberculosis u lidí a skotu
• Další diagnostické moţnosti u jiných infekcí a rakoviny
přehled: Šimšova et al. (2004). Int. J. Med. Microbiol., 293, 571-576.
dACT umoţňuje indukci buněčných imunitních
odpovědí proti cizorodým antigenům
Antigeny CD8+ Antigeny CD4+
OVA MalE
LCMV MAGE
Apa, Cfp ESAT-6, CFP10
gp120 TB-10.4
E7 Ag85A
CSP
Melanomy
ESAT-6, CFP10
TB-10.4
Sebo et al., 1995, Infect. Immun. HIV, LCMV in vitroFayolle et al., 1996, J. Immunol. HIVSaron et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Ochrana před LCMV in vivoOsicka et al., 2000, Infect. Immun. Mapování permisivních místFayolle et al., 2001, J. Virol. polyvalentní CTL opdpověďLoucka et al., 2002, Infect. Immun. CD4+ T odpovědiSchlecht et al., 2004, J. Immunol. MechanismusMackova et al., 2006, Cancer Immunol. Immunother. Imunoterapie nádorůTartz et al., 2006, Infect. Immun., očkování proti malárii (myší)Wilkinson et al. 2005 Infect Immun. Vylepšení tuberkulosního testuAnderson et al. 2006 Am. J. Crit. Care Resp. Med. Vylepšení tuberkulosního testuMajlessi et al., 2006, Infect. Immun., IFN a imunita proti MTBHervas-Stubs et al., 2006, Infect Immun IFN a imunita proti MTB
Slušně nás to živí….
Nedávno registrované nové vakcíny
Hexavalentní pediatrická vakcína - od 1.1. 2009: INFANRIX hexa™- Diftérie, Tetanus, Pertuse, Hepatitis B, Polio, a Haemophilus influenzae typ b- pro imunizaci kojenců ve 2., 4. a 6. měsíci ţivota
Rotavirová vakcína (orální), intranasální chřipková vakcína- RotaTeq™, Rotarix™, FluMist
MMR-Varicella- zarděnky, příušnice, spalničky + plané nešovice
Pneumokoková konjugovaná vakcína- Prevenar™ (heptavalentní, různé serotypy)
Meningokoková kojugovaná vakcína- MENVEO™ (serotypy A, C, Y and W135)
s poněkud spornou nákladovou efektivitou:
Vylepšení diagnostiky pomocí stanovení uvoňovaného IFN (IGRA) detekce paměťových T lymfocytů zbylých po latentní infekci
Cílená doprava antigenů do prezentujících buněk
• Pomocí:
derivátů adenylátcyklázového toxoidu
antigenů fúzovaných se streptavidinem
v komplexech s biotinylovanou směřující protilátkou
Účel:• sníţit potřebný objem krve
• zkrátit čas stanovení
• eliminovat neurčité výsledky
• sníţit detekční limit
Detekce IFN-γ
• ELISA
• cytometrií
• qPCR
buňka
prezentující
antigen
paměťová
T buňka
specifická
pro daný
antigenbuňka
prezentující
antigen
APC buňky
prezentují
antigen T
buňkám
aktivovaná T
buňka
produkuje
IFN
předchozí asymptomatická infekce (LTBI nebo CMV)
jsou přítomny specifické T lymfocyty – jejich detekce ve vzorku krve
pokud dotyčný byl infikován má antigen-specifické
T buňky, takţe dojde k imunologické synapsi a aktivaci
Habilitační řízení Ing. Petra Šeba, CSc., 12.04.2012, FPBT VŠCHT Praha
Odpovědi oponentům habilitační práce:
Doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc. nevznesl žádný dotaz.
Prof. RNDr. Stanislav Zadražil, DrSc.: „Jaký je současný stav v metodologii produkce cizorodých rekombinantních proteinů bakteriální
buňkou z hlediska poměru produkt - výtěžek v denaturovaném a „nativním“ stavu; skutečnost, která sehrála centrální úlohu
v experimentální práci autora?”
Odpověď: Od roku 1990, kdy byl rekombinantní AC toxin poprvé produkován v bakterii Escherichia coli, došlo k velmi významnému
rozvoji metod produkce rekombinantních proteinů v bakteriích. Kromě E. coli je veřejně dostupných, nebo na výběr u
specializovaných dodavatelských firem, i široká škála produkčních kmenů Gram-negativních i Gram-pozitivních bakterií. Tyto kmeny
byly zpravidla upraveny pomocí genové manipulace tak, aby v nich bylo možno produkovat rekombinantní proteiny jak velmi
majoritně v rozpustné frakci v cytosolu, tak vystavené na bakteriálním povrchu, posttranslačně modifikované například glykozylací ,
či přímo sekretované do média kmeny deficientními v produkci proteáz.
Přesto zůstává nejoblíbenějším, tradičním a mnohdy i ekonomicky nejvýhodnějším expresním organismem pořád bakterie E. coli. K dispozici jsou dnes především osvědčené kmeny E. coli ze skupiny B, například BL21(λDE3), které lze dále upravovat vkládáním genů pro expresi chaperonů.Nejjednodušší pak je nadprodukovat rekombinantní protein do nerozpustných inkluzních tělísek ve výtěžcích dosahujících někdy až 70% celkového buněčného proteinu (v průmyslově optimalizovaných kmenech a médiích). Tato technologie velmi usnadňuje následnou purifikaci proteinu po separaci a promytí inkluzních tělísek. Po jejich solubilizaci denaturačním činidlem a optimalizovaném refoldování produkovaného proteinu, lze takové proteiny poté purifikovat do vysoké čistoty s velmi vysokým výtěžkem. Tento způsob přípravy používáme i v případě našeho toxinu s výhodou již 20 let. Lepší způsob přípravy toxinu schopnéhopronikat do buněk zatím vynalezen nebyl. Jeho výhodou je, že tím získáváme formu rozvinutého proteinu analogického sekrečnímuintermediátu toxinu, který je v denaturačním roztoku velmi stabilní při skladování ve zmraženém stavu po mnoho let. Vyředění denaturačního roztoku s toxinem do buněčné suspenze pak vede k svinutí aspoň části molekul toxinu do funkční konformace, podobně jako po sekreci toxinu z bakteriální buňky kanálem o průměru pouhého 1 nm, kterým toxin musí procházet v rozvinuté "lineární" formě.Pokud je potřeba některý rekombinantní protein produkovat do rozpustné cytosolické frakce bakteriálních buněk, protože jej například nelze úspěšně refoldovat do biologicky nebo enzymaticky aktivní podoby, lze toho dnes již zpravidla dosáhnout ko-expresí vhodného chaperonu v bakteriálních buňkách a především snížením kultivační teploty. Dále může pomoci i přídavek různých činidel do kultivačního média, například betainu.Asi nejúspěšnější rutinní strategií v tomto směru je použití kmene E. coli BL21 Gold, jeho varianty Arctic Express, ve kterém jsou po indukci IPTG spolu s produkovaným proteinem syntetizovány též chaperony Cpn60 a Cpn10, produkované přirozeně při chladovém šoku bakteriálních buněk. Ty pak umožňují zpravidla úspěšně produkovat v rozpustné formě i velmi “obtížné” proteiny při kultivačních teplotách 4-12 °C, byť někdy s nepříliš vysokým výtěžkem.
Doc. RNDr. Ivan Rychlík, Ph.D. -3 dotazy:
1. Podle habilitační práce usuzuji, že v podstatě veškerá práce byla vykonána s ACT exprimovaným v E. coli, včetně
připravených mutantů s definovanými bodovými mutacemi. Zkoušeli jste se někdy vrátit k Bordetella sp., tedy připravit
stejné mutanty v původním hostiteli sledovat vliv těchto mutací na virulenci tohoto patogena?
Odpověď: Ano, tento typ experimentů jsme zahájili před 1,5 rokem a jsou předmětem disertační práce Ing. Karolíny
Baslerové. Tyto experimenty začaly být technicky schůdné poté, co jsme v roce 2006 získali velmi efektivní genetický
systém pro alelickou výměnu na chromozomu B. pertussis, vyvinutý dr. Scottem Stibitzem z CEBR FDA. Daný systém
umoţňuje efektivně vnášet do genomu B. pertussis bodové neznačené (marker-less) mutace, takţe nyní můţeme otestovat
vliv aminokyselinových záměn v proteinu CyaA na virulenci bakterie. Dalším, hlavním důvodem bylo, ţe jsme v roce 2009
popsali první kombinaci substitucí E570Q+K860R v proteinu CyaA (Osičková et al., 2010), která vede k zásadnímu sníţení
póro-tvorné (hemolytické) aktivity CyaA, aniţ by došlo k ovlivnění kapacity toxinu translokovat AC doménu do CD11b+
buněk a zvyšovat v nich hladinu intracelulárního cAMP. Doposud totiţ veškeré dostupné mutanty postrádali buďto jenom
enzymatickou AC aktivitu, nebo jak enzymatickou, tak hemolytickou aktivitu. To nám umoţnilo nyní jako prvním otestovat
příspěvek hemolytické aktivity CyaA k virulenci B. pertussis. Sledovali jsme rovněţ kolonizační schopnosti v myším modelu.
Výsledky, které budeme brzy publikovat, ukazují, ţe selektivní odstranění hemolytické aktivity vede ke sníţení virulence
bakterie, tedy ke sníţení LD50 o jeden řád, zatímco nehemolytické bakterie podané v niţších dávkách, kolonizují myši
stejně úspěšně jako nemutované bakterie. Hemolytická aktivita tedy nehraje roli v kolonizaci a ovlivňuje pouze
prozánětlivou reakci myšího imunitního systému.
2. K poznatkům, které nakonec vedou k aplikaci základního výzkumu do farmaceutické praxe došlo během pobytu
habilitanta ve Francii. Z toho vyplývá, ţe v případě komerční realizace by podíly z prodeje šly do Francie, nikoli do České
republiky. Je to tak pravda?
Odpověď: Je to pravda částečně, neb oponent správně konstatuje, ţe primární patentová přihláška na pouţitý systém
dopravy antigenů, ze které pak vycházely další aplikace, byla podaná v roce 1993, kdy jsem byl zaměstnancem Institut
Pasteur. Veškerá práva a výnosy z této přihlášky tak patří Institut Pasteur, který následně technologii licencoval firmě
Genticel Sarl. Nicméně, od mého návratu do MBÚ v roce 1995 jsme podali společně s francouzskou laboratoří Dr. Leclerc
další 4 mezinárodní patentové přihlášky. Jedna z nich, z roku 2003, je nyní součástí patentového portfolia licencovaného
firmou Genticel a pokud bude jimi vyvíjený preparát uveden na trh, budou mít MBÚ a čeští spoluautoři nárok na příslušné
podíly na čistých výnosech z prodeje preparátu. Čili, doufejme, ţe něco přijde i do ČR. Zatím v tomhle ohledu vypadá
slibněji situace u jiné společné patentové přihlášky, rovněţ se týkající studovaného toxinu.
3. Habilitant uvádí, že testování ACT při nádorové terapii bylo zahájeno v lednu 2011. Jsou po prvním roce
testování k dispozici již nějaké předběžné výsledky? Jak se připravuje ACT pro aplikaci lidem když autor uvádí,
že po expresi v E. coli se musí solubilizovat v 8M močovině?
Odpověď: Solubilizace, purifikace a skladování ACT v 8 M močovině nepředstavuje problém z hlediska
klinické aplikace. Naopak umoţňuje dosáhnout vysokou koncentraci proteinu, aniţ by došlo k jeho precipitaci a
následně jej z 8 M roztoku močoviny lyofilizovat a skladovat v podobě prášku ve stabilní formě i při pokojové
teplotě. Před injekci do kůţe nebo subkutánně se pak ředěním fyziologickým roztokem zředí močovina pod
denaturační koncentraci na méně neţ 0,8 M, ale typicky aţ na 80 mM a takový roztok se injikuje. Močovina je
biogenní látka, je netoxická, ve tkáních se rychle vyředí a je vyloučen z organismu. Kaţdopádně pro regulační
autoritu povolující klinické testy tento postup nepředstavoval ţádný problém.
Pokud jde o klinické studie, v současnosti probíhají dvě studie:
První je organizovaná firmou Genticel, s preparátem určeným pro imunoterapii nádorů děloţního čípku,
respektive eradikaci HPV-infikovaných epiteliálních buněk čípku. Zatím se jedná o čistou studii bezpečnosti
preparátu ve fázi I., která je prováděna na zdravých neinfikovaných dobrovolnicích a zároveň je sledováno
navození imunitní odpovědi na úrovni protilátek a buněčné imunity. Po roce lze sdělit pouze to, ţe preparát
vyrobený ve schématu cGMP jiţ byl podán několika desítkám dobrovolnic. Jakékoliv další informace jsou
předmětem obchodního tajemství firmy Genticel a do doby zveřejnění oficiálních, vyhodnocených a
validovaných výsledků klinické studie firmou Genticel, nelze je nijak komentovat.
Druhá klinická studie probíhá na klinice St. Luc v Bruselu. Z etických důvodů jde o sloučenou studii fáze I. a
IIa., s preparátem určeným pro imunoterapii metastazujícího melanomu u terminálně nemocných pacientů s
haplotypem HLA.A2., u kterých selhala jakákoliv předchozí léčba. V této studii se ověřuje jak bezpečnost, tak
imunitní odpověď navozená daným preparátem, tak jeho případný terapeutický uţitek pro pacienta. Studie byla
zahájená v lednu roku 2011 a postupně jsou do ní zařazováni indikovaní pacienti, kterých je ovšem relativně
málo a tak zařazení všech plánovaných 27 pacientů do studie potrvá několik let. Ve studii bude testováno
opakované podávání i postupné zvyšování dávky. Ohledne dosud získaných výsledků platí totéţ co u
předchozí studie. Do ukončení celé studie a kompletního vyhodnocení všech získaných dat, nelze sdělovat
ţádné dílčí výsledky a nemám souhlas sponzora klinické studie k tomu, abych mohl k probíhající studii cokoliv
dalšího veřejně říct.